DE60212840T2

DE60212840T2 - Immunassayverfahren

Info

Publication number: DE60212840T2
Application number: DE60212840T
Authority: DE
Inventors: c/o Laboratory of Diagnostic Masaaki Hachioji-shi SAKURAI; c/o Laboratory of Diagnostic Naoki Hachioji-shi TAKANASHI; c/o Laboratory of Diagnostic Masanori Hachioji-shi OKA; c/o Laboratory of Diagnostic Minoru Hachioji-shi HIRATA
Original assignee: SRL Inc
Current assignee: TFB Inc
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2022-04-27
Also published as: TWI224674B; KR20040010589A; ES2268015T3; CN1258091C; EP1400808B1; WO2002095407A1; DE60212840D1; US6964872B2; DK1400808T3; CA2435535A1; US20040058387A1; EP1400808A1; ATE331953T1; JP3863493B2; EP1400808A4; JPWO2002095407A1; CN1491359A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur immunologischen Messung (Immunbestimmung) einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeit (wie einer biologischen Probe) unter Verwendung eines magnetischen Teilchens.
Hintergrund der Erfindung
In Krankenhäusern, Testzentren usw. gab es in den letzten Jahren aufgrund von Personalmangel, Kosteneinsparungen, Anforderungen der Behandlung von großen Probenmengen usw. Versuche, verschiedene Tests einschließlich klinischer Tests zu automatisieren und/oder Messzeit zu sparen. Bezüglich der Technik, die für diese Automatisierung geeignet ist, hat ein Verfahren Aufmerksamkeit erregt, bei dem antigene Substanzen einem qualitativen oder quantitativen Assay mit unlöslichen magnetischen Trägerteilchen unterzogen werden. Eines der Ziele bei der Verwendung solcher unlöslicher magnetischer Trägerteilchen besteht darin, in dem Assay leicht eine unvermeidliche Trennung von gebundenen/freien Substanzen unter Einwirkung eines Magnetfelds durchführen zu können.
Außerdem werden auf dem Gebiet der Immunchemie, wo solche unlöslichen magnetischen Trägerteilchen verwendet werden, antigen- oder antikörpergebundene unlösliche magnetische Teilchen (sensibilisierte unlösliche magnetische Teilchen) verwendet, wobei der magnetische Träger ein Antigen oder einen Antikörper trägt, der mit einem zu bestimmenden Zielanalyten identisch ist. Die auf dem vorliegenden Gebiet öffentlich bekannten sind solche, die (zum Beispiel gemäß der Beschreibung in JP-A-06-160387 (1994) und JP-A-07-72,155 (1995)) im Fall der Bestimmung einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeit (Testprobe), wie einer biologischen Probe, Folgendes umfasst: den Schritt des Mischens der Testprobe mit unlöslichen magnetischen Teilchen, auf denen ein Antikörper, der spezifisch an die antigene Substanz binden kann, oder ein Fragment davon voradsorbiert und trägergebunden ist, und den Schritt des anschließenden Messens des Grads der Bindung der antigenen Substanz an die unlöslichen magnetischen Teilchen, woraufhin die antigene Substanz nachgewiesen oder quantifiziert wird.
Weitere Verfahren gemäß diesem Format sind in EP-A-0 351 857, EP-A-0 709 680, P. L. Lim et al. (1998), J. Clin. Microbiol. 36, 2271, und D. Müller-Schulte & Η. Brunner (1995), J. Chromatog. 711, 53, offenbart.
Wenn Antikörper usw. jedoch im voraus auf unlöslichen magnetischen Teilchen adsorbiert sind und für den Assay verwendet werden, ist das Problem der Stabilität der sensibilisierten unlöslichen magnetischen Teilchen unvermeidlich. Daher gibt es trotz aller Bemühungen immer noch Probleme einschließlich der Mindesthaltbarkeitszeit der Reagentien, Schwierigkeiten bei deren Herstellung usw. Weiterhin gibt es insofern ein weiteres Problem, als die sensibilisierten magnetischen Teilchen, wenn sie lange Zeit konserviert werden, in einer Suspension Niederschläge verursachen können.
Bei der Einführung von Testinstrumenten für vollautomatische klinische Tests usw., um Arbeit zu sparen oder um große Mengen von Proben innerhalb einer kurzen Zeit zu behandeln, ist es gewöhnlich notwendig, Waschbehandlungen für die Trennung von gebundenen/freien Substanzen in dem Assay durchzuführen. Auch nur wenige Schritte zu reduzieren oder den Assay in einfacher Weise durchzuführen, ist unvermeidlich, um die Messung effizient und schnell zu machen. Zu diesem Zweck wurde vor kurzem versucht, ein Immunoassaysystem zu entwickeln, bei dem unlösliche magnetische Teilchen als Träger verwendet werden, aber es ist unvermeidlich, die dafür verwendeten unlöslichen magnetischen Teilchen im Waschschritt zu verlieren. Dies ist auch eine Ursache für den Verbrauch von wertvollen Antikörpern, die sich auf dem Träger befinden, usw.
Daher gibt es in automatisierten klinischen Testinstrumenten, bei denen magnetische Teilchen verwendet werden, den Nachteil, dass wegen der Verwendung relativ großer Mengen von magnetischen Teilchen mehr Antikörper usw. erforderlich sind als bei einem gewöhnlichen Immunoassay. Außerdem gibt es das Problem des Verlusts von Teilchen aufgrund des vielmaligen Waschens.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Als Ergebnis einer intensiven Untersuchung ist es den Erfindern gelungen, Folgendes herauszufinden: Bei Assays auf antigene Substanzen in Testproben ohne Verwendung eines unlöslichen magnetischen Trägerteilchens, das einen für die antigene Substanz spezifischen Antikörper trägt, aber unter Verwendung eines unlöslichen magnetischen Trägerteilchens in einem solchen Zustand, in dem keiner der Antikörper und dergleichen im Wesentlichen darauf adsorbiert ist, kann die antigene Substanz (zu bestimmender Zielanalyt) selbst auf dem antikörperfreien unlöslichen magnetischen Trägerteilchen adsorbieren gelassen werden, woraufhin eine Reaktion mit einem markierten Antikörper erfolgt, der für die resultierende antigene Substanz, die auf dem Teilchen adsorbiert ist, spezifisch ist, wodurch die antigene Substanz in der Testprobe in einem für die Automatisierung geeigneten Modus effizient bestimmt werden kann. So ist es den Erfindern gelungen, die vorliegende Erfindung fertigzustellen.
Insbesondere umfasst der Immunoassay der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines unlöslichen magnetischen Trägerteilchens in einem Zustand, in dem es im Wesentlichen frei von jedem Antikörper usw. ist;
dann Adsorbieren oder Binden einer antigenen Substanz in einer Testprobe auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen; und
Umsetzen des resultierenden Gemischs mit einem markierten Antikörper, der gegenüber der adsorbierten antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist, wobei der Immunoassay die selektive Messung der antigenen Substanz auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen ermöglicht.
