ES2989473T3 - Aparatos para clasificar partículas objetivo - Google Patents

Aparatos para clasificar partículas objetivo Download PDF

Info

Publication number
ES2989473T3
ES2989473T3 ES17870339T ES17870339T ES2989473T3 ES 2989473 T3 ES2989473 T3 ES 2989473T3 ES 17870339 T ES17870339 T ES 17870339T ES 17870339 T ES17870339 T ES 17870339T ES 2989473 T3 ES2989473 T3 ES 2989473T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
extraction
cells
scanner
substrate
target particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17870339T
Other languages
English (en)
Inventor
Ivan K Dimov
Nathaniel Fernhoff
Lagnajeet Pradhan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Orca Biosystems Inc
Original Assignee
Orca Biosystems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orca Biosystems Inc filed Critical Orca Biosystems Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2989473T3 publication Critical patent/ES2989473T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50853—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates with covers or lids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5088—Rigid containers without fluid transport within confining liquids at a location by surface tension, e.g. virtual wells on plates, wires
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
    • B01L9/523—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for multisample carriers, e.g. used for microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G01N15/1436—Optical arrangements the optical arrangement forming an integrated apparatus with the sample container, e.g. a flow cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01S—DEVICES USING THE PROCESS OF LIGHT AMPLIFICATION BY STIMULATED EMISSION OF RADIATION [LASER] TO AMPLIFY OR GENERATE LIGHT; DEVICES USING STIMULATED EMISSION OF ELECTROMAGNETIC RADIATION IN WAVE RANGES OTHER THAN OPTICAL
    • H01S5/00—Semiconductor lasers
    • H01S5/10—Construction or shape of the optical resonator, e.g. extended or external cavity, coupled cavities, bent-guide, varying width, thickness or composition of the active region
    • H01S5/18—Surface-emitting [SE] lasers, e.g. having both horizontal and vertical cavities
    • H01S5/183—Surface-emitting [SE] lasers, e.g. having both horizontal and vertical cavities having only vertical cavities, e.g. vertical cavity surface-emitting lasers [VCSEL]
    • H01S5/18386—Details of the emission surface for influencing the near- or far-field, e.g. a grating on the surface
    • H01S5/18388—Lenses
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01S—DEVICES USING THE PROCESS OF LIGHT AMPLIFICATION BY STIMULATED EMISSION OF RADIATION [LASER] TO AMPLIFY OR GENERATE LIGHT; DEVICES USING STIMULATED EMISSION OF ELECTROMAGNETIC RADIATION IN WAVE RANGES OTHER THAN OPTICAL
    • H01S5/00—Semiconductor lasers
    • H01S5/40—Arrangement of two or more semiconductor lasers, not provided for in groups H01S5/02 - H01S5/30
    • H01S5/42—Arrays of surface emitting lasers
    • H01S5/423—Arrays of surface emitting lasers having a vertical cavity
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0605—Metering of fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Esta divulgación proporciona métodos y aparatos para clasificar partículas objetivo. En diversas realizaciones, la divulgación proporciona un casete para clasificar partículas objetivo, métodos para clasificar partículas objetivo, métodos para cargar un microcanal para mantener la viabilidad del material de muestra, métodos para cuantificar el material de muestra y un aparato óptico para escaneo láser y clasificación de partículas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Aparatos para clasificar partículas objetivo
Antecedentes de la invención
A través de tecnologías convencionales, el material biológico puede cribarse en busca de componentes biológicos, tales como células, anticuerpos, proteínas, péptidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, aún persiste una serie de desafíos en la identificación, el aislamiento y la caracterización de componentes biológicos. Por ejemplo, algunos dispositivos y métodos requieren múltiples etapas de selección que consumen mucho tiempo. Adicionalmente, algunos dispositivos y métodos no logran evitar la contaminación de las muestras, no logran detectar de forma precisa múltiples señales positivas, no logran aislar células viables, no logran detectar células y no logran diferenciar una única célula de múltiples células. Algunos dispositivos y métodos también están limitados en cuanto al número de células que pueden cribarse con una agilidad razonable.
El documento US 2016/245805A divulga matrices de microcavidades y métodos para el análisis bioquímico y biofísico cuantitativo de poblaciones de variantes biológicas y la extracción basada en láser de contenidos de microcavidades. Los ejemplos incluyen un análisis de alto rendimiento de células y los productos proteicos usan una gama de ensayos de fluorescencia, incluyendo la medición de afinidad de unión y ensayos enzimáticos de resolución temporal.
El documento US 2014/011690A divulga un método para detectar uno o más analitos en una muestra. El método se basa, en parte, en la capacidad de partículas funcionalizadas añadidas a la muestra para inhibir parcial o completamente la transmisión de radiación electromagnética hacia dentro y hacia fuera de la muestra a través de una superficie de detección en un recipiente de reacción que contiene la muestra. En un formato de micromatriz, la invención puede usarse para cribar millones, miles de millones o más elementos biológicos, tales como un organismo, célula, proteína, ácido nucleico, lípido, sacárido, metabolito o moléculas pequeñas.
El documento US 2016/129443A divulga un método y un sistema para el aislamiento de gotitas del orden de picolitros de una corriente continua de fluido portador en un sistema microfluídico. En particular, la divulgación se refiere a un sistema que comprende un clasificador, un detector y un colector. El clasificador sirve para seleccionar gotitas del orden de picolitros con un contenido deseado basándose en una señal óptica obtenida a partir de las gotitas del orden de picolitros. Las gotitas del orden de picolitros seleccionadas son guiadas hacia el detector que comprende un canal de detección que está dispuesto perpendicularmente a un haz de luz. Por medio de un fotodetector que está alineado con el eje óptico del haz de luz puede detectarse el paso de las gotitas del orden de picolitros. El colector comprende múltiples pocillos y la detección del paso de las gotitas del orden de picolitros da como resultado un movimiento relativo del detector y un colector de tal modo que la gotita del orden de picolitros se aísla depositando la misma en uno de dichos pocillos. La divulgación se refiere además a un método que usa un sistema de este tipo para aislar gotitas de picolitros individuales. En particular, la divulgación se refiere a un método que permite un análisis y/o procesamiento adicional del contenido de las gotitas del orden de picolitros que han sido aisladas a partir de un sistema microfluídico depositándolas en un pocillo.
En consecuencia, existe actualmente una necesidad en la técnica de nuevos métodos y aparatos para identificar, aislar, clasificar y caracterizar material biológico, en particular, material celular. La presente divulgación aborda esta deficiencia con nuevos métodos y aparatos para clasificar material celular viable así como otras partículas objetivo.
Sumario de la invención
La presente divulgación proporciona nuevos métodos y aparatos para clasificar partículas objetivo, incluyendo material celular viable y sus productos.
La divulgación proporciona un aparato para clasificar partículas objetivo, comprendiendo el aparato una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una superficie o en una pluralidad de canales, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la superficie o de una pluralidad de canales, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la superficie o la pluralidad de canales, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de la superficie o los canales, en donde el aparato está configurado para procesar la superficie o pluralidad de canales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo, en donde el escáner, el haz de excitación y el haz de extracción se disponen con una óptica para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción a lo largo de la pluralidad de canales, estando el haz de excitación separado del haz de extracción, en donde las ópticas comprenden una lente objetivo y en donde la fuente de excitación, la lente objetivo y el detector se disponen en una configuración confocal.
El aparato que comprende una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una superficie, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la superficie, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la superficie, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de la superficie, en donde el aparato está configurado para procesar la superficie a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo.
El aparato que comprende una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una pluralidad de canales, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de una pluralidad de canales, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la pluralidad de canales, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de los canales, en donde el aparato está configurado para procesar la pluralidad de canales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo.
En ciertas realizaciones, la circuitería, el láser de extracción y el detector están configurados para procesar la superficie o la pluralidad de canales a una velocidad dentro del intervalo de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 20.000.000 de partículas objetivo por segundo. El escáner puede acoplarse ópticamente al haz de excitación y al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción juntos a lo largo de la superficie o pluralidad de canales.
El escáner y una pluralidad de haces de extracción se disponen con ópticas para escanear los haces de extracción hacia la superficie o pluralidad de canales con los haces de extracción separados entre sí y modulados independientemente. En ciertas realizaciones, las ópticas están configuradas para enfocar simultáneamente el haz de excitación a una primera ubicación en la superficie o un primer canal de la pluralidad de canales y el haz de extracción a una segunda ubicación en la superficie o un segundo canal de la pluralidad de canales, en donde la primera ubicación se separa de la segunda ubicación una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 5 mm y opcionalmente en donde la distancia se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 250 pm a aproximadamente 1 mm. En ciertas realizaciones, en donde el escáner, las ópticas, el haz de excitación y el haz de extracción se disponen para enfocar simultáneamente el haz de excitación a una primera ubicación en la superficie o un primer canal de la pluralidad de canales y el haz de extracción a una segunda ubicación en la superficie o un segundo canal de la pluralidad de canales, en donde la primera ubicación se separa de la segunda ubicación una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 1 mm.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende una o más superficies de espejo sustancialmente planas, y en donde el haz de excitación y el haz de extracción se disponen para reflejarse juntos desde cada una de la pluralidad de superficies de espejo sustancialmente planas.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende un primer escáner para reflejar y escanear con el haz de excitación y un segundo escáner para reflejar y escanear con el haz de extracción, en donde la circuitería está configurada para coordinar el escaneo del haz de excitación con el primer escáner y el escaneo del haz de extracción con el segundo escáner a lo largo de la matriz para retirar selectivamente partículas objetivo de la superficie o la pluralidad de canales.
En ciertas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se ubican en un lado de un sustrato que define la superficie o la pluralidad de canales. En algunas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se ubican en lados opuestos de un soporte que define la superficie o la pluralidad de canales. En ciertas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico, un modulador acústico-óptico, sistema de procesamiento de luz digital (DLPS) y un escáner resonante. En ciertas realizaciones, el escáner se selecciona del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico y un modulador acústico-óptico.
En ciertas realizaciones, la circuitería y el detector están configurados para detectar la fluorescencia de una partícula objetivo por encima de una cantidad umbral en cada ubicación de la superficie o cada canal de la pluralidad de canales y, basándose en la respuesta de fluorescencia, para irradiar selectivamente cada ubicación de la superficie o cada canal de la pluralidad de canales, en donde la duracción de tiempo que transcurre entre la fluorescencia y la irradiación se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 10 ns a aproximadamente 100 ps, opcionalmente dentro de un intervalo de aproximadamente 100 ns a aproximadamente 10 ps. En ciertas realizaciones, la fuente de luz de excitación, el láser de extracción y la circuitería se sincronizan con un reloj compartido. En ciertas realizaciones, la fuente de luz de excitación está configurada para emitir una pluralidad de longitudes de onda, comprendiendo cada una de la pluralidad de longitudes de onda un pico separado de otros picos de la pluralidad de longitudes de onda. La fuente de luz de excitación puede seleccionarse del grupo que consiste en LED y láseres.
En ciertas realizaciones, la lente objetivo comprende una óptica F-theta. En ciertas realizaciones, el escáner comprende un espejo y las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a una ubicación de la superficie a través de la lente objetivo con el espejo a un primer ángulo y para transmitir una primera luz fluorescente desde una primera partícula objetivo en la ubicación de la superficie al detector a través de la lente objetivo con el espejo al primer ángulo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a una segunda ubicación de la superficie a través de la lente objetivo con el espejo a un segundo ángulo y para transmitir luz fluorescente desde una segunda partícula objetivo en la segunda ubicación de la superficie al detector a través de la lente objetivo con el espejo al segundo ángulo, para escanear con el haz de excitación hacia una pluralidad de ubicaciones en la superficie y medir la fluorescencia desde la pluralidad de ubicaciones en la superficie con la configuración confocal.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende un espejo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a un primer canal de la pluralidad de canales a través de la lente objetivo con el espejo a un primer ángulo y para transmitir una primera luz fluorescente desde una primera partícula objetivo en el primer canal de la pluralidad de canales al detector a través de la lente objetivo con el espejo al primer ángulo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a un segundo canal de la pluralidad de canales a través de la lente objetivo con el espejo a un segundo ángulo y para transmitir luz fluorescente desde una segunda partícula objetivo en el segundo canal de la pluralidad de canales al detector a través de la lente objetivo con el espejo al segundo ángulo, para escanear con el haz de excitación hacia una pluralidad de canales y medir la fluorescencia desde la pluralidad de canales con la configuración confocal.
En ciertas realizaciones, las ópticas se disponen para transmitir el haz de excitación coaxialmente con un campo de visión del detector a través de la lente objetivo. En ciertas realizaciones, un campo de visión del detector no es mayor que aproximadamente 100 mm a lo largo de una superficie de un sustrato que define la superficie o la pluralidad de canales cuando el haz de excitación se enfoca en una ubicación de la superficie o un canal de la pluralidad de canales y opcionalmente en donde el haz está configurado para utilizar luz de excitación conjugada al infinito difusa. En ciertos ejemplos, el detector comprende un campo de visión en la superficie o la pluralidad de canales, y en donde un tamaño máximo de la sección transversal de la mitad de la anchura total del haz en la superficie o la pluralidad de canales no es mayor que el campo de visión en la superficie o la pluralidad de canales y, opcionalmente, en donde el tamaño máximo de la sección transversal de la mitad de la anchura total no es mayor que aproximadamente la mitad del campo de visión. En ciertas realizaciones, el campo de visión del detector se define con una estructura óptica seleccionada del grupo que consiste en una abertura, una dimensión a lo largo de la abertura, un orificio estenopeico, espejo, y una dimensión máxima a lo largo de una superficie reflectante a lo largo de un espejo.
En ciertas realizaciones, el detector comprende una pluralidad de detectores y en donde un campo de visión de cada uno de la pluralidad de detectores se dispone en la configuración confocal con el haz de excitación. En ciertas realizaciones, el haz de excitación comprende una pluralidad de haces de excitación solapantes y en donde cada uno de la pluralidad de haces de excitación se dispone en la configuración confocal con el detector. En ciertas realizaciones, el haz de excitación comprende un primer haz de excitación y un segundo haz de excitación y en donde un primer campo de visión de un primer detector es confocal con el primer haz de excitación y un segundo campo de visión de un segundo detector es confocal con el segundo haz de excitación.
En ciertas realizaciones, una dimensión de sección transversal máxima de cada uno de la pluralidad de canales se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm para contener una única partícula objetivo. En ciertas realizaciones, la circuitería está configurada para pulsar el haz de extracción en respuesta a la fluorescencia de una partícula objetivo con una cantidad de energía suficiente para extraer la partícula objetivo de la superficie o el canal y permitir que la partícula objetivo sobreviva y, opcionalmente, en donde una cantidad de energía para extraer la partícula objetivo se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 pJ a aproximadamente 1000 pJ. En ciertas realizaciones, la circuitería está configurada para generar una pluralidad de pulsos para extraer una pluralidad de partículas objetivo, y en donde una cantidad de energía de extracción para cada partícula objetivo extraída se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 1 pJ a aproximadamente 50 pJ, y en donde una duración de la energía de extracción para cada partícula objetivo extraída se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 ns a aproximadamente 1000 ns y en donde una potencia de extracción pico para cada una de la pluralidad de partículas objetivo extraídas se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 W a aproximadamente 107 W.
Breve descripción de los dibujos
En las reivindicaciones adjuntas se exponen características de la invención con particularidad. Se obtendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención por
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para cuantificar el número de partículas objetivo en un microcanal de un sustrato, comprendiendo el método en primer lugar añadir una mezcla de muestra a un microcanal de un sustrato, después de añadir la mezcla de muestra, añadir partículas marcadas con un material fluorescente a los microcanales del sustrato y cuantificar el número de partículas objetivo en los microcanales.
En ciertas realizaciones, la cuantificación del número de partículas objetivo en los microcanales se realiza usando microscopía. Las partículas pueden ser perlas opacas. Las perlas opacas pueden seleccionarse de Dynabead, agarosa y ProMag. En ciertas realizaciones, las partículas se añaden aproximadamente 5 minutos o más después de que la mezcla de muestra se añada a los microcanales. En ciertas realizaciones, las partículas objetivo comprenden una célula.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para cuantificar el número de partículas objetivo en un microcanal de un sustrato, comprendiendo el método añadir una mezcla de muestra que comprende partículas objetivo a un microcanal de un sustrato, añadir un material fluorescente a los microcanales del sustrato y cuantificar el número de partículas objetivo en los microcanales detectando la fluorescencia emitida desde los microcanales, en donde la intensidad de la fluorescencia emitida se correlaciona con el recuento de partículas objetivo.
En ciertas realizaciones, el material fluorescente está en solución. En ciertas realizaciones, la mezcla de muestra y el material fluorescente se añaden concurrentemente a los microcanales. El material fluorescente puede estar asociado con las partículas objetivo. En ciertas realizaciones, la fluorescencia emitida alta se correlaciona con un recuento de partículas objetivo bajo o ningún recuento de partículas objetivo y la baja fluorescencia emitida se correlaciona con un recuento de partículas objetivo alto. En ciertas realizaciones, la partícula objetivo es una célula.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un casete para detectar y clasificar partículas objetivo, comprendiendo el casete un sustrato con una primera superficie y una segunda superficie, en donde la segunda superficie está configurada para adherir una mezcla de material de muestra a la segunda superficie, un primer alojamiento configurado para recibir el sustrato en donde el primer alojamiento comprende una superficie interna para recibir una partícula objetivo liberada desde el sustrato, un segundo alojamiento acoplado al primer alojamiento de una forma en donde el primer y el segundo alojamiento conjuntamente encapsulan el sustrato y en donde el primer o el segundo alojamiento comprende además un primer acceso de llenado y una porción transmisiva ubicada en uno o cada uno del primer alojamiento y el segundo alojamiento, en donde la porción transmisiva permite la transmisión de radiación electromagnética desde el exterior del casete al sustrato.
En ciertas realizaciones, la segunda superficie del sustrato está al menos parcialmente recubierta para aumentar la adhesión de la mezcla de material de muestra a la segunda superficie. En ciertas realizaciones, la segunda superficie del sustrato está al menos parcialmente recubierta para aumentar la adhesión de partículas objetivo a la segunda superficie. En ciertas realizaciones, el sustrato comprende vidrio.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un aparato para clasificar partículas objetivo, comprendiendo el aparato una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una superficie o en una pluralidad de canales, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la superficie o de una pluralidad de canales, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la superficie o la pluralidad de canales, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de la superficie o los canales, en donde el aparato está configurado para procesar la superficie o pluralidad de canales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo.
En ciertas realizaciones, el aparato que comprende una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una superficie, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la superficie, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la superficie, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de la superficie, en donde el aparato está configurado para procesar la superficie a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo.
En ciertas realizaciones, el aparato que comprende una fuente de luz de excitación para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una pluralidad de canales, un detector para recibir luz fluorescente desde las partículas objetivo, un láser de extracción para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de una pluralidad de canales, un escáner acoplado al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la pluralidad de canales, y una circuitería acoplada al detector y al haz de extracción para retirar selectivamente partículas objetivo en respuesta a la fluorescencia detectada de los canales, en donde el aparato está configurado para procesar la pluralidad de canales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo.
En ciertas realizaciones, la circuitería, el láser de extracción y el detector están configurados para procesar la superficie o la pluralidad de canales a una velocidad dentro del intervalo de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 20.000.000 de partículas objetivo por segundo. El escáner puede acoplarse ópticamente al haz de excitación y al haz de extracción para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción juntos a lo largo de la superficie o pluralidad de canales.
En ciertas realizaciones, el escáner, el haz de excitación y el haz de extracción se disponen con ópticas para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción hacia la superficie o pluralidad de canales con el haz de excitación separado del haz de extracción. En algunas realizaciones, el escáner y una pluralidad de haces de extracción se disponen con ópticas para escanear los haces de extracción hacia la superficie o pluralidad de canales con los haces de extracción separados entre sí y modulados independientemente. En ciertas realizaciones, las ópticas están configuradas para enfocar simultáneamente el haz de excitación a una primera ubicación en la superficie o un primer canal de la pluralidad de canales y el haz de extracción a una segunda ubicación en la superficie o un segundo canal de la pluralidad de canales, en donde la primera ubicación se separa de la segunda ubicación una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 5 mm y opcionalmente en donde la distancia se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 250 pm a aproximadamente 1 mm. En ciertas realizaciones, en donde el escáner, las ópticas, el haz de excitación y el haz de extracción se disponen para enfocar simultáneamente el haz de excitación a una primera ubicación en la superficie o un primer canal de la pluralidad de canales y el haz de extracción a una segunda ubicación en la superficie o un segundo canal de la pluralidad de canales, en donde la primera ubicación se separa de la segunda ubicación una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 1 mm.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende una o más superficies de espejo sustancialmente planas, y en donde el haz de excitación y el haz de extracción se disponen para reflejarse juntos desde cada una de la pluralidad de superficies de espejo sustancialmente planas.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende un primer escáner para reflejar y escanear con el haz de excitación y un segundo escáner para reflejar y escanear con el haz de extracción, en donde la circuitería está configurada para coordinar el escaneo del haz de excitación con el primer escáner y el escaneo del haz de extracción con el segundo escáner a lo largo de la matriz para retirar selectivamente partículas objetivo de la superficie o la pluralidad de canales.
