DE69228817T2 - Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger - Google Patents
Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen trägerInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft allgemein heterogene Assays und insbesondere das Nachweisen und/oder Quantifizieren der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe durch photometrisches Nachweisen eines Signals, das von einem mit dem Analyten assoziierten Marker erzeugt wird, in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers.
- Festphasenassays können in mehreren verschiedenen Formaten durchgeführt werden. Viele der zur Zeit verfügbaren Systeme verwenden ein Format mit nichtkompetitiver oder sequentieller Bindung.
- Zum Beispiel wird im Falle von Immunoassays ein Antikörper entweder durch unspezifische Adsorption oder durch kovalente Bindung an eine Festphasenoberfläche gebunden. Die klinische Probe oder Gewebekulturflüssigkeit wird zu der festen Phase gegeben und nach ausreichender Zeit für die Reaktion in einem Waschvorgang wieder entfernt. Dann wird ein zweiter Antikörper hinzugefügt, der mit antigenen Stellen reagiert, die sich auf dem hinzugefügten Antigen befinden, aber nicht durch die Bindung an den Festphasenantikörper besetzt worden sind. Bei einigen Formaten ist dieser Antikörper direkt mit dem Marker verknüpft. In solchen Fällen wird die Reaktion durch Auswaschen von nicht gebundenem Antikörper und Messen der Menge des an die Oberfläche der festen Phase gebundenen Markers beendet. Alternativ dazu kann der zweite Antikörper auch in unmarkierter Form hinzugefügt werden, und seine Anwesenheit kann durch die Zugabe eines weiteren Immunreaktanten quantifiziert werden, der spezifisch an den zweiten Antikörper bindet (ein indirektes Format). Der zweite Antikörper kann auch mit einer nichtenzymatischen Struktureinheit markiert sein, und die Reaktion kann durch die Zugabe eines Reaktanten quantifiziert werden, der diese Struktureinheit spezifisch erkennt, z. B. bei einem Streptavidin-Biotin-Immunoassay. In allen Fällen wird nicht umgesetzter markierter Antikörper durch Waschen entfernt, und die Menge des an die feste Phase gebundenen Markers wird mit geeigneten Geräten bestimmt.
- Das US-Patent Nr. 4, 656, 143, ausgegeben an Baker et al. am 7. April 1987, beschreibt einen heterogenen Bindungsassay, bei dem eine flüssige Komponente und eine körnige teilchenförmige feste Phase während einer vorbestimmten Zeit miteinander inkubiert werden und der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Dichte der flüssigen Komponente wenigstens während der vorbestimmten Zeit im wesentlichen gleich der Dichte der körnigen teilchenförmigen festen Phase gehalten wird. Die Dichte der flüssigen Komponente wird im wesentlichen gleich der Dichte der körnigen teilchenförmigen festen Phase gehalten, indem man ein dichtemodifizierendes Medium hinzufügt, das eine größere Dichte als die körnige teilchenförmige feste Phase hat.
- Das US-Patent Nr. 4,914,023, ausgegeben an Philo am 3. April 1990, beschreibt ein Verfahren zur Ausdehnung des linearen Bereichs eines Enzymimmunoassays durch Messen der Extinktion neben dem Maximum.
- Die am 26. Oktober 1988 veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 288 179 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis des MB-Isoenzyms von Kreatin-Kinase in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend (a) das Bilden eines Gemischs aus einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, einem immobilisierten Antikörper gegen das B-Monomer von Kreatin- Kinase und einem markierten monoklonalen Antikörper gegen das MB-Isoenzym von Kreatin-Kinase, (b) das Inkubieren des Gemischs, (c) das Abtrennen des festen Trägers aus dem Gemisch und (d) das Nachweisen der Menge des mit dem festen Träger assoziierten Markers.
- Das US-Patent Nr. 4,098,876, ausgegeben an Piasio et al. am 4. Juli 1978, beschreibt einen umgekehrten Sandwich-Immunoassay, der das Inkubieren einer Flüssigkeit mit markierten Antikörpern gegen den nachzuweisenden Analyten unter Bildung eines Komplexes aus markiertem Antikörper und Analyt und dann das Inkubieren dieses Komplexes mit immobilisierten Antikörpern gegen den Analyten unter Bildung eines Komplexes aus markiertem Antikörper, Analyten und immobilisiertem Antikörper, der aus dem Inkubationsmedium abgetrennt wird, beinhaltet.
- Das US-Patent Nr. 4,244,940, ausgegeben an Jeong et al. am 13. Januar 1981, beschreibt einen Zwei-Zentren-Immunoassay, bei dem die den Analyten enthaltende Probe, ein markierter Rezeptor für den Analyten und ein an einen Festphasenträger gebundener unmarkierter Rezeptor in einem wäßrigen Medium miteinander inkubiert werden, so daß eine im wesentlichen stabile Suspension entsteht. Die feste und die flüssige Phase werden voneinander getrennt, und jede Phase wird auf den markierten Rezeptor hin analysiert, dessen Konzentration eine Funktion der Konzentration von Ligand in der Probe ist.
- GB-A-2 190 490 A, veröffentlicht am 18. November 1987, beschreibt einen Enzym-Immunoassay, bei dem ein Immunkomplex erhalten wird, indem man das Antigen, einen immobilisierten ersten Antikörper und einen zweiten Antikörper gleichzeitig mit einem enzymmarkierten dritten Antikörper gegen den zweiten Antikörper umsetzt, die feste Phase von der flüssigen Phase trennt und die Menge der in der festen Phase vorhandenen Enzymaktivität mißt.
- Diese Erfindung betrifft
- (1) einen Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer Probe, umfassend:
- Umsetzen eines Abfangreagens, das auf einem suspendierten festen Träger immobilisiert ist, mit dem Analyten und einem Marker, wobei der Marker mit dem Analyten assoziiert ist und entweder selbst photometrisch nachweisbar ist oder ein Enzym ist, das ein photometrisch nachweisbares Produkt zu erzeugen vermag;
- Abtrennen von nicht umgesetztem Analyt von dem auf dem festen Träger immobilisierten Abfangreagens; und
- photometrisches Nachweisen und/oder Quantifizieren eines Signals, das von dem mit dem Analyten assoziierten Marker erzeugt wird, wobei der Nachweis und/oder das Quantifizieren in Gegenwart des suspendierten festen Trägers erfolgt und bei der Messung der Lichtmenge, die von dem mit dem Analyten assoziierten Marker absorbiert wird, wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge, die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom Absorptionsmaximum des Markers abgelesen wird;
- (2) einen Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers, umfassend:
- a) Umsetzen eines Abfangreagens, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, mit einer Probe, die den Analyten ent hält, unter Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Abfangreagens und Analyt;
- b) Inkubieren des immobilisierten Komplexes aus Abfangreagens und Analyt mit einem nachweisbar markierten Reagens;
- c) Abtrennen von nicht umgesetzter Probe und nicht umgesetztem nachweisbar markierten Reagens von dem immobilisierten Komplex aus Abfangreagens und Analyt; und
- d) photometrisches Nachweisen und/oder Quantifizieren des Produkts von Schritt (b), wobei der Nachweis und/oder das Quantifizieren in Gegenwart des suspendierten festen Trägers erfolgt und bei der Messung der Lichtmenge, die von dem mit dem Analyten assoziierten Marker absorbiert wird, wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge, die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom Absorptionsmaximum des Markers abgelesen wird;
- (3) einen Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers, umfassend:
- a) gleichzeitiges Umsetzen eines Abfangreagens, das auf dem suspendierten festen Träger immobilisiert ist, mit einer Probe, die den Analyten und ein nachweisbar markiertes Reagens enthält, wobei sowohl das Abfangreagens als auch das nachweisbar markierte Reagens spezifisch an den Analyten binden, so daß ein Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar markiertem Reagens entsteht, wobei der nachweisbare Marker entweder selbst photometrisch nachweisbar ist oder (ii) ein Enzym ist, das in Gegenwart eines für das Enzym spezifischen Substrats ein photometrisch nachweisbares Produkt erzeugt;
- b) Abtrennen von nicht umgesetzter Probe und/oder nicht umgesetztem nachweisbar markierten Reagens von dem immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar markiertem Reagens;
- c) Messen der Lichtmenge, die (i) von dem immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar markiertem Reagens, wenn der nachweisbare Marker selbst photometrisch nachweisbar ist, oder (ii) von dem photometrisch nachweisbaren Produkt, das bei der Zugabe von Substrat entsteht, wenn der nachweisbare Marker ein Enzym ist, absorbiert wird, wobei bei der Messung wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge, die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts abgelesen wird, wobei die Messung weiterhin in Gegenwart des suspendierten festen Trägers erfolgt; und
- d) Korrelieren der in Schritt (c) erhaltenen Messungen mit der Menge und/oder der Anwesenheit des Analyten, wobei der Wert, den man erhält, wenn man die Ablesung bei der zweiten Referenzwellenlänge von der Ablesung bei der ersten Referenzwellenlänge subtrahiert, proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe ist; sowie
- (4) einen Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum Quantifizieren eines. Analyten in einer Probe in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers, umfassend:
- a) Inkubieren der Probe, die den Analyten enthält, mit einem nachweisbar markierten Reagens, das spezifisch an den Analyten bindet, so daß ein Komplex aus Analyt und nachweisbar markiertem Reagens entsteht, wobei der nachweisbare Marker entweder (i) selbst photometrisch nachweisbar ist oder (ii) ein Enzym ist, das in Gegenwart eines für das Enzym spezifischen Substrats ein photometrisch nachweisbares Produkt erzeugt;
- b) Umsetzen des Komplexes aus Analyt und nachweisbar markiertem Reagens mit einem Abfangreagens, das auf dem suspendierten festen Träger immobilisiert ist, wobei das Abfangreagens spezifisch an den Analyten bindet;
- c) Abtrennen von nicht gebundener Probe und/oder nachweisbar markiertem Reagens von dem immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar markiertem Reagens;
- d) Messen der Lichtmenge, die (i) von dem immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar markiertem Reagens, wenn der nachweisbare Marker selbst photometrisch nachweisbar ist, oder (ii) von dem photometrisch nachweisbaren Produkt, das bei der Zugabe von Substrat entsteht, wenn der nachweisbare Marker ein Enzym ist, absorbiert wird, wobei bei der Messung wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge, die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts abgelesen wird, wobei die Messung weiterhin in Gegenwart des suspendierten festen Trägers erfolgt; und
- e) Korrelieren der in Schritt (d) erhaltenen Messungen mit der Menge und/oder der Anwesenheit des Analyten, wobei der Wert, den man erhält, wenn man die Ablesung bei der zweiten Referenzwellenlänge von der Ablesung bei der er sten Referenzwellenlänge subtrahiert, proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe ist.