Im Hinblick darauf, die Aufrechterhaltung der Quantifizierung in der vorliegenden Erfindung leicht zu machen, werden die Bedingungen einschließlich Biomaterialkonzentrationen und Konzentrationen von Puffern für Suspensionen unlöslicher Trägerteilchen vorzugsweise je nach den speziellen Assaysituationen ausgewählt, so dass die antigene Substanz in dem Biomaterial proportional zu ihrer vorhandenen Menge auf dem unlöslichen Trägerteilchen adsorbiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit:

(1) einen Immunoassay unter Verwendung eines unlöslichen Trägerteilchens, das Folgendes umfasst:
(i) Verwendung eines unlöslichen magnetischen Trägerteilchens in einem Zustand, in dem es im Wesentlichen frei von jedem adsorbierten Antigen und/oder Antikörper ist;
(ii) Adsorbieren einer antigenen Substanz in einer Testprobe auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen oder Binden der antigenen Substanz an das unlösliche magnetische Trägerteilchen;
(iii) Umsetzen des resultierenden unlöslichen magnetischen Trägerteilchens aus der obigen Behandlung (ii) mit einem Antikörper, bei dem es sich um einen markierten Antikörper handelt, der gegenüber einem Teil der antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist, wobei der Antikörper gegenüber einer Festphasenform der antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist, aber gegenüber einer nativen Form der antigenen Substanz im Wesentlichen unreaktiv ist, wobei die in der Festphasenform vorliegende antigene Substanz an das unlösliche Trägerteilchen gebunden ist und die im nativen Zustand vorliegende antigene Substanz noch in einer flüssigen Phase vorhanden ist; und
(iv) Messen des Markers an dem resultierenden markierten Antikörper, der durch die in Festphasenform vorliegende antigene Substanz abgefangen wurde, als Indikator;
(2) den Immunoassay gemäß dem obigen Punkt (1), wobei der Immunoassay Folgendes umfasst:
(A) Adsorbieren der antigenen Substanz in der Testprobe auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen oder Binden der antigenen Substanz an das unlösliche magnetische Trägerteilchen; und
(B) dann Umsetzen der abgefangenen antigenen Substanz mit dem gegenüber der in Festphasenform vorliegenden antigenen Substanz spezifisch reaktiven Antikörper, ohne die Testprobe durch Waschen zu entfernen;
(3) den Immunoassay gemäß dem obigen Punkt (1) oder (2), wobei der Immunoassay Folgendes umfasst:
(a) Umsetzen des markierten Antikörpers mit dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen, an das die antigene Substanz in der Testprobe adsorbiert oder gebunden ist;
(b) dann Abtrennen des nicht umgesetzten markierten Antikörpers von dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen in Gegenwart einer Magnetfeldeinwirkung; und
(c) Messen des Markers an dem resultierenden markierten Antikörper, der durch die in Festphasenform vorliegende antigene Substanz abgefangen wurde, als Indikator;
(4) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (3), wobei der Antikörper monoklonal ist;
(5) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (3), wobei der Antikörper polyklonal ist;
(6) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (5), wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus feinen Teilchen ausgewählt ist, wobei das feine Teilchen in einem wässrigen flüssigen Medium im Wesentlichen unlöslich ist und aus einer organischen Polymermaterialphase und einer magnetischen Materialphase besteht;
(7) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (6), wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus feinen Teilchen ausgewählt ist, wobei das feine Teilchen nicht nur eine Hüllphase, die aus einem oder mehreren organischen Polymermaterialien besteht, sondern auch eine Kernphase, die aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht, umfasst;
(8) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7), wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus Latexteilchen ausgewählt ist, wobei das Latexteilchen (a) eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 0,01 bis 20 μm hat und (b) einen Kern aufweist, der aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht;
(9) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7), wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus Latexteilchen ausgewählt ist, wobei das Latexteilchen eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 0,1 bis 6 μm hat und einen Kern aufweist, der aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht;
(10) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (9), wobei der Immunoassay von der Ausgabe der Testprobe bis zum Erreichen der Testergebnisse mit einem automatischen klinischen Testinstrument oder einem Autoanalyzer der klinischen Chemie, der für magnetische Teilchen geeignet ist, automatisiert durchgeführt werden kann; und
(11) den Immunoassay gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (10), wobei es sich bei der antigenen Substanz in der Testprobe um HbA1c handelt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Beziehung zwischen spezifischer Oberfläche der Teilchen und Signal zwischen den unlöslichen magnetischen Trägerteilchen und den resultierenden Signalen im HbA1c-Assay mit markierten Anti-HbA1c-mAb einschließlich des Schritts des Adsorbierens von HbA1C auf den magnetischen Latexteilchen.
2 zeigt die Beziehung zwischen Signal und Antikörpermenge zwischen den resultierenden Signalen und den Antikörpern, die in einem System für einen HbA1c-Assay mit markierten Anti-HbA1c-mAb einschließlich des Schritts des Adsorbierens von HbA1C auf magnetischen Latexteilchen vorkommen.
3 zeigt die Ergebnisse, wenn der verwendete Marker im HbA1c-Assay mit markierten Anti-HbA1c-mAb einschließlich des Schritts des Adsorbierens von HbA1C auf magnetischen Latexteilchen ein direkt nachweisbarer Marker ist.
4 zeigt die Korrelation zwischen einem Latexaggregationsverfahren und einem HbA1c-Bestimmungsverfahren mit markierten Anti-HbA1c-mAb einschließlich des Schritts des Adsorbierens von HbA1C auf magnetischen Latexteilchen.
5 zeigt den Assayeinfluss von Schwankungen unter den verwendeten unlöslichen magnetischen Trägerteilchen auf den HbA1c-Assay mit markierten Anti-HbA1c-mAb einschließlich des Schritts des Adsorbierens von HbA1C auf magnetischen Latexteilchen.
Bester Modus für die Durchführung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, einen markierten Antikörper (markierten Ab), insbesondere einen markierten monoklonalen Antikörper (markierten mAb), selektiv mit einer spezifischen antigenen Substanz umzuset zen, die an einen unlöslichen magnetischen Träger adsorbiert oder gebunden ist, im Wesentlichen ohne den markierten Ab (insbesondere den markierten mAb) mit der spezifischen antigenen Substanz, die sich noch in der flüssigen Phase befindet, umzusetzen. Dementsprechend ist es in einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung möglich, eine antigene Substanz, die sich in einer Testprobe befindet, an einem unlöslichen Träger zu adsorbieren, woraufhin eine Reaktion mit einem mAb gegen die antigene Substanz in dem oben genannten Immunoassay erfolgt, ohne die Testprobe durch Waschen zu entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird also der hier verwendete mAb aus solchen ausgewählt, die reaktiv gegenüber einem auf einem unlöslichen Trägerteilchen adsorbierten Antigen sind, aber gegenüber einer nicht adsorbierten (ungebundenen) nativen antigenen Substanz, die in einer flüssigen Phase vorhanden ist, im Wesentlichen unreaktiv ist, wodurch es jetzt möglich ist, die störende Einwirkung der nicht adsorbierten (ungebundenen) Komponente im Wesentlichen auszuschließen.
(Antigene Substanz)
Antigene Substanzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden sollen, umfassen beliebige, solange sie an einen unlöslichen magnetischen Träger adsorbiert (oder gebunden) werden können, vorausgesetzt, dass es möglich ist, wenigstens einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gegen die spezifische antigene Substanz zu produzieren oder zu erhalten, aber dies soll keine Einschränkung des Bereichs der antigenen Substanz bedeuten. Im Hinblick auf eine Erleichterung der Adsorption auf dem unlöslichen magnetischen Träger ist es jedoch zu bevorzugen, eine Substanz auszuwählen, die in einer Menge von nicht weniger als 100 μg/ml (weiterhin nicht weniger als 1 mg/ml) oder nicht weniger als 1% (des Gesamtgewichts des Proteins) in einer biologischen Probe enthalten sein soll. Außerdem ist es im Hinblick auf die Erleichterung der Produktion der oben genannten polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper zu bevorzugen, dass die oben genannte antigene Substanz eine Substanz (wie ein Protein) mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 10 000 sein sollte.
Die "antigene Substanz", die gemäß dem Immunoassay der vorliegenden Erfindung bestimmt werden soll, umfasst beliebige, solange wenigstens ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen die antigene Zielsubstanz produzieren werden kann oder erhältlich ist. Die "antigene Substanz" umfasst eine Vielzahl von Substanzen, wie Proteine, Polypeptide und rekombinante Proteine, die mittels gentechnischer Methoden produziert werden. Es können entweder öffentlich bekannte oder auf dem Gebiet des Immunoassays neue sein. Ein Vertreter der antigenen Substanz ist HbA1c.
(Antikörper, der für die antigene Substanz spezifisch ist)
Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper, der gegenüber einer antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist," kann polyklonale Antikörper und/oder monoklonale Antikörper abdecken, und auch solche, die intakte Moleküle oder Fragmente und Derivate davon sind, einschließlich F(ab')₂-, Fab'- und Fab-Fragmenten. Zu den bevorzugten Techniken für die Produktion von monoklonalen Antikörpern gehören zum Beispiel die Verfahren unter Verwendung von Hybridomzellen (G. Kohler und C. Milstein, Nature, 256, 5. 495–497 (1975); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)) usw., und daneben seien die folgenden Dokumente, die Antikörper betreffen, beispielhaft genannt: J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986), oder dort zitierte Dokumente.
Zweckmäßigerweise können monoklonale Antikörper durch Anlehnungen an Zellfusionstechniken produziert werden, wie sie von Koehler & Milstein (Nature, 256, 495–497, 1975) usw. beschrieben werden. Das Verfahren ist an sich eine herkömmliche Technik. Daher wird es unnötig sein, es im Einzelnen zu erläutern; es ist bei diesem Verfahren jedoch erforderlich, monoklonale Zielantikörper produzierende Hybridomzellen effizient auszuwählen. Weil es leicht möglich ist, eine große Zahl von Proben zu behandeln, wird die Auswahl häufig durch den sogenannten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) durchgeführt, wobei ein vorbestimmtes Antigen auf einer 96-Napf-Platte in eine feste Phase gebracht und dann mit dem Überstand von Hybridomzellkulturen zur Reaktion gebracht und weiterhin mit enzymmarkiertem Anti-Maus-Immunglobulin zur Reaktion gebracht wird. Da das Antigen in diesem Fall in eine feste Phase gebracht wird, ist dieses Auswahlverfahren annehmbar, wenn ein Assaysystem ausgebaut werden kann, bei dem der Antikörper in einem solchen Zustand des in fester Phase befindlichen Antigens zur Reaktion gebracht wird, aber es gibt einige Fälle, bei denen unter monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridomzellen produziert und über die ELISA-Auswahl erhalten wurden, ein Antikörper vorkommt, der in einem Assaysystem unreaktiv ist, wobei das Assaysystem ein solches ist, bei dem die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung in einer flüssigen Phase durchgeführt wird, wie im Fall des Radioimmunoassays (RIA).