En ciertas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se ubican en un lado de un sustrato que define la superficie o la pluralidad de canales. En algunas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se ubican en lados opuestos de un soporte que define la superficie o la pluralidad de canales. En ciertas realizaciones, el primer escáner y el segundo escáner se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico, un modulador acústico-óptico, sistema de procesamiento de luz digital (DLPS) y un escáner resonante. En ciertas realizaciones, el escáner se selecciona del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico y un modulador acústico-óptico.
En ciertas realizaciones, la circuitería y el detector están configurados para detectar la fluorescencia de una partícula objetivo por encima de una cantidad umbral en cada ubicación de la superficie o cada canal de la pluralidad de canales y, basándose en la respuesta de fluorescencia, para irradiar selectivamente cada ubicación de la superficie o cada canal de la pluralidad de canales, en donde la duracción de tiempo que transcurre entre la fluorescencia y la irradiación se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 10 ns a aproximadamente 100 ps, opcionalmente dentro de un intervalo de aproximadamente 100 ns a aproximadamente 10 ps. En ciertas realizaciones, la fuente de luz de excitación, el láser de extracción y la circuitería se sincronizan con un reloj compartido. En ciertas realizaciones, la fuente de luz de excitación está configurada para emitir una pluralidad de longitudes de onda, comprendiendo cada una de la pluralidad de longitudes de onda un pico separado de otros picos de la pluralidad de longitudes de onda. La fuente de luz de excitación puede seleccionarse del grupo que consiste en LED y láseres. En ciertas realizaciones, la óptica comprende una lente objetivo y en donde la fuente de excitación, la lente objetivo y el detector se disponen en una configuración confocal.
En ciertas realizaciones, la lente objetivo comprende una óptica F-theta. En ciertas realizaciones, el escáner comprende un espejo y las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a una ubicación de la superficie a través de la lente objetivo con el espejo a un primer ángulo y para transmitir una primera luz fluorescente desde una primera partícula objetivo en la ubicación de la superficie al detector a través de la lente objetivo con el espejo al primer ángulo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a una segunda ubicación de la superficie a través de la lente objetivo con el espejo a un segundo ángulo y para transmitir luz fluorescente desde una segunda partícula objetivo en la segunda ubicación de la superficie al detector a través de la lente objetivo con el espejo al segundo ángulo, para escanear con el haz de excitación hacia una pluralidad de ubicaciones en la superficie y medir la fluorescencia desde la pluralidad de ubicaciones en la superficie con la configuración confocal.
En ciertas realizaciones, el escáner comprende un espejo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a un primer canal de la pluralidad de canales a través de la lente objetivo con el espejo a un primer ángulo y para transmitir una primera luz fluorescente desde una primera partícula objetivo en el primer canal de la pluralidad de canales al detector a través de la lente objetivo con el espejo al primer ángulo y en donde las ópticas se disponen para enfocar el haz de excitación a un segundo canal de la pluralidad de canales a través de la lente objetivo con el espejo a un segundo ángulo y para transmitir luz fluorescente desde una segunda partícula objetivo en el segundo canal de la pluralidad de canales al detector a través de la lente objetivo con el espejo al segundo ángulo, para escanear con el haz de excitación hacia una pluralidad de canales y medir la fluorescencia desde la pluralidad de canales con la configuración confocal.
En ciertas realizaciones, las ópticas se disponen para transmitir el haz de excitación coaxialmente con un campo de visión del detector a través de la lente objetivo. En ciertas realizaciones, un campo de visión del detector no es mayor que aproximadamente 100 mm a lo largo de una superficie de un sustrato que define la superficie o la pluralidad de canales cuando el haz de excitación se enfoca en una ubicación de la superficie o un canal de la pluralidad de canales y opcionalmente en donde el haz está configurado para utilizar luz de excitación conjugada al infinito difusa. En ciertas realizaciones, el detector comprende un campo de visión en la superficie o la pluralidad de canales, y en donde un tamaño máximo de la sección transversal de la mitad de la anchura total del haz en la superficie o la pluralidad de canales no es mayor que el campo de visión en la superficie o la pluralidad de canales y, opcionalmente, en donde el tamaño máximo de la sección transversal de la mitad de la anchura total no es mayor que aproximadamente la mitad del campo de visión. En ciertas realizaciones, el campo de visión del detector se define con una estructura óptica seleccionada del grupo que consiste en una abertura, una dimensión a lo largo de la abertura, un orificio estenopeico, espejo, y una dimensión máxima a lo largo de una superficie reflectante a lo largo de un espejo.
En ciertas realizaciones, el detector comprende una pluralidad de detectores y en donde un campo de visión de cada uno de la pluralidad de detectores se dispone en la configuración confocal con el haz de excitación. En ciertas realizaciones, el haz de excitación comprende una pluralidad de haces de excitación solapantes y en donde cada uno de la pluralidad de haces de excitación se dispone en la configuración confocal con el detector. En ciertas realizaciones, el haz de excitación comprende un primer haz de excitación y un segundo haz de excitación y en donde un primer campo de visión de un primer detector es confocal con el primer haz de excitación y un segundo campo de visión de un segundo detector es confocal con el segundo haz de excitación.
En ciertas realizaciones, una dimensión de sección transversal máxima de cada uno de la pluralidad de canales se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm para contener una única partícula objetivo. En ciertas realizaciones, la circuitería está configurada para pulsar el haz de extracción en respuesta a la fluorescencia de una partícula objetivo con una cantidad de energía suficiente para extraer la partícula objetivo de la superficie o el canal y permitir que la partícula objetivo sobreviva y, opcionalmente, en donde una cantidad de energía para extraer la partícula objetivo se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 pJ a aproximadamente 1000 pJ. En ciertas realizaciones, la circuitería está configurada para generar una pluralidad de pulsos para extraer una pluralidad de partículas objetivo, y en donde una cantidad de energía de extracción para cada partícula objetivo extraída se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 1 pJ a aproximadamente 50 pJ, y en donde una duración de la energía de extracción para cada partícula objetivo extraída se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 ns a aproximadamente 1000 ns y en donde una potencia de extracción pico para cada una de la pluralidad de partículas objetivo extraídas se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 W a aproximadamente 107 W.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un aparato para clasificar partículas objetivo, comprendiendo el aparato una lente objetivo para dirigir luz sobre una pluralidad de canales dimensionados para contener las partículas objetivo, una fuente de luz para generar un haz de excitación, estando la fuente de luz acoplada ópticamente a la lente objetivo para generar fluorescencia a partir de las partículas objetivo contenidas en la pluralidad de canales, un detector de matriz bidimensional acoplado ópticamente a la lente objetivo para recibir luz de fluorescencia desde las partículas objetivo, un láser para generar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la pluralidad de canales, y un escáner acoplado ópticamente al haz de extracción para escanear con el haz de extracción hacia la pluralidad de canales.
En ciertas realizaciones, la lente objetivo define una primera trayectoria óptica en un primer lado de la lente hacia la superficie o la pluralidad de canales y una segunda trayectoria óptica en un segundo lado de la lente objetivo alejándose de la superficie o la pluralidad de canales y en donde el haz de extracción, el haz de excitación y el detector de matriz bidimensional se acoplan ópticamente a la lente objetivo a lo largo de al menos una porción de la segunda trayectoria óptica. En ciertas realizaciones, comprendiendo el aparato además un primer divisor de haz para acoplar el haz de extracción a la lente objetivo y un segundo divisor de haz para acoplar el haz de excitación a la lente objetivo y el detector de matriz bidimensional a la lente objetivo. En ciertas realizaciones, el primer divisor de haz comprende un revestimiento dicroico para reflejar el haz de extracción hacia la lente objetivo, el revestimiento dicroico ubicado sobre una superficie del primer divisor de haz orientado hacia la lente objetivo y en donde el segundo divisor de haz comprende un divisor de haz dicroico configurado para reflejar el haz de excitación hacia la lente objetivo y transmitir la fluorescencia desde las partículas objetivo que pasan a través de la lente objetivo al detector de matriz bidimensional.
En ciertas realizaciones, el aparato comprende además una lente de relé F-theta para acoplar el haz de extracción desde el escáner a la lente objetivo. En ciertas realizaciones, el aparato comprende además un par de lentes de relé F-theta para acoplar el haz de extracción desde el escáner a la lente objetivo.
En ciertas realizaciones, el aparato comprende además un selector de longitud de onda acoplado al haz de excitación para filtrar el haz de excitación entre un divisor de haz y la fuente de luz de excitación y opcionalmente en donde el selector de longitud de onda se selecciona del grupo que consiste en una rueda de filtros que comprende una pluralidad de filtros, un prisma y una rejilla.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para detectar y clasificar partículas objetivo, comprendiendo el método proporcionar un sustrato con una pluralidad de microcanales, en donde los microcanales comprenden una mezcla de material de muestra que comprende una pluralidad de partículas objetivo, escanear el contenido de los microcanales con un haz de excitación, detectar una señal de fluorescencia emitida desde los microcanales en donde la señal de fluorescencia indica la presencia de la partícula objetivo en un microcanal, y extraer las partículas objetivo de los microcanales con un haz de extracción, en donde dicha duración de tiempo que transcurre entre dicha detección de fluorescencia y extracción de dichas partículas objetivo de un único microcanal es de aproximadamente 10 ns a aproximadamente 100 ps.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para detectar y clasificar partículas objetivo, comprendiendo el método proporcionar un sustrato con una pluralidad de microcanales, en donde los microcanales comprenden una mezcla de material de muestra que comprende una pluralidad de partículas objetivo, escanear el contenido de los microcanales con un haz de excitación, detectar una señal de fluorescencia emitida desde los microcanales en donde la señal de fluorescencia indica la presencia de la partícula objetivo en un microcanal, y extraer las partículas objetivo de los microcanales con un haz de extracción, en donde el escaneo de dichos microcanales con un haz de excitación tiene lugar a una velocidad superior a 1.000.000 de microcanales por segundo, superior a 2.000.000 de microcanales por segundo, o superior a 3.000.000 de microcanales por segundo.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para detectar y clasificar partículas objetivo, comprendiendo el método proporcionar un sustrato con una pluralidad de microcanales, en donde los microcanales comprenden una mezcla de material de muestra que comprende una pluralidad de partículas objetivo, escanear el contenido de los microcanales con un haz de excitación, detectar una señal de fluorescencia emitida desde los microcanales en donde la señal de fluorescencia indica la presencia de la partícula objetivo en un microcanal, y extraer las partículas objetivo de los microcanales con un haz de extracción, en donde la extracción de las partículas objetivo de dichos microcanales con un haz de extracción tiene lugar a una velocidad superior a 500.000 microcanales por segundo, 600.000 microcanales por segundo, 700.000 microcanales por segundo, 800.000 microcanales por segundo, 900.000 microcanales por segundo o 1.000.000 de microcanales por segundo.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para detectar y clasificar partículas objetivo, comprendiendo el método proporcionar un sustrato con una pluralidad de microcanales, en donde los microcanales comprenden una mezcla de material de muestra que comprende una pluralidad de partículas objetivo, escanear el contenido de los microcanales con un haz de excitación, detectar una señal de fluorescencia emitida desde los microcanales en donde la señal de fluorescencia indica la presencia de la partícula objetivo en un microcanal, y extraer las partículas objetivo de los microcanales con un haz de extracción, en donde la extracción de las partículas objetivo de dichos microcanales da como resultado una recogida de partículas con una pureza superior al 90 %, mayor que el 95 % o mayor que el 99 %.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un microscopio de fluorescencia que comprende: una fuente de luz de excitación de fluorescencia configurada para dirigir luz de excitación de fluorescencia a una muestra y para inducir la emisión de luz de fluorescencia emitida desde la muestra; una lente objetivo configurada para recibir luz de fluorescencia emitida desde la muestra; y un detector de luz configurado para detectar luz de fluorescencia emitida recibida por la lente objetivo. La fuente de luz de excitación de fluorescencia puede configurarse para dirigir la luz de excitación de fluorescencia a la muestra de tal manera que la luz de excitación de fluorescencia no pasa a través de la lente objetivo. Dirigir la luz de excitación de fluorescencia a la muestra de tal manera que la luz de excitación de fluorescencia no pasa a través de la lente objetivo puede reducir la fluorescencia de fondo detectada por el detector de luz. Dirigir la luz de excitación de fluorescencia a la muestra de tal manera que la luz de excitación de fluorescencia no pasa a través de la lente objetivo, puede reducir el ruido de moteado detectado por el detector de luz.
La divulgación proporciona un método para clasificar células, que comprende cribar material celular para identificar células con un fenotipo deseado, en donde el material celular se criba a una velocidad de 100.000 células por segundo o más. En ciertas realizaciones, el material celular se criba a una velocidad de 500.000 células por segundo o más, tal como a una velocidad de 1.000.000 células por segundo o más. En ciertas realizaciones, el método comprende además extraer dichas células de un fenotipo deseado a partir de dicho material celular a una velocidad de 100.000 células por segundo o más, tal como a una velocidad de 300.000 células por segundo o más. Dicho material celular puede cribarse en una matriz con orificios pasantes y dichas células de un fenotipo deseado pueden extraarse de dicha matriz. En ciertas realizaciones, la extracción comprende liberar dichas células de un fenotipo deseado usando radiación electromagnética. En ciertas realizaciones, cada orificio pasante de dicha matriz comprende de 0 a aproximadamente 5 células y al menos el 30 % de los orificios pasantes de la matriz comprenden al menos una célula.
En ciertas realizaciones, el material celular de dicho método se obtiene de un sujeto humano y/o comprende menos del 5 % de HSC y HSPC. En ciertas realizaciones, más del 95 % de las células extraídas son HSC y/o HSPC. En ciertas realizaciones, más del 95 % de las células extraídas son células del fenotipo deseado. En ciertas realizaciones, más del 95 % de las células extraídas son viables, según se determina evaluando las células dentro de las 5 horas posteriores a dicha extracción. En ciertas realizaciones, las células extraídas son adecuadas para un uso terapéutico sin necesidad de etapas de esterilización adicionales. Las células extraídas pueden estar esencialmente libres de patógenos. Las células extraídas pueden comprender menos del 0,1 % de patógenos. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona células extraídas obtenidas mediante cualquiera de los métodos del presente documento y su composición farmacéutica.
Breve descripción de los dibujos
En las reivindicaciones adjuntas se exponen características de la invención con particularidad. Se obtendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:
La figura 1 es un casete para clasificar partículas objetivo de acuerdo con una realización ilustrativa de la invención. La figura 2 representa una vista externa de un casete para clasificar partículas objetivo.
La figura 3 representa varios componentes externos e internos de un casete para clasificar partículas objetivo. La figura 4A ilustra una realización de adición o carga de una mezcla de material de muestra a un pocillo de muestra.
La figura 4B ilustra una realización de adición o carga de una mezcla de material de muestra desde un pocillo de muestra a un sustrato que comprende una pluralidad de microcanales. El pocillo de muestra se mueve en paralelo al sustrato para añadir o cargar la mezcla de material de muestra al sustrato. El pocillo de muestra puede moverse desde el primer extremo del sustrato al segundo extremo del sustrato para añadir o cargar la mezcla de material de muestra al sustrato.
La figura 4C ilustra una realización de adición o carga de una solución a la membrana de hidratación del casete a través del acceso de hidrato en la tapa superior del casete.
La figura 4D ilustra una realización de colocación de un bastidor que contiene una membrana de hidratación en la superficie de un sustrato a través de una fuerza magnética externa.
La figura 4E ilustra una realización de escaneo de partículas objetivo a través de la ventana inferior de la tapa inferior del casete.
La figura 4F ilustra una realización del lavado de las partículas objetivo extraídas desde la superficie interna de la tapa inferior al pocillo de recogida.
La figura 4G ilustra una realización de lavado y recuperación de las partículas objetivo extraídas del acceso de liberación.
La figura 5A representa varios componentes internos de un casete que incluyen un sustrato, un sello y un bastidor de metal.
La figura 5B representa el sustrato afianzado al bastidor de metal a través de un sello, que reduce la flacidez del sustrato en condiciones de calor.
La figura 6 ilustra una realización de carga de una mezcla de material de muestra a un microcanal de un sustrato. El microcanal comprende una primera mezcla y una segunda mezcla. La primera mezcla comprende una solución transparente y una pluralidad de partículas opacas. La segunda mezcla comprende un componente celular y una solución acuosa.
La figura 7A representa un microcanal de un sustrato que se carga con un componente celular y una pluralidad de partículas opacas.
La figura 7B representa un microcanal de un sustrato que se carga con un componente celular y una pluralidad de partículas que comprenden un núcleo opaco y una cubierta que rodea el núcleo.
La figura 7C es una representación gráfica de la eficiencia de extracción de células que se cargaron independientemente con partículas opacas o partículas que comprendían un núcleo opaco y una cubierta que rodeaba el núcleo. La representación gráfica ilustra que las células que contenían partículas opacas se extrajeron con menos eficiencia que las células que contenían partículas que comprendían un núcleo opaco y una cubierta que rodeaba el núcleo.
La figura 7D es una representación gráfica de la supervivencia celular de células que se cargaron independientemente con partículas opacas o partículas que comprendían un núcleo opaco y una cubierta que rodeaba el núcleo. La representación gráfica ilustra que las células que contenían partículas opacas eran menos viables que las células que contenían partículas que comprendían un núcleo opaco y una cubierta que rodeaba el núcleo.
La figura 8A representa un microcanal de un sustrato que se carga con una mezcla que comprende un componente celular, una pluralidad de partículas magnéticas y una pluralidad de partículas no magnéticas.
La figura 8B es una representación gráfica de la eficiencia de extracción y la tasa de supervivencia de las células que se cargaron con cantidades variables de partículas no magnéticas y una cantidad establecida de partículas magnéticas.
La figura 9A representa una realización ilustrativa del método de carga secuencial.
La figura 9B es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con Dynabeads® en un lote mixto. La figura 9C es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con Dynabeads® de una forma secuencial.
La figura 9D es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con agarosa en un lote mixto.
La figura 9E es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con agarosa de una forma secuencial. La figura 9F es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con ProMag® en un lote mixto.
La figura 9G es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales con ProMag® de una forma secuencial. La figura 9H es una representación gráfica del número de células por microcanal del sustrato. Las células se cargaron sobre el sustrato que comprendía una pluralidad de microcanales sin ninguna partícula opaca.
La figura 10A ilustra los microcanales de un sustrato cargado con material fluorescente y células. El material fluorescente se desplaza en presencia de células. El número de células en el microcanal se cuantifica mediante la cantidad de desplazamiento fluorescente. La señal de fluorescencia es más intensa en canales con un recuento de células bajo o es menos intensa en canales con un recuento de células alto.
La figura 10B muestra los diferentes niveles de intensidad de fluorescencia que se detectan o se visualizan por la presencia o la ausencia de células. Los microcanales del sustrato contienen material fluorescente en el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las regiones relativamente oscurecidas indican la presencia de una o más células en el microcanal del sustrato. Las regiones relativamente brillantes indican la ausencia de células en el microcanal del sustrato.
La figura 10C muestra los diferentes niveles de intensidad de fluorescencia que se detectan o se visualizan por la presencia o la ausencia de células. Los microcanales del sustrato contienen material fluorescente en el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las regiones relativamente oscurecidas indican la presencia de una o más células en el microcanal del sustrato. Las regiones relativamente brillantes indican la ausencia de células en el microcanal del sustrato. Las regiones que contienen células se rodean con un círculo.
La figura 10D identifica las regiones que contienen células teñidas con colorante de color rojo lejano de rastreador de células en el microcanal del sustrato. Los microcanales que contienen la fluorescencia de colorante corresponden a regiones relativamente brillantes.
La figura 10E identifica las regiones que contienen células teñidas con el color rojo lejano de células en el microcanal del sustrato. Los microcanales que contienen color rojo lejano de rastreador de células corresponden a regiones relativamente brillantes. Las regiones restantes corresponden a microcanales que contienen material fluorescente, pero ninguna célula.
La figura 10F es una representación gráfica de la intensidad fluorescente en presencia de células y en ausencia de células. La intensidad fluorescente promedio fue inferior en presencia de una célula que en su ausencia. La figura 11 es una representación esquemática de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser que utiliza un espejo poligonal rotatorio.
La figura 12 es una representación esquemática de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser que utiliza dos espejos poligonales rotatorios.
La figura 13 es una representación esquemática de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser que utiliza dos espejos poligonales rotatorios y una técnica de detección confocal.