- Fig. 1 zeigt das Absorptionsspektrum von Chromdioxidteilchen in Puffer sowie von CPRG und CPR in Gegenwart von Chromdioxidteilchen.
- Der hier verwendete Ausdruck "photometrisch nachweisen und/oder quantifizieren" bedeutet das Messen der von der Lösung, die das nachweisbar markierte Reagens enthält, absorbierten Lichtmenge unter Verwendung von wenigstens zwei verschiedenen Wellenlängen.
- Der Assay dieser Erfindung ermöglicht es, die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers photometrisch nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, da der photometrische Nachweis es ermöglicht, den photometrischen Beitrag der festen Phase auszugleichen. Je nach dem Typ des durchgeführten Assays kann das Signal, das von dem mit dem Analyten assoziierten Marker erzeugt wird, direkt proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen Analyten oder umgekehrt proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen Analyten sein. "Assoziiert mit" bedeutet, daß das vom Marker erzeugte Signal mathematisch entweder direkt oder indirekt mit der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten korreliert werden kann. Die Assoziation zwischen Analyt und Marker braucht nicht notwendigerweise eine direkte physikalische Assoziation zu sein.
- In der Praxis wird der Assay dieser Erfindung vorzugsweise durchgeführt, indem man photometrisch bei wenigstens zwei verschiedenen Wellenlängen, d. h. wenigstens bichromatisch, nach weist. Dieser Ansatz vereinfacht den Assayvorgang und stellt ein unkompliziertes Mittel bereit, um Assays, wie Immunoassays, auf automatische klinische Analysegeräte, wie aca® Discrete Clinical Analyzer (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE) und Dimension®, anzuwenden.
- Der Assay dieser Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Format oder einen bestimmten Analyten beschränkt. Er kann verwendet werden, um Immunoassays sowie Assays mit Nucleinsäuresonden durchzuführen.
- Der Assay dieser Erfindung betrifft also einen Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer Probe, der das photometrische Nachweisen und/oder Quantifizieren eines Signals, das von einem mit dem Analyten assoziierten Marker erzeugt wird, umfaßt, wobei der Nachweis in Gegenwart eines suspendierten festen Trägers erfolgt.
- Zu den suspendierten festen Phasen, die zur praktischen Durchführung, der Erfindung verwendet werden können, gehören beschichtete Chromdioxidteilchen, Eisenoxidteilchen, Latexteilchen und Teilchen auf der Basis von Polysaccharidharz. Die bevorzugte feste Phase ist ein beschichtetes Chromdioxidteilchen, wie es im US-Patent Nr. 4, 661, 408, ausgegeben an Lau et al. am 28. April 1987, beschrieben ist.
- Diese Chromdioxidteilchen sind ausreichend hydrolysestabil, um als feste Träger in heterogenen Immunoassays und Bioaffinitätstrennungen geeignet zu sein. Der Kern der Teilchen ist azikuläres Rutil-Chromdioxid mit einer spezifischen Oberfläche von 5-100 m²/g, einer Koerzivität von 100-750 Oersted, einer bleibenden Magnetisierung von 5-45 emu/g und einer Sättigungsmagnetisierung von 8-85 emu/g. Diese Teilchen sind oberflächenstabilisiert und weiterhin mit einer Beschichtung von SiO&sub2; stabilisiert. Dann wird das siliciumoxidbeschichtete Chromdi oxid weiter mit einem Silan beschichtet, sowohl, um das Teilchen weiter zu stabilisieren, als auch, um Bindungsstellen für Proteine bereitzustellen.
- Der Assay der Erfindung kann verwendet werden, um die Anwesenheit irgendeines Analyten nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Erwähnt seien Glycopeptidhormone, wie Thyreotropin (TSH), Human-Chorion-Gonadotropin (hCG), carcinoembryonisches Antigen (CEA), α-Fetoprotein (AFP) und Kreatin-Kinase-MB (CKMB).
- Das Abfangreagens kann ein Partner eines spezifischen Bindungspaars des Immun- oder Nichtimmuntyps sein. Beispiele für spezifische Bindungspaare des Immuntyps sind Antigen/Antikörper-Systeme oder Hapten-Antihapten-Systeme. Wenn ein Antikörper verwendet wird, kann er polyklonal, monoklonal oder ein immunreaktives Fragment davon sein und kann nach üblichen Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig sind.
- Die Ausdrücke "immunreaktives Antikörperfragment" oder "immunreaktives Fragment" bedeuten Fragmente, die den bindenden Bereich des Antikörpers enthalten. Solche Fragmente können Fragmente des Fab-Typs sein, die als Fragmente definiert sind, denen der Fc-Teil fehlt, z. B. Fab-, Fab'- und F(ab')&sub2;-Fragmente, oder es können sogenannte "Halbmolekül"-Fragmente sein, die man durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen erhält, die die schweren Ketten als Komponenten des intakten Antikörpers miteinander verbinden. Wenn der Antigenpartner des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z. B. ein Hapten, kann er kovalent an ein Trägerprotein gekuppelt werden, um ihn immunogen zu machen. Solche Fragmente können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
- Zu den Bindungspaaren des Nichtimmuntyps gehören Systeme, bei denen die beiden Komponenten eine natürliche Affinität zuein ander haben, aber keine Antikörper sind. Beispiele für Bindungspaare des Nichtimmuntyps sind Biotin/Streptavidin, Folsäure/folatbindendes Protein und komplementäre Sondennucleinsäuren.
- Das Abfangreagens kann unter Verwendung irgendeines herkömmlichen Mittels, das dem Fachmann bekannt ist, wie Adsorption und kovalente Bindung, auf der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert werden.
- Die Bildung eines immobilisierten Komplexes aus Abfangreagens und Analyt wird mit Hilfe eines nachweisbar markierten Reagens nachgewiesen und/oder quantifiziert. Zum Beispiel kann der nachweisbare Marker ein Enzym sein, dessen Produkt photometrisch nachgewiesen werden kann. Beispiele für solche Enzyme sind β-Galactosidase, Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase usw. Weitere Beispiele findet man bei Ishikawa et al., Clin. Chem. Acta, 194: 51-74 (1990).
- Der nachweisbare Marker wird unter Verwendung üblicher Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, an einen Partner eines spezifischen Bindungspaars des Immun- oder Nichtimmuntyps gekuppelt.