Ein solches Phänomen ist zwar an sich öffentlich bekannt oder auf dem vorliegenden Gebiet allgemein bekannt, doch wenn ein solcher monoklonaler Antikörper verwendet wird, ermöglicht der Immunoassay der vorliegenden Erfindung eine spezifische Reaktion mit einer antigenen Zielsubstanz, die sich in fester Phase auf unlöslichen Trägerteilchen befindet, ohne eine Hemmung aufgrund der antigenen Substanz, die sich noch in der flüssigen Phase befindet.
Zu den repräsentativen monoklonalen Antikörpern gehören zum Beispiel solche, die im Japanischen Patent Nr. 2,677,753 offenbart sind. Insbesondere sind repräsentative monoklonale Antikörper zum Beispiel monoklonale Anti-HbA1C-Antikörper (Anti-HbA1c-mAbs), die im Japanischen Patent Nr. 2,677,753 offenbart sind.
Obwohl es sich bei dem verwendeten Antikörper gewöhnlich um IgG handelt, kann er auch Antikörperfragmente umfassen, einschließlich F(ab')₂, Fab', Fab usw., bei denen es sich um niedere Moleküle handelt, die durch Behandlung mit einem Verdauungsenzym, wie Trypsin, Papain, Pepsin und anderen, und gelegentliche Reduktion mit einem Reduktionsmittel, wie Dithiothreit und Mercaptoethanol, von Stammantikörpern abgeleitet sind.
Es ist weiterhin möglich, IgM anstelle von IgG zu verwenden oder Fragmente zu verwenden, bei denen es sich um niedere Moleküle handelt, die durch dieselbe Behandlung wie bei IgG von Stamm-IgM abgeleitet sind. Es ist weiterhin möglich, eine Kombination von zwei oder mehr monoklonalen Antikörpern, die unterschiedliche Erkennungsepitope aufweisen, zu verwenden.
(Markierung des Antikörpers)
Der hier verwendete Antikörper kann mit einem geeigneten Marker markiert sein.
Der Marker kann Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, prosthetische Gruppen, Coenzyme, Enzymvorstufen, Apoenzyme, fluoreszierende Substanzen, Pigmente, chemolumineszierende Verbindungen, lumineszente Substanzen, färbende Substanzen, magnetische Substanzen, Metallteilchen, wie Goldkolloide, radioaktive Substanzen usw. umfassen. Das Enzym kann Dehydrogenasen, Oxidoreductasen, wie Reductasen und Oxidasen, Transferasen, die die Übertragung von funktionellen Gruppen, wie Amino-, Carboxy-, Methyl-, Acyl- und Phosphatgruppen, katalysieren, Hydrolasen, die Bindungen wie Ester-, Glycosid-, Ether- und Peptidbindungen hydrolysieren, Lyasen, Isomerasen, Ligasen usw. Zum Nachweis können auch mehrere Enzyme in konjugierter Form verwendet werden.
Enzymatische zyklische Behandlungen können zum Beispiel auch verwendbar sein. Typische Enzyme für den Marker sind Peroxidasen, wie Meerrettich-Peroxidase, Galactosidasen, wie E.-coli-β-D-galactosidase, Maleat-Dehydrogenasen, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenasen, Glucose-Oxidasen, Glucoamylasen, Acetylcholin-Esterasen, Katalasen, Alkalische Phosphatasen, wie Kälberdarm-Alkalische-Phosphatase und E.-coli-Alkalische-Phosphatase usw. Wenn Alkalische Phosphatase verwendet wird, können die Messungen durch Überwachen oder Untersuchen der Fluoreszenz, Lumineszenz usw. erfolgen, die mit Substraten wie Umbelliferon-Derivaten einschließlich 4-Methylumbellipherylphosphat, phosphorylierten Phenolderivaten, wie Nitrophenylphosphat, Luciferin-Derivaten und Dioxetanderivaten, enzymatischen zyklischen Systemen unter Verwendung von NADP und anderen erzeugt wird. Es ist auch möglich, Luciferin/Luciferase-Systeme zu verwenden. Wenn die Reaktion mit Wasserstoffperoxid stattfindet, entsteht Sauerstoff, der mit einer Elektrode oder anderen Mitteln nachgewiesen werden kann. Die Elektrode kann eine Glaselektrode, eine Ionenelektrode unter Verwendung einer unlöslichen Salzmembran, eine Elektrode des Flüssigmembrantyps, eine Polymermembranelektrode und dergleichen sein. Der Enzymmarker kann durch einen Biotinmarker und ein enzymmarkiertes Avidin (Streptavidin) ersetzt sein. Als Marker können mehrere verschiedene Arten von Markern oder Signalsubstanzen verwendet werden. In diesem Fall ist es möglich, mehrere Messungen kontinuierlich oder diskontinuierlich und/oder gleichzeitig oder getrennt durchzuführen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Signalbildung unter Verwendung von Enzym-Reagens-Kombinationen erfolgen, wie Kombinationen von Meerrettich-Peroxidase oder anderen Peroxidasen mit einem Vertreter, der aus 4-Hydroxyphenylessigsäure, 1,2-Phenylendiamin, Tetramethylbenzidin usw. ausgewählt ist, Kombinationen von β-D-Galactosidasen oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenasen mit einem Vertreter, der aus Umbelliferylgalactosiden, Nitrophenylgalactosiden usw. ausgewählt ist, und andere. Das Signal kann mit denjenigen gebildet werden, die enzymatisch Folgendes bilden können: Chinolverbindungen, wie Hydrochinon, Hydroxybenzochinon und Hydroxyanthrachinon, Thiolverbindungen, wie Liponsäure und Glutathion, Phenolderivate, Ferrocenderivate usw.
Die fluoreszierenden Substanzen und chemilumineszenten Verbindungen können folgende umfassen: Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin-Derivate, wie Rhodamin-B-isothiocyanat und Tetramethylrhodaminisothiocyanat; Dansylchlorid (5-(Dimethylamino)-1-naphthalinsulfonylchlorid), Dansylfluorid, Fluorescamin (4-Phenylspiro[furan-2(3H),1'-(3'H)-isobenzofuran]-3,3'-dion); Phycobiliproteine, wie Phycocyanin und Phycoerythrin; Acridiniumsalze; Luminolverbindungen, wie Lumiferin, Luciferase und Aequorin; Imidazole; Oxalsäureester; Chelat-Verbin dungen von Seltenerdelementen, wie Europium (Eu), Terbium (Tb) und Samarium (Sm); Cumarinderivate, wie 7-Amino-4-methylcumarin usw.
Die Kupplung zwischen dem Antikörper und dem Marker kann mit Techniken einschließlich physikalischer Verfahren, wie Adsorption, eines chemischen Verfahrens unter Verwendung eines Kupplungsmittels usw. oder eines aktivierten Reaktanten, eines Verfahrens unter Verwendung einer Kupplung durch chemische Wechselwirkung durchgeführt werden. Die Markierung kann durch die Reaktion einer Thiolgruppe mit einer Maleinimidgruppe, die Reaktion einer Pyridyldisulfidgruppe mit einer Thiolgruppe, die Reaktion einer Aminogruppe mit einer Aldehydgruppe usw. erreicht werden. Zusätzlich kann sie zweckmäßigerweise aus wohlbekannten Verfahren, Techniken, die vom Fachmann leicht in die Praxis umgesetzt werden können, und irgendwelchen davon abgeleiteten Modifikationen ausgewählt werden. Zu den Kupplungsmitteln gehören zum Beispiel Formaldehyd, Glutaraldehyd, Hexamethylendiisocyanat, Hexamethylendiisothiocyanat, N,N'-Polymethylenbisiodacetamid, N,N'-Ethylenbismaleinimid, Ethylenglycolbissuccinimidylsuccinat, Bisdiazobenzidin, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), N-Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), N-Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat, N-Succinimidyl-4-(1-maleinimidophenyl)butyrat, N-ε-maleinimidocaproyloxy)succinimid (EMCS), Iminothiolan, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, Methyl-3-(4'-dithiopyridyl)propionimidat, Methyl-4-mercaptobutyrylimidat, Methyl-3-mercaptopropionimidat, N-Succinimidyl-S-acetylmercaptoacetat usw.