La figura 14 es una representación esquemática de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser que utiliza un mecanismo de escaneo galvanométrico.
La figura 15 muestra los ajustes de potencia de pulso óptimos para la extracción por láser de células a partir de una matriz de microcanales.
La figura 16 muestra un dispositivo de procesamiento digital ilustrativo programado o configurado de otro modo para hacer funcionar un dispositivo de clasificación de células mediante escaneo por láser.
La figura 17 es una representación esquemática para un sistema de detección de fluorescencia alternativo.
Descripción detallada de la invención
En una breve visión general, las realizaciones de la presente divulgación proporcionan métodos y aparatos para clasificar partículas objetivo. En diversas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos y aparatos que criban, extraen y clasifican partículas objetivo de forma sencilla, rápida, eficiente y rentable. Adicionalmente, en diversas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos y aparatos que criban, extraen y clasifican partículas objetivo en condiciones estériles. En una realización ilustrativa, la presente divulgación proporciona métodos y aparatos para clasificar material celular viable.
La presente divulgación prevé que las partículas objetivo incluyan una amplia gama de partículas, tales como partículas orgánicas e inorgánicas, partículas naturales y sintéticas, y combinaciones de las mismas. Las partículas objetivo presentadas en el presente documento son realizaciones ilustrativas de partículas objetivo y no se limitan a las partículas descritas en el presente documento. En diversas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir cualquier partícula que pese de aproximadamente 20 daltons a aproximadamente 200 kilodaltons. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden ser identificables a través de fluorescencia. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir partículas inorgánicas, tales como perlas de metal y perlas de sílice. Por ejemplo, las perlas metálicas pueden incluir perlas que contienen alúmina (por ejemplo, gamma-alúmina). En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir perlas de sílice. Las partículas objetivo pueden incluir polímeros, tales como poliestireno, polietileno, poli(vinilpirrolidona), acrilamidopropil-PEG y derivados de los mismos. En ciertas realizaciones, las partículas objetivo comprenden una resina Merrifield, resina de hidroximetilo, resina Wang, resina de aminometilo, resina SASRIN, resina TentaGel S AC, resina TentaGel PHB, resina TentaGel S NH2 o combinaciones de las mismas. Las partículas objetivo también pueden comprender nanotubos de carbono y fullerenos. En ciertas realizaciones, las partículas objetivo comprenden partículas que se usan en la síntesis de agrupación dividida. En algunas realizaciones, las partículas objetivo comprenden material celular, tal como células enteras, células lisadas, componentes celulares, matriz extracelular, tejido biológico y porciones de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas objetivo comprenden biomoléculas tales como proteínas, péptidos, anticuerpos, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Las partículas objetivo también pueden incluir moléculas pequeñas, moléculas pequeñas tanto sintéticas como naturales, por ejemplo, moléculas que pesan menos de 1000 daltons. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir virus.
En ciertas realizaciones, las partículas objetivo comprenden material celular, tal como células enteras o células lisadas. Las células pueden ser cualquier célula derivada de un organismo, que incluye humano, animal, fúngico, microbiano, de insecto y células modificadas de los mismos. En ciertas realizaciones, las partículas objetivo se identifican en una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, una mezcla de material celular comprende material celular, una solución acuosa y, opcionalmente, partículas opacas. Los ejemplos de una solución acuosa incluyen medios, tampón y agua. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona sistemas y métodos para aislar células objetivo a partir de una mezcla de material celular, en donde dichas células objetivo expresan o producen proteínas, hidratos de carbono, enzimas, péptidos, hormonas o receptores particulares, o combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona sistemas y métodos para aislar células objetivo a partir de una mezcla de material celular que produce anticuerpos particulares. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona sistemas y métodos para aislar células objetivo a partir de una mezcla celular que son células genomanipuladas o células activadas particulares.
El término "opaco", como se describe en el presente documento, se refiere a un material que absorbe al menos una porción del espectro electromagnético. Un material opaco puede no permitir, al menos parcialmente, el paso de la luz visible a través del material. Un material opaco puede no permitir el paso de una o más longitudes de onda que varían de aproximadamente 390 nm a aproximadamente 700 nm. Por ejemplo, tales materiales no permitirán el paso de una o más longitudes de onda que varían de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un casete para clasificar partículas objetivo. En algunas realizaciones, el casete es un sistema cerrado que permite la clasificación de partículas objetivo en condiciones de esterilizado. El casete puede esterilizarse antes de su uso. El casete puede contener uno o más accesos de llenado que permiten al usuario introducir una mezcla de material de muestra y, opcionalmente, otras soluciones en el casete sin poner en peligro la integridad de la muestra, por ejemplo, exponer la muestra a pirógenos u otros contaminantes. En algunas realizaciones, el casete puede estar destinado solo a un único uso, por ejemplo, ser desechable después de su uso. Por ejemplo, el casete puede usarse para clasificar material celular de una única muestra de paciente y desecharlo después de su uso. Adicionalmente, el casete puede configurarse para ser recibido por diversos aparatos y máquinas para facilitar la clasificación de partículas objetivo. En otra realización, el casete puede estar disponible con información instructiva acerca de cómo usar el casete.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para clasificar partículas objetivo usando el casete de la divulgación. En diversas realizaciones, una mezcla de material de muestra puede cargarse en los microcanales de un sustrato de un casete para el escaneo y la extracción de partículas objetivo. En una realización ilustrativa, una mezcla de material celular puede cargarse en los microcanales de un sustrato de un casete para el escaneo y la extracción de material celular. En ciertas realizaciones, la mezcla de material de muestra puede cargarse sobre la primera superficie del sustrato para el escaneo y la extracción. En ciertas realizaciones, uno o más tipos de células, por ejemplo, células con ciertos marcadores de superficie celular, pueden extraerse de una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, uno o más tipos de células que están secretando ciertas proteínas u otras biomoléculas de interés pueden extraerse de una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, uno o más tipos de células que están expresando ciertas proteínas intracelulares u otras biomoléculas de interés pueden extraerse de una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, uno o más tipos de células que están expresando ciertas proteínas u otras biomoléculas de interés dirigidas a un orgánulo específico u otra localización subcelular pueden extraerse de una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, uno o más tipos de células que están expresando una combinación de los atributos mencionados anteriormente pueden extraerse de una mezcla de material celular. En ciertas realizaciones, la extracción de uno o más tipos de células puede realizarse en condiciones estériles.
En ciertas realizaciones, los microcanales del sustrato pueden comprender partículas opacas. Las partículas opacas pueden estar implicadas en un proceso en el que las partículas opacas absorben radiación electromagnética y, vaporizan una porción de los medios acuosos, lo que provoca de ese modo que el material celular en el microcanal se libere del microcanal. En ciertas realizaciones, la energía liberada de dicho proceso puede dañar la viabilidad celular del material celular. Para proteger la viabilidad del material celular, las partículas opacas pueden añadirse a los microcanales de una forma que proteja y preserve la viabilidad celular del material celular frente a dicho proceso. En ciertas realizaciones, la viabilidad del material celular se mantiene espaciando las partículas opacas a una distancia lejos de las células en los microcanales. En un ejemplo,
el método implica la adición de dos capas de mezcla al microcanal de sustrato, en donde la primera capa de mezcla contiene partículas opacas en una solución transparente, por ejemplo, suspendidas en un gel, y la segunda capa de mezcla contiene material celular en una solución acuosa. En ciertos ejemplos,
el método para cargar microcanales de un sustrato implica la adición de partículas que comprenden un núcleo opaco y una cubierta exterior aislante de un material transparente, lo que impide el contacto o acercamiento estrecho de una célula con el núcleo opaco. En ciertas realizaciones, el método para cargar microcanales de un sustrato implica la adición de micropartículas opacas y micropartículas transparentes, en el que las micropartículas transparentes impiden el contacto o acercamiento estrecho de la célula con las micropartículas opacas.
Adicionalmente, y no formando parte de la invención, se describe un método para situar las células más cerca de la abertura del microcanal que las partículas opacas. En algunas realizaciones, las células se observan a través de una abertura del microcanal y resulta ventajoso respecto a los métodos existentes situar las partículas opacas distalmente a la célula desde el plano de observación. Tal posicionamiento de las partículas opacas puede permitir la observación de un número mayor de células en relación con el número de células cargadas sobre el microcanal. En ciertas realizaciones, el método para cargar microcanales de un sustrato implica la adición de una mezcla de material celular y partículas opacas de manera secuencial.
Adicionalmente, y no formando parte de la invención, se describe un método para controlar la posición de las células y material opaco dentro del microcanal. En algunos ejemplos, las células son ayudadas hacia un extremo del microcanal usando sonicación o ultrasonicación. En algunos aspectos, el material opaco es ayudado hacia un extremo del microcanal usando sonicación o ultrasonicación. En algunos aspectos, estos procesos se realizan secuencialmente. En ciertos aspectos, un casete de la divulgación comprende además un transductor de contacto o un dispositivo similar, en donde el transductor de contacto puede ubicarse en cualquier posición funcional en el casete, por ejemplo, en contacto con el sustrato dentro del alojamiento o en la superficie externa del alojamiento. En ciertos ejemplos, que no forman parte de la invención, el transductor de contacto puede estar en contacto con uno o más componentes de un casete descrito en el presente documento.
Adicionalmente, y no formando parte de la invención, se describe un método para discriminar una célula de entre múltiples células depositadas en microcanales de un sustrato. En ciertos ejemplos, el método implica el uso de material fluorescente situado distalmente a la célula o células desde el plano de observación. La luz fluorescente del material fluorescente puede medirse posteriormente. En ciertas realizaciones, el método implica la distribución de material fluorescente por entre el material celular y el desplazamiento de material fluorescente en presencia o ausencia de células se usa para cuantificar material celular.
Adicionalmente, la divulgación proporciona aparatos ópticos para la clasificación de células mediante escaneo por láser.
En una realización, la divulgación proporciona un aparato óptico que utiliza un espejo poligonal rotatorio. En una realización adicional, dicho aparato se combina con una fase lineal, una fase X-Y o galvanómetros.
En otra realización, la divulgación proporciona un aparato óptico que utiliza dos espejos poligonales rotatorios. En una realización adicional, dicho aparato se combina con una o más fases lineales, fases X-Y, galvanómetros, sistemas de procesamiento de luz digital, o escáneres resonantes.
En otra realización, la divulgación proporciona un aparato óptico que utiliza dos espejos poligonales rotatorios y una técnica de detección confocal. En una realización adicional, dicho aparato se combina con una fase lineal, una fase X-Y o galvanómetros.
En otra realización, la divulgación proporciona un aparato óptico que utiliza un mecanismo de escaneo de galvanómetro. En una realización adicional, dicho aparato se combina con una fase lineal, una fase X-Y o galvanómetros.
En algunos aspectos, los métodos de la divulgación posibilitan la preparación de composiciones farmacéuticas de células madre hematopoyéticas (HSC) y/o células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC) con una esterilidad, pureza y viabilidad sin precedentes. En particular, la divulgación proporciona métodos para clasificar células, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto, en donde el método comprende uno o más de lo siguiente: (a) cribar material celular a una velocidad de 100.000 células por segundo o más, tal como 200.000 células por segundo o más, tal como 300.000 células por segundo o más; (b) escanear células en donde menos del 10 % del material celular original comprende HSC y/o HSPC (c) extraer células de un fenotipo o fenotipos deseado(s) a una velocidad de 100.000 células por segundo o más, tal como 200.000 células por segundo o más, tal como 300.000 células por segundo o más; (d) extraer células produciendo de este modo un extracto celular en donde el 95 % o más de dichas células del extracto celular son HSC y/o HSPC; (e) extraer células produciendo de este modo un extracto celular en donde el 95 % o más, tal como el 95 % o más o incluso el 98 % o más de las HSC y/o HSPC extraídas tienen el fenotipo o fenotipos deseado(s); (f) extraer células produciendo de este modo un extracto celular en donde el extracto celular tiene una viabilidad superior al 95 %; y (g) extraer células produciendo de este modo un extracto celular en donde las HSC y/o HSPC del extracto celular son adecuadas para un uso clínico sin necesidad de purificación o esterilización adicional.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas de HSC y/o HSPC con una o más de las siguientes características: (a) la composición comprende menos de aproximadamente el 1 % de patógenos y otros contaminantes, tal como una cantidad despreciable de patógenos y otros contaminantes; (b) el 95 % o más, tal como el 95%o más o incluso el 98%o más de las HSC y/o HSPC de la composición tienen un fenotipo o fenotipos deseado(s); (c) el 95 % o más de las células de la composición son viables; (d) la composición comprende menos del 0,01 % de células T sin exposición previa; y (e) la composición es adecuada para un uso terapéutico.
Definiciones
Ha de entenderse que la terminología usada en el presente documento es solo para el fin de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante.
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la materia. En el presente documento se proporciona una ampliación y aclaración de algunos términos. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento, si no se indica lo contrario, se incorporan explícitamente por referencia.
Como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los términos "hidratación" e "hidrato" como se usan en el presente documento se refieren a restablecer o mantener el equilibrio de fluidos.
Los términos "estéril" y "esterilizado" como se usan en el presente documento se refieren a reducir la presencia de contaminantes, bacterias, patógenos u otros organismos vivos no deseados.
En las figuras presentadas en el presente documento, elementos numerados de forma semejante se refieren a componentes semejantes.
Casete
En una realización ilustrativa, la figura1ilustra un casete para clasificar partículas objetivo. La presente divulgación prevé que las partículas objetivo incluyan una amplia gama de partículas, tales como partículas orgánicas e inorgánicas, partículas naturales y sintéticas, y combinaciones de las mismas. Las partículas objetivo presentadas en el presente documento son realizaciones ilustrativas de partículas objetivo y no están limitadas por las realizaciones ilustrativas. En diversas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir cualquier partícula que pese de aproximadamente 20 daltons a aproximadamente 200 kilodaltons. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden ser identificables a través de fluorescencia. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir partículas inorgánicas, tales como perlas de metal y perlas de sílice. Por ejemplo, las perlas metálicas pueden incluir perlas que contienen alúmina (por ejemplo, gamma-alúmina). En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir perlas de sílice. Las partículas objetivo pueden incluir polímeros, tales como poliestireno, polietileno, poli(vinilpirrolidona), acrilamidopropil-PEG y derivados de los mismos. Por ejemplo, los polímeros pueden ser una resina Merrifield, resina de hidroximetilo, resina Wang, resina de aminometilo, resina SASRIN, resina TentaGel S AC, resina TentaGel PHB o resina TentaGel S NH2. Las partículas objetivo también pueden incluir nanotubos de carbono y fullerenos. Tales partículas objetivo pueden incluir partículas que se usan en la síntesis de agrupación dividida. Adicionalmente, en algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir material celular. El material celular puede incluir células enteras, células lisadas, componentes celulares, matriz extracelular, tejido biológico y porciones de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas objetivo también pueden incluir biomoléculas, que incluyen proteínas, péptidos, anticuerpos, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Las partículas objetivo también pueden incluir moléculas pequeñas, moléculas pequeñas tanto sintéticas como naturales, que pesan menos de 1000 daltons. En algunas realizaciones, las partículas objetivo pueden incluir virus. El material celular puede comprender una suspensión celular. Las células pueden ser cualquier célula derivada de un organismo, que incluye humano, animal, fúngico, microbiano, de insecto y células modificadas de los mismos. Una mezcla de material celular comprende material celular, partículas opacas y una solución acuosa. Los ejemplos de una solución acuosa incluyen medios, tampón y agua. El dispositivo de la presente divulgación puede usarse para aislar células que expresan o producen proteínas de forma diferencial, hidratos de carbono, enzimas, péptidos, hormonas, receptores y, además, células que producen anticuerpos, células genomanipuladas y células activadas. En una realización ilustrativa, de acuerdo con las figuras2y3, el casete100comprende una tapa superior110, una tapa inferior120, un sustrato130, un pocillo de muestra140y un bastidor150. Como se representa en la figura2, la tapa superior110se sitúa encima de la tapa inferior120y se sitúa en un plano sustancialmente paralelo con la tapa inferior120. El casete100puede ser un sistema cerrado.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, como se representa en la figura2, la tapa superior110puede comprender uno o más accesos de llenado para recibir soluciones en el casete100. En algunas realizaciones, la tapa superior puede comprender uno o más accesos de salida para drenar soluciones del casete. Los uno o más accesos de llenado pueden configurarse para introducir soluciones en el casete100. Tales soluciones pueden introducirse para hidratar la membrana, recibir una mezcla de material de muestra para cargar una mezcla de material de muestra sobre el sustrato, recibir una mezcla de material de muestra en el pocillo de muestra y/o recibir una solución tampón para drenar partículas objetivo, tales como material celular, fuera del casete.
En ciertas realizaciones, la tapa superior comprende un acceso de llenado configurado para recibir soluciones en el casete. En una realización ilustrativa, como se representa en la figura2, los accesos de llenado de la tapa superior110comprenden un acceso de material accesorio112, un acceso de hidrato113y un acceso de muestral l 4. El acceso de material accesorio112, el acceso de hidrato113y el acceso de muestra114pueden configurarse para recibir soluciones. El acceso de muestra114puede configurarse para recibir una mezcla de material de muestra para su carga en un pocillo de muestra140. El acceso de muestra114puede estar en comunicación de fluidos con el pocillo de muestra140. En otra realización, el acceso de muestra puede configurarse para recibir una mezcla de material de muestra para su carga directa sobre el sustrato y a los microcanales del sustrato. En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 * 106 a 100 * 109 células se cargan en el casete100. El acceso de hidrato113puede configurarse para recibir soluciones para hidratar la membrana de hidratación151. El acceso de hidrato113puede estar en comunicación de fluidos con la membrana de hidratación151. El acceso de material accesorio112puede configurarse para recibir una solución acuosa para recolectar partículas objetivo desde el casete100. En algunas realizaciones, la solución acuosa es un tampón. El acceso de material accesorio112puede estar en comunicación de fluidos con la superficie interna de la tapa inferior120, el pocillo de recogida122y/o el acceso de recepción123. Adicionalmente, el pocillo de recogida122puede estar en comunicación de fluidos con el acceso de recepción123. En ciertas realizaciones, el método para cargar microcanales de cualquier sustrato descrito en el presente documento, puede ir acompañado de una etapa de sonicación. La etapa de sonicación puede dejar que las partículas objetivo, partículas opacas u otros componentes de la mezcla de material de muestra se asienten en los microcanales. En ciertas realizaciones, la etapa de sonicación puede tener lugar antes del escaneo de los microcanales. Por ejemplo, la etapa de sonicación puede tener lugar antes de, concurrentemente con o posteriormente a dicha etapa de carga o una combinación de ello. En ciertas realizaciones, la etapa de sonicación tiene lugar antes de y concurrentemente con la carga de los microcanales. En ciertas realizaciones, la etapa de sonicación tiene lugar concurrentemente con y posteriormente a la carga de los microcanales.
En ciertas realizaciones, la tapa inferior puede comprender uno o más accesos de llenado para recibir soluciones en el casete. En algunas realizaciones, la tapa inferior puede comprender uno o más accesos de salida para drenar soluciones del casete. Los uno o más accesos de llenado pueden configurarse para introducir soluciones en el casete. Tales soluciones pueden introducirse para hidratar la membrana, recibir una mezcla de material de muestra para cargar una mezcla de material de muestra sobre el sustrato, recibir una mezcla de material de muestra para cargar una mezcla de material de muestra en el pocillo de muestra y/o recibir una solución tampón para drenar partículas objetivo, tales como material celular, fuera del casete. En ciertas realizaciones, la tapa inferior comprende un acceso de llenado configurado para recibir soluciones en el casete. En otra realización, los accesos de llenado de la tapa inferior comprenden un acceso de material accesorio, un acceso de hidrato y un acceso de muestra. El acceso de muestra puede configurarse para recibir una mezcla de material de muestra para su carga en un pocillo de muestra. El acceso de muestra puede estar en comunicación de fluidos con el pocillo de muestra. En otra realización, el acceso de muestra puede configurarse para recibir una mezcla de material de muestra para su carga directa sobre el sustrato y a los microcanales del sustrato. En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 * 106 a 100 * 109 células se cargan en el casete. El acceso de hidrato puede configurarse para recibir soluciones para hidratar la membrana de hidratación. El acceso de hidrato puede estar en comunicación de fluidos con la membrana de hidratación. El acceso de material accesorio puede configurarse para recibir una solución acuosa para recolectar partículas objetivo desde el casete. En algunas realizaciones, la solución acuosa es un tampón. El acceso de material accesorio puede estar en comunicación de fluidos con la superficie interna de la tapa inferior, el pocillo de recogida y/o el acceso de recepción. Adicionalmente, el pocillo de recogida puede estar en comunicación de fluidos con el acceso de recepción.