- In einer weiteren Ausführungsform kann eine Enzymverstärkungskaskade, wie sie in WO 90/01559, veröffentlicht am 22. Februar 1990, beschrieben ist, verwendet werden, um den Nachweis und die Quantifizierung zu erleichtern. Der dort beschriebene Verstärkungsassay für Hydrolase-Enzyme ist eine hochgradig empfindliche Enzymverstärkungskaskade auf der Basis von Flavinadenindinucleotid-3'-phosphat (FADP), die für die Bestimmung von Alkalischer Phosphatase (ALP) entwickelt wurde. Die Kaskade weist ALP über die Dephosphorylierung des Substrats FADP unter Bildung des Cofaktors FAD nach, der stöchiometrisch an inaktive Apo-D-Aminosäure-Oxidase (D-AAO) bindet. Die resultierende aktive Holo-D-AAO oxidiert D-Prolin unter Bildung von Wasserstoffperoxid, das über die HRP-vermittelte Umwandlung von 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure (DCHBS) und 4- Aminoantipyrin (AAP) in ein farbiges Produkt quantifiziert wird.
- Insbesondere dephosphoryliert ALP, das Reporterenzym, FADP unter Bildung von FAD, der prosthetischen Gruppe für D-AAO. Sowohl die Signal-Rausch-Verhältnisse als auch die Empfindlichkeit werden durch die Verstärkungseigenschaften der Kaskade erhöht, bei der ein einziges Molekül ALP viele FAD-Moleküle erzeugt. Diese FAD-Moleküle binden wiederum an eine äquivalente Anzahl von Apo-D-AAO-Molekülen, wobei sie in aktive Holo-D- AAO-Moleküle umgewandelt werden. Jedes Molekül Holo-D-AAO erzeugt dann mehrere Moleküle Wasserstoffperoxid, die DCHBS und AAP in ein farbiges Produkt umwandeln. Das endgültige Signal ergibt sich also aus einer multiplikativen zweistufigen Vermehrung der ursprünglichen Zahl der ALP-Moleküle. Das Schema kann auch leicht so verallgemeinert werden, daß andere Hydrolase-Enzyme, Apoenzyme und Nachweisenzymsysteme einschließlich eines Schlußsubstrat-Cyclisierungssystems eingebaut werden, um eine noch größere Empfindlichkeit zu erhalten.
- Vorzugsweise werden die Nachweisempfindlichkeit und Assaypräzision durch Ausgleich des photometrischen Beitrags der festen Phase erhöht, indem man das Signal bei wenigstens zwei verschiedenen Wellenlängen aufzeichnet, einer auf dem Absorptionsmaximum des Produkts oder in dessen Nähe, und einer zweiten Wellenlänge, der Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom Absorptionsmaximum des Produkts abgelesen wird. Der Wert, den man erhält, wenn man die Ablesung bei der Referenzwellenlänge von der Ablesung bei der Maximumwellenlänge subtrahiert, ist proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe, d. h. bichromatischer Nachweis.
- Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
- Bei allen unten besprochenen Beispielen wurde ein aca® Discrete Clinical Analyzer (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE 19898) verwendet. Ein Beispiel für einen aca® ist im US-Patent Nr. 4,066,412 beschrieben.
- Die Zellinien, die die eingesetzten monoklonalen Antikörper erzeugen, wurden unter Verwendung des Verfahrens erhalten, das im US-Patent Nr. 4,912,033 und in Vaidya et al., Clin. Chem. 32(4): 657-663 (1986), beschrieben ist.
- Sobald die Ascites-Erzeugung beendet ist, können die so erhaltenen monoklonalen Antikörper unter Verwendung einer beliebigen Zahl von Standardtechniken gereinigt werden, wie Ammoniumsulfatfällung, Dialyse, Affinitätschromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie. Diese und andere Verfahren zur Isolierung und Reinigung monoklonaler Antikörper sind allgemein beschrieben in Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London und New York, 1983, und im US-Patent 4,533,496.
- Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung und Isolierung war die Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose® (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Protein A ist ein Polypeptid (MW 42 000), das von Staphylococcus aureus isoliert wird und Immunglobulin bindet, ohne mit der Antigenbindungsstelle in Wechselwirkung zu treten.
- Monoklonaler Anti-CKB-Antikörper, der als auf Chromdioxidteilchen immobilisiertes Abfangreagens verwendet wurde, wie es unten beschrieben ist, wurde so erhalten, wie es oben beschrieben ist. Die Klonnummer war 2581 BH 1.1, und der monoklonale Antikörper gehörte zur Unterklasse IgG&sub1;.
- Der monoklonale Anti-CKMB-Antikörper, der verwendet wurde, um das unten beschriebene immunreaktive Fragment zu erzeugen, wurde so erhalten, wie es oben beschrieben ist. Die Klonnummer war 2580 CC 4.2, und der monoklonale Antikörper gehörte zur Unterklasse IgG2b.
- Gereinigter Protein-A-Antikörper wurde über Nacht bei 4ºC gegen Acetatpuffer (100 mM Natriumacetat, 150 mM Natriumchlorid, pH 3,5) dialysiert. Der dialysierte Antikörper wurde mit Dialysepuffer auf eine Konzentration von 5 mg/ml verdünnt. Die Antikörperlösung wurde 5 bis 10 Minuten lang in ein Wasserbad von 37ºC gebracht.
- Eine Lösung von Pepsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) von 10 mg/ml wurde in Acetatpuffer hergestellt. Die Menge des Pepsins, die erforderlich war, um ein Gewichtsverhältnis von Antikörper zu Pepsin von 50 : 1 zu erhalten, wurde berechnet. Die Antikörperlösung wurde gerührt, während das Pepsin hinzugefügt wurde. Das Gemisch wurde 10-15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde abgebrochen, indem man langsam 3,5 M Tris- Base hinzutropfte, bis der pH-Wert der Lösung im Bereich von 7,0 bis 8,0 lag. Das F(ab')&sub2;-Präparat wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 4-4,5 ml pro Stunde durch 15-20 ml Protein- A-Sepharose® in einer Säule von 2,2 · 25 cm gegeben. Das Proteinmaximum wurde überwacht, indem man die Extinktion der Fraktionen bei 280 nm aufzeichnete. Das Proteinmaximum wurde aufgefangen und auf etwa 30 mg/ml konzentriert, wobei man eine mit einem 62-mm-PM-30-Membranfilter ausgestattete Amicon-Rührzelle verwendete. Sterilisiertes F(ab')&sub2;-Konzentrat wurde filtriert und bei -20ºC aufbewahrt.
- Anti-CKMB-Antikörperfragment, wie es oben beschrieben ist, wurde an β-Galactosidase gekuppelt, wobei im wesentlichen das Verfahren verwendet wurde, wie es in Kitagawa et al., Enzyme labeling with N-hydroxysuccinimidyl ester of maleimide in "Enzyme Immunoassays", Ishikawa et al. (Hrsg.), S. 81-90 (1981), beschrieben ist.
- Das Konjugat wurde wie folgt hergestellt: F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Anti-CKMB-Antikörpers wurde gegen Antikörper-Dialysepuffer (20 mM Phosphatpuffer, 300 mM NaCl, pH 7,0) dialysiert. Ein mol F(ab')&sub2; wurde mit 30 mol SMCC [N-Succinimidyl- 4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat] gemischt und unter ständigem Rühren 35 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde auf eine Sephadex®-G-25-Säule (2,2 · 13 cm) gegeben, die mit einem UV-Detektor (Extinktion 280 nm) ausgestattet war. Aktiviertes F(ab')&sub2;-Fragment wurde mit Antikörper- Dialysepuffer eluiert. Das Proteinmaximum wurde aufgefangen. Das Volumen wurde aufgezeichnet, und die Proteinkonzentration wurde geschätzt. Ein mol E.-coli-β-Galactosidase [äquivalent zu SMCC-aktiviertem F(ab')&sub2;], die von Boehringer Mannheim bezogen wurde, wurde in Antikörper-Dialysepuffer gelöst. Aktiviertes F(ab')&sub2; wurde mit β-Galactosidase gemischt und unter ständigem Rühren wenigstens 25 min bei 25ºC inkubiert. Die Synthese des Konjugats wurde unter Verwendung von LKB-HPLC mit Hilfe einer GF-450-Analysesäule mit einer 100 ul-Probenschleife überwacht. Als sich der führende Peak auf dem Chromatogramm über den zweiten Peak hinaus erstreckte, wurde die Reaktion abgebrochen, indem man für jeden ml Konjugat-Reaktionsgemisch 10 ul 0,1 M N-Ethylmaleinimid-Lösung hinzufügte. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle und eines YM-100- Filters (beide von Amicon) auf 4,0 ml konzentriert. Das Konjugat-Konzentrat wurde durch ein 0,2-um-Spritzenfilter filtriert und unter Verwendung von LKB-HPLC mit Hilfe einer GF-450-Säule mit einer 1 ml-Probenschleife, UV-Monitor, Fraktionssammler und Bandschreiber gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden aufgefangen und vereinigt, und die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen, um die Proteinkonzentration abzuschätzen. Das resultierende Konzentrat wurde filtriert, sterilisiert und bei 4ºC aufbewahrt. Das Konjugatkonzentrat wurde für den CKMB-Assay nach Bedarf in β-Galactosidase- Konjugat-Verdünnungspuffer (33,5 g PIPES (Piperazin-N,N'-bis- [2-ethansulfonsäure]), 0,2 g MgCl&sub2;, 29,2 g NaCl, 100 g Rinderserumalbumin und 0,167 g Maus-IgG pro Liter entionisiertes Wasser, pH 7,0) verdünnt.