(Unlösliches magnetisches Trägerteilchen)
Die unlöslichen magnetischen Trägerteilchen, wie sie hier verwendet werden, sind vorzugsweise feine Teilchen, wobei das feine Teilchen in einem wässrigen flüssigen Medium im Wesentlichen unlöslich ist und eine Phase aus einem organischen Polymermaterial und eine Phase aus einem magnetischen Material bzw. Substanz umfasst. Repräsentative unlösliche magnetische Trägerteilchen sind feine Teilchen, von denen jedes nicht nur eine Hüllphase, die aus einem oder mehreren organischen Polymermaterialien besteht, sondern auch eine Kernphase, die aus einem oder mehreren magnetischen Materialien oder Substanzen besteht, umfasst. Das unlösliche magnetische Trägerteilchen kann zum Beispiel feine Teilchen umfassen, die einen oder mehrere Vertreter umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Trieisentetraoxid (Fe₃O₄), Dieisentrioxid (γ-Fe₂O₃), verschiedenen Ferriten, Metallen wie Eisen, Mangan, Nickel, Cobalt und Chrom, Legierungen wie Cobaltlegierungen, Nickellegierungen, Manganlegierungen usw., Latexteilchen, Gelatineteilchen, Liposomenteilchen usw., die das magnetische Teilchen in ihrem Innern enthalten, und anderen besteht. Zweckmäßigerweise umfasst das unlösliche magnetische Trägerteilchen Latexteilchen, die aus einer Latexhülle bestehen, die den Kern des magnetischen Materials bzw. der magnetischen Substanz umgibt. Ursprünglich bedeutet der Ausdruck "Latex" einen Milchsaft, der aus einem Gummibaum austritt, wenn dieser eingeschnitten oder verwundet wird, aber der hier verwendete Ausdruck "Latex" bezieht sich auch auf eine Suspension oder Emulsion, bei der diskontinuierliche feine Teilchen in einer wässrigen Lösung suspendiert oder dispergiert werden. Zu den unlöslichen magnetischen Teilchen, die hier vorzugsweise verwendet werden, gehören unter anderem feine Teilchen, bei denen die Oberfläche des Kerns in Form des magnetischen Teilchens einer Oberflächenbehandlung mit einer organischen Substanz usw. unterzogen wird.
Wenn ein Immunoassay quantitativ durchgeführt wird, werden solche Latexteilchen gewöhnlich aufgrund ihrer Teilchengrößehomogenität oder -gleichmäßigkeit, der Steuerung ihres Oberflächenzustands, der Wahl ihrer inneren Struktur usw. auf hohem Niveau nachgefragt. Solche qualitativ hochwertigen Latexteilchen, die für Testreagensanwendungen geeignet sind, können aus kommerziell erhältlichen Produkten ausgewählt werden. Organische Polymermaterialien, die zum Aufbau der obigen Teilchen eingesetzt werden können, sind unter anderem solche für feine Teilchen aus organischen Polymermaterialien, wie sie im Stand der Technik offenbart sind (z.B. JP-A-58-11575 (1983)). Das organische Polymermaterial umfasst zum Beispiel hydrophobe Polymere, wie Polystyrol, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat, Polycapramid und Polyethylenterephthalat, ver netzte hydrophile Polymere, wie Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Poly-2-oxyethylacrylat, Poly-2-oxyethylmethacrylat, Poly-2,3-dioxypropylacrylat, Poly-2,3-dioxypropylmethacrylat und Polyethylenglycolmethacrylat, Copolymere, die etwa 2 bis 4 Arten von jedem Monomer umfassen, und andere. Das Material für den Latex unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch sind vorzugsweise verwendete Latices des Styroltyps, wie Polystyrol-Latices, Latices des Acrylsäuretyps usw. Die Verwendung von Latex mit einer starken Oberflächenhydrophobie (wie Polystyrollatex) ist im Hinblick auf die Erleichterung der glatten Adsorption von Proteinen oder Peptiden bevorzugt. Es ist auch je nach Notwendigkeit möglich, verschiedene Arten von denaturierten Latices (wie denaturierten Carbonsäurelatices) zu verwenden. Der oben genannte unlösliche Träger, wie er hier verwendet wird, umfasst vorzugsweise Latices, wie Polystyrol-Latices. Die besonders bevorzugten Latexteilchen sind Polystyrolteilchen, die durch Emulsionspolymerisationsverfahren ohne Verwendung eines Emulgators hergestellt werden. Der Latex als solcher kann wegen der gegenseitigen Abstoßung zwischen negativen Ladungen auf der Oberfläche auch ohne Emulgator stabil vorliegen. Repräsentative kommerziell erhältliche unlösliche magnetische Trägerteilchen sind Dynabeads M-270 Epoxy, Dynabeads M-270 Amine, Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynabeads M-270 Tosylactivated, Dynabeads M-450 Epoxy und Dynabeads M-450 Tosylactivated (VERITAS Corporation, Japan), IMMUTEX-MAG (JSR Corporation, Japan) und SMG-11 (Fujikura Kasei Co., Ltd., Japan). Die Trägerteilchen sind auch von Bangs Laboratories, Inc., usw. verfügbar.
Die Teilchengröße der hier verwendeten unlöslichen magnetischen Trägerteilchen liegen im Bereich von 0,01 μm bis 20 μm. Vorzugsweise werden unlösliche magnetische Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 0,1 μm bis 6 μm ausgewählt. Verfahren zum Adsorbieren der antigenen Substanz auf dem unlöslichen magnetischen Teilchen oder zur Bindung der antigenen Substanz auf dem unlöslichen magnetischen Teilchen können eine physikalische Adsorption oder Bindung der antigenen Substanz, die in der Testprobe vorhanden ist, oder eine chemische Bindung der antigenen Substanz, die in der Testprobe vorhanden ist, umfassen. Zweckmäßigerweise ist sie physikalisch adsorbiert oder gebunden.
Um die in der Testprobe enthaltene antigene Substanz auf den Latexteilchen zu adsorbieren, können Techniken, die denjenigen zur Bindung eines Antigens an eine Platte bei ELISA im Wesentlichen äquivalent sind, usw. bezüglich eines Puffers für das Suspendieren der Latexteilchen angewendet werden. Bei manchen Latexteilchen findet leicht eine natürliche Aggregation statt. In diesem Fall ist es im Hinblick auf die Stabilität zu bevorzugen, die Teilchen in einem schwach alkalischen Glycinpuffer oder Boratpuffer zu suspendieren. Bezüglich der Konzentration des Latex wird vorzugsweise eine Suspension von 0,05 bis 1 Gew.-% verwendet.
(Antigen-Antikörper-Wechselwirkung)
In der vorliegenden Erfindung werden antigene Substanzen, die in der Testprobe vorhanden sind, an eine feste Phase gebunden (oder immobilisiert) und dann mit markierten Ab, die gegenüber der in fester Phase vorliegenden antigenen Substanz spezifisch reaktiv sind, reagieren gelassen, um die eingefangene antigene Substanz auf einem unlöslichen magnetischen Träger, der aus Latex usw. besteht, zu markieren. Vorzugsweise enthält eine dafür verwendete wässrige Suspension ein Tensid (wie Tween 20) in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,3%, um die Adsorption des Antikörpers auf dem unlöslichen Träger, der aus Latex usw. besteht, zu verhindern.
Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich des Behälters, in dem die Reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. Es ist möglich, einen Behälter in einer normalen Rohrform zu verwenden (Teströhrchen, zum Beispiel Polystyrol-Teströhrchen). Wenn in Betracht gezogen wird, wie leicht es ist, gleichzeitig Tausende von Proben oder Hunderte von Proben zu behandeln, ist es sehr zweckmäßig, eine ELISA-Platte mit einer Menge von Näpfen zu verwenden, wie eine 96-Napf-ELISA-Platte (Nunc-Immunoplatte usw.). Wie später noch erwähnt wird, ist es im Hinblick auf die Erleichterung von Messungen mit optischen Mitteln bevorzugt, die Reaktion unter Verwendung eines im Wesentlichen transparenten Behälters durchzuführen. Für die Verwendung eines Autoanalyzers, der später noch erwähnt wird, sei erwähnt, dass die Reaktion gewöhnlich in einem Reaktor in dem Analysator durchgeführt wird.
(Messung)
Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich der Verfahren zur Messung der Markerkonzentration bei den unlöslichen magnetischen Trägerteilchen. Wenn der Marker qualitativ oder halbqualitativ gemessen wird, ist es zum Beispiel möglich, die Markerkonzentration bei den oben genannten unlöslichen Trägerteilchen auf der Basis von Vergleichen mit der Trübheit bekannter Proben visuell zu bewerten. Wenn der Marker quantitativ gemessen wird, ist es im Hinblick auf die Einfachheit und Zweckmäßigkeit bevorzugt, optische Messungen durchzuführen.