En diversas realizaciones, el casete puede contener una porción transmisiva que es al menos parcialmente transparente a ciertas longitudes de onda de radiación electromagnética. En una realización, la porción transmisiva es al menos parcialmente transparente a longitudes de onda en el intervalo de 250 nm a 1600 nm. Una porción transmisiva contiene un material que permite al menos parcialmente la transferencia de una o más ondas electromagnéticas de una ubicación a otra. Por ejemplo, una porción transmisiva puede incluir, pero sin limitación, vidrio, cuarzo, plásticos o combinaciones de los mismos. En diversas realizaciones, la porción transmisiva es una ventana transmisiva. En algunas realizaciones, como se representa en la figura3, la tapa superior puede comprender una ventana superior111. La ventana superior111puede ser una ventana transmisiva. En otra realización, la ventana superior111puede ser una ventana no transmisiva. Una ventana no transmisiva contiene un material que no permite la transferencia de radiación electromagnética de una ubicación a otra. En un ejemplo de realización de un casete para clasificar partículas objetivo, como se representa en la figura3, la tapa inferior120puede comprender una ventana inferior121. En otra realización, la ventana inferior121puede ser una ventana transmisiva. La ventana inferior121puede ser una ventana no transmisiva. En ciertas realizaciones, la ventana superior111puede ser una ventana no transmisiva y la ventana inferior puede ser una ventana transmisiva.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, como se representa mediante la figura3, el casete100está configurado para recibir un sustrato130dentro del casete100. El sustrato se ubica entre la tapa superior110y la tapa inferior120. Como se muestra en la figura1, el sustrato es encapsulado por las unidades de alojamiento del casete100. El sustrato se protege frente a la contaminación durante la clasificación de las partículas objetivo.
En ciertas realizaciones, el casete comprende un primer alojamiento y un segundo alojamiento que se acoplan entre sí de cualquier forma conocida en la técnica. Por ejemplo, el primer alojamiento y el segundo alojamiento pueden ser dos componentes separados que se acoplan entre sí a través de una bisagra que permite la apertura del alojamiento para exponer el interior del casete. En ciertas realizaciones, el primer y el segundo alojamiento son dos componentes separados que se acoplan entre sí de forma reversible tal como entrelazados entre sí con elementos adyacentes complementarios, por ejemplo, la superficie de separación del primer alojamiento comprende un elemento receptor, tal como una porción cóncava, y la superficie de separación del segundo alojamiento comprende un elemento donante, tal como una porción convexa, en donde los elementos cóncavo y convexo se entrelazan reversiblemente entre sí. En ciertas realizaciones, el primer alojamiento y el segundo alojamiento se unen entre sí de forma permanente, por ejemplo, con un adhesivo, o se fusionan entre sí. En ciertas realizaciones, el primer alojamiento y el segundo alojamiento se acoplan de forma que un único alojamiento, tal como en donde el primer alojamiento y el segundo alojamiento no se forman a partir de la unión de múltiples componentes o se moldean o se forman mediante el apilamiento de capas, por ejemplo, impresión 3D, y se acoplan irreversiblemente, por ejemplo, no comprenden costuras ni bisagras para separar el primer alojamiento del segundo alojamiento.
Encapsular o la encapsulación del sustrato, como se describe en el presente documento, se refiere al posicionamiento de la totalidad del sustrato dentro del alojamiento del casete.
En ciertas realizaciones, el sustrato contiene una primera superficie y una segunda superficie. El sustrato puede tener unas dimensiones de aproximadamente 3 mm * 3 mm * 0,3 mm a aproximadamente 5000 mm * 15000 mm * 1000 mm. La distancia desde la primera superficie a la segunda superficie del sustrato es de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1000 mm. En algunas realizaciones, la forma del sustrato puede ser rectangular, octogonal o circular. En algunas realizaciones, el sustrato puede ser una placa de vidrio.
En ciertas realizaciones, la primera superficie del sustrato se acopla a la primera superficie de un material absorbente. La primera superficie del sustrato puede modificarse para mejorar las propiedades adhesivas del sustrato. Por ejemplo, la primera superficie del sustrato puede recubrirse con uno o más grupos diaminopropil silano. El material absorbente puede comprender partículas opacas. El material absorbente puede comprender un metal. En algunas realizaciones, la segunda superficie del material absorbente puede acoplarse a la primera superficie de una capa transparente. La capa transparente puede comprender agarosa, colágeno, matrigel, alginato y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una mezcla de material de muestra puede acoplarse a la segunda superficie de la capa transparente. En algunas realizaciones, el sustrato puede acoplarse a un canal que está configurado para recibir partículas objetivo extraídas. Por ejemplo, el canal puede ser un tubo de células de flujo.
En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un sustrato tal como los descritos previamente en el presente documento con una pluralidad de microcanales, en donde los microcanales del sustrato comprenden partículas objetivo y material opaco en donde dichas partículas objetivo y material opaco se separan con un espaciador que comprende un gel transparente o un sólido transparente. En ciertas realizaciones, el material opaco comprende una partícula o un revestimiento. En ciertas realizaciones, el material opaco se separa de las partículas objetivo al menos aproximadamente 1 pm o más.
El sustrato puede ser una matriz de microporos de vidrio. En ciertas realizaciones, el sustrato comprende además una pluralidad de microcanales que se extienden desde la primera superficie y la segunda superficie. Los microcanales de los sustratos descritos en el presente documento pueden situarse sustancialmente paralelos entre sí. El sustrato puede contener de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 300 mil millones de microcanales. En ciertas realizaciones, los microcanales de un sustrato descrito en el presente documento tienen un diámetro interno promedio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 500 pm. En ciertas realizaciones, los microcanales de un sustrato descrito en el presente documento tienen un diámetro interno promedio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 10 micrómetros. En ciertas realizaciones, los microcanales de un sustrato en el presente documento tienen un diámetro interno promedio de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros.
En ciertas realizaciones, un microcanal del sustrato descrito en el presente documento se tapa o se cubre en una de las aberturas. En ciertas realizaciones, los microcanales del sustrato no tienen una abertura en una de las superficies del sustrato, tal como en la primera superficie o en la segunda superficie del sustrato. Un microcanal del sustrato puede taparse o cubrirse con un material. Por ejemplo, tal material puede ser a base de agarosa, a base de vidrio, a base de metal, a base de gelatina y/o a base de plástico.
En ciertas realizaciones, los microcanales del sustrato están configurados para recibir una mezcla de material de muestra desde el acceso de muestra. En otra realización, los microcanales del sustrato130están configurados para recibir una mezcla de material de muestra desde el pocillo de muestra. El contenido de los microcanales puede mantenerse en su lugar mediante fuerzas hidrostáticas.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, como se representa en la figura 2, el casete100está configurado para recibir un bastidor150dentro del casete100. En ciertas realizaciones, el bastidor150puede incluir además una membrana de hidratación151dentro del bastidor150. El bastidor150que contiene la membrana de hidratación151puede colocarse encima del sustrato130a continuación de la adición o carga de una mezcla de material celular al sustrato130. La membrana de hidratación151puede sellar la superficie superior del sustrato130para mantener el contenido de agua o ciertas concentraciones de sólidos disueltos en el microcanal. Una o más membranas de hidratación sustancialmente permeables y/o impermeables a gas pueden usarse para sellar las superficies del sustrato130a continuación de la adición de material celular al sustrato130. La membrana de hidratación151puede ser un sólido capaz de retener la humedad. Por ejemplo, la membrana de hidratación151puede ser una toalla de papel, Kimwipes®, agarosa, nitrocelulosa o plásticos, tales como poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF). En algunas realizaciones, una capa de hidratación hecha de una solución acuosa puede usarse en lugar de o junto con una membrana de hidratación. En una realización, la membrana de hidratación permite que el agua de un depósito se equilibre con la capa superior del líquido en el microcanal, lo que puede ayudar a mitigar el agua perdida a partir de evaporación. Por ejemplo, una membrana de hidratación151colocada en contacto con la superficie superior del sustrato130, con agua colocada encima de la película, atraparía el contenido del microcanal dentro de cada microcanal individual, pero permitiría que el agua o los medios fluyeran al microcanal. La membrana de hidratación pueden ser membranas de nitrocelulosa y NAFION®. Una disposición similar podría obtenerse con una forma porosa de una membrana de politetrafluoroetileno (por ejemplo, tejidos GORE-TEX®) que tiene orificios muy pequeños (por ejemplo, 10-100 nm) que atraparía cualquier célula en el microcanal pero permitiría que agua, medios y otros reactivos pasaran a los microcanales.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, representada en la figura2, el casete contiene un pocillo de muestra140. El pocillo de muestra140está configurado para recibir soluciones desde uno o más accesos de llenado. Como se representa en la figura4A, en una realización, el pocillo de muestra140está configurado para recibir una mezcla de material de muestra desde el acceso de muestra114. El pocillo de muestra puede comprender, contener o conectarse a materiales que pueden magnetizarse. Tales materiales incluyen hierro, níquel, cobalto, algunas aleaciones de metales raros, algunos minerales de origen natural y composiciones de los mismos. En una realización, como se representa en la figura4B, el pocillo de muestra140puede configurarse para estar en contacto con una superficie del sustrato130. En ciertas realizaciones, el pocillo de muestra140puede configurarse para moverse transversalmente a una superficie de un sustrato130. El pocillo de muestra140puede configurarse para moverse de forma manual, mecánica o electrónica. En algunas realizaciones, el pocillo de muestra puede conectarse a ruedas u otros cojinetes de bolas que están, a su vez, en contacto con una pista lisa fijada a la tapa superior. En diversas realizaciones, el pocillo de muestra puede conectarse a engranajes, que a su vez se conectan a ranuras que se conectan a la tapa superior. Cuando se aplica fuerza en paralelo a la pista, el pocillo de muestra se guía en la dirección de las pistas. La fuerza puede aplicarse mediante una fuerza de tracción de cables unidos que se conectan a un motor. El motor puede ser interno o externo al casete y alimentarse de forma manual con una manivela o de forma electrónica con una batería u otra fuente de voltaje. En ciertas realizaciones, el movimiento del pocillo de muestra puede controlarse magnéticamente. El pocillo de muestra puede ser controlado externamente por fuerzas magnéticas ubicadas fuera del casete, por ejemplo, dentro del aparato de clasificación de partículas de la divulgación. En ciertas realizaciones, se unen imanes al pocillo de muestra en las proximidades de la pared interior de la tapa superior. Entonces, los campos magnéticos externos al casete se manipulan hasta un contacto estrecho con los imanes internos en el pocillo de muestra. El movimiento del campo magnético externo genera una fuerza sobre los imanes en el interior del casete y mueve el pocillo de muestra a lo largo de una pista en el interior de la tapa superior. Los imanes pueden ser imanes de tierras raras como neodimio o electroimanes. En ciertas realizaciones, como se representa en la figura4B, el pocillo de muestra140puede moverse mientras la tapa superior110permanece unida a la tapa inferior120. En una realización, el pocillo de muestra puede configurarse para añadir o cargar material celular a los microcanales de un sustrato. En una realización, el pocillo de muestra incluye además un implemento de esparcimiento ubicado en la superficie inferior del pocillo de muestra. El implemento de esparcimiento puede estar en contacto con el sustrato para distribuir material celular a los microcanales. El instrumento de esparcimiento puede asemejarse a una racleta, lámina o agente de policía. El instrumento de esparcimiento puede hacerse de caucho, plástico, metal u otro material biocompatible impermeable a líquidos.
La realización de la figura1incluye además un sello510y un bastidor de metal520, como se representa en la figura5Ay la figura5B. Como se representa en la figura5Ay la figura5B, en una realización, el sello510se coloca entre el sustrato130y el bastidor de metal520. El sello510puede ser un material adhesivo. Por ejemplo, el sello510puede ser un adhesivo epoxi, incluyendo poliuretano, acrílico y cianoacrilato, que puede usarse como adhesivo para madera, metal, vidrio, piedra y plásticos. El adhesivo epoxi puede hacerse flexible o rígido, transparente u opaco, de endurecimiento rápido o de endurecimiento lento. Como se representa en la figura5B, el sustrato130y el bastidor de metal520están en contacto con el sello510. En una realización, el sustrato130, el sello510y el bastidor de metal520pueden ensamblarse a una temperatura de 15 °C o menos. Por ejemplo, el sustrato130, el sello510y el bastidor de metal520pueden ensamblarse a una temperatura de 5 °C. Como se representa en la figura 5B, el sustrato130, el sello510y el bastidor de metal520se ensamblan cuando están en funcionamiento. La temperatura del sustrato130, el sello510y el bastidor de metal520puede aumentarse durante el funcionamiento del casete100. A temperaturas aumentadas, el sustrato130, el sello510y el bastidor de metal520pueden expandirse. En algunas realizaciones, a temperaturas aumentadas, la expansión del bastidor de metal excede la expansión del sustrato, provocando de ese modo que se aplique una tensión transversalmente a la superficie del sustrato. Tal tensión transversalmente a la superficie del sustrato puede reducir la flacidez del sustrato y, de ese modo, mantener la planitud del sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende un primer extremo, un segundo extremo y una porción media, y el primer extremo, el segundo extremo y la porción media están sustancialmente en el mismo plano.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, representada en la figura2, la tapa inferior120también puede comprender una superficie interna para recoger partículas objetivo. En una realización, la superficie interna puede incluir una superficie de captación. La superficie de captación puede ser extraíble o afianzarse al casete. Por ejemplo, la superficie de captación puede ser un plato, una placa, una superficie curva o una superficie plana. En algunas realizaciones, como se representa en la figura2, la superficie interna de la tapa inferior120puede comprender un pocillo de recogida122y un acceso de recepción123. La superficie interna de la tapa inferior120puede configurarse para recibir soluciones desde uno o más accesos de llenado desde la tapa superior110. La tapa inferior puede comprender uno o más accesos de salida para drenar partículas objetivo y soluciones acuosas. En una realización de la divulgación, como se representa en la figura4F, la superficie interna de la tapa inferior120está configurada para recibir una solución acuosa desde el acceso de material accesorio112. La solución acuosa puede ayudar a transportar partículas objetivo desde la superficie interna de la tapa inferior120al pocillo de recogida122. La solución acuosa también puede ayudar a transportar partículas objetivo desde el pocillo de recogida122al acceso de recepción123. En una realización, las partículas objetivo pueden recuperarse del acceso de recepción123.
En otra realización, la superficie interna de la tapa inferior está configurada para recibir soluciones desde uno o más accesos de llenado de la tapa inferior. La tapa inferior puede comprender uno o más accesos de salida para drenar partículas objetivo y soluciones acuosas. En una realización, la superficie interna de la tapa inferior está configurada para recibir una solución acuosa desde un acceso de llenado. La solución acuosa puede ayudar a transportar partículas objetivo desde la superficie interna de la tapa inferior al pocillo de recogida. La solución acuosa también puede ayudar a transportar partículas objetivo desde el pocillo de recogida al acceso de recepción. En ciertas realizaciones, las partículas objetivo pueden recuperarse del acceso de recepción.
En una realización de un casete para clasificar partículas objetivo, representada en la figura1, la tapa superior 110 puede unirse a la tapa inferior120. Como se ha analizado anteriormente, el casete100puede ser un sistema cerrado. El sistema cerrado protege el material celular frente a contaminantes. El casete puede esterilizarse antes de añadir o cargar material celular sobre el sustrato130. Las porciones interiores del casete100pueden esterilizarse por separado y el casete100puede ensamblarse en condiciones estériles. La tapa superior110y la tapa inferior120pueden evitar la entrada de contaminantes en el casete100. La tapa superior 110 y la tapa inferior120pueden proteger las partículas objetivo frente a la contaminación, lo que incluye bacterias, hongos, levaduras, virus y micoplasmas. La naturaleza cerrada del casete100también protege al operador frente a cualquier patógeno potencial en el material de clasificación y protege cada muestra frente a la contaminación a partir de otra muestra.
Método para clasificar partículas objetivo
En diversas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para clasificar partículas objetivo. En diversas realizaciones de un método para clasificar partículas objetivo, como se representa en las figuras4Ay4B, se añade o carga una mezcla de material de muestra en el casete100a través de un acceso de muestra114ubicado en la tapa superior110. En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 * 106 a 100 * 109 células se cargan en el casete100. En diversas realizaciones, la mezcla de material de muestra se añade o carga directamente sobre el sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato puede inundarse con la mezcla de material de muestra. La mezcla de material de muestra puede moverse hacia los microcanales del sustrato a través de acción capilar. En algunas realizaciones, el sustrato puede inundarse con la mezcla de material de muestra cuando el diámetro de los microcanales varía de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 pm. En ciertas realizaciones, cualquier sustrato descrito en el presente documento puede comprender además elementos de frontera, en donde dichos elementos de frontera se extienden verticalmente desde el perímetro de la superficie superior del sustrato y permiten la contención de fluido en la superficie superior de dicho sustrato. En ciertas realizaciones, en donde dicho sustrato se inunda con un volumen de mezcla de material de muestra, dichos elementos de frontera contienen dicha mezcla de material de muestra y evitan que dicha mezcla contamine otras porciones de dicho casete. En ciertas realizaciones, el sustrato puede comprender elementos de frontera con dimensiones verticales de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 10 cm. En ciertas realizaciones, el diámetro promedio de los microcanales del sustrato es proporcional a la altura de los elementos de frontera, de tal modo que un sustrato con microcanales de diámetros promedio estrechos, por ejemplo, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 10 micrómetros, tiene elementos de frontera con dimensiones verticales de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 3 mm y un sustrato con microcanales de un diámetro promedio más amplio, por ejemplo, de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros, tiene elementos de frontera con unas dimensiones verticales de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 10 cm.
En otra realización, los microcanales del sustrato pueden llenarse con la mezcla de material de muestra colocando una gota colgante desde la tapa superior hasta una posición por encima del microcanal. En algunas realizaciones, la gota colgante puede estar en contacto con el microcanal. En algunas realizaciones, el volumen de la gota colgante puede variar de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 900 ml. La mezcla de material de muestra puede moverse hacia los microcanales a través de acción capilar. En otra realización, la mezcla de material de muestra puede ser recibida por el pocillo de muestra140. En una realización ilustrativa, como se representa en la figura4B, el pocillo de muestra140puede moverse transversalmente a la superficie superior del sustrato130de un extremo al extremo opuesto del sustrato. El pocillo de muestra140puede cargar o añadir una mezcla de material de muestra al sustrato130y los microcanales del sustrato. El pocillo de muestra140puede cargar una cantidad aproximadamente equivalente de mezcla de material de muestra a cada microcanal del sustrato. En algunas realizaciones, la mezcla de material de muestra puede cargarse con un pocillo de muestra cuando el diámetro de los microcanales varía de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm. En algunas realizaciones, el pocillo de muestra140puede contener un implemento de esparcimiento en el fondo del pocillo de muestra140. El implemento de esparcimiento puede estar en contacto con el sustrato130para distribuir una mezcla de material de muestra a los microcanales y fuera de la superficie del sustrato. El instrumento de esparcimiento puede moverse transversalmente de un extremo al extremo opuesto del sustrato130para distribuir una mezcla de material de muestra a los microcanales del sustrato. En una realización, el método de la presente divulgación contempla una distribución de material celular que puede ser de 1 a 1000 células, de 1 a 500 células, de 1 a 100 células, de 1 a 50 células o aproximadamente 1 a 5 células en un microcanal del sustrato.
En otra realización, se añade o carga una mezcla de material de muestra en el casete a través de un acceso de llenado ubicado en la tapa inferior. En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 * 106 a 100 * 109 células se cargan en el casete. En diversas realizaciones, la mezcla de material de muestra se añade o carga directamente sobre el sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato puede inundarse con la mezcla de material de muestra. La mezcla de material de muestra puede moverse hacia los microcanales del sustrato a través de acción capilar. En algunas realizaciones, el sustrato puede inundarse con la mezcla de material de muestra cuando el diámetro de los microcanales varía de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 pm. En otra realización, los microcanales del sustrato pueden llenarse con la mezcla de material de muestra colocando una gota colgante desde la tapa inferior hasta una posición por encima del microcanal. En algunas realizaciones, la gota colgante puede estar en contacto con el microcanal. En algunas realizaciones, el volumen de la gota colgante puede variar de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 900 ml. La mezcla de material de muestra puede moverse hacia los microcanales a través de acción capilar. En otra realización, la mezcla de material de muestra puede ser recibida por el pocillo de muestra. El pocillo de muestra puede moverse transversalmente a la superficie superior del sustrato de un extremo al extremo opuesto del sustrato. El pocillo de muestra puede cargar o añadir una mezcla de material de muestra al sustrato y los microcanales del sustrato. El pocillo de muestra puede cargar una cantidad aproximadamente equivalente de mezcla de material de muestra a cada microcanal del sustrato. En algunas realizaciones, la mezcla de material de muestra puede cargarse con un pocillo de muestra cuando el diámetro de los microcanales varía de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm. En algunas realizaciones, el pocillo de muestra puede contener un implemento de esparcimiento en el fondo del pocillo de muestra. El implemento de esparcimiento puede estar en contacto con el sustrato para distribuir material de muestra a los microcanales. El instrumento de esparcimiento puede moverse transversalmente de un extremo al extremo opuesto del sustrato para distribuir una mezcla de material de muestra a los microcanales del sustrato y fuera de la superficie del sustrato. En ciertas realizaciones, el método de la presente divulgación contempla una distribución de material celular que puede ser de 1 a 1000 células, de 1 a 500 células, de 1 a 100 células, de 1 a 50 células, y aproximadamente de 1 a 5 células en al menos uno de los microcanales del sustrato.