- Anti-CKB-Antikörper wurde im wesentlichen nach dem von Birkmeyer et al. beschriebenen Verfahren (Birkmeyer et al., Application of novel chromium dioxide magnetic particles to immunoassay development, Clin. Chem. 33, 1543-1547, 1987) auf Chromdioxidteilchen immobilisiert.
- 4 Liter Kupplungspuffer wurden hergestellt, indem man 196 ml 10 mM KH&sub2;PO&sub4; (Dihydrogenphosphat) und 204 ml 10 mM K&sub2;HPO&sub4; (Monohydrogenphosphat) miteinander mischte und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 4 Liter erhöhte. Der pH-Wert würde auf 7,0 eingestellt. Monoklonaler Anti-CKB-Antikörper (2581 BH 1.1) wurde über Nacht gegen Kupplungspuffer dialysiert, der dann gewechselt wurde, und die Dialyse wurde noch vier Stunden lang fortgesetzt. Das Volumen des dialysierten Antikörpers wurde gemessen, und die Proteinkonzentration wurde abgeschätzt. Die Antikörperlösung wurde mit dem Kupplungspuffer auf 2 mg/ml verdünnt. Gleiche Volumina verdünnter Antikörper (2 mg/ml) und 5%ige Suspension von mit Glutaraldehyd aktivierten Chromdioxidteilchen wurden in einem Gewebekulturkolben miteinander gemischt. (Das endgültige Reaktionsvolumen betrug bei diesem Experiment 200 ml.) Man ließ das Gemisch über Nacht bei 4ºC sich vermischen. Man ließ die Teilchen 60 Minuten lang sich abtrennen, indem man den Gewebekulturkolben bei Raumtemperatur auf eine Magnetplatte stellte. Der Überstand wurde entfernt, und ein Aliquot wurde aufbewahrt, um die Menge des an die Teilchen gebundenen Antikörpers abzuschätzen. Mehr als 98% des Antikörpers waren unter diesen Bedingungen an die Teilchen gebunden. Die Reaktion wurde mit 200 ml Stopplösung (2,0 M Glycinpuffer) abgebrochen, und man ließ das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur schaukeln. Die Teilchen wurden 30 Minuten lang auf einer Magnetplatte abgetrennt. Der Überstand wurde entfernt und dann in einem Gewebekulturkolben 10mal mit 150 ml Waschpuffer (10 mM Kaliumphosphatpuffer, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,4) gewaschen. Der Überstand aus dem letzten Waschvorgang wurde verworfen. 200 ml Aufbewahrungspuffer (10 mM Kaliumphosphatpuffer, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,01% Thimerosal, pH 7,4) wurden zu der Teilchensuspension gegeben, die bei 4ºC aufbewahrt wurde. Zehn ul der Teilchensuspension enthielten 10 ug Anti-CKB-Antikörper und 250 ug Chromdioxid.
- Bei dem hier für einen automatischen Immunoassay beschriebenen Immunoassay für CKMB wurde β-Galactosidase als Reporterenzym, d. h. nachweisbarer Marker, verwendet. Die β-Galactosidase- Aktivität wurde unter Verwendung von Chlorphenolrotgalactosid (CPRG) als Substrat gemessen, wobei das Enzym mit CPRG unter Bildung von Chlorphenolrot (CPR) reagierte.
- Pro Assay wurden 3 mg CPRG verwendet. Die maximale Extinktion von CPRG war bei 412 nm.
- CPR hat andererseits eine maximale Extinktion bei 577 nm. Die Menge des vom Enzym gebildeten CPR beträgt weniger als 1% des CPRG. Fig. 1 zeigt das Absorptionsspektrum von Chromdioxid teilchen in Puffer und außerdem von CPRG und CPR in Gegenwart von Chromdioxidteilchen.
- Es wurde gefunden, daß eine bichromatische Endpunktsmessung gute, reproduzierbare Messungen ergab. Die ausgewählte primäre Wellenlänge betrug 577 nm, da CPR bei dieser Wellenlänge maximal absorbiert. Die Verwendung einer Wellenlänge von 600 nm als Blindwert ergab befriedigende Ergebnisse. Es wurde bestimmt, daß ein 620-nm-Filter benötigt wurde, um mit dem Nachweissystem die besten Ergebnisse zu erzielen. Kleinere Wellenlängen, wie 510 und 540 nm, können ebenfalls verwendet werden, aber diese fallen auf die absteigende Flanke des CPRG-Peaks und können daher empfindlich gegenüber einer Variation der CPRG-Konzentration sein.
- Das bevorzugte Meßsystem sollte also das Produkt der β-Galactosidase-Aktivität bei der primären Wellenlänge von 577 nm und einer sekundären Wellenlänge von 600 nm oder darüber messen. Die Subtraktion der bei der sekundären Wellenlänge erhaltenen Ablesung von der bei der primären Wellenlänge erhaltenen Ablesung erlaubte eine präzise Messung der Enzymaktivität.
- 1. CKMB-Eichlösungen: 0, 12,5, 25, 50, 100 und 200 ng Hunde- CKMB pro ml oder 0, 13,8, 32, 64 und 128 ng Human-CKMB pro ml. Gereinigtes Human- oder Hunde-CKMB (Aalto Scientific Ltd., Vista, CA) wurde zu einem CKMB-freien Human-Serumpool gegeben.
- 2. Anti-CKB-Chromdioxidteilchen wurden so hergestellt, wie es oben beschrieben ist.
- 3. Anti-CKMB-F(ab')&sub2;-β-Galactosidase-Konjugat-Konzentrat wurde so hergestellt, wie es oben beschrieben ist.
- 4. Konjugat-Verdünnungspuffer enthielt 100 g Rinderserumalbumin. 33,5 g Natrium-PIPES, 29,2 g Natriumchlorid und 0,2 g Magnesiumchlorid pro Liter entionisiertem Wasser, pH 7,0.
- 5. Waschpuffer bestand aus 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, pH 7,85.
- 6. Resuspensionspuffer bestand aus 0,03 M HEPES, 0,02 M Natrium-HEPES, 0,01 M Magnesiumacetat und 0,005% Tween® 20, pH 7,6.
- 7. Eine CPRG-Tablette, die 3 mg Chlorphenolrotgalactosid, 8,75 mg Trehalose, 30 mg Mannit und 3,15 mg Carbowax enthielt (20 um), wurde im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt, das im US-Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde.
- 8. Eine HEPES-Tablette (HEPES = N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'- (2-ethansulfonsäure)), die 40,4 mg Natrium-HEPES, 22,8 mg HEPES, 7,0 mg Sorbit, 1,15 mg Magnesiumacetat und 4,0 mg Carbowax enthielt (20 um), wurde im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt, das im US-Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde.
- Zehn ug Anti-CKB-Antikörper, die auf Chromdioxidteilchen aufgetragen wurden, wie es oben beschrieben ist, wurden zusammen mit 300 ul geeignet verdünntem Konjugat in ein Reagenzglas gegeben. In das Glas wurden 300 ul Probe oder Eichlösung gegeben, das dann verwirbelt und 15 min lang in ein Wasserbad von 37ºC gestellt und alle 2 min gemischt wurde. Nach der Inkubationszeit wurden die Teilchen abgetrennt, indem man die Reagenzgläser in einen Corning-Magnet-Reagenzglasständer stellte. Der Überstand wurde abgesaugt, und dann wurden 500 ul Waschpuffer hinzugefügt, und die Teilchen wurden resuspendiert. Dieser Schritt wurde 3mal wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt wurden 75 ul Resuspensionspuffer hinzugefügt, und die Teilchen wurden erneut resuspendiert. 60 ul Teilchensuspension wurden in einen Pack gegeben.
- Die an die Teilchen gebundene β-Galactosidase-Aktivität wurde mit dem aca® (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE 19898) gemessen. aca®-CPRG-Packs (Standard-aca®-Discrete- Clinical-Analyzer-Packs, erhältlich von E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE) zur Verwendung mit dem aca® Discrete Clinical Analyzer enthielten eine HEPES-Tablette in Grübchen 2 und eine CPRG-Tablette in Grübchen 3, wobei sich Grübchen 2 und 3 auf Tablettenaufbewahrungsbereiche in einem Standard-aca®-Discrete-Clinical-Analyzer-Pack beziehen, eine CPRG-Tablette 3 mg Chlorphenolrotgalactosid, 8,75 mg Trehalose, 30 mg Mannit und 3,15 mg Carbowax enthält (20 um) und im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt wurde, das im US- Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde, und eine HEPES-Tablette 40,4 mg Natrium-HEPES, 22,8 mg HEPES, 7,0 mg Sorbit, 1,15 mg Magnesiumacetat und 4,0 mg Carbowax enthält (20 um) und unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardtablettierverfahren hergestellt wurde.