Als Verfahren zur optischen Messung des Markers auf den unlöslichen magnetischen Trägerteilchen, die aus Latex usw. bestehen, können herkömmlicherweise bekannte Verfahren verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Messungsbehandlungen für Testproben, Schritte von Probenausgabebehandlungen bis zu Assayergebniserfassungen mittels eines automatischen Instruments durchzuführen, wie eines klinischen Testautoanalyzers für magnetische Teilchen. Zu diesen automatischen Instrumenten (Systemen) für klinische Tests gehören ADVIA^TM (Handelsname, Bayer), ARCHITECT^TM (Handelsname, Dinabbot), IMx^TM (Handelsname, Dinabbot), Access^TM (Handelsname, Beckmann), ECLusys^TM (Handelsname, Roche Diagnostics), LUMIPULSE^TM (Handelsname, FUJIREBIO) usw. Solche Instrumente werden verbreitet in Immunoassaysystemen verwendet (unter Ausnutzung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen) und können für die vorliegende Erfindung ohne jede Einschränkung übernommen werden, solange es sich tatsächlich um solche handelt. Die charakteristischen Merkmale dieser Instrumente haben Vorzüge und Vorteile einschließlich der Möglichkeit, mehrere Größen mit beliebigem Zugriff zu messen, einer hohen Assayempfindlichkeit, einer Bestimmbarkeit über einen breiten Bereich, einer möglichen Fertigstellung des Assays innerhalb einer kurzen Zeit, einer hohen Assaygenauigkeit, da alle Schritte von der Ausgabe bis zur Gewinnung von Assayergebnissen automatisch durchgeführt werden, einer sehr geringen Kontamination aufgrund der Verwendung von exklusiven Kartuschen usw.
Wenn Antigene in gewöhnlichen Proben gemessen werden, werden Antikörpersensibilisierte magnetische Teilchen in den herkömmlichen automatischen klinischen Testinstrumenten verwendet, wobei die Schritte Folgendes umfassen:

(a) erste Reaktion:
(1) Umsetzen des magnetischen Teilchens mit dem Antigen in der Probe und (2) dann Waschen;
(b) zweite Reaktion:
(3) Umsetzen des resultierenden Produkts mit einem zweiten Antikörper (unter Verwendung eines Markers, wie eines Enzyms oder einer fluoreszenten Substanz, als Marker) gegen das Antigen und (4) dann Waschen; und
(c) dritte Reaktion:
(5) Umsetzen des resultierenden Produkts mit einem Substrat für den Marker und (6) dann Messen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Zahl der Waschvorgänge jedoch wie folgt reduziert werden:

(a) erste Reaktion:
(1) Umsetzen der magnetischen Teilchen mit einem Antigen in einer Probe;
(b) zweite Reaktion:
(2) Umsetzen des resultierenden Produkts mit einem zweiten Antikörper (unter Verwendung eines Markers, wie eines Enzyms oder einer fluoreszenten Substanz, als Marker) gegen das Antigen und (3) dann Waschen; und
(c) dritte Reaktion:
(5) Umsetzen des resultierenden Produkts mit einem Substrat für den Marker und (6) dann Messen.

Als Ergebnis kann der Verlust an Teilchen in der vorliegenden Erfindung stark gehemmt werden.
Bei Verfahren zum optischen Nachweis der Aggregation von Latexteilchen ist es notwendig, relativ große Mengen der Teilchen zu verwenden. In der vorliegenden Erfindung ist die Menge der an die Teilchen gebundenen Substanzen jedoch nachweisbar. Daher erlauben sowohl die Teilchen als auch die markierten Antikörper in der vorliegenden Erfindung eine Messung mit einem Zehntel oder einer noch kleineren Menge als bei den herkömmlichen Verfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Herstellungsprobleme in Verbindung mit Antikörperkomplexen, die bei den herkömmlichen Verfahren verwendet werden, zu vermeiden, wobei die Probleme Schwierigkeiten im Verfahren zur Herstellung derselben, Instabilität bei der tatsächlich verwendeten Konzentration usw. umfassen. Die Verwendung nur eines einzelnen Ab in der vorliegenden Erfindung sorgt also für eine verbesserte Stabilität von Substanzen, aber keine Schwankung zwischen den Herstellungschargen, so dass eine stabile und zuverlässige Herstellung möglich ist. Die Verwendung von nur mAb erlaubt die Ausnutzung dieser Vorzüge. Zum Beispiel ist es möglich, Schwankungen zwischen den Antikörperchargen zu beseitigen und hochgradig zuverlässige Reagentien mit einer konstanten Qualität zu erhalten.
Da das unlösliche Trägerteilchenreagens der vorliegenden Erfindung nie mit einem Antigen usw. sensibilisiert wird, sind Reagenskits in Verbindung mit Problemen bezüglich Chargenschwankungen zwischen den Teilchen stark verbessert. Weiterhin umfasst das Teilchen nicht nur einen Kern, der aus magnetischen Materialien oder Substanzen besteht, sondern auch eine Oberfläche, die aus Kunststoffen besteht und ausgezeichnete Eigenschaften der Adsorption oder Bindung von antigenen Substanzen hat.
Zu den Assayinstrumenten, bei denen die in der vorliegenden Erfindung anwendbaren unlöslichen magnetischen Trägerteilchen verwendet werden können, gehören zum Beispiel FUJIREBIO LUMIPULS^TM (ALP-AMPPD^TM); Beckmann Coulter Access^TM (ALP-Lumigen^TM PPD); Beckmann Coulter LUMIWARD^TM (ALP-Lumigen^TM PPD); Nippon DPC Corporation "Immulize"^TM (ALP-AMPPDT^TM); Bayer ACS^TM (Acridiniumester); Ortho Clinical Diagnostics VITROS^TM ECi (HRP-Luminol); Precision System Science Co., Ltd. HiMICO^TM; Dinabbot ARCHITECT^TM (Acridiniumester); Roche Picolumi^TM (Rutheniumkomplex); Tosoh AIA-600II (ALP-4MUP) usw. Diese Instrumente können auch solche umfassen, bei denen Chemilumineszenz mit Enzymen, Elektrochemilumineszenz mit Rutheniumkomplexen, Chemilumineszenz mit Acridiniumestern usw. verwendet wird.
(Assayausführungsformen für Hämoglobin-A1c)
Als Ausführungsform, die die Merkmale des Immunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung gut veranschaulicht, wird im Folgenden ein Assaybeispiel für Hämoglobin-A1c (HbA1c) beschrieben, obwohl der erfindungsgemäße Immunoassay nicht auf den Hämoglobin-A1c-Assay beschränkt ist.
Das oben genannte "Hämoglobin A1c" bezieht sich auf einen spezifischen Typ von glycosyliertem (oder glyciertem) Hämoglobin, der über die nichtenzymatische Bindung von Glucose an die α-Aminogruppe von Valin, den N-terminalen Aminosäurerest der β-Kette von Hämoglobin (Hb), gebildet wird. Die Menge des Blut-Hämoglobin-A1c spiegelt die Blutglucose-Regulationszustände in Diabetes für eine relativ lange Zeit wider. Dementsprechend ist der Assay für das HbA1c klinisch sehr signifikant im Hinblick auf die Bewertung der glykämischen Regulierung (siehe zum Beispiel Nippon-Rinsho, 48, Special Issue, 315–322 (1990)).
Hämoglobin ist ein Heterotetramer, das grundsätzlich aus zwei α-Ketten und zwei β-Ketten besteht. Hämoglobin A1c ist dadurch gekennzeichnet, dass eine N-terminale β-Aminogruppe an einer von zwei β-Ketten glycosyliert ist. Es gibt also genau eine charakteristische Reaktionsstelle an Hämoglobin A1c. Mit anderen Worten, Hämoglobin A1c fungiert im Hinblick auf die Reaktivität mit mAb, die spezifisch für Hämoglobin A1c sind, als einwertiges Antigen.
In dem Immunoassay der vorliegenden Erfindung kann für die Messung von Hämoglobin A1c zum Beispiel eine Testprobe (wie eine hämolysierte Blutprobe, die durch die Zugabe von gereinigtem Wasser zu Vollblut hergestellt wird) an unlöslichen magnetischen Trägerteilchen (latexbeschichteten magnetischen Teilchen) adsorbiert werden, und dann erfolgt eine Reaktion mit markierten Anti-Hämoglobin-A1c-mAb, so dass auf der Latexbeschichtung vorhandenes Hämoglobin A1c selektiv markiert wird. Die Messung der Konzentration des selektiv vorhandenen Markers erlaubt einen quantitativen Assay auf Hämoglobin A1c. Zum Beispiel wird eine Standardprobe, bei der der Prozentsatz an Hämoglobin A1c bekanntermaßen durch HPLC oder andere gemessen wird, gleichzeitig mittels des Immunoassay der vorliegenden Erfindung quantifiziert, um eine Eichkurve anzufertigen. Auf der Basis dieser Eichkurve ist es möglich, den prozentualen Anteil von Hämoglobin A1c in unbekannten Proben zu bestimmen.