Después de que la mezcla de material de muestra se haya cargado en los microcanales del sustrato 100 o se haya cargado sobre la primera superficie del sustrato, se escanean los microcanales y la primera superficie del sustrato, como se representa en la figura4E, para detectar una o más partículas objetivo. El escaneo incluye la iluminación de los microcanales con una longitud de onda específica (una primera longitud de onda) o un conjunto de longitudes de onda específicas, y la detección de las partículas objetivo con una longitud de onda específica (una segunda longitud de onda) o un conjunto de longitudes de onda específicas. Por ejemplo, las longitudes de onda específicas incluyen longitudes de onda que varían desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1,5 mm. Las longitudes de onda específicas para la iluminación y detección pueden ser iguales o diferentes. Cualquier longitud de onda a la que se hace referencia en el presente documento, por ejemplo, una primera longitud de onda, una segunda longitud de onda, una tercera longitud de onda, una cuarta longitud de onda y una longitud de onda X1, pueden seleccionarse independientemente de entre al menos una longitud de onda dentro de un intervalo del espectro electromagnético que se extiende desde el ultravioleta hasta el infrarrojo lejano. La primera, la segunda, la tercera y la cuarta longitudes de onda y la longitud de onda X1 se seleccionan independientemente de entre una o más longitudes de onda que varían desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1,5 mm. En algunas realizaciones, la primera, la segunda, la tercera y la cuarta longitudes de onda y la longitud de onda X1 se seleccionan independientemente de entre longitudes de onda que varían desde aproximadamente 400 nm hasta aproximadamente 700 nm. Por ejemplo, las longitudes de onda de iluminación pueden incluir de 350 nm a 400 nm para iluminar el 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI); 400 nm a 450 nm para excitar colorantes tales como BV421™, proteína fluorescente cian (CFP), AmCyan y Pacific Blue™; 450 nm a 500 nm para excitar colorantes tales como la proteína fluorescente de color verde (GFP), complejo peridinina-clorofila-proteína (PerCP) y PerCP-Cy™5,5; 500 nm a 600 nm para iluminar colorantes tales como R-ficoeritrina (PE), PE-Texas Red®, Texas Red®, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), PE-Cy™5, PE-Cy™5,5, PE-Cy™7 y PE-Dazzle™; 600 nm a 700 nm para excitar colorantes tales como la aloficocianina (APC), Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 780 y APC-Cy™7; y de 800 nm a 1200 nm para iluminar puntos cuánticos de AG2SE o nanotubos de carbono monopared (SWNT). Las longitudes de onda de detección pueden incluir de 350 nm a 400 nm y de 400 a 500 nm para detectar un colorante tal como BV421™; de 500 nm a 600 nm para detectar colorantes tales como la proteína fluorescente de color verde (GFP) y el complejo de proteína clorofila peridinina (PerCP); de 600 nm a 700 nm, de 800 nm a 900 nm, de 900 nm a 1100 nm y de 1100 nm a 1300 nm para detectar nanotubos de carbono de una única pared (SWNT) y puntos cuánticos de AG2SE; y de 1300 nm a 1500 nm para detectar puntos cuánticos de AG2SE y nanotubos de carbono monopared (SWNT). Además, la fuente de radiación electromagnética puede iluminar una longitud de onda, como en una fuente de láser, o una banda de longitud de onda, como en las fuentes de luz de LED. La fuente de radiación electromagnética puede usarse sola o puede generarse una trayectoria de luz que contenga múltiples longitudes de onda o múltiples potencias simultáneamente. También pueden aislarse temporalmente diferentes longitudes de onda o potencias, lo que significa que solo una longitud de onda o potencia ocupa el tren óptico en un momento dado, pero pueden intercambiarse múltiples longitudes de onda o potencias diferentes. Los tiempos de iluminación pueden variar de 10 femtosegundos a 5 s. La luz de la fuente también puede separarse espacialmente, lo que significa que la luz de una longitud de onda o potencia diferente puede entrar en el casete al mismo tiempo, pero en diferentes ubicaciones. Las fuentes de luz también pueden separarse espacial y temporalmente. La fuente puede ser capaz de emitir múltiples longitudes de onda para adaptarse a diferentes propiedades de absorción de distintos materiales y etiquetas. En ciertas realizaciones, la especificidad deseada será una única célula por microcanal. En algunas realizaciones, la radiación electromagnética se transmite desde la fuente al sustrato a través de una porción transmisiva en un casete. Las señales desde cada microcanal se escanean para localizar los microcanales de interés. En una realización, un microcanal se criba detectando una señal electromagnética emitida desde una etiqueta en cada cavidad.
Las partículas objetivo pueden identificarse mediante un perfil de emisión singular. En algunas realizaciones, iluminar un microcanal con una pluralidad de longitudes de onda diferentes y detectar una emisión del microcanal que se corresponde con emisiones desde una o más partículas objetivo. En otra realización, iluminar un microcanal con una única longitud de onda y detectar una pluralidad de emisiones del microcanal se corresponde con emisiones desde una o más partículas objetivo. En otra realización, iluminar un microcanal con una pluralidad de longitudes de onda y detectar una pluralidad de emisiones del microcanal se corresponde con emisiones desde una o más partículas objetivo.
Tras detectar la partícula de interés, la partícula de interés puede extraerse, como se representa en la figura4E, del sustrato130. Los microcanales individuales que contienen la partícula de interés pueden extraerse usando una diversidad de métodos. En una realización, el método incluye la eyección a presión. Por ejemplo, un sustrato es cubierto por una película de plástico. El método proporciona además un láser capaz de hacer un orificio a través de la película de plástico, exponiendo de ese modo el microcanal direccionado espacialmente. Posteriormente, la exposición a una fuente de presión (por ejemplo, presión de aire) expulsa el contenido del microcanal direccionado espacialmente. En otra realización, el método de extracción implica enfocar radiación electromagnética en el microcanal del sustrato para que sea absorbida por material opaco. La energía de la radiación incidente se convierte en calor de vaporización de una porción de la solución acuosa para generar una expansión de las partículas objetivo o evaporación que expulsa al menos parte de las partículas objetivo del microcanal del sustrato.
En ciertas realizaciones, la extracción de los microcanales del sustrato se logra mediante la excitación de una o más partículas, por ejemplo, partículas opacas, en los microcanales del sustrato, en donde la energía de excitación se enfoca en las partículas. En consecuencia, algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, emplean partículas absorbentes de energía en las cavidades y una fuente de radiación electromagnética capaz de entregar radiación electromagnética de las partículas en cada microcanal del sustrato. La excitación de las partículas en un microcanal puede provocar una liberación de energía que perturba y libera la solución o mezcla del microcanal. En ciertas realizaciones, la energía se transfiere a las partículas con un aumento mínimo o nulo de la temperatura de la solución o mezcla dentro del microcanal. En ciertos aspectos, una secuencia de pulsos agita repetidamente perlas magnéticas en un microcanal para perturbar un menisco, lo que expulsa material celular objetivo del sustrato. En ciertos aspectos, el material celular extraído se expulsa sobre la superficie interna de la tapa inferior.
Las partículas objetivo se extraen del microcanal con una longitud de onda específica (una tercera longitud de onda) que puede seleccionarse de entre longitudes de onda que varían de 200 nm a aproximadamente 1,5 mm. En algunas realizaciones, las partículas objetivo se extraen del microcanal con una longitud de onda específica (una tercera longitud de onda) que puede seleccionarse de entre longitudes de onda que varían de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 1200 nm. La longitud de onda específica para la extracción puede ser la misma o diferente de las longitudes de onda usadas para iluminar y detectar las partículas objetivo. La primera, la segunda y la tercera longitudes de onda a las que se hace referencia en el presente documento se seleccionan independientemente de entre longitudes de onda que varían desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1,5 mm. Además, la fuente de radiación electromagnética puede ser la misma o diferente de la fuente usada para iluminar y detectar las partículas objetivo. La fuente puede ser capaz de emitir múltiples longitudes de onda para adaptarse a diferentes espectros de absorción de distintos materiales y etiquetas. Además, las fuentes de radiación electromagnética usadas para la iluminación, la detección y la extracción pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Como se ha analizado previamente, las partículas objetivo extraídas pueden acumularse en la superficie interna de la tapa inferior120. Como se representa en la figura4F, puede añadirse una solución al casete100a través de un acceso de llenado ubicado en la tapa superior. En otra realización, puede añadirse una solución acuosa al casete100a través de un acceso de llenado ubicado en la tapa inferior. En una realización, la solución es tampón. En una realización, puede añadirse tampón al acceso de material accesorio112ubicado en la tapa superior110. Como se representa en la figura4F, el tampón puede mover las partículas objetivo extraídas desde la superficie interna de la tapa inferior al pocillo de recogida122. Adicionalmente, como se representa en la figura4G, las partículas objetivo extraídas pueden retirarse del casete100a través del acceso de recepción123. Las partículas objetivo extraídas pueden recuperarse a un recipiente esterilizado previamente. Las partículas objetivo extraídas pueden recuperarse en condiciones estériles.
Las partículas objetivo extraídas pueden estar libres de contaminantes.
Composiciones farmacéuticas y preparaciones de las mismas
En algunos aspectos, los dispositivos y métodos de la divulgación posibilitan la preparación de composiciones farmacéuticas de células, por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC) y/o células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC), con una esterilidad, pureza y viabilidad sin precedentes. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden prepararse cribando material celular y extrayendo células con el fenotipo o fenotipos deseado(s).
En particular, la divulgación proporciona métodos de clasificación de material celular, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos comprenden cribar material celular, por ejemplo, con los sistemas y métodos de escáner descritos en el presente documento, a una velocidad de aproximadamente 100.000 células por segundo o más. Los métodos pueden comprender cribar material celular para identificar células con un fenotipo deseado a una velocidad de aproximadamente 150.000 células por segundo o más, aproximadamente 200.000 células por segundo o más, aproximadamente 250.000 células por segundo o más, aproximadamente 300.000 células por segundo o más, aproximadamente 350.000 células por segundo o más, aproximadamente 400.000 células por segundo o más, aproximadamente 450.000 células por segundo o más, aproximadamente 500.000 células por segundo o más, aproximadamente 550.000 células por segundo o más, aproximadamente 600.000 células por segundo o más, aproximadamente 650.000 células por segundo o más, aproximadamente 700.000 células por segundo o más, aproximadamente 750.000 células por segundo o más, aproximadamente 800.000 células por segundo o más, aproximadamente 850.000 células por segundo o más, aproximadamente 900.000 células por segundo o más, o aproximadamente 950.000 células por segundo o más. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden cribar material celular para identificar células de un fenotipo deseado a una velocidad de aproximadamente 1.000.000 de células por segundo o más, aproximadamente 1.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 2.000.000 células por segundo o más, aproximadamente 2.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 3.000.000 células por segundo o más, aproximadamente 3.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 4.000.000 células por segundo o más, aproximadamente 4.500.000 células por segundo o más, o aproximadamente 5.000.000 células por segundo o más. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden cribar material celular para identificar células de un fenotipo deseado a una velocidad de aproximadamente 100.000 células por segundo a aproximadamente 2.000.000 de células por segundo.
Se describen métodos, que no forman parte de la invención, para el cribado de material celular, por ejemplo, con los sistemas y métodos de escáner descritos en el presente documento, para identificar HSC y/o HSPC con un fenotipo deseado. En algunas realizaciones, los métodos comprenden cribar material celular en donde menos del 10 % del material celular original comprende HSC y/o HSPC, tal como menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o incluso menos del 1 % del material celular original comprende HSC y/o HSPC.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para extraer células a partir del material celular original, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto humano, en donde las células extraídas son de un fenotipo deseado a una velocidad de 100.000 células por segundo o más. Los métodos pueden comprender extraer células de un fenotipo o fenotipos deseado(s) del material celular a una velocidad de aproximadamente 150.000 células por segundo o más, aproximadamente 200.000 células por segundo o más, aproximadamente 250.000 células por segundo o más, aproximadamente 300.000 células por segundo o más, aproximadamente 350.000 células por segundo o más, aproximadamente 400.000 células por segundo o más, aproximadamente 450.000 células por segundo o más, aproximadamente 500.000 células por segundo o más, aproximadamente 550.000 células por segundo o más, aproximadamente 600.000 células por segundo o más, aproximadamente 650.000 células por segundo o más, aproximadamente 700.000 células por segundo o más, aproximadamente 750.000 células por segundo o más, aproximadamente 800.000 células por segundo o más, aproximadamente 850.000 células por segundo o más, aproximadamente 900.000 células por segundo o más, o aproximadamente 950.000 células por segundo o más. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden extraer células de un fenotipo o fenotipos deseado(s) a una velocidad de aproximadamente 1.000.000 de células por segundo o más, aproximadamente 1.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 2.000.000 células por segundo o más, aproxim 2.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 3.000.000 células por segundo o más, aproxim 3.500.000 células por segundo o más, aproximadamente 4.000.000 células por segundo o más, aproxim 4.500.000 células por segundo o más, o aproximadamente 5.000.000 células por segundo o más. Los métodos pueden comprender extraer células de un fenotipo o fenotipos deseado(s) del material celular a una velocidad de aproximadamente 150.000 células por segundo a aproximadamente 2.000.000 de células por segundo. En ciertas realizaciones, mayor que el 90 %, mayor que el 92 %, mayor que el 95 %, más del 98 % o más del 99 % de las células extraídas son HSC y/o HSPC.
Algunos ejemplos, que no forman parte de la invención, describen métodos que comprenden la extracción de células de un fenotipo deseado en donde el extracto resultante tiene una pureza muy alta para dicho fenotipo deseado. La extracción de células puede producir un extracto celular en donde aproximadamente el 95 % o más del extracto celular son células de un fenotipo deseado. Los métodos pueden comprender extraer células en donde aproximadamente el
96%o más del extracto celular, aproximadamente el 97%o más del extracto celular, aproximadamente el 98%o más del extracto celular, aproximadamente el 99 % o más del extracto celular, son células de un fenotipo deseado. Las células extraídas, tales como HSC y/o HSPC extraídas, pueden comprender células con un fenotipo o fenotipos deseado(s), por ejemplo, el 95 % o más del extracto celular tiene el fenotipo o fenotipos deseado(s). En ciertas realizaciones, el 96 % o más del extracto celular, el 97 % o más del extracto celular, el 98 % o más del extracto celular, o el 99 % o más del extracto celular son células del fenotipo o fenotipos deseado(s).
Los métodos pueden comprender extraer células de un fenotipo deseado, en donde el extracto celular tiene una viabilidad alta. La viabilidad de las células puede medirse en términos de supervivencia celular posteriormente a extraer las células. Posteriormente a extraer las células puede incluir medir la supervivencia de las células de aproximadamente 1 minuto después hasta aproximadamente 5 horas después de extraer las células. En algunas realizaciones, los métodos comprenden extraer células produciendo de ese modo un extracto celular en donde el extracto celular tiene una viabilidad aproximadamente superior al 95 %. En ciertas realizaciones, el extracto celular tiene una viabilidad superior al 96 %, mayor que el 97 %, mayor que el 98 %, mayor que el 99 %. Los métodos de la presente divulgación pueden dar como resultado extraer células de un fenotipo deseado, en donde el extracto celular tiene una esterilidad adecuada para un uso terapéutico sin necesidad de procedimientos de esterilización adicionales. El extracto celular puede estar esencialmente libre de patógenos y otros contaminantes, por ejemplo, el extracto celular tiene menos del 1 % de patógenos, menos del 0,05 % de patógenos, menos del 0,01 % de patógenos, o menos del 0,005 % de patógenos. En ciertas realizaciones, los métodos de la divulgación posibilitan la preparación de extractos de células con propiedades terapéuticas mejoradas, por ejemplo, enfermedad de injerto contra hospedador despreciable.
En algunos aspectos, que no forman parte de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden extractos de células con una o más de las siguientes características: (a) mayor que el 90 %, más del 95 %, o más del 99 % de las células del extracto celular son HSC y/o HSPC; (b) el extracto celular está esencialmente libre de patógenos, por ejemplo, menos del 1 %, menos del 0,5 %, menos del 0,05 %, o menos del 0,01 % de patógenos; (c) el extracto de células tiene una pureza para las células de los fenotipos deseados de más del 95 %, mayor que el 96 %, mayor que el 97 %, más del 98 % o más del 99 % de las células en el extracto; (d) el extracto es adecuado para un uso terapéutico sin procedimientos de esterilización adicionales; y (e) más del 90 % del extracto celular es viable según se determina a continuación de la extracción, por ejemplo, la viabilidad medida dentro de las 2 horas posteriores a la extracción.
La presente divulgación proporciona una composición terapéutica que comprende células, en donde más del 95 % de las células de las composiciones son HSC y/o HSPC, y más del 95 % de las células son de un fenotipo o fenotipos deseado(s). Se describe una composición terapéutica que comprende células, en donde más del 95 % de las células de las composiciones son HSC y/o HSPC, más del 95 % de las células son de un fenotipo o fenotipos deseado(s), y la composición comprende una cantidad despreciable de patógenos, por ejemplo, menos del 0,1 %, menos del 0,05 % o menos del 0,001 % de patógenos. La presente divulgación proporciona una composición terapéutica que comprende células, en donde más del 95 % de las células de las composiciones son HSC y/o HSPC, más del 95 % de las células son de un fenotipo o fenotipos deseado(s), y menos del 0,009 %, menos del 0,008 %, menos del 0,007 %, menos del 0,006 %, menos del 0,005 %, menos del 0,004 %, menos del 0,003 %, menos del 0,002 % o menos del 0,001 % de las células son células T sin exposición previa. La presente divulgación proporciona una composición terapéutica que comprende células, en donde más del 95 % de las células de las composiciones son HSC y o HSPC, más del 95 % de las células son de un fenotipo deseado y el 96 % o más, el 97 % o más, el 98 % o más, o el 99 % o más de las células son viables.
Kits
En otro aspecto, un ejemplo se dirige a kits para clasificar partículas objetivo. En una realización, los kits incluyen un casete para clasificar partículas objetivo. En ciertas realizaciones, el casete contiene una unidad de alojamiento cerrada, una porción transmisiva, un sustrato encapsulado en la unidad de alojamiento cerrada y uno o más accesos de llenado. En ciertas realizaciones, el casete se esteriliza antes de la adición de una mezcla de material de muestra.
Los kits también pueden incluir materiales instructivos que contienen instrucciones (es decir, protocolos) que prevén el uso del casete para clasificar partículas objetivo. Aunque los materiales de instrucciones incluyen habitualmente materiales escritos o impresos, estos no se limitan a tales cosas. Cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicar las mismas a un usuario final es contemplado por esta divulgación. Tales medios incluyen, pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejempo, CD-ROM) y similares. Tales medios pueden incluir direcciones a sitios de Internet que proporcionan tales materiales de instrucciones.
Aislamiento de macrogel
Los microcanales610del sustrato130se cargan de una forma específica para mantener la integridad de las partículas objetivo. En una realización, como se representa en la figura6, el microcanal610de un sustrato130se carga con una mezcla de partículas y una mezcla de componentes de muestra.
Como se representa en la figura6, la mezcla de partículas puede contener una mezcla heterogénea de partículas opacas620y una solución transparente630. En algunas realizaciones, la solución transparente separa las partículas opacas del componente de muestra. En una realización, las partículas opacas y el componente de muestra se separan una distancia promedio de 1 pm o más. La solución transparente proporciona protección al componente de muestra frente a la energía liberada desde las partículas opacas. Las partículas opacas absorben al menos parcialmente la radiación electromagnética y transfieren al menos parcialmente la energía a la solución transparente. En algunas realizaciones, la transferencia de energía a la solución transparente provoca la vaporización de la solución transparente circundante. En una realización, las partículas opacas no están en contacto con el componente de muestra. En algunas realizaciones, la solución transparente también es una solución viscosa. Por ejemplo, la solución transparente puede ser agarosa, colágeno, matrigel o alginato. En algunas realizaciones, las partículas opacas pueden tener propiedades de dispersión de luz. Las partículas opacas pueden proteger el componente de muestra frente a la radiación electromagnética durante la extracción. Las partículas opacas pueden absorber radiación electromagnética de una longitud de onda específica. Por ejemplo, las longitudes de onda específicas incluyen longitudes de onda que varían desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1,5 mm. Como se representa en la figura6, la mezcla de componentes de muestra contiene un componente de muestra650y una solución acuosa640. El componente de muestra puede comprender una célula. La solución acuosa puede incluir agua, tampón, medios y suero. En algunas realizaciones, la mezcla de partículas y la mezcla de componentes de muestra están en capas separadas.