- Dann wurden die Packs mit Cellophanband verschlossen, und die an die Teilchen gebundene β-Galactosidase-Aktivität wurde wie folgt mit dem aca® Discrete Clinical Analyzer gemessen. Sobald der Pack auf den aca® aufgegeben worden war, wurden 2 ml Phosphatpuffer, pH 7,8, und 3 ml Wasser in den Pack gegeben. Der Brecher/Mischer 1 (eine Komponente des aca® Discrete Clinical Analyzer, die Tablettenreagentien bricht und das Mischen der Reagentien erleichtert) wurde verwendet, um die HEPES- und die CPRG-Tablette aufzulösen und die Teilchen zu suspendieren. Gebundenes Enzym reagierte bei 37ºC mit CPRG unter Bildung von CPR. Nach 4,2 min wurde das gebildete CPR bei den Wellenlängen 577 und 600 nm gemessen. 577 nm war die primäre Wellenlänge, bei der das CPR eine maximale Extinktion hat, und 600 nm war die Blindwertwellenlänge. Die Ablesung bei 600 nm wurde von der Ablesung bei 577 nm subtrahiert, um eine Störung durch suspendierte Teilchen auszuschalten. Die Ablesung von 577 nm minus 600 nm, die bei aca® die Endpunktablesung genannt wird, wurde gegen die Flaschenwerte der CKMB-Eichlösungen aufgetragen, um eine Standardkurve zu erzeugen.
- CKMB-Standardkurven wurden unter Verwendung von Eichlösungen mit Hunde-CKMB (Tabelle 1) und Human-CKMB (Tabelle 2) erzeugt. Der Assay wurde so durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Die endgültige Extinktion wurde unter Verwendung des aca® bei Wellenlängen von 577 und 600 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Tabelle 1 Daten für CKMB-Standardkurve unter Verwendung von Hunde-CKMB Tabelle 2 Daten für CKMB-Standardkurve unter Verwendung von Human-CKMB
- Die Genauigkeit innerhalb eines Durchlaufs und die analytische Empfindlichkeit des CKMB-Assays wurden ermittelt, indem man Kontrollmaterialien mit drei Konzentrationen analysierte. Die Empfindlichkeit des CKMB-Assays wurde als zwei Standardabweichungen des Kontrollmaterials mit einer Nullablesung definiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Genauigkeit innerhalb eines Durchlaufs und Empfindlichkeit des CKMB-Assays
- Der bei der Herstellung des Detektorantikörperfragment-Konjugats verwendete monoklonale Anti-hCG-Antikörper (Hybritech 514) wurde von Hybritech Inc., P. O. Box 269006, San Diego, CA 92126, bezogen. Dieser Antikörper war ein β-Ketten-spezifischer monoklonaler Antikörper mit einer Affinität von 3 · 10&supmin;¹&sup0; M
- Es kann jedoch jeder monoklonale Anti-hCG-Antikörper mit ausreichender Affinität zur Verwendung in einem Immunoassayformat verwendet werden, und solche Antikörper können mit Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, z. B. Kohler und Milstein, Nature, 256: 495-497 (7. August 1975). Das F(ab')&sub2;-Fragment und das F(ab')&sub2;-β-galactosidase-Konjugat wurden so hergestellt, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Eine Lösung von konzentriertem Konjugat, die so hergestellt wurde, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde mit einem Volumen des β-Galactosidase-Konjugat-Verdünnungspuffers (der 100 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl, 10% (w/v) Rinderserumalbumin und 167 ug/ml Protein-A-gereinigtes Maus-IgG enthielt, pH 7,0) auf eine Endkonzentration von 4 · 10&supmin;&sup9; M β-Galactosidase verdünnt.
- Chromdioxidteilchen wurden im wesentlichen so hergestellt, wie es im US-Patent Nr. 4,661,408 beschrieben ist, das am 28. April 1987 an Lau et al. ausgegeben wurde. Der als Abfanganti körper verwendete Anti-hCG-Antikörper (DuPont-Zellinie 34/25) wurde unter Verwendung des hCG-Vollmoleküls als Immunogen und mit herkömmlichen Techniken, die auf dem Gebiet der Herstellung monoklonaler Antikörper bekannt sind, hergestellt. Siehe den oben genannten Artikel von Kohler und Milstein. Der verwendete Antikörper war ein α-Ketten-spezifischer monoklonaler Anti-hCG-Antikörper mit einer Affinität von 3 · 10&supmin;¹&sup0; M. Es kann jedoch jeder monoklonale Anti-hCG-Antikörper mit ausreichender Affinität zur Verwendung in einem Immunoassayformat verwendet werden, und solche Antikörper können mit Techniken hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Herstellung monoklonaler Antikörper bekannt sind. Wiederum kann der Immunoassay dieser Erfindung in der Praxis unter Verwendung jedes zur Verwendung in einem Immunoassay geeigneten Antikörpers und/oder immunreaktiven Fragments durchgeführt werden.
- Abfang-Anti-hCG-Antikörper wurde an Chromdioxidteilchen gekuppelt, wie es oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Eine Konzentration von 0,75 mg Anti-hCG-Abfangantikörper pro ml Chromdioxidteilchen wurde zu einer Aufschlämmung von Chromdioxidteilchen mit einem Feststoffgehalt von 25 mg/ml gegeben. Die so erhaltene Aufschlämmung von mit Anti-hCG-Abfangantikörper beschichteten Chromdioxidteilchen wurde zu Tabletten verarbeitet, die 3,0 mg antikörperbeschichtete Chromdioxidteilchen pro Tablette enthielten, wobei 9,83 mg Trehalose, 0,98 mg Carbowax und 0,03 mg Thimerosol als inerte Materialien zugegeben wurden. Die Tabletten wurden im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt, das im US-Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde.
- Die Auswirkung von Chromdioxidteilchen auf die Extinktion von CPRG in aca®-Discrete-Clinical-Analyzer-Packs wurde gemessen.
- Drei Gruppen zu jeweils zehn Röhrchen wurden hergestellt, wobei jede Gruppe (unten als i, ii bzw. iii bezeichnet) folgendes enthielt:
- i) Resuspensionspuffer bestand aus 0,03 M HEPES, 0,02 M Natrium-HEPES, 0,01 M Magnesiumacetat und 0,005% Tween 20, pH 7,6.
- ii) Resuspensionspuffer und mit Anti-hCG-Abfangantikörper beschichtete Chromdioxidteilchen: 5 Chromoxidtabletten mit jeweils 3 mg Chromoxidfeststoffen wurden in 3 ml Wasser gelöst, so daß eine Lösung mit einem Feststoffgehalt von 5 mg/ml entstand. In jedes Röhrchen wurden 75 ul gegeben, die 250 ug Chromoxidfeststoffe enthielten.
- iii) Resuspensionspuffer und mit Anti-hCG-Abfangantikörper beschichtete Chromdioxidteilchen, mit hCG-0-Eichlösung behandelt (Pferdeserum erhalten von Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR 72756).
- Wie oben angegeben, wurden jeweils 75 ul mit Anti-hCG-Abfangantikörper beschichtete Chromdioxidteilchen in 20 Polyethylenröhrchen von 12 mm · 75 mm gegeben (Gruppen ii und iii). In 10 Röhrchen wurden jeweils 400 ul in geeigneter Weise verdünntes F(ab')&sub2;-β-Galactosidase-Konjugat-Reagens (Konjugat von β-Galactosidase-Marker und Antikörper, verdünnt mit Konjugatverdünnungspuffer, der 100 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl, 10% (w/v) Rinderserumalbumin und 167 ug/ml Protein-A-gereinigtes Maus-IgG enthielt, pH 7,0) gegeben (Gruppe iii). In Gruppe iii wurden in jedes Röhrchen 100 ul hCG-0-Eichlösung gegeben. Der Inhalt jedes der Röhrchen wurde durch Verwirbeln gemischt und 15 Minuten in einen Heizblock von 37ºC gestellt. Nach 15 Minuten wurden die Teilchen abgetrennt, indem man die Röhrchen in einen Magnet-Reagenzglasständer stellte, so daß die Teilchen magnetisch gegen die Seiten des Röhrchens gehalten wurden. Der Überstand jedes Röhrchens wurde abgesaugt, 500 ul Waschpuffer (250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, pH 7,85) wurden zu jedem Röhrchen gegeben, und die Teilchen wurden durch Verwirbeln resuspendiert. Der Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem letzten Waschvorgang wurden 75 ul Resuspensionspuffer (0,03 M HEPES, 0,02 M Natrium-HEPES, 0,01 M Magnesiumacetat und 0,005% Tween® 20, pH 7,6) hinzugefügt, und die Teilchen wurden durch Verwirbeln resuspendiert.