(Monoklonaler Anti-HbA1c-Antikörper)
Der Anti-HbA1c-mAb, der hier verwendet werden kann, umfasst ohne besondere Einschränkung einen beliebigen, solange es sich um Anti-HbA1c-mAb handelt, der gegenüber HbA1c, der adsorbiert ist oder in fester Phase vorliegt, im Wesentlichen reaktiv ist, aber gegenüber HbA0, das in fester Phase vorliegt, im Wesentlichen unreaktiv ist (vorzugsweise reagiert der Anti-HbA1c-mAb weiterhin im Wesentlichen nicht mit entweder HbA1c oder HbA0, die noch in flüssiger Phase vorliegen). Wenn mAb unter Verwendung eines glycierten Peptids als Immunogen hergestellt wird, kann ein solcher monoklonaler Antikörper erhalten werden. Die Reaktivität gegenüber HbA1c und HbA0 kann zum Beispiel so gemessen werden, wie es im Japanischen Patent Nr. 2,677,753 offenbart ist.
In der vorliegenden Erfindung ist es zu bevorzugen, dass der Anti-HbA1c-mAb eine HbA1c-Reaktivität von nicht weniger als 1,0 (besonders bevorzugt nicht weniger als 2,0) auf der Skala eines Immunplatten-Lesegeräts hat, wie es im Japanischen Patent Nr. 2,677,753 beschrieben ist. Es ist auch zu bevorzugen, dass der Anti-HbA1c-mAb eine HbA0-Reaktivität von nicht mehr als 0,1 (besonders bevorzugt nicht mehr als 0,05) auf einer solchen Skala hat.
In der vorliegenden Erfindung ist es zu bevorzugen, dass der Anti-HbA1c-mAb gegenüber nicht denaturiertem HbA1c, gegenüber HbA0 oder gegenüber denaturiertem HbA0 usw. in einer flüssigen Phase unreaktiv ist, selbst in einer Menge von 10 μg/ml (oder weiter 20 μg/ml) Anti-HbA1c-mAb, während er gegenüber denaturiertem HbA1c in einer flüssigen Phase in einer Menge von 1 μg/ml (oder weiter 0,5 μg/ml) Anti-HbA1c-mAb oder weniger reaktiv ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Assays auf HbA1c gemäß der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden offenbart.
In der vorliegenden Erfindung werden gewöhnlich etwa 1 bis 20 μl (oder 2 bis 5 μl) hämolysierte Blutlösung als Testprobe in jedes Röhrchen gegeben. Bei hämolysierten Blutlösungen, die hier tatsächlich verwendet werden, können auch Produkte verwendet werden, die durch Verdünnung einer Testprobe (wie einer Probe, bei der 1 ml gereinigtes Wasser zu 50 μl Vollblut gegeben wird) mit einem Glycinpuffer usw. mit einem Verdünnungsfaktor von etwa 5 bis 10 erhalten werden.
Danach wird ein Aliquot (etwa 100 bis 300 μl (oder 150 bis 200 μl)) einer Suspension von magnetischen Latexteilchen (wie 0,12 μM Suspension eines mit magnetischen Teilchen beschichteten Latex, 0,2% Konzentration) in jedes Röhrchen gegeben, das man dann etwa 1 bis 30 min (oder 3 bis 20 min) bei 37°C stehen lässt, so dass in der Probe vorhandenes HbA1c auf dem Latex adsorbiert wird. Es ist zu bevorzugen, dass die so verwendete Suspension von magnetischen Latexteilchen ein Produkt der Verdünnung einer Originallösung magnetischer Latexteilchen mit einem Glycinpuffer usw. ist.
Dann wird zu HbA1c, das auf dem Latex adsorbiert ist, ein Aliquot (etwa 100 bis 300 μl (oder 150 bis 200 μl)) von Anti-HbA1c-mAb (wie von Mäuseaszites abgeleiteter mAb), der mit einem geeigneten Marker markiert ist, gegeben, und das Gemisch wird etwa 2 bis 30 min (oder 3 bis 10 min) bei 37°C stehen gelassen (inkubiert), so dass HbA1c mit dem markierten mAb reagieren gelassen wird. Es ist zu bevorzugen, dass die Konzentration der so verwendeten mAb-Lösung optimal eingestellt ist, zum Beispiel auf der Basis einer hergestellten Verdünnungsreihe von Anti-HbA1c-mAb. Der für die Verdünnung verwendete Puffer kann 0,05 bis 0,1 M Glycinpuffer (GBS: glycingepufferte Kochsalzlösung; pH 8,1 bis 8,5, mit 0,15 M NaCl) usw. umfassen. Es ist zu bevorzugen, dass der zu diesem Zweck verwendete Puffer ein Tensid (wie Tween 20) in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,5% (oder 0,2 bis 0,3%) enthält, um die physikalische Adsorption von mAb auf der Latexoberfläche zu verhindern.
Wenn auf dem vorliegenden Gebiet Latexteilchen als unlösliche magnetische Trägerteilchen verwendet werden, ist es schwierig, Latexreagentien (Antigen, Antikörper usw. auf Latices als Träger) herzustellen, die ohne Ausnahme eine gleiche Qualität haben, und Produkte in einem stabilen Zustand zu konservieren, während das Vorkommen von unspezifischer Aggregation und Fällung verhindert wird.
Dagegen ermöglicht gemäß der vorliegenden Erfindung die Nichtsensibilisierung des unlöslichen magnetischen Trägers (Latex usw.) mit einem Antigen und einem Antikörper Anwendungen von kommerziell erhältlichem nichtsensibilisiertem magnetischem Latex als solcher als unlöslicher magnetischer Träger. Außerdem ist es nicht immer notwendig, dass der Antikörper ein reines Produkt ist. Wegen des einfachen Reagens ist es weiterhin möglich, seine Lagerstabilität höher zu halten, wodurch es auch für Hersteller vorteilhaft ist. Wie oben er wähnt, können die Reagentien gemäß der vorliegenden Erfindung einfach und leicht hergestellt werden, wobei es jetzt möglich ist, Verfahren unter Verwendung von Reagentien anzugeben, die bei Konservierung eine hohe Stabilität haben.
Bei der Anwendung des Immunoassays der vorliegenden Erfindung können Assaysysteme für die Zielmoleküle der vorliegenden Erfindung oder Zielsubstanzen mit einer Aktivität, die zu dieser im Wesentlichen äquivalent ist, durch Anlehnungen an technische Konzepten konstruiert werden, die vom Fachmann gewöhnlich in Bezug auf allgemeine Bedingungen und Arbeitsschritte, die für die Verfahren jeweils geeignet sind, angegeben werden.
Wegen Einzelheiten zu diesen herkömmlichen technischen Verfahren kann es möglich sein, sich auf eine Vielzahl von Übersichtsartikeln, Texten, Büchern usw. zu beziehen. Es gibt zum Beispiel Hiroshi Irie (Hrsg.), "Radioimmunoassay", Kodansha Ltd., Japan, 1974; Hiroshi Irie (Hrsg.), "Zoku-Radioimmunoassay" (Radioimmunoassay; 2. Auflage), Kodansha Ltd., Japan, 1979; Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.), "Koso Meneki Sokuteiho" (Enzyme Immunoassays), Igaku-Shoin Ltd., Japan, 1978; Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.), "Koso Meneki Sokuteiho" (Enzyme Immunoassays) (2. Auflage), Igaku-Shoin Ltd., Japan, 1982; Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.), "Koso Meneki Sokuteiho" (Enzyme Immunoassays) (3. Auflage), Igaku-Shoin Ltd., Japan, 1987; H. V. Vunakis et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990); J. J. Langone et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Antibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991); etc., und Literaturzitate in den obigen Dokumenten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird insbesondere anhand der folgenden Beispiele, die nur zu Veranschaulichungszwecken angegeben werden, und unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden alle Beispiele unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann gut oder herkömmlicherweise bekannt sind, praktiziert oder können so praktiziert werden.
Beispiel 1
Beziehung zwischen der Oberfläche von Teilchen und dem resultierenden Signal
Hämolysiertes Blut: Rote Blutkörperchen (5 μl), die vom Menschen entnommen wurden, wurden durch Zugabe von gereinigtem Wasser (500 μl) hämolysiert, und das resultierende Gemisch wurde als Testprobe verwendet.