En diversas realizaciones, la mezcla de partículas se vierte en el microcanal antes de la adición de la mezcla de componentes de muestra. La mezcla de partículas puede solidificarse antes de la adición de la mezcla de componentes de muestra. En algunas realizaciones, la mezcla de partículas se añade al microcanal del sustrato y, entonces, la mezcla de componentes de muestra se añade posteriormente al microcanal del sustrato. En ciertas realizaciones, una solución de grabado se añade al microcanal antes de la adición de la mezcla de componentes de muestra. La solución de grabado puede disolver al menos parcialmente la mezcla de partículas. La solución de grabado puede incluir ácido fluorhídrico, un ácido fuerte tal como ácido clorhídrico, ácido nítrico o ácido sulfúrico, una base fuerte tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, o cualquier otro agente de grabado como es conocido por un experto en la materia. El componente de muestra permanece viable después del escaneo y la extracción con radiación electromagnética.
Aislamiento de microgel
En algunas realizaciones, como se representa en la figura7B, material de muestra y partículas que contienen una cubierta710se cargan simultáneamente en los microcanales del sustrato. Las partículas pueden comprender un núcleo opaco. Un núcleo opaco puede comprender una perla magnética o una perla no magnética. En una realización, el núcleo opaco es una perla magnética. En otro aspecto, la cubierta comprende un material transparente. El material transparente puede ser agarosa, colágeno, matriz extracelular, alginato, membranas biológicas llenas de fluido, micela, vesículas de lípido o ácido graso llenas de fluido. En ciertas realizaciones, las partículas que no contienen una cubierta pueden tener un diámetro de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 200 pm. En ciertas realizaciones, las partículas que contienen una cubierta pueden tener un diámetro de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 400 pm. El material de muestra puede ser una célula. En estas realizaciones, el material de muestra puede mantener la viabilidad después del escaneo y la extracción con radiación electromagnética. En algunas realizaciones, el material de muestra es viable al menos al 10 %. Por ejemplo, las células cargadas con partículas que contenían una cubierta se extrajeron con una eficiencia de extracción superior al 90 %, como se representa en la figura7C, y el 100 % de supervivencia celular, como se representa en la figura7D.
En otra realización, material de muestra y partículas que contienen una cubierta se cargan secuencialmente en los microcanales del sustrato. En una realización, en primer lugar se carga el material de muestra y entonces, las partículas que contienen la cubierta son carga. Las partículas pueden comprender un núcleo opaco. Un núcleo opaco puede comprender una perla magnética o una perla no magnética. En una realización, el núcleo opaco es una perla no magnética. En otro aspecto, la cubierta comprende un material transparente. El material transparente puede ser agarosa, colágeno, matriz extracelular, alginato, membranas biológicas llenas de fluido, micela, vesículas de lípido o ácido graso llenas de fluido. En ciertas realizaciones, las partículas que no contienen una cubierta pueden tener un diámetro de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 200 pm. En ciertas realizaciones, las partículas que contienen una cubierta pueden tener un diámetro de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 400 pm. El material de muestra puede ser una célula. En estas realizaciones, el material celular puede mantener la viabilidad después del escaneo y la extracción con radiación electromagnética. En algunas realizaciones, el material de muestra es viable al menos al 10 %.
En cambio, un material de muestra cargado con partículas sin una cubierta puede no mantener la viabilidad. En algunas realizaciones, la viabilidad del material de muestra cargado con partículas sin una cubierta puede ser de aproximadamente el 9 % o menos. Por ejemplo, para las células que se cargaron con partículas sin una cubierta, como se representa en la figura7A, aunque la eficiencia de extracción fue del 100 %, como se muestra en la figura7C, la tasa de supervivencia celular fue del 0 %, como se muestra en la figura7D.
Espaciador en el poro
Los microcanales610del sustrato130se cargan de una forma específica para mantener la integridad del componente de muestra. En algunas realizaciones, como se representa en la figura8A, el componente de muestra puede cargarse con unas partículas magnéticas710y unas partículas no magnéticas810. En algunas realizaciones, la mezcla está formada por unas partículas magnéticas710y las partículas no magnéticas en una relación de peso de aproximadamente 1:0,5 a 1:10. En una realización, las partículas magnéticas en el microcanal están en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml o aproximadamente 30 mg/ml. Las partículas no magnéticas en el microcanal están en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. En algunas realizaciones, el componente de muestra es una célula intacta o lisada. Las partículas no magnéticas810comprenden un material que no daña las células cuando se excita con radiación electromagnética. Por ejemplo, las partículas no magnéticas pueden comprender sílice, plástico, agarosa o alginato. En algunas realizaciones, se aplica una fuerza magnética sobre el microcanal para atraer las partículas magnéticas710para formar una capa encima de las partículas no magnéticas810, como se representa en la figura8A. Las partículas magnéticas710se ubican por encima de las partículas no magnéticas810. En otra realización, se aplica una fuerza magnética debajo del microcanal para atraer las partículas magnéticas y formar una capa debajo de las partículas no magnéticas. Las partículas magnéticas710se separan del material de muestra, por al menos 1 pm o más.
La relación de partículas magnéticas710con respecto a partículas no magnéticas810desempeña un papel en la eficiencia de extracción y la viabilidad celular del material celular. Por ejemplo, como se representa en la figura8B, cuando las partículas magnéticas710se mantienen constantes a 15 mg/ml, la eficiencia de extracción y la tasa de supervivencia celular variaron dependiendo de la concentración de partículas no magnéticas. En particular, a 5 mg/ml de partículas no magnéticas, la eficiencia de extracción fue de aproximadamente el 57 % y la supervivencia celular fue del 0 %; a 10 mg/ml de partículas no magnéticas, la eficiencia de extracción fue de aproximadamente el 100 % y la supervivencia celular fue del 0 %; a 20 mg/ml de partículas no magnéticas, la eficiencia de extracción fue de aproximadamente el 73 % y la supervivencia celular fue de aproximadamente el 63 %; y a 40 mg/ml de partículas no magnéticas, la eficiencia de extracción fue de aproximadamente el 80 % y la supervivencia celular fue de aproximadamente el 25 %.
En otro aspecto, el componente de muestra puede cargarse con partículas opacas de una forma secuencial. En primer lugar, el componente de muestra y una pluralidad de partículas opacas que no absorben una longitud de onda específica se cargan en el microcanal del sustrato. Las longitudes de onda específicas incluyen longitudes de onda que varían desde aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 1,5 mm. Entonces, las partículas opacas que absorben una longitud de onda específica se cargan en el microcanal. En una realización, las partículas opacas comprenden partículas magnéticas y no magnéticas. En una realización, las partículas opacas comprenden partículas magnéticas.
Carga secuencial
En diversos aspectos de un método para cuantificar el número de material de muestra en un microcanal de un sustrato, los microcanales610del sustrato130puede cargarse secuencialmente para mejorar la visibilidad de la muestra. En ciertas realizaciones, el material de muestra puede comprender una célula. En una realización ilustrativa, como se representa en la figura9A, la mezcla de muestra se añade en primer lugar a los microcanales del sustrato y entonces, las partículas se añaden posteriormente a los microcanales del sustrato. Entonces, puede cuantificarse el número de material de muestra en los microcanales. En diversas realizaciones, las partículas son perlas opacas. Por ejemplo, las perlas opacas incluyen Dynabead®, agarosa y ProMag®. En algunas realizaciones, las partículas se añaden a los microcanales del sustrato después de aproximadamente 5 minutos o más después de la adición de la mezcla de muestra. En ciertas realizaciones, las partículas se añaden a los microcanales del sustrato después de aproximadamente 10 minutos de la adición de la mezcla de muestra. En una realización, la cantidad de material de muestra puede cuantificarse por microscopía. En ciertas realizaciones, la cantidad de células puede cuantificarse por microscopía. En algunas realizaciones, tal carga secuencial evita que las células queden ocultas a la vista por las perlas. Por ejemplo, como se representa en las figuras9Ba9G, tres tipos de partículas (es decir, Dynabead®, agarosa y ProMag®) se aplicaron a los microcanales de un sustrato tanto de una forma secuencial como en un lote mixto con material celular. Se usó Dynabead® en las figuras9By9C, se usó agarosa en las figuras9Dy9E, y se usó ProMag® en las figuras9Fy9G. Adicionalmente, la figura9Hmuestra una representación gráfica del control que no contenía ninguna partícula. La precisión del recuento de células en cada microcanal utilizando el método de carga secuencial y el método de lote mixto se comparó con el control en la figura9H. Como se muestra en las figuras9Ba9G, los microcanales que se cargaron con el método de carga secuencial (las figuras9C,9Ey9G) se asemejaban más al recuento de células en el control (la figura9H) que los microcanales que se cargaron con el método de lote mixto (las figuras9B,9Dy9F).
Desplazamiento de fluorescencia
En ciertas realizaciones, los microcanales610del sustrato130se cargan con material fluorescente para mejorar la visibilidad de la muestra. En una realización ilustrativa, como se representa en la figura10, se añade material de muestra y material fluorescente a los microcanales y posteriormente se cuantifica el material de muestra. En ciertas realizaciones, el material de muestra puede comprender un material celular. En ciertas realizaciones, el material celular puede comprender células. Cada microcanal del sustrato130se carga casi uniformemente con material fluorescente.
El material fluorescente puede estar en solución o unido a un sólido, tal como perlas opacas. Por ejemplo, el material fluorescente puede incluir isotiocianato de fluoresceína (FITC), Alexa Fluor®, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 700, Brilliant Violet™ 421, R-ficoeritrina (PE), PE-Cy® 5, aloficocianina (APC), PE Texas Red®, proteína fluorescente de color verde (GFP) y proteína fluorescente de color amarillo (YFP). La presencia de una o más células baja la señal fluorescente a partir del microcanal. La presencia de una célula reduce la intensidad fluorescente en al menos el 5 % del valor máximo y no más del 95 % del valor máximo. En esta realización, la intensidad de fluorescencia alta en el microcanal se correlaciona con un recuento de células nulo o un recuento de células bajo en el microcanal. Una intensidad de fluorescencia baja se correlaciona con un recuento de células alto en el microcanal. Por ejemplo, como se ve en las figuras10Cy10D, los microcanales del sustrato que se cargan con material fluorescente y no contienen células, esas regiones correspondientes son más brillantes que las regiones que contienen células. Las regiones que contienen células se rodean con un círculo en la figura10D. Adicionalmente, La figura10Ey10Fmuestran las regiones que contienen células a través del uso de células APC y sus regiones brillantes correspondientes. La figura 10G muestra que la intensidad fluorescente promedio de un microcanal sin ninguna célula es mayor que la intensidad fluorescente promedio de un microcanal con una célula.
Clasificador ultrarrápido
En una realización de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser, La figura11ilustra un aparato óptico que utiliza un espejo poligonal rotatorio. El aparato1100comprende una primera fuente de luz de excitación de fluorescencia1110y una segunda fuente de luz de excitación de fluorescencia1112. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia. En algunos casos, la pluralidad de fuentes de luz de excitación pueden superponerse. En algunos casos, la pluralidad de fuentes de luz de excitación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 fuentes de luz de excitación de fluorescencia. Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden comprender fuentes de luz láser. Una o más de las fuentes de luz de excitación pueden comprender fuentes de luz de diodos emisores de luz (LED). En algunos casos, una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de fluorescencia de un fluoróforo particular. En algunos casos, una o más de las fuentes de luz de excitación pueden estar configuradas para emitir una pluralidad de longitudes de onda de luz. En algunos casos, una o más de las fuentes de luz de excitación pueden estar configuradas para emitir una pluralidad de longitudes de onda de luz, de tal modo que cada una de la pluralidad de longitudes de onda comprende un pico separado de otros picos de la pluralidad de longitudes de onda. Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de un fluoróforo que es endógeno a una célula para excitar la autofluorescencia. Por ejemplo, una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden sintonizarse a la longitud de onda de excitación de una molécula autofluorescente tal como nicotinamida adenina dinucleotido fosfato (NADPH), clorofila, colágeno, retinol, riboflavina, colecalciferol, ácido fólico, piridoxina, tirosina, ditirosina, indolamina, lipofuscina, polifenol, triptófano, flavina o melanina. Una o más de las fuentes de luz de excitación pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de cualquier molécula autofluorescente.
Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de un fluoróforo que es exógeno a una célula. Por ejemplo, una o más de la pluralidad de fuentes de luces de excitación de fluorescencia pueden sintonizarse a la longitud de onda de excitación de la hidroxicumarina, metoxicumarina, Alexa Fluor, aminocumarina, Cy2, carboxifluoresceína (FAM), Alexa Fluor 488, isotiocianato de fluoresceína (FITC,fluorescein isothiocyanate),Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, 6-carboxi-2,4,4,5,7,7-hexaclorofluoresceína (HEX), Cy3, tetrametilrodamina (TRITC), Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, R-ficoeritrina, Rojo Rodamina-X, Tamara, Cy3.5 581, Rox, Alexa Fluor 568, Rojo 613, rojo Texas, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, aloficocianina, Alexa Fluor 647, Cy5, Alexa Fluor 660, Cy5.5, TruRed, Alexa Fluor 680, Cy7 o cualquier otro fluoróforo como es conocido por un experto en la materia.
La luz desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia se dirige a un espejo dicroico1120y se hace pasar a un expansor de haces1122. En algunos casos, se utilizan una pluralidad de espejos dicroicos para dirigir la luz desde más de dos fuentes de luz de excitación al expansor de haces. El aparato puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 espejos dicroicos. Tras la expansión de los haces en el expansor de haces, la luz desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia se dirige entonces a un espejo1124. En algunos casos, el espejo1124comprende un galvanómetro. El espejo dirige la luz a un espejo poligonal rotatorio1140. En algunos casos, el espejo poligonal puede reemplazarse por un espejo de escaneo resonante.
En ciertas realizaciones, el espejo poligonal puede sustituirse por un sistema de procesamiento de luz digital (DLPS). El DLPS puede comprender una pluralidad de microespejos direccionables independientemente. El DLPS puede irradiarse con una fuente de luz. Cada uno de la pluralidad de microespejos puede situarse independientemente para dirigir luz a una ubicación particular o para impedir que la luz alcance una ubicación particular. Cada microespejo puede ser direccionado de forma electrónica.
El espejo poligonal rotatorio escanea rápidamente la luz desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia a lo largo de un plano focal curvo perpendicular al eje de rotación del espejo poligonal. Una lente F-theta1150produce un plano focal que es sustancialmente plano. Después de la reflexión desde una superficie del espejo poligonal rotatorio y la refracción a través de la lente F-theta, la luz desde las fuentes de luz de excitación se dirige al casete100. La lente F-theta puede configurarse para enfocar la pluralidad de haces de excitación hacia un microcanal en el casete. A medida que el espejo poligonal rotatorio rota, la luz desde las fuentes de luz de excitación se escanea transversalmente a una línea de microcanales en el casete. Después de un escaneo a lo largo de una única línea, el casete puede moverse para permitir el escaneo de una nueva línea. En algunos casos, el movimiento está sincronizado con el escaneo de una única línea. La temporización puede lograrse, por ejemplo, coordinando el movimiento del casete y el escaneo de la luz a través de una señal de reloj sincronizada.
Tras recibir luz desde las fuentes de luz de excitación, una o más células en un microcanal pueden generar fluorescencia y emitir luz de una longitud de onda mayor que la longitud de onda de la fuente de luz de excitación que estimuló la fluorescencia. La fluorescencia puede ser debida a la presencia de fluoróforos endógenos ubicados dentro o sobre la célula. La fluorescencia puede ser debida a la presencia de fluoróforos exógenos. La luz emitida es recibida y guiada por una guía de luz1160. La guía de luz puede comprender una fibra óptica. La guía de luz puede comprender un haz de fibras ópticas. La guía de luz puede comprender uno o más espejos. Los uno o más espejos pueden comprender espejos planos. Los uno o más espejos pueden comprender espejos dicroicos planos. Los uno o más espejos pueden comprender espejos cóncavos. Los uno o más espejos pueden comprender espejos esféricos. La luz emitida se dirige a un conjunto de ópticas de acoplamiento1162y a un divisor de haz1164. El divisor de haz permite que una longitud de onda de la luz emitida pase a un primer detector1172y redirige otra longitud de onda de luz emitida a un segundo detector1174. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de divisores de haz. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de detectores. En algunos casos, la pluralidad de divisores de haz puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 divisores de haz. En algunos casos, la pluralidad de detectores puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 detectores. Cada divisor de haz de la pluralidad de divisores de haz puede permitir que pasen una o más longitudes de onda de luz emitida y puede redirigir otras longitudes de onda de luz emitida. Cada detector de la pluralidad de detectores puede ser un fotodiodo, un tubo fotomultiplicador o cualquier otro detector óptico como es conocido por un experto en la materia.
Cada detector registra una señal correspondiente a la intensidad de la luz emitida que tiene una longitud de onda particular. La intensidad de la luz en cada detector se muestrea de forma electrónica, se digitaliza y se dirige a circuitería electrónica (no mostrada). La circuitería electrónica procesa las señales desde cada detector para hacer una determinación en cuanto a si un microcanal particular contiene una célula que debería retirarse del microcanal. En algunos casos, la circuitería electrónica actúa para determinar si las intensidades de luz emitida detectadas por cada uno de la pluralidad de detectores exceden un valor umbral. En algunos casos, la circuitería electrónica actúa para determinar si las intensidades de la luz emitida detectada por cada uno de la pluralidad de detectores caen dentro de un intervalo de valores. En algunos casos, el intervalo de valores puede ser diferente para cada detector. Si las intensidades de luz emitida detectadas por cada uno de la pluralidad de detectores se encuentran dentro del intervalo de valores, la circuitería electrónica envía una señal para retirar la célula correspondiente del microcanal dado. En algunos casos, la circuitería se implementa como firmware. En algunos casos, la circuitería se implementa como una matriz de puertas programables en campo (FPGA).
En algunos casos, el intervalo de valores para cada detector puede ser desconocido al principio del procedimiento de escaneo. Por ejemplo, el intervalo de valores puede depender del tipo de célula (por ejemplo, glóbulo rojo, leucocito, etc.). El intervalo de valores puede depender de los parámetros operativos del sistema (por ejemplo, degradación relacionada con la edad de componentes ópticos). Por lo tanto, puede ser beneficioso determinar intervalos aceptables de valores tras recibir un nuevo casete en el sistema. Por ejemplo, tales intervalos pueden determinarse escaneando la pluralidad de fuentes de luz de excitación a lo largo de una población de muestra de células y determinando las intensidades en cada detector para la población de células. La población de células puede comprender más de 1.000, más de 10.000, más de 100.000 o más de 1.000.000 de células. La población de células puede encontrarse en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El intervalo de valores puede elegirse de tal modo que solo una subpoblación de células de entre la población de muestra da lugar a intensidades de fluorescencia que caen dentro del intervalo de valores. Por ejemplo, el intervalo de valores para cada detector puede elegirse de tal modo que es menos del 1 %, menos del 5 %, menos del 10 %, menos del 20 % o menos del 50 % de las células dan lugar a intensidades de fluorescencia en cada detector que caen dentro del intervalo de valores. El intervalo de valores puede elegirse para encontrarse en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. Estos intervalos de valores pueden usarse entonces para determinar si una célula dada debería retirarse de un microcanal dado durante un escaneo de todo el casete.
Cuando la circuitería electrónica hace una determinación de que una célula dada en un microcanal dado cumple con los criterios para su retirada del microcanal, puede enviarse una señal para dirigir la luz desde una fuente de láser de extracción1130al microcanal. En algunos casos, el láser de extracción y la circuitería pueden sincronizarse con un reloj compartido. La fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda que permite la extracción de una célula desde un microcanal. Por ejemplo, la fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda que es absorbida por una partícula en un microcanal, como se describe en el presente documento. La fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda en la región ultravioleta, visible o de infrarrojo cercano del espectro electromagnético. La fuente de láser de extracción puede emitir luz en un intervalo de longitudes de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 2000 nm. La fuente de láser de extracción puede comprender una fuente de láser de onda continua. La fuente de extracción puede comprender una fuente de láser de onda cuasicontinua. La fuente de láser de extracción puede comprender una fuente de láser pulsado. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una duración más corta que 10 fs, más corta que 100 fs, más corta que 1 ps, más corta que 10 ps, más corta que 100 ps, más corta que 1 ns, más corta que 10 ns, más corta que 100 ns, más corta que 1 ps, más corta que 10 ps, más corta que 100 ps o más corta que 1 ms. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración dentro del intervalo de aproximadamente 1 fs a aproximadamente 100 ps. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración dentro del intervalo de aproximadamente 100 ns a aproximadamente 10 ps. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración ajustable.