- Von allen Röhrchen in den Gruppen i, ii und iii wurden 60 ul in Grübchen 1 von aca®-CPRG-Packs (Standard-aca®-Discrete- Clinical-Analyzer-Packs, erhältlich von E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, zur Verwendung mit dem aca® Discrete Clinical Analyzer) gegeben, die eine HEPES-Tablette in Grübchen 2 und eine CPRG-Tablette in Grübchen 3 enthielten, wobei sich Grübchen 2 und 3 auf Tablettenaufbewahrungsbereiche in einem Standard-aca®-Discrete-Clinical-Analyzer-Pack beziehen, eine CPRG-Tablette 3 mg Chlorphenolrotgalactosid, 8,75 mg Trehalose, 30 mg Mannit und 3,15 mg Carbowax® enthält (20 um) (im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt, das im US-Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde), und eine HEPES-Tablette 40,4 mg Natrium-HEPES, 22,8 mg HEPES, 7,0 mg Sorbit, 1,15 mg Magnesiumacetat und 4,0 mg Carbowax® enthält (20 um) und unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardtablettierverfahren hergestellt wurde. Dann wurden die Packs mit Cellophanband verschlossen, und die an die Teilchen gebundene β-Galactosidase- Aktivität wurde wie folgt mit dem aca® Discrete Clinical Analyzer gemessen. Sobald der Pack auf den aca® aufgegeben worden war, wurden 2 ml Phosphatpuffer, pH 7,8, und 3 ml Wasser in den Pack gegeben. Der Brecher/Mischer 1 (eine Komponente des aca® Discrete Clinical Analyzer, die Tablettenreagentien bricht und das Mischen der Reagentien erleichtert) wurde verwendet, um die HEPES- und die CPRG-Tablette aufzulösen und die Teilchen zu suspendieren. Gebundenes β-Galactosidase-Enzym reagierte bei 37ºC mit CPRG unter Bildung von Chlorphenolrot (CPR). Nach 4,2 Minuten wurde das gebildete CPR bei den Wellenlängen 577 und 600 nm gemessen. 577 nm ist die primäre Wellenlänge, bei der das CPR eine maximale Extinktion hat, und 600 nm ist die Blindwertwellenlänge. Die Ablesung bei 600 nm wurde von der Ablesung bei 577 nm subtrahiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Auswirkung der Gegenwart von suspendierten Chromdioxidteilchen in einem aca®-Discrete-Clinical-Analyzer-Pack auf die Extinktion von Chlorphenolrotgalactosid (CPRG)
- * + zeigt die Anwesenheit von Chromdioxidteilchen an
- - zeigt die Abwesenheit von Chromdioxidteilchen an
- Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen keinen wesentlichen Unterschied zwischen den bichromatischen Endpunktsablesungen (Messung der Extinktion bei 577 nm minus Messung bei 600 nm), die in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von suspendierten Chromdioxidteilchen erhalten wurden.
- Die Präzision, Meßunsicherheit, Kurvenform und der Meßbereich des Immunoassayformats der vorliegenden Erfindung bei Anwendung auf den Analyten hCG wurden so bewertet, wie es unten beschrieben ist.
- Jeweils 75 ul Chromdioxidteilchenlösung, die 250 ug Chromfeststoffe sowie Anti-hCG-Abfangantikörper enthielt, wurden in 15 Polyethylenröhrchen von 12 mm · 75 mm gegeben. In 10 Röhrchen wurden jeweils 400 ul in geeigneter Weise verdünntes β-Galactosidase-Marker-Antikörper-Konjugat (4 · 10&supmin;&sup9; M Konjugat von β- Galactosidase-Marker und Antikörper, verdünnt mit Konjugatverdünnungspuffer, der 100 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl, 10% (w/v) Rinderserumalbumin und 167 ug/ml Protein-A-gereinigtes Maus-IgG enthielt, pH 7,0) gegeben. Von einer Reihe von hCG- Eichlösungen (0, 25, 100, 300 und 500 mIE/ml Human-hCG pro ml; hCG wurde aus dem Urin schwangerer Frauen gereinigt und gemäß der ist International Reference Preparation [first IRP] der World Health Organization standardisiert) wurden jeweils 100 ul in eine Reihe von Röhrchen gegeben (für jede Eichlösungskonzentration wurden zwei gleiche Röhrchen präpariert); deren Inhalt wurde dann durch Verwirbeln gemischt und 15 Minuten in einen Heizblock von 37ºC gestellt. Nach 15 Minuten wurden die Teilchen abgetrennt, indem man die Röhrchen in einen Magnet-Reagenzglasständer stellte, so daß die Teilchen magnetisch gegen die Seiten und den Boden des Röhrchens gehalten wurden. Der Überstand jedes Röhrchens wurde abgesaugt, 500 ul Waschpuffer (250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, pH 7,85) wurden zu jedem Röhrchen gegeben, und die Teilchen wurden durch Verwirbeln resuspendiert. Der Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem letzten Waschvorgang wurden 75 ul Resuspensionspuffer (0,03 M HEPES, 0,02 M Natrium-HEPES, 0,01 M Magnesiumacetat und 0,005% Tween® 20, pH 7,6) hinzugefügt, und die Teilchen wurden durch Verwirbeln resuspendiert.
- Von jedem Röhrchen wurden 60 ul in Grübchen 1 von aca®-CPRG- Packs (Standard-aca®-Discrete-Clinical-Analyzer-Packs, erhältlich von E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, zur Verwendung mit dem aca® Discrete Clinical Analyzer) gegeben, die eine HEPES-Tablette in Grübchen 2 und eine CPRG-Tablette in Grübchen 3 enthielten, wobei sich Grübchen 2 und 3 auf Tablettenaufbewahrungsbereiche in einem Standard-aca®-Discrete-Clini cal-Analyzer-Pack beziehen, eine CPRG-Tablette 3 mg Chlorphenolrotgalactosid, 8,75 mg Trehalose, 30 mg Mannit und 3,15 mg Carbowax® enthält (20 um) und im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt wird, das im US-Patent Nr. 3,932,943 offenbart ist, das am 20. Januar 1976 an Briggs et al. ausgegeben wurde, und eine HEPES-Tablette 40,4 mg Natrium-HEPES, 22,8 mg HEPES, 7,0 mg Sorbit, 1,15 mg Magnesiumacetat und 4,0 mg Carbowax® enthält (20 Mm) und unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardtablettierverfahren hergestellt wurde. Die Packs wurden mit Cellophanband verschlossen, und die an die Teilchen gebundene β-Galactosidase-Aktivität wurde mit dem aca® gemessen. Die Messungen werden mit dem aca® so erhalten, wie es oben in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Messung bei 577 nm minus der Messung bei 600 nm, genannt die bichromatische Ablesung auf dem aca®, wurde gegen die Konzentration der hCG-Eichlösungen aufgetragen, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 hCG-Immunoassay-Standardkurve
- Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß eine Standardkurve in einem Immunoassay für hCG über einen Bereich von 0-500 mIE/ml in Gegenwart von suspendierten Chromdioxidteilchen erzeugt werden kann, und weiterhin, daß die Präzision einer bichromatischen Ablesung (Messung bei 577 nm minus Messung bei 699 nm) erheblich besser war als die mit einer monochromatischen Ablesung erhaltene.
- Die Präzision, Empfindlichkeit, Standardkurve und der Meßbereich des Immunoassayformats der vorliegenden Erfindung bei Anwendung auf den Analyten TSH wurden so bewertet, wie es unten beschrieben ist.