Biotinmarkierter Anti-HbA1c-mAb: NHS-LC-Biotin (Nr. 21335; Pierce) wurde als Biotinylierungsreagens verwendet. Anti-HbA1c-mAb wurde gemäß dem Handbuch, das dem Biotinylierungsreagens beigefügt war, biotinyliert. Nicht umgesetztes Biotin wurde entfernt, indem man eine Dialyse wiederholte. Der verwendete Anti-HbA1c-mAb ist einer, wie er im Patent Nr. 2,677,753 offenbart ist (für diesen monoklonalen Antikörper kann auch das Anti-HbA1c-Agens verwendet werden, das im Hämoglobin-A1c(HbA1c)-Testreagens "RAPIDIA AUTO HbA1c" (Lieferant: FUJIREBIO Inc., Japan; Hersteller: SRL, Inc., Japan) enthalten ist).
Für die unlöslichen magnetischen Trägerteilchen wurde SMG-11 (Fujikura Kasei Co., Ltd., Japan) verwendet. Dieses magnetische Latexteilchenprodukt hatte die folgenden physikalischen Eigenschaften: Teilchengröße (nm): 990 und Dichte: 1,58. Die unlöslichen magnetischen Trägerteilchen wurden mit Wasser verdünnt, um eine wässrige Verdünnungsreihe zu bilden: 2,5%, 0,25% und 0,025%. In 100 μl einer 2,5%igen wässrigen magnetischen Latexteilchenverdünnung betrug die Zahl der Teilchen 3,12·10⁹, und die Oberfläche (m²) betrug 9,59·10^–3. Im Falle der 0,25%igen Verdünnung betrug die Zahl der Teilchen 3,12·10⁸, und die Oberfläche (m²) betrug 9,59·10^–4; und im Falle der 0,025%igen Verdünnung betrug die Zahl der Teilchen 3,12·10⁷, und die Oberfläche (m²) betrug 9,59·10^–5.
Zu 100 μl wässriger Verdünnung von magnetischen Latexteilchen wurden 5 μl hämolysierte Blutlösung gegeben, und das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, um antigene Substanzen daran zu adsorbieren. Danach wurden 50 μl 0,07 mg/ml biotinylierter Anti-HbA1c-mAb hinzugefügt. Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und einmal mit einem ALP-Puffer (1% BSA, 50 mM Imidazol, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,05% Tween 20; pH 7,6), zu dem dann 100 μl Avidin-ALP (*5000; DAKO D-365) gegeben worden war, gewaschen. Das resultierende Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und viermal mit einem ALP-Puffer gewaschen, da ein Biotin-Avidin-System verwendet wurde. Nach der Zugabe von AMPPD (100 μl, Lumigen PPD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) wurde das Gemisch auf eine weiße Platte übertragen. Zehn Minuten später wurde die Menge der Lumineszenz gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Als Ergebnis wurde angenommen, dass die Proteinmenge der hämolysierten Lösung etwa 10 μg beträgt. Daher wurde Folgendes angenommen: Wenn die Teilchen in einer Konzentration von 2,5% und mit einer Oberfläche von 9,6·10^–3 m² vorlagen, war die Menge der Proteine zu gering, und dementspre chend würde während der Reaktion eine Aggregation stattfinden, wodurch es unmöglich wäre, diejenigen Analyten, die in die Träger eingetreten sind, zu bestimmen. Wenn Teilchen mit einer Größe von 1 μm verwendet wurden, schien der Wert, etwa 9,6·10^–3 m², geeignet zu sein.
Beispiel 2
Beziehung zwischen Antikörpermenge und Signal
Zu 100 μl 0,025%iger wässriger Verdünnung von magnetischen Latexteilchen (dasselbe Latexprodukt wie in Beispiel 1 wurde für die unlöslichen magnetischen Trägerteilchen verwendet) wurden 5 μl hämolysierter Lösung (in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt) gegeben, und das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dazu wurde ein Aliquot von biotinyliertem Anti-HbA1c-mAb gegeben (in derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, in einer Menge von 0,048 mg/ml (50 μl, 2,4 μg), 0,0048 mg/ml (50 μl, 0,24 μg) oder 0,00048 mg/ml (50 μl, 0,024 μg)). Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und einmal mit einem ALP-Puffer (1% BSA, 50 mM Imidazol, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,05% Tween 20; pH 7,6) gewaschen. Danach wurden 100 μl Avidin-ALP (dasselbe Reagens wie in Beispiel 1) hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann viermal mit einem ALP-Puffer gewaschen, da ein Biotin-Avidin-System verwendet wurde. Dann wurden 100 μl AMPPD (dasselbe Reagens wie in Beispiel 1) hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf eine weiße Platte übertragen. Zehn Minuten später wurde die Menge der Lumineszenz gemessen.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Als Ergebnis zeigte sich, dass etwa 0,25 μg als Menge des Anti-HbA1c-mAb ausreichend war.
Beispiel 3
Assays mit direkt markierten Antikörpern
Um Assays zu vereinfachen und die Reproduzierbarkeit zu verbessern, wurde Anti-HbA1c-mAb direkt mit ALP markiert.
(1) Alkalische Phosphatase (ALP; Oriental Yeast Co., Ltd., Japan) wurde mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC; DOJINDO, Japan) markiert. Zuerst wurde ALP (10 mg/ml, 100 μl) zu 0,1 M NaHCO₃-Puffer (400 μl) gegeben, und dazu wurden dann 10 μl FITC-Lösung (4 mg FITC in Dimethylformamid (DMF, 1 ml)) gegeben (ALP : FITC = 1 : 10). Das Gemisch wurde 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt, und das resultierende Produkt wurde unter Verwendung von PD-10 (Pharmacia) gewonnen. Für die Elution wurden 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,5, verwendet. FITC-markiertes ALP (1,7 ml) wurde gewonnen.
Das oben hergestellte FITC-markierte ALP (ALP-FITC) wurde maleinimidiert. Zuerst wurde das oben gewonnene ALP-FITC mit Centricon 30 (Millipore) auf 500 μl konzentriert. Danach wurden 10 μl EMCS-Lösung (N-(ε-Maleinimidocaproyloxy)succinimid (EMCS, 6 mg) in DMF (1 ml)) hinzugefügt (ALP-FITC : EMCS = 1 : 20). Das Gemisch wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt, und das resultierende Produkt wurde unter Verwendung von PD-10 (Pharmacia) gewonnen. Für die Elution wurde 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 6,3, der 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, verwendet. Eine Lösung von maleinimidiertem ALP-FITC (1,7 ml) wurde gewonnen.
Inzwischen wurde der Anti-HbA1c-mAb (derselbe Antikörper, der in Beispiel 1 verwendet wurde) in eine SH-Form umgewandelt. So wurden 19,1 mg Anti-HbA1c-mAb (52,4 μl) zu 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,5 (450 μl), gegeben, und dann wurden 10 μl AMSA-Lösung (S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (AMSA, 6 mg) in DMF (1 ml)) hinzugefügt (Antikörper : AMSA = 1 : 50). Das Gemisch wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt, und dazu wurden dann 1 M Tris-Puffer, pH 7,0 (20 μl), der 50 mM EDTA enthielt, und 1 M Hydro xylamin-Hydrochlorid-Lösung, pH 7,0 (20 μl), gegeben. Das Gemisch wurde 15 min lang bei Raumtemperatur gerührt, und das resultierende Produkt wurde unter Verwendung von PD-10 (Pharmacia) gewonnen. Zur Elution wurde 0,1 M NaH₂PO₄, pH 6,3, die 5 mM EDTA enthält, verwendet. Ein Antikörper in der SH-Form (IgG-SH, 1,7 ml) wurde gewonnen.
Danach wurde die Gesamtmenge des oben hergestellten maleinimidierten ALP-FITC mit der Gesamtmenge des oben hergestellten IgG-SH gemischt. Als Mischungsverhältnis wurde ALP : IgG = 1,5 : 1 (Stoffmengenverhältnis) angenommen. Nach 2 h Reaktion bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Centricon (Millipore) auf 500 μl konzentriert und einer Gelfiltration (verwendeter Träger: Superose^TM 12; Pharmacia) unterzogen, was ALP-markierten Anti-HbA1c-mAb ergab.