La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una velocidad de repetición inferior a 1 kHz, menos de 10 kHz, menos de 100 kHz, menos de 1 MHz, menos de 10 MHz, menos de 100 MHz o menos de 1 GHz. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una velocidad de repetición que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos con una velocidad de repetición dentro del intervalo de aproximadamente 10 kHz a aproximadamente 1 MHz. En algunos casos, cada pulso puede producir menos de 1 nJ, menos de 10 nJ, menos de 100 nJ, menos de 1 pJ, menos de 10 pJ, menos de 100 pJ o menos de 1 mJ de energía. Cada pulso puede producir una energía que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, cada pulso puede producir una energía que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 pJ a aproximadamente 50 pJ. La fuente de láser pulsado puede emitir una potencia máxima en el intervalo de 0,1 W a 107 W.
La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra de pulso bajo demanda. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de amplificador de fibra de oscilador maestro (MOPA). La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada con iones de tierras raras. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada con iterbio. La fuente de láser pulsado puede ser un láser que utiliza un medio de ganancia de cristal dopado. La fuente de láser pulsado puede ser un láser que utiliza un medio de ganancia de cristal dopado con neodimio. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de Nd:YAG. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de Nd:YVO4. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de semiconductor. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de diodo. La fuente de láser pulsado puede ser un láser emisor de superficie de cavidad vertical (VCSEL). La fuente de láser pulsado puede ser una matriz de VCSEL. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de gas. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de CO2. La fuente de láser pulsado puede ser un láser excimérico. La fuente de láser pulsado puede emplear conmutación Q. La fuente de láser pulsado puede emplear bloqueo de modo. La fuente de láser pulsado puede ser cualquier fuente de láser pulsado como es conocido por un experto en la materia.
La fuente de láser pulsado puede dirigir un pulso de láser a un microcanal en respuesta a una señal desde una circuitería electrónica en respuesta a intensidades de detector de luz en cada uno de la pluralidad de detectores. El pulso puede dirigirse al microcanal usando un modulador acústico-óptico (AOM), un modulador electroóptico (EOM) o cualquier dispositivo de modulación tal como puede ser conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, el dispositivo de modulación puede estar configurado para dejar pasar el haz difractado de orden cero solo en respuesta a una señal de que el láser de extracción debería retirar una célula de un microcanal; en todo otro momento, el dispositivo de modulación puede estar configurado para dejar pasar el haz difractado de primer orden o el haz difractado de orden superior. En algunos casos, el láser pulsado puede producir pulsos solo en respuesta a una señal de que el láser de extracción debería retirar una célula de un microcanal. Por ejemplo, un láser de fibra dopado puede funcionar en una configuración polarizada inversamente hasta recibir una señal para dirigir un pulso al microcanal; tras recibir la señal para dirigir un pulso al microcanal, el láser de fibra dopado puede funcionar en la configuración polarizada directamente.
El láser de extracción puede ser dirigido al espejo poligonal rotatorio mediante un espejo 1132. El espejo poligonal rotatorio escanea rápidamente la luz desde el láser de extracción a lo largo de un plano focal curvo perpendicular al eje de rotación del espejo poligonal. La lente F-theta produce un plano focal que es sustancialmente plano. Después de la reflexión desde una superficie del espejo poligonal rotatorio y la refracción a través de la lente F-theta, la luz desde el láser de extracción se dirige al casete100. La lente F-theta puede configurarse para enfocar la pluralidad de haces de excitación hacia un microcanal en el casete. Cuando el láser de extracción se dirige a un microcanal, la energía del láser provoca la cavitación de la muestra líquida en la que se suspende una célula. Esto provoca la retirada de la célula del microcanal.
El sistema puede configurarse para escanear tanto la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia como el haz de extracción. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear con el haz de extracción de tal modo que se separa de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia. En algunos casos, el sistema puede estar configurado para enfocar la pluralidad de fuentes de luz de excitación en un primer microcanal y para enfocar simultáneamente el láser de extracción en un segundo microcanal. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia de menos de 1 pm, 5 pm, 10 pm, menos de 50 pm, menos de 100 pm, menos de 500 pm, menos de 1 mm, menos de 5 mm o menos de 10 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 |jm a aproximadamente 5 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 1 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 1000 mm. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en el mismo lado del casete. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en lados opuestos del casete.
En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de más de 10.000 canales por segundo, más de 50.000 canales por segundo, más de 100.000 canales por segundo, más de 500.000 canales por segundo, más de 1.000.000 de canales por segundo, más de 5.000.000 de canales por segundo, más de 10.000. 000 de canales por segundo, más de 50.000.000 de canales por segundo, o más de 100.000.000 de canales por segundo. El sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de repetición que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 300.000.000 de canales por segundo.
El sistema1100puede escanear el sustrato a una velocidad superior a 1.000.000 de microcanales por segundo, superior a 2.000.000 de microcanales por segundo, o superior a 3.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1100puede escanear el sustrato a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1100puede extraer partículas objetivo desde el sustrato a una velocidad superior a 500.000 microcanales por segundo, más de 600.000 microcanales por segundo, más de 700.000 microcanales por segundo, más de 800.000 microcanales por segundo, superior a 900.000 microcanales por segundo, o superior a 1.000. 000 de microcanales por segundo. El sistema1100puede extraer partículas objetivo a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1100puede extraer las partículas objetivo de tal modo que una colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza mayor que el 90 %, mayor que el 95 % o mayor que el 99 %. El sistema1100puede extraer las partículas objetivo de tal modo que la colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
Aunque se muestra como formando un único dispositivo en la figura11, el sistema1100puede configurarse de tal modo que el subsistema de fluorescencia (que comprende los elementos1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1140, 1150, 1160, 1162, 1164, 1170y1172) se dispone como un dispositivo de fluorescencia y el subsistema de extracción (que comprende los elementos1130, 1132, 1140y1150) se dispone como un dispositivo de extracción. En una disposición de este tipo, el sustrato100puede someterse a un análisis de fluorescencia como se describe en el presente documento usando el dispositivo de fluorescencia. A continuación del análisis de fluorescencia, el sustrato puede transferirse al dispositivo de extracción para la extracción de ubicaciones de interés sobre el sustrato identificadas durante el análisis de fluorescencia. Una alineación apropiada del sustrato en cada uno del dispositivo de fluorescencia y el dispositivo de extracción puede lograrse haciendo referencia a uno o más marcadores de referencia sobre el sustrato. En algunos casos, disponer el sistema1100en dos dispositivos puede requerir la duplicación de uno o más elementos del sistema1100. Por ejemplo, los elementos1140y1150pueden requerirse tanto en el dispositivo de fluorescencia como en el dispositivo de extracción.
En otra realización de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser, La figura12ilustra un aparato óptico que utiliza dos espejos poligonales rotatorios. El aparato1200comprende todos los elementos del aparato1100de la figura11. El aparato comprende: una pluralidad de fuentes de luz de excitación1110y1112, un espejo dicroico1120, un expansor de haces1122, un espejo de luz de excitación1124, un láser de extracción1130, un espejo de láser de extracción1132, un espejo poligonal rotatorio1140, una lente F-theta1150, una guía de luz1160, unas ópticas de acoplamiento1162, una pluralidad de divisores de haz1164y una pluralidad de detectores1170y1172.
Adicionalmente, el aparato1200comprende un segundo espejo poligonal rotatorio1142y una segunda lente F-theta1152. En algunos casos, el segundo espejo poligonal puede reemplazarse por un espejo de escaneo resonante. El sistema puede configurarse de tal modo que la pluralidad de fuentes de luz de excitación son dirigidos al casete100por el primer espejo poligonal rotatorio1140y la primera lente F-theta1150, mientras que el láser de extracción es dirigido al casete por el segundo espejo poligonal rotatorio1142y la segunda lente F-theta1152. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en el mismo lado del casete. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en lados opuestos del casete.
El primer espejo poligonal rotatorio escanea rápidamente la luz desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia a lo largo de un plano focal curvo perpendicular al eje de rotación del espejo poligonal. La primera lente F-theta produce un plano focal que es sustancialmente plano. Después de la reflexión desde una superficie del primer espejo poligonal rotatorio y la refracción a través de la primera lente F-theta, la luz desde las fuentes de luz de excitación se dirige al casete100. La primera lente F-theta puede configurarse para enfocar la pluralidad de haces de excitación hacia un microcanal en el casete. A medida que rota el primer espejo poligonal rotatorio, la luz desde las fuentes de luz de excitación se escanea transversalmente a una línea de microcanales en el casete.
El segundo espejo poligonal rotatorio escanea rápidamente la luz desde el láser de excitación a lo largo de un plano focal curvo perpendicular al eje de rotación del espejo poligonal. La segunda lente F-theta produce un plano focal que es sustancialmente plano. Después de la reflexión desde una superficie del segundo espejo poligonal rotatorio y la refracción a través de la segunda lente F-theta, la luz desde el láser de extracción se dirige al casete100. La segunda lente F-theta puede configurarse para enfocar el láser de extracción hacia un microcanal en el casete. A medida que rota el segundo espejo poligonal rotatorio, la luz desde el láser de extracción se escanea transversalmente a una línea de microcanales en el casete.
El sistema puede configurarse para escanear tanto la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia, usando el primer espejo poligonal rotatorio y el haz de extracción, usando el segundo espejo poligonal rotatorio. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear con el haz de extracción de tal modo que se separa de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia. En algunos casos, el sistema puede estar configurado para enfocar la pluralidad de fuentes de luz de excitación en un primer microcanal y para enfocar simultáneamente el láser de extracción en un segundo microcanal. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia de menos de 1 pm, 5 pm, 10 pm, menos de 50 pm, menos de 100 pm, menos de 500 pm, menos de 1 mm, menos de 5 mm o menos de 10 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 5 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 1 mm. En algunos casos, el haz de extracción puede separarse de la pluralidad de haces de excitación de fluorescencia una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1000 mm. En algunos casos, el escaneo de la pluralidad de fuentes de luz de excitación y del láser de excitación está sincronizado. En algunos casos, la sincronización se consigue a través de una señal de reloj sincronizada. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en el mismo lado del casete. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en lados opuestos del casete.
En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de más de 10.000 canales por segundo, más de 50.000 canales por segundo, más de 100.000 canales por segundo, más de 500.000 canales por segundo, más de 1.000.000 de canales por segundo, más de 5.000.000 de canales por segundo, más de 10.000. 000 de canales por segundo, más de 50.000.000 de canales por segundo, o más de 100.000.000 de canales por segundo. El sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de repetición que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 300.000.000 de canales por segundo.
El sistema1200puede escanear el sustrato a una velocidad superior a 1.000.000 de microcanales por segundo, superior a 2.000.000 de microcanales por segundo, o superior a 3.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1200puede escanear el sustrato a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1200puede extraer partículas objetivo desde el sustrato a una velocidad superior a 500.000 microcanales por segundo, más de 600.000 microcanales por segundo, más de 700.000 microcanales por segundo, más de 800.000 microcanales por segundo, superior a 900.000 microcanales por segundo, o superior a 1.000. 000 de microcanales por segundo. El sistema1200puede extraer partículas objetivo a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1200puede extraer las partículas objetivo de tal modo que una colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza mayor que el 90 %, mayor que el 95 % o mayor que el 99 %. El sistema1200puede extraer las partículas objetivo de tal modo que la colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
Aunque se muestra como formando un único dispositivo en la figura12, el sistema1200puede configurarse de tal modo que el subsistema de fluorescencia (que comprende los elementos1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1140, 1150, 1160, 1162, 1164, 1170y1172) se dispone como un dispositivo de fluorescencia y el subsistema de extracción (que comprende los elementos1130, 1132, 1142y1152) se dispone como un dispositivo de extracción. En una disposición de este tipo, el sustrato100puede someterse a un análisis de fluorescencia como se describe en el presente documento usando el dispositivo de fluorescencia. A continuación del análisis de fluorescencia, el sustrato puede transferirse al dispositivo de extracción para la extracción de ubicaciones de interés sobre el sustrato identificadas durante el análisis de fluorescencia. Una alineación apropiada del sustrato en cada uno del dispositivo de fluorescencia y el dispositivo de extracción puede lograrse haciendo referencia a uno o más marcadores de referencia sobre el sustrato.
En otra realización de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser, La figura13ilustra un aparato óptico que utiliza dos espejos poligonales rotatorios y una técnica de detección confocal. El aparato1300comprende muchos de los elementos del aparato1100de la figura11. El aparato comprende: una pluralidad de fuentes de luz de excitación1110y1112, un espejo dicroico1120, un expansor de haces1122, un espejo de luz de excitación1124, un láser de extracción1130, un espejo de láser de extracción1132, un espejo poligonal rotatorio1140, una lente F-theta1150, unas ópticas de acoplamiento1162, una pluralidad de divisores de haz1164y una pluralidad de detectores1170y1172.
Adicionalmente, el aparato1300puede comprender un segundo espejo poligonal rotatorio1142y una segunda lente F-theta1152. El sistema puede configurarse de tal modo que la pluralidad de fuentes de luz de excitación son dirigidos al casete100por el primer espejo poligonal rotatorio1140y la primera lente F-theta1150, mientras que el láser de extracción es dirigido al casete por el segundo espejo poligonal rotatorio1142y la segunda lente F-theta1152. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en el mismo lado del casete. La pluralidad de fuentes de luz de excitación y el haz de extracción pueden ubicarse en lados opuestos del casete.
En lugar de la guía de luz, el aparato1300comprende además un conjunto de espejos para dirigir la luz a los uno o más detectores. El espejo de luz de excitación1124puede ser un espejo dicroico. La cavidad de detección confocal puede comprender unos espejos1166y1168. Los espejos pueden ser espejos planos. Los espejos pueden ser espejos cóncavos. Los espejos pueden ser espejos esféricos. Los espejos pueden disponerse en una configuración confocal.
El sistema1300puede escanear el sustrato a una velocidad superior a 1.000.000 de microcanales por segundo, superior a 2.000.000 de microcanales por segundo, o superior a 3.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1300puede escanear el sustrato a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1300puede extraer partículas objetivo desde el sustrato a una velocidad superior a 500.000 microcanales por segundo, más de 600.000 microcanales por segundo, más de 700.000 microcanales por segundo, más de 800.000 microcanales por segundo, superior a 900.000 microcanales por segundo, o superior a 1.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1300puede extraer partículas objetivo a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1300puede extraer las partículas objetivo de tal modo que una colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza mayor que el 90 %, mayor que el 95 % o mayor que el 99 %. El sistema1300puede extraer las partículas objetivo de tal modo que la colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
Aunque se muestra como formando un único dispositivo en la figura13, el sistema1300puede configurarse de tal modo que el subsistema de fluorescencia (que comprende los elementos1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1140, 1150, 1164, 1166, 1168, 1170y1172) se dispone como un dispositivo de fluorescencia y el subsistema de extracción (que comprende los elementos1130, 1132, 1142y1152) se dispone como un dispositivo de extracción. En una disposición de este tipo, el sustrato100puede someterse a un análisis de fluorescencia como se describe en el presente documento usando el dispositivo de fluorescencia. A continuación del análisis de fluorescencia, el sustrato puede transferirse al dispositivo de extracción para la extracción de ubicaciones de interés sobre el sustrato identificadas durante el análisis de fluorescencia. Una alineación apropiada del sustrato en cada uno del dispositivo de fluorescencia y el dispositivo de extracción puede lograrse haciendo referencia a uno o más marcadores de referencia sobre el sustrato.
En otra realización de un aparato óptico para la clasificación de células mediante escaneo por láser, La figura14ilustra un aparato óptico que utiliza un mecanismo de escaneo galvanométrico. El aparato1400comprende una fuente de luz de excitación de fluorescencia1410. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia. En algunos casos, la pluralidad de fuentes de luz de excitación pueden superponerse. En algunos casos, la pluralidad de fuentes de luz de excitación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 fuentes de luz de excitación de fluorescencia. Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden comprender fuentes de luz láser. Una o más de las fuentes de luz de excitación pueden comprender fuentes de luz de diodos emisores de luz (LED). En algunos casos, una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de fluorescencia de un fluoróforo particular. En algunos casos, una o más de las fuentes de luz de excitación pueden estar configuradas para emitir una pluralidad de longitudes de onda de luz. En algunos casos, una o más de las fuentes de luz de excitación pueden estar configuradas para emitir una pluralidad de longitudes de onda de luz, de tal modo que cada una de la pluralidad de longitudes de onda comprende un pico separado de otros picos de la pluralidad de longitudes de onda. Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de un fluoróforo que es endógeno a una célula para excitar la autofluorescencia. Por ejemplo, una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden sintonizarse a la longitud de onda de excitación de una molécula autofluorescente tal como nicotinamida adenina dinucleotido fosfato (NADPH), clorofila, colágeno, retinol, riboflavina, colecalciferol, ácido fólico, piridoxina, tirosina, ditirosina, indolamina, lipofuscina, polifenol, triptófano, flavina o melanina. Una o más de las fuentes de luz de excitación pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de cualquier molécula autofluorescente.
Una o más de la pluralidad de fuentes de luz de excitación de fluorescencia pueden emitir luz a una longitud de onda correspondiente a una longitud de onda de excitación de un fluoróforo que es exógeno a una célula. Por ejemplo, una o más de la pluralidad de fuentes de luces de excitación de fluorescencia pueden sintonizarse a la longitud de onda de excitación de la hidroxicumarina, metoxicumarina, Alexa Fluor, aminocumarina, Cy2, carboxifluoresceína (FAM), Alexa Fluor 488, isotiocianato de fluoresceína (FITC,fluorescein isothiocyanate),Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, 6-carboxi-2,4,4,5,7,7-hexaclorofluoresceína (HEX), Cy3, tetrametilrodamina (TRITC), Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, R-ficoeritrina, Rojo Rodamina-X, Tamara, Cy3.5 581, Rox, Alexa Fluor 568, Rojo 613, rojo Texas, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, aloficocianina, Alexa Fluor 647, Cy5, Alexa Fluor 660, Cy5.5, TruRed, Alexa Fluor 680, Cy7 o cualquier otro fluoróforo como es conocido por un experto en la materia.
La luz desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia se dirige a un conjunto de ópticas de acondicionamiento. Las ópticas de acondicionamiento pueden comprender una primera lente1420y una segunda lente1424. Las dos lentes pueden actuar para expandir la cintura del haz de la luz de excitación, reducir la circunferencia del haz de la luz de excitación y/o colimar la luz de excitación. Las ópticas de acondicionamiento pueden comprender además una rueda de filtros1422.
La luz de excitación pasa entonces a un espejo dicroico1480. En algunos casos, se utilizan una pluralidad de espejos dicroicos para dirigir la luz desde más de dos fuentes de luz de excitación al expansor de haces. El aparato puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 espejos dicroicos. En algunos casos, el aparato puede comprender un cubo dicroico de múltiples aristas.
La luz de excitación se dirige a un espejo dicroico1460. El espejo dicroico1460puede ser un espejo dicroico configurado para dejar pasar luz que tiene una longitud de onda en la región ultravioleta o visible del espectro electromagnético y para reflejar luz que tiene una longitud de onda en la región infrarroja del espectro electromagnético. La luz de excitación se dirige a una lente objetivo1470. La lente objetivo puede tener un aumento mayor que 1X, 2X, 5X, 10X, 20X, 50X, 100X, 200X, 500X, 1000X. La lente objetivo puede tener un aumento en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. La lente objetivo puede ser una lente objetivo corregida al infinito. La lente objetivo proporciona un gran campo de excitación y un gran campo de visión. Esto permite que la fuente de luz de excitación ilumine una gran área del casete100sin requerir escanear las fuentes de luz de excitación. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de lentes objetivo que tienen una pluralidad de campos de visión.
En algunos casos, el aparato está configurado para transmitir la luz de excitación coaxialmente con el campo de visión a través de la lente objetivo. En algunos casos, la luz de excitación comprende luz de excitación difusa. En algunos casos, la luz de excitación comprende luz de excitación corregida al infinito y difusa. La luz de excitación puede excitar la fluorescencia en un campo de excitación de menos de 1 mm, menos de 5 mm, menos de 10 mm, menos de 50 mm o menos de 100 mm. La luz de excitación puede excitar la fluorescencia a lo largo de un campo de excitación que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. La lente objetivo puede tener un campo de visión de menos de 1 mm, menos de 5 mm, menos de 10 mm, menos de 50 mm o menos de 100 mm. La lente objetivo puede tener un campo de visión que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el campo de visión se define con una estructura óptica. La estructura óptica puede ser una abertura. La estructura óptica puede ser una dimensión transversalmente a una abertura. La estructura óptica puede ser un orificio estenopeico. La estructura óptica puede ser un espejo. La estructura óptica puede ser una dimensión transversalmente a una superficie reflectante de un espejo.