- Anti-TSH-F(ab')&sub2;-Antikörperfragmente wurden aus einem monoklonalen Anti-TSH-IgG-Antikörper hergestellt, der von der als 972.2 identifizierten Hybritech-Hybridomzellinie erhalten worden war. IgG wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose-CL-4B-Säule (Pharmacia Co.) aus von der Zellinie stammender Ascitesflüssigkeit isoliert. IgG wurde mit Natriumacetatpuffer, pH 3,0, von der Säule eluiert und dann gegen 10 mM Natriumphosphat und 300 mM Natriumchloridlösung, pH 7,0, dialysiert. Dann wurde die isolierte IgG-Lösung 65 Minuten bei 37ºC mit Pepsin im Stoffmengenverhältnis von 50 : 1 abgebaut. Anti-TSH-F(ab')&sub2;-Antikörperfragmente wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose®-CL-4B-Säule (Pharmacia Co.) aus der resultierenden Lösung isoliert. Die Anti-TSH-F(ab')&sub2;-Antikörperfragmente wurden mit 1 M Glycin, 1 M Natriumchlorid, pH 8,6, von der Säule eluiert und dann durch HPLC-Ausschlußsäulenchromatographie unter Verwendung einer GF-250-XL-Säule (DuPont Co.) gereinigt. 1 ml einer Lösung, die 5 mg/ml Anti- TSH-F(ab')&sub2; enthielt, wurde gegen 1000 Volumina 10 mM Natrium phosphat/300 mM NaCl-Puffer, pH 7,0, dialysiert und über Nacht unter ständigem Rühren auf 2-8ºC gehalten. Nach der Dialyse wurde die F(ab')&sub2;-haltige Lösung in ein dunkles Gläschen übergeführt. Dann wurde die Antikörperfragmentlösung mit einem 10fachen molaren Überschuß des Vernetzungsmittels N-Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC; Pierce Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten sachte bei Raumtemperatur schaukeln. Dann wurde das Gemisch auf eine Sephadex®-G-25-Säule (1,0 cm · 30 cm) aufgegeben und mit 10 mM Natriumphosphat/300 mM NaCl-Puffer, pH 6,5, eluiert. Die Fraktionen wurden aufgefangen und vereinigt, was die Maleinimid-funktionalisierte F(ab')&sub2;-Lösung ergab.
- 1 ml einer Stammlösung von Alkalischer Phosphatase mit 10 mg/ml (Boehringer-Mannheim Biochemicals) wurde gegen 1000 Volumina 10 mM Natriumphosphat/300 mM NaCl-Puffer, pH 7,0, dialysiert und über Nacht unter ständigem Rühren auf 2-8ºC gehalten. Nach der Dialyse wurde die Enzymlösung in ein dunkles Gläschen übergeführt, und die Proteinkonzentration wurde durch Hinzufügen von Dialysepuffer zu der Lösung eingestellt. Die endgültige Proteinkonzentration der Enzymlösung wurde auf 5 mg/ml eingestellt. Die Enzymlösung wurde mit einem 15fachen molaren Überschuß von N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA; Calbiochem.) in Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt, um blockierte Thiolgruppen einzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang sachte bei Raumtemperatur geschaukelt, auf eine Sephadex®-G-25-Säule (1,0 · 30 cm) aufgegeben und dann mit 10 mM Natriumphosphat/300 mM NaCl-Puffer, pH 6,5, eluiert. Die Fraktionen wurden aufgefangen und vereinigt, wobei man acetylthiolierte Alkalische Phosphatase erhielt.
- 2,9 ml einer Lösung (1,10 mg/ml) von Maleinimid-funktionalisiertem Anti-TSH-F(ab')&sub2; wurden zu 4,1 ml einer Lösung (1 mg/ml) von acetylthiolierter Alkalischer Phosphatase (AP) gegeben, und es wurde mit 210 ul 1 M Hydroxylamin, pH 7,0, behandelt. Man ließ das Reaktionsgemisch 60 Minuten sachte bei Raumtemperatur schaukeln. Die Konjugationsreaktion wurde durch HPLC unter Verwendung einer GF-450-Ausschlußchromatographiesäule (9,4 cm x 25 cm) (DuPont Co.) überwacht, bis die Reaktion beendet war.
- Die Konjugationsreaktion wurde bei Raumtemperatur durch die Zugabe von 7 ul 0,1 M N-Ethylmaleinimid-Lösung (NEM) abgebrochen. Nach 30 Minuten wurde die rohe Konjugatlösung auf 2 ml konzentriert (unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle, PM-30- Membran).
- Das Konjugat von Anti-TSH-F(ab')&sub2; und Alkalischer Phosphatase wurde durch HPLC unter Verwendung einer GF-450-XL-Ausschlußchromatographiesäule (22,5 mm · 25 cm) gereinigt. Das Konjugat wurde mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Die abfließende Lösung wurde bei 280 nm überwacht. Zwei 1-ml-Injektionen wurden vorgenommen, und die Fraktionen (jeweils 1,0 ml) würden aufgefangen. Fraktionen, die sowohl Immunreaktivität als auch enzymatische Aktivität aufwiesen, wurden vereinigt.
- Das Konjugatkonzentrat wurde auf Extinktion 0,1 bei 280 nm verdünnt.
- Magnetische Chromdioxidteilchen, die gegen TSH spezifischen monoklonalen Maus-Antikörper enthielten, wurden hergestellt.
- Dieser monoklonale Antikörper wurde von der DuPont-Hybridomzellinie 4/46.2 erhalten, die durch Immunisieren von BALB/c- Mäusen mit reinem Voll-TSH nach dem von Freund beschriebenen Verfahren, J. Adv. Tuberc. Res., F: 130-148 (1956), erzeugt wurde. Milz-Lymphocyten wurden unter Verwendung von Standardtechniken erhalten und mit Myelomzellen verschmolzen; Galfre et al., Nature, 266: 550-552 (1976). Das Verfahren von Engvall et al., J. Immunol., 109: 129-135 (1972), wurde verwendet, um die resultierenden Klone zu durchmustern.
- Konjugatverdünnungsmittel wurde so hergestellt, wie es unten beschrieben ist.
- Verdünnungsmittel-Konzentration
- TRIS 1,515 g/l
- Natriumchlorid 29,23 g/l
- Magnesiumchlorid 0,2035 g/l
- Zinkchlorid 0,0135 g/l
- BSA, 30%ige Lösung 41,65 ml/l
- Mannit, 500 ug 25 g/l
- Pferdeserum, wärmebehandelt 750 ml/l
- Tween® 20 0,075 ml/l
- Amphotericin B 0,01 g/l
- 2-Chloracetamid 2,5 g/l
- Gentamycinsulfat 0,1 g/l
- Neomycinsulfat 1 g/l
- Streptomycinsulfat 0,1 g/l
- Probe (0,3 ml) (TSH-Eichlösung; Konzentration 0, 0,5, 5, 30, 50 uIE/ml), Konjugatreagens (0,4 ml) (1/50-Verdünnung von Konjugatkonzentrat in Konjugatverdünnungsmittel) und antikörperbeschichtetes Chromoxid (0,05 ml, 125 ug Chromoxid) wurden 15 Minuten bei 37ºC in Polypropylenröhrchen unter regelmäßigem Verwirbeln inkubiert. Die Teilchen wurden magnetisch abgetrennt und dreimal mit 1,0-ml-Aliquoten Waschpuffer (0,25 M Tris-HCl, pH 7,85, und 50 mM Natriumborat) gewaschen. Nach dem dritten Waschvorgang wurden die Teilchen in 0,06 ml 100 mM Tris-Puffer, pH = 8,8, resuspendiert, und die Inhalte von Röhrchen mit identischen Konzentrationen wurden vereinigt. Dann wurden 50 ul Chromoxid in Grübchen 4 eines aca-Packs gegeben. Die Struktur des Chromoxids ist: Chromoxidteilchen: Antikörper: TSH: F(ab')&sub2;: Alkalische Phosphatase.
- Alle Reagentien für die auf FADP beruhende Kaskade wurden wie folgt in den Pack aufgenommen: FADP war in Grübchen 2 (Brecher/Mischer 1), Apo-D-Aminosäure-Oxidase war in Grübchen 6 (Brecher/Mischer 2), HRP, DCHBS, 4-AAP-Lösung waren in Grübchen 5 (Brecher/Mischer 2), und Prolin war in Grübchen 1.
- * LBL = London Biotechnology, Ltd.
- Die Packs wurden mit einem aca verarbeitet. Alle Reaktionen fanden bei 37ºC in einem Reaktionsvolumen von 5 ml statt. Im kinetischen Modus wurde eine bichromatische (BC) Geschwindigkeitsmessung von 17 Sekunden bei 510 und 600 nm durchgeführt. Die Daten wurden sowohl im Modus bichromatisch Endpunkt als auch im Modus bichromatisch Geschwindigkeit (mA bzw. mA/min) analysiert. Das Ansprechergebnis wurde unter Verwendung einer Logit-Gleichung in Konzentration des Analyten umgerechnet. Die Ergebnisse sind unten zusammengefaßt: Präzisionsanalytenergebnisse Standardkurve
- ¹ E = Extinktion
- Dieses Experiment war so gestaltet, daß es die durch Verwendung von bichromatischer Ablesung gegenüber monochromatischer Ablesung verbesserte Varianz mit Chromoxid im Pack zeigt. Bei diesem Experiment wurde keine Immunchemie verwendet. Die Packs waren leer.