(2) Zu 100 μl 0,025%iger Verdünnung von magnetischen Latexteilchen (derselben Latexverdünnung wie in Beispiel 1) wurden 5 μl hämolysierte Blutlösung (dieselbe Blutprobe wie in Beispiel 1) gegeben. Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurde ALP-markierter Anti-HbA1c-mAb hinzugefügt. Als Antikörper wurden 50 μl 5 μg/ml IgG hinzugefügt. Eine Antikörperverdünnung, bei der der Antikörper mit PBS-Tween verdünnt wurde, und eine andere Antikörperverdünnung, bei der der Antikörper mit BSA-haltigem Puffer verdünnt wurde, wurden zum Vergleich ebenfalls verwendet. Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann viermal mit PBS-Tween gewaschen. Nach der Zugabe von AMPPD (100 μl, dasselbe Reagens wie in Beispiel 1) wurde das Gemisch auf eine weiße Platte übertragen. Fünfzehn Minuten später wurde die Menge der Lumineszenz gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Wenn nach der Zugabe des Antikörpers Protein coexistiert, wurde beobachtet, dass der Hintergrund abgesenkt wurde. Infolge der Absenkung des Hintergrunds kann eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit erwartet werden. Es wurde bestätigt, dass das Signal im Vergleich zu dem Fall von Avidin-ALP erhöht war. 4 zeigt die Ergebnisse einer Überprüfung der Korrelation zwischen dem Hämoglobin-A1c(HbA1c)-Testreagens "RAPIDIA AUTO HbA1c" (Lieferant: FUJIREBIO Inc., Japan; Hersteller: SRL, Inc., Japan) mit einem Latexaggregationsverfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die Existenz einer guten Korrelation wurde bestätigt.
Beispiel 4
Vergleich aufgrund von Schwankungen bei den unlöslichen magnetischen Trägerteilchen
Dieselben Arbeitsschritte und Reagentien wie in Beispiel 3 wurden angewendet. Die Latexteilchen von Fujikura Kasei (Fujikura Kasei Co., Ltd., Japan), wie sie in den Beispielen 1 bis 3 verwendet wurden, wurden mit den VERITAS-Latexteilchen (VERITAS Corporation, Japan) verglichen. Messungen wurden durchgeführt, bei denen jede Gesamtoberfläche des für die Assays zu verwendenden Magnetteilchenreagentien gleich eingestellt wurde.
Die VERITAS-Latexteilchen hatten eine Teilchengröße von 2,8 μm, eine Teilchenkonzentration von 4,0·10⁹ Teilchen/ml, eine Fläche (berechnet) von 2,46·10^–11 und eine Oberfläche pro Assay von 9,59·10^–5 m²/Teilchen (für Einstellung auf m² ist 1 μl erforderlich). Die VERITAS-Latexteilchen wurden mit Wasser unter Bildung einer 100fachen Verdünnung verdünnt. Die VERITAS-Latexteilchenverdünnung wurde in einer Menge von 100 μl verwendet.
Zu 100 μl jeder Suspension von magnetischen Teilchen (Oberfläche: 9,59·10^–11 m²) wurden 5 μl hämolysierte Blutlösung gegeben, und das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde ALP-markierter Anti-HbA1c-mAb zu dem Gemisch gegeben. Als Antikörper wurden 50 μl 5 μg/ml IgG hinzugefügt. Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und viermal mit PBS-Tween, zu dem 100 μl AMPPD (dasselbe Reagens wie in Beispiel 1) gegeben worden war, gewaschen. Das resultierende Gemisch wurde auf eine weiße Platte übertragen. Zehn Minuten später wurde die Menge der Lumineszenz gemessen.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Als Eichsubstanz wurde das Hämoglobin-A1c(HbA1c)-Testreagens "RAPIDIA AUTO HbA1c" (Lieferant: FUJIREBIO Inc., Japan; Hersteller: SRL, Inc., Japan) verwendet.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Der Immunoassay der vorliegenden Erfindung erlaubt einfache, zweckmäßige und schnelle Messungen von antigenen Substanzen in Testproben ohne mühsame Vorbehandlung, wodurch die gleichzeitige parallele Behandlung einer sehr großen Zahl von Proben sehr erleichtert wird. Außerdem sind solche Assayverfahren zweckmäßigerweise auf vollautomatische Instrumente für klinische Tests anwendbar. Daher ist es möglich, Messschritte zu automatisieren und Massenbehandlungen durchzuführen. Weiterhin gibt es gemäß der vorliegenden Erfindung Vorteile nicht nur bezüglich des Assays an sich, sondern auch bezüglich der Herstellung der Reagentien. So ist es bei der Herstellung von magnetischen Latexreagentien (Latex, an den Antigen, Antikörper usw. gebunden sind) im Allgemeinen nicht immer leicht, Reagentien mit gleicher Qualität herzustellen. Außerdem wird das Praxiswissen benötigt, um eine Aggregation und Fällung während der Lagerung zu verhindern. Im Allgemeinen stellen die Kosten für die Latexmaterialien lediglich einen kleineren Teil der Ausgaben für das diagnostische Latexreagens dar, und der größte Teil der Reagentienkosten ist den Kosten für Biomaterialien und den Ausgaben, die für Schritte der Beschichtung der Latexteilchen mit den Biomaterialien erforderlich sind, zuzuschreiben. In dieser Hinsicht ist der unlösliche magnetische Träger (wie ein Latex) gemäß der vorliegenden Erfindung weder mit einem Antigen noch mit einem Antikörper wesentlich sensibilisiert, was die Anwendung von kommerziell erhältlichen unlöslichen magnetischen Trägern (Latex usw.) für Testreagentien an sich ohne jede Modifikation ermöglicht, so dass es nicht wesentlich ist, ein "Latexreagens" neu herzustellen. Außerdem müssen die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung nicht immer gereinigte Produkte sein, und ihre notwendige Menge wird ebenfalls stark reduziert sein. Die Produktion von Testreagentien wird also leichter, und es gibt sehr große Vorteile in Bezug auf die Haltbarkeit.

Claims

Immunoassay unter Verwendung eines unlöslichen Trägerteilchens, umfassend: (i) Verwendung eines unlöslichen magnetischen Trägerteilchens in einem Zustand, in dem es im Wesentlichen frei von jedem adsorbierten Antigen und/oder Antikörper ist; (ii) Adsorbieren einer antigenen Substanz in einer Testprobe auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen oder Binden der antigenen Substanz an das unlösliche magnetische Trägerteilchen; (iii) Umsetzen des resultierenden unlöslichen magnetischen Trägerteilchens aus der obigen Behandlung (ii) mit einem Antikörper, bei dem es sich um einen markierten Antikörper handelt, der gegenüber einem Teil der antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist, wobei der Antikörper gegenüber einer Festphasenform der antigenen Substanz spezifisch reaktiv ist, aber gegenüber einer nativen Form der antigenen Substanz im Wesentlichen unreaktiv ist, wobei die in der Festphasenform vorliegende antigene Substanz an das unlösliche Trägerteilchen gebunden ist und die im nativen Zustand vorliegende antigene Substanz in einer flüssigen Phase vorhanden ist; und (iv) Messen des Markers an dem resultierenden markierten Antikörper, der durch die in Festphasenform vorliegende antigene Substanz abgefangen wurde, als Indikator.
Immunoassay gemäß Anspruch 1, wobei der Immunoassay Folgendes umfasst: (A) Adsorbieren der antigenen Substanz in der Testprobe auf dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen oder Binden der antigenen Substanz an das unlösliche magnetische Trägerteilchen; und (B) dann Umsetzen der abgefangenen antigenen Substanz mit dem gegenüber der in Festphasenform vorliegenden antigenen Substanz spezifisch reaktiven Antikörper, ohne die Testprobe durch Waschen zu entfernen.
Immunoassay gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Immunoassay Folgendes umfasst: (a) Umsetzen des markierten Antikörpers mit dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen, an das die antigene Substanz in der Testprobe adsorbiert oder gebunden ist; (b) dann Abtrennen des nicht umgesetzten markierten Antikörpers von dem unlöslichen magnetischen Trägerteilchen in Gegenwart einer Magnetfeldeinwirkung; und (c) Messen des Markers an dem resultierenden markierten Antikörper, der durch die in Festphasenform vorliegende antigene Substanz abgefangen wurde, als Indikator.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper monoklonal ist.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper polyklonal ist.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus feinen Teilchen ausgewählt ist, wobei das feine Teilchen in einem wässrigen flüssigen Medium im Wesentlichen unlöslich ist und aus einer organischen Polymermaterialphase und einer magnetischen Materialphase besteht.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus feinen Teilchen ausgewählt ist, wobei das feine Teilchen nicht nur eine Hüllphase, die aus einem oder mehreren organischen Polymermaterialien besteht, sondern auch eine Kernphase, die aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht, umfasst.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus Latexteilchen ausgewählt ist, wobei das Latexteilchen (a) eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 0,01 bis 20 μm hat und (b) einen Kern aufweist, der aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das unlösliche magnetische Trägerteilchen aus Latexteilchen ausgewählt ist, wobei das Latexteilchen eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 0,1 bis 6 μm hat und einen Kern aufweist, der aus einem oder mehreren magnetischen Materialien besteht.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Immunoassay von der Ausgabe der Testprobe bis zum Erreichen der Testergebnisse mit einem Autoanalyzer der klinischen Chemie, der für magnetische Teilchen geeignet ist, automatisiert durchgeführt werden kann.
Immunoassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der antigenen Substanz in der Testprobe um HbA1c handelt.