- TSH-Chromoxid wurde auf 125 ug Chromoxid pro 0,5 ml zubereitet. 0,5 ml wurden pro Pack auf dem aca® hinzugefügt, und 4,5 ml 90 mM Tris (pH 8,8) wurden als Verdünnungsmittel zu dem Pack gegeben. Der Pack wurde mit dem aca verarbeitet und im Photometer wie folgt bei 2 Wellenlängen gemessen:
- Die bichromatische Endpunktsmessung (A2-A1) ist erheblich genauer als die monochromatischen Endpunktsmessungen bei einer der Wellenlängen A1 oder A2 zu den Zeitpunkten 0 bzw. 5,3 Sekunden. Die bichromatische Endpunktsmessung (A4-A3) ist erheblich genauer als die monochromatischen Endpunktsmessungen bei einer der Wellenlängen A4 oder A3 zu den Zeitpunkten 17,1 bzw. 22,4 s. Die bichromatische Geschwindigkeitsmessung ((A4 - A3) - (A2 - A1)) ist genauer als die monochromatische Geschwindigkeitsmessung (A3 - A1)
Claims (13)
1. Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit
und/oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer
Probe, umfassend:
Umsetzen eines Abfangreagens, das auf einem suspendierten
festen Träger immobilisiert ist, mit dem Analyten und
einem Marker, wobei der Marker mit dem Analyten assoziiert
ist und entweder selbst photometrisch nachweisbar ist
oder ein Enzym ist, das ein photometrisch nachweisbares
Produkt zu erzeugen vermag;
Abtrennen von nicht umgesetztem Analyt von dem auf dem
festen Träger immobilisierten Abfangreagens; und
photometrisches Nachweisen und/oder Quantifizieren eines
Signals, das von dem mit dem Analyten assoziierten Marker
erzeugt wird, wobei der Nachweis und/oder das
Quantifizieren in Gegenwart des suspendierten festen Trägers
erfolgt und bei der Messung der Lichtmenge, die von dem mit
dem Analyten assoziierten Marker absorbiert wird,
wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen verwendet werden,
eine erste Referenzwellenlänge, die auf dem
Absorptionsmaximum des Markers oder in dessen Nähe abgelesen wird,
und eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt
vom Absorptionsmaximum des Markers abgelesen wird.
2. Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum
Quantifizieren eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines
suspendierten festen Trägers, umfassend:
a) Umsetzen eines Abfangreagens, das auf einem festen
Träger immobilisiert ist, mit einer Probe, die den
Analyten enthält, unter Bildung eines
immobilisierten Komplexes aus Abfangreagens und Analyt;
b) Inkubieren des immobilisierten Komplexes aus
Abfangreagens und Analyt mit einem nachweisbar
markierten Reagens;
c) Abtrennen von nicht umgesetzter Probe und nicht
umgesetztem nachweisbar markierten Reagens von dem
immobilisierten Komplex aus Abfangreagens und
Analyt; und
d) photometrisches Nachweisen und/oder Quantifizieren
des Produkts von Schritt (b), wobei der Nachweis
und/oder das Quantifizieren in Gegenwart des
suspendierten festen Trägers erfolgt und bei der Messung
der Lichtmenge, die von dem mit dem Analyten
assoziierten Marker absorbiert wird, wenigstens zwei
verschiedene Wellenlängen verwendet werden, eine erste
Referenzwellenlänge, die auf dem Absorptionsmaximum
des Markers oder in dessen Nähe abgelesen wird, und
eine zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt
vom Absorptionsmaximum des Markers abgelesen wird.
3. Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum
Quantifizieren eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines
suspendierten festen Trägers, umfassend:
a) gleichzeitiges Umsetzen eines Abfangreagens, das auf
dem suspendierten festen Träger immobilisiert ist,
mit einer Probe, die den Analyten und ein
nachweisbar markiertes Reagens enthält, wobei sowohl das
Abfangreagens als auch das nachweisbar markierte
Reagens spezifisch an den Analyten binden, so daß ein
Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar
markiertem Reagens entsteht, wobei der nachweisbare
Marker entweder selbst photometrisch nachweisbar ist
oder (ii) ein Enzym ist, das in Gegenwart eines für
das Enzym spezifischen Substrats ein photometrisch
nachweisbares Produkt erzeugt;
b) Abtrennen von nicht umgesetzter Probe und/oder nicht
umgesetztem nachweisbar markierten Reagens von dem
immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt
und nachweisbar markiertem Reagens;
c) Messen der Lichtmenge, die (1) von dem
immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und
nachweisbar markiertem Reagens, wenn der nachweisbare Marker
selbst photometrisch nachweisbar ist, oder (ii) von
dem photometrisch nachweisbaren Produkt, das bei der
Zugabe von Substrat entsteht, wenn der nachweisbare
Marker ein Enzym ist, absorbiert wird, wobei bei der
Messung wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen
verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge,
die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder
Produkts oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine
zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom
Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts
abgelesen wird, wobei die Messung weiterhin in Gegenwart
des suspendierten festen Trägers erfolgt; und
d) Korrelieren der in Schritt (c) erhaltenen Messungen
mit der Menge und/oder der Anwesenheit des Analyten,
wobei der Wert, den man erhält, wenn man die
Ablesung bei der zweiten Referenzwellenlänge von der
Ab
lesung bei der ersten Referenzwellenlänge
subtrahiert, proportional zur Konzentration des Analyten
in der Probe ist.
4. Assay zum Nachweisen der Anwesenheit oder zum
Quantifizieren eines Analyten in einer Probe in Gegenwart eines
suspendierten festen Trägers, umfassend:
a) Inkubieren der Probe, die den Analyten enthält, mit
einem nachweisbar markierten Reagens, das spezifisch
an den Analyten bindet, so daß ein Komplex aus
Analyt und nachweisbar markiertem Reagens entsteht,
wobei der nachweisbare Marker entweder (i) selbst
photometrisch nachweisbar ist oder (ii) ein Enzym ist,
das in Gegenwart eines für das Enzym spezifischen
Substrats ein photometrisch nachweisbares Produkt
erzeugt;
b) Umsetzen des Komplexes aus Analyt und nachweisbar
markiertem Reagens mit einem Abfangreagens, das auf
dem suspendierten festen Träger immobilisiert ist,
wobei das Abfangreagens spezifisch an den Analyten
bindet;
c) Abtrennen von nicht gebundener Probe und/oder
nachweisbar markiertem Reagens von dem immobilisierten
Komplex aus Abfangreagens, Analyt und nachweisbar
markiertem Reagens;
d) Messen der Lichtmenge, die (i) von dem
immobilisierten Komplex aus Abfangreagens, Analyt und
nachweisbar markiertem Reagens, wenn der nachweisbare Marker
selbst photometrisch nachweisbar ist, oder (ii) von
dem photometrisch nachweisbaren Produkt, das bei der
Zugabe von Substrat entsteht, wenn der nachweisbare
Marker ein Enzym ist, absorbiert wird, wobei bei der
Messung wenigstens zwei verschiedene Wellenlängen
verwendet werden, eine erste Referenzwellenlänge,
die auf dem Absorptionsmaximum des Markers oder
Produkts oder in dessen Nähe abgelesen wird, und eine
zweite Referenzwellenlänge, die weiter entfernt vom
Absorptionsmaximum des Markers oder Produkts
abgelesen wird, wobei die Messung weiterhin in Gegenwart
des suspendierten festen Trägers erfolgt; und
e) Korrelieren der in Schritt (d) erhaltenen Messungen
mit der Menge und/oder der Anwesenheit des Analyten,
wobei der Wert, den man erhält, wenn man die
Ablesung bei der zweiten Referenzwellenlänge von der
Ablesung bei der ersten Referenzwellenlänge
subtrahiert, proportional zur Konzentration des Analyten
in der Probe ist.
5. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der
suspendierte feste Träger aus beschichteten
Chromdioxidteilchen; Eisenoxidteilchen, Latexteilchen und Teilchen auf
der Basis von Polysaccharidharz ausgewählt ist.
6. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der Analyt ein
Glycopeptidhormon ist.
7. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der Analyt aus
TSH, CKMB und HCG ausgewählt ist.
8. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der Nachweis
und/oder das Quantifizieren unter Verwendung einer
Enzymverstärkungskaskade erfolgen.
9. Assay gemäß Anspruch 8, wobei die Kaskade eine auf FADP
beruhende Enzymverstärkungskaskade ist.
10. Assay gemäß Anspruch 1, wobei das Signal, das von dem mit
dem Analyten assoziierten Marker erzeugt wird, zur Menge
des in der Probe vorhandenen Analyten direkt proportional
oder umgekehrt proportional ist.
11. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei das
Abfangreagens ein Partner eines spezifischen Bindungspaars des
Immun- oder Nichtimmuntyps ist.
12. Assay gemäß Anspruch 11, wobei das spezifische
Bindungspaar des Immuntyps ein Antigen/Antikörper-System ist.
13. Assay gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei das
Abfangreagens ein Partner eines spezifischen Bindungspaars des
Immuntyps ist, bei dem es sich um ein Hapten/Antihapten-
System handelt.
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