Tras recibir luz desde las fuentes de luz de excitación, una o más células en un microcanal pueden generar fluorescencia y emitir luz de una longitud de onda mayor que la longitud de onda de la fuente de luz de excitación que estimuló la fluorescencia. La fluorescencia puede ser debida a la presencia de fluoróforos endógenos ubicados dentro o sobre la célula. La fluorescencia puede ser debida a la presencia de fluoróforos exógenos. La luz emitida se dirige a un selector de longitud de onda1482para seleccionar las longitudes de onda de luz deseadas. En algunos casos, el selector de longitud de onda produce luz filtrada. La luz filtrada se dirige a un detector de matriz bidimensional1490usando una lente1484. En algunos casos, el detector de matriz bidimensional comprende una cámara. En algunos casos, la lente1484comprende una lente de tubo. La cámara produce una imagen de fluorescencia de células que se ubican dentro de su campo de visión.
El selector de longitud de onda puede comprender un filtro. El filtro puede comprender un filtro de emisión. El filtro puede comprender una rueda de filtros de emisión. La rueda de filtros de emisión puede comprender una pluralidad de filtros. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de filtros selectivos de longitud de onda. El selector de longitud de onda puede comprender un espejo dicroico. El selector de longitud de onda puede comprender un prisma. El selector de longitud de onda puede comprender una rejilla de difracción. El aparato puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 selectores de longitud de onda. En algunos casos, el aparato puede comprender una pluralidad de cámaras. El aparato puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 cámaras. Cada filtro de la pluralidad de selectores de longitud de onda puede permitir que una o más longitudes de onda de luz emitida pasen a una o más de la pluralidad de cámaras y puede redirigir o absorber otras longitudes de onda de luz emitida. Cada cámara de la pluralidad de cámaras puede ser una cámara de dispositivo acoplado por carga (CCD), una cámara de metal-óxido-semiconductor complementario (CMOS), o cualquier otra cámara como es conocido por un experto en la materia.
Cada cámara registra una imagen correspondiente a la intensidad de la luz emitida que tiene una longitud de onda particular. La intensidad de la luz en cada cámara se muestrea de forma electrónica, se digitaliza y se dirige a circuitería electrónica (no mostrada). La circuitería electrónica procesa las señales desde cada cámara para hacer una determinación en cuanto a si un microcanal particular contiene una célula que debería retirarse del microcanal. En algunos casos, la circuitería electrónica actúa para determinar si las intensidades de la luz emitida en cada píxel detectado por cada una de la pluralidad de cámaras exceden un valor umbral. En algunos casos, la circuitería electrónica actúa para determinar si las intensidades de la luz emitida en cada píxel detectada por cada una de la pluralidad de cámaras caen dentro de un intervalo de valores. En algunos casos, el intervalo de valores puede ser diferente para cada cámara. Si las intensidades de luz emitida detectadas por cada una de la pluralidad de cámaras se encuentran dentro del intervalo de valores para un píxel dado, la circuitería electrónica envía una señal para retirar la célula correspondiente del microcanal dado. En algunos casos, la circuitería se implementa como firmware. En algunos casos, la circuitería se implementa como una matriz de puertas programables en campo (FPGA).
En algunos casos, el intervalo de valores para cada detector puede ser desconocido al principio del procedimiento de escaneo. Por ejemplo, el intervalo de valores puede depender del tipo de célula (por ejemplo, glóbulo rojo, leucocito, etc.). El intervalo de valores puede depender de los parámetros operativos del sistema (por ejemplo, degradación relacionada con la edad de componentes ópticos). Por lo tanto, puede ser beneficioso determinar intervalos aceptables de valores tras recibir un nuevo casete en el sistema. Por ejemplo, tales intervalos pueden determinarse escaneando la pluralidad de fuentes de luz de excitación a lo largo de una población de muestra de células y determinando las intensidades en cada píxel de cada cámara para la población de células. La población de células puede comprender más de 1.000, más de 10.000, más de 100.000 o más de 1.000.000 de células. La población de células puede encontrarse en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El intervalo de valores puede elegirse de tal modo que solo una subpoblación de células de entre la población de muestra da lugar a intensidades de fluorescencia que caen dentro del intervalo de valores. Por ejemplo, el intervalo de valores para cada píxel de cada cámara puede elegirse de tal modo que es menos del 1 %, menos del 5 %, menos del 10 %, menos del 20 % o menos del 50 % de las células dan lugar a intensidades de fluorescencia en cada píxel en cada cámara que caen dentro del intervalo de valores. El intervalo de valores puede elegirse para encontrarse en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. Estos intervalos de valores pueden usarse entonces para determinar si una célula dada debería retirarse de un microcanal dado durante un escaneo de todo el casete.
Cuando la circuitería electrónica hace una determinación de que una célula dada en un microcanal dado cumple con los criterios para su retirada del microcanal, puede enviarse una señal para dirigir la luz desde una fuente de láser de extracción1430al microcanal. En algunos casos, el láser de extracción y la circuitería pueden sincronizarse con un reloj compartido. La fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda que permite la extracción de una célula desde un microcanal. Por ejemplo, la fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda que es absorbida por una partícula en un microcanal, como se describe en el presente documento. La fuente de láser de extracción puede emitir luz a una longitud de onda en la región ultravioleta, visible o de infrarrojo cercano del espectro electromagnético. La fuente de láser de extracción puede emitir luz en un intervalo de longitudes de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 2000 nm. La fuente de láser de extracción puede comprender una fuente de láser de onda continua. La fuente de extracción puede comprender una fuente de láser de onda cuasicontinua. La fuente de láser de extracción puede comprender una fuente de láser pulsado. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una duración más corta que 10 fs, más corta que 100 fs, más corta que 1 ps, más corta que 10 ps, más corta que 100 ps, más corta que 1 ns, más corta que 10 ns, más corta que 100 ns, más corta que 1 ps, más corta que 10 ps, más corta que 100 ps o más corta que 1 ms. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración dentro del intervalo de aproximadamente 1 fs a aproximadamente 100 ps. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración dentro del intervalo de aproximadamente 100 ns a aproximadamente 10 ps. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser que tienen una duración ajustable.
La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una velocidad de repetición inferior a 1 kHz, menos de 10 kHz, menos de 100 kHz, menos de 1 MHz, menos de 10 MHz, menos de 100 MHz o menos de 1 GHz. La fuente de láser pulsado puede emitir pulsos de láser con una velocidad de repetición que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la fuente de láser pulsado puede emitir pulsos con una velocidad de repetición dentro del intervalo de aproximadamente 10 kHz a aproximadamente 1 MHz. En algunos casos, cada pulso puede producir menos de 1 nJ, menos de 10 nJ, menos de 100 nJ, menos de 1 pJ, menos de 10 pJ, menos de 100 pJ, menos de 1 mJ, o menos de 10 mJ de energía. Cada pulso puede producir una energía que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, cada pulso puede producir una energía que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 100 nJ a aproximadamente 1 mJ. La fuente de láser pulsado puede emitir una potencia máxima en el intervalo de 0,1 W a 107 W.
La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra de pulso bajo demanda. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de amplificador de fibra de oscilador maestro (MOPA). La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada con iones de tierras raras. La fuente de láser pulsado puede ser una fuente de láser de fibra dopada con iterbio. La fuente de láser pulsado puede ser un láser que utiliza un medio de ganancia de cristal dopado. La fuente de láser pulsado puede ser un láser que utiliza un medio de ganancia de cristal dopado con neodimio. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de Nd:YAG. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de Nd:YVO4. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de semiconductor. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de diodo. La fuente de láser pulsado puede ser un láser emisor de superficie de cavidad vertical (VCSEL). La fuente de láser pulsado puede ser una matriz de VCSEL. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de gas. La fuente de láser pulsado puede ser un láser de CO2. La fuente de láser pulsado puede ser un láser excimérico. La fuente de láser pulsado puede emplear conmutación Q. La fuente de láser pulsado puede emplear bloqueo de modo. La fuente de láser pulsado puede ser cualquier fuente de láser pulsado como es conocido por un experto en la materia.
La fuente de láser pulsado puede dirigir un pulso de láser a un microcanal en respuesta a una señal desde una circuitería electrónica en respuesta a intensidades de detector de luz en cada uno de la pluralidad de detectores. El pulso puede dirigirse al microcanal usando un modulador acústico-óptico (AOM), un modulador electroóptico (EOM) o cualquier dispositivo de modulación tal como puede ser conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, el dispositivo de modulación puede estar configurado para dejar pasar el haz difractado de orden cero solo en respuesta a una señal de que el láser de extracción debería retirar una célula de un microcanal; en todo otro momento, el dispositivo de modulación puede estar configurado para dejar pasar el haz difractado de primer orden o el haz difractado de orden superior. En algunos casos, el láser pulsado puede producir pulsos solo en respuesta a una señal de que el láser de extracción debería retirar una célula de un microcanal. Por ejemplo, un láser de fibra dopado puede funcionar en una configuración polarizada inversamente hasta recibir una señal para dirigir un pulso al microcanal; tras recibir la señal para dirigir un pulso al microcanal, el láser de fibra dopado puede funcionar en la configuración polarizada directamente.
El láser de extracción puede dirigirse a un bloque de escáner de galvanómetro1440. El bloque de escáner de galvanómetro puede configurarse para escanear rápidamente la luz desde el láser de extracción a lo largo de un plano focal curvo perpendicular a sus ejes de rotación. El galvanómetro puede escanearse hasta recibir una señal desde la circuitería para disparar un pulso de láser en una posición de disparo deseada. El bloque de escáner de galvanómetro puede configurarse para esperar una señal desde la circuitería antes de dirigir el láser de extracción a una posición de disparo deseada. Siguiendo la dirección del haz de extracción por el bloque de escáner galvanométrico, las lentes de relés F-theta1450y1452producen un plano focal que es sustancialmente plano. Después de la reflexión del bloque de escáner de galvanómetro y la refracción a través de las lentes F-theta, la luz desde el láser de extracción se dirige al casete100. Las lentes F-theta pueden configurarse para enfocar la pluralidad de haces de extracción hacia un microcanal en el casete. Cuando el láser de extracción se dirige a un microcanal, la energía del láser provoca la cavitación de la muestra líquida en la que se suspende una célula. Esto provoca la retirada de la célula del microcanal.
El sistema puede configurarse para escanear con el haz de extracción. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de más de 10.000 canales por segundo, más de 50.000 canales por segundo, más de 100.000 canales por segundo, más de 500.000 canales por segundo, más de 1.000.000 de canales por segundo, más de 5.000.000 de canales por segundo, más de 10.000.000 de canales por segundo, más de 50.000.000 de canales por segundo, o más de 100.000.000 de canales por segundo. El sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad de repetición que se encuentra en un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, el sistema puede configurarse para escanear los microcanales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 300.000.000 de canales por segundo.
El sistema1400puede escanear el sustrato a una velocidad superior a 1.000.000 de microcanales por segundo, superior a 2.000.000 de microcanales por segundo, o superior a 3.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1400puede escanear el sustrato a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1400puede extraer partículas objetivo desde el sustrato a una velocidad superior a 500.000 microcanales por segundo, más de 600.000 microcanales por segundo, más de 700.000 microcanales por segundo, más de 800.000 microcanales por segundo, superior a 900.000 microcanales por segundo, o superior a 1.000.000 de microcanales por segundo. El sistema1400puede extraer partículas objetivo a una velocidad que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. El sistema1100puede extraer las partículas objetivo de tal modo que una colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza mayor que el 90 %, mayor que el 95 % o mayor que el 99 %. El sistema1400puede extraer las partículas objetivo de tal modo que la colección de partículas objetivo extraídas tiene una pureza que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
Aunque se muestra como formando un único dispositivo en la figura14, el sistema1400puede configurarse de tal modo que el subsistema de fluorescencia (que comprende los elementos1410, 1420, 1422, 1424, 1460, 1470, 1480, 1482, 1484y1490) se dispone como un dispositivo de fluorescencia y el subsistema de extracción (que comprende los elementos1430, 1440, 1450, 1452, 1460y1470) se dispone como un dispositivo de extracción. En una disposición de este tipo, el sustrato100puede someterse a un análisis de fluorescencia como se describe en el presente documento usando el dispositivo de fluorescencia. A continuación del análisis de fluorescencia, el sustrato puede transferirse al dispositivo de extracción para la extracción de ubicaciones de interés sobre el sustrato identificadas durante el análisis de fluorescencia. Una alineación apropiada del sustrato en cada uno del dispositivo de fluorescencia y el dispositivo de extracción puede lograrse haciendo referencia a uno o más marcadores de referencia sobre el sustrato. En algunos casos, disponer el sistema1400en dos dispositivos puede requerir la duplicación de uno o más elementos del sistema1400. Por ejemplo, los elementos1460y1470pueden requerirse tanto en el dispositivo de fluorescencia como en el dispositivo de extracción.
Sistema de detección de fluorescencia alternativo
La figura17muestra una representación esquemática para un sistema de detección de fluorescencia1700alternativo. El sistema1700puede usarse en lugar de cualquier otro sistema de detección de fluorescencia descrito en el presente documento. Por ejemplo, el sistema1700puede usarse en lugar de cualquier subconjunto del conjunto de componentes1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1132, 1150, 1160, 1162, 1164, 1170y1172de la figura11, cualquier subconjunto del conjunto de componentes1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1140, 1150, 1160, 1162, 1174, 1170y1172de la figura12, cualquier subconjunto del conjunto de componentes1110, 1112, 1120, 1122, 1124, 1140, 1150, 1164, 1166, 1168, 1170y1172de la figura13, o cualquier subconjunto del conjunto de componentes1410, 1420, 1422, 1424, 1460, 1470, 1480, 1482, 1484y1490de la figura14.
A diferencia de ciertos sistemas de microscopio de epifluorescencia, el sistema1700puede funcionar enviando luz de excitación a lo largo de una trayectoria óptica que no pasa a través de una lente objetivo y recogiendo la luz de fluorescencia emitida a través de la lente objetivo. El sistema1700puede comprender una fuente de luz de excitación1710. La fuente de luz de excitación puede ser cualquier fuente de luz de excitación descrita en el presente documento. Por ejemplo, la fuente de luz de excitación puede ser cualquier fuente de láser de excitación descrita en el presente documento. La fuente de luz de excitación puede producir luz en cualquier longitud de onda descrita en el presente documento.
El sistema1700puede comprender uno o más espejos para dirigir la luz desde la fuente de luz de excitación a un expansor de haces1730. Por ejemplo, el sistema puede comprender unos espejos1720a,1720by1720c. Aunque se muestra como comprendiendo tres espejos en la figura 17, el sistema puede comprender cualquier número de espejos para dirigir la luz al expansor de haces, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 espejos. Los espejos pueden comprender uno o más recubrimientos para mejorar la reflectividad, tales como uno o más recubrimientos dieléctricos como con conocidos por un experto en la materia.
El expansor de haces1730puede ampliar la cintura del haz de la luz de excitación en un factor de 1, 2, 5 o 10. El expansor de haces puede expandir la cintura del haz de la luz de excitación en un factor que está dentro de un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
El expansor de haces puede dirigir la luz de excitación expandida a un mecanismo de escaneo1740. El mecanismo de escaneo puede ser similar a cualquier mecanismo de escaneo descrito en el presente documento. Por ejemplo, el mecanismo de escaneo puede comprender un espejo poligonal como se describe en el presente documento. El mecanismo de escaneo puede comprender un galvanómetro como se describe en el presente documento. El mecanismo de escaneo puede dirigir la luz de excitación a una o más ubicaciones sobre un sustrato100. El sustrato puede ser cualquier sustrato descrito en el presente documento (tal como uno o más microcanales en una matriz de microcanales descrita en el presente documento).
El mecanismo de escaneo puede dirigir la luz de excitación a las una o más ubicaciones sobre el sustrato de tal modo que la luz de excitación no pasa a través de una lente objetivo1750. El mecanismo de escaneo puede dirigir la luz de excitación a las una o más ubicaciones sobre el sustrato de tal modo que la luz de excitación incide sobre las una o más ubicaciones sobre el sustrato a un ángulo con respecto a la normal. Configurar el sistema de esta forma puede reducir el ruido asociado con el sistema de fluorescencia. Por ejemplo, una configuración de este tipo puede reducir el ruido de moteado o el ruido asociado con la autofluorescencia de la lente objetivo. En algunas realizaciones, una configuración de este tipo reduce la fluorescencia de fondo en el 20 % o más. La configuración puede reducir la fluorescencia de fondo en el 30 % o más, el 40 % o más, el 50 % o más, el 60 % o más, o el 70 % o más. En una realización ilustrativa, una configuración de este tipo reduce la fluorescencia de fondo en el 60 % o más. Configurar el sistema de esta forma puede reducir el ruido de moteado detectado por el detector de luz en el 30 % o más, el 40 % o más, el 50 % o más, el 60 % o más, o el 70 % o más. En una realización ilustrativa, la configuración reduce el ruido de moteado detectado por el detector de luz en el 50 % o más.
La luz de excitación puede interaccionar con las ubicaciones sobre el sustrato para producir luz de fluorescencia, como se describe en el presente documento.
La lente objetivo1750puede recoger la luz fluorescente. La lente objetivo puede comprender cualquier lente objetivo descrita en el presente documento. La lente objetivo puede dirigir la luz de fluorescencia a uno o más divisores de haz1760a,1760by1760c, uno o más filtros1770a,1770by1770c, una o más lentes (tales como una o más lentes de tubo)1780a,1780b, 1780cy uno o más detectores de luz (tales como fotodiodos, cámaras de CCD o cámaras de CMOS)1790a,1790by1790c. Aunque se muestra como comprendiendo tres divisores de haz, tres filtros, tres lentes y tres detectores de luz en la figura17, el sistema de detección de fluorescencia1700puede comprender cualquier número de divisores de haz, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 divisores de haz, cualquier número de filtros, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 filtros, cualquier número de lentes, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 lentes y cualquier número de detectores de luz, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 detectores de luz. Los divisores de haz pueden comprender cualquier divisor de haz descrito en el presente documento. Los filtros pueden comprender cualquier filtro descrito en el presente documento. Las lentes pueden comprender cualquier lente descrita en el presente documento. Los detectores de luz pueden comprender cualquier detector de luz descrito en el presente documento.
Dispositivo de procesamiento digital
En algunas realizaciones, las plataformas, sistemas, medios y métodos descritos en el presente documento incluyen un dispositivo de procesamiento digital o el uso del mismo. En realizaciones adicionales, el dispositivo de procesamiento digital incluye una o más unidades centrales de procesamiento (CPU) de hardware, unidades de procesamiento de gráficos de propósito general (GPGPU) o matrices de puertas programables en campo (FPGA) que llevan a cabo las funciones del dispositivo. En otras realizaciones adicionales, el dispositivo de procesamiento digital comprende además un sistema operativo configurado para realizar instrucciones ejecutables. En algunas realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital se conecta opcionalmente a una red informática. En realizaciones adicionales, el dispositivo de procesamiento digital se conecta opcionalmente a Internet de tal modo que accede a la multimalla mundial. En otras realizaciones adicionales, el dispositivo de procesamiento digital se conecta opcionalmente a una infraestructura de computación en la nube. En otras realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital se conecta opcionalmente a una intranet. En otras realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital se conecta opcionalmente a un dispositivo de almacenamiento de datos.
De acuerdo con la descripción contenida en el presente documento, los dispositivos de procesamiento digital adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, ordenadores servidores, ordenadores de escritorio, ordenadores portátiles, ordenadores ultraportátiles, ordenadores subultraportátiles, ordenadores miniportátiles, ordenadores NetPad, ordenadores descodificadores, dispositivos de transmisión por secuencias de medios, ordenadores de mano, aparatos de Internet, teléfonos inteligentes móviles, ordenadores de tipo tableta, asistentes digitales personales, consolas de videojuegos y vehículos. Los expertos en la materia reconocerán que muchos teléfonos inteligentes son adecuados para su uso en el sistema descrito en el presente documento. Los expertos en la materia también reconocerán que ciertos televisores, reproductores de vídeo y reproductores de música digital con conectividad de red informática opcional son adecuados para su uso en el sistema descrito en el presente documento. Los ordenadores de tipo tableta adecuados incluyen los que tienen configuraciones de cuaderno, pizarra y convertible, conocidas por los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital incluye un sistema operativo configurado para ejecutar instrucciones ejecutables. El sistema operativo es, por ejemplo, software, incluyendo programas y datos, que gestiona el hardware del dispositivo y proporciona servicios para la ejecución de aplicaciones. Los expertos en la materia reconocerán que los sistemas operativos de servidor adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, FreeBSD, OpenBSD, NetBSD®, Linux, Mac OS X Server® de Apple®, Solaris® de Oracle®, Windows Server® y NetWare® de Novell®. Los expertos en la materia reconocerán que los sistemas operativos de ordenador personal adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, Windows® de Microsoft®, Mac OS X® de Apple®, UNIX®, y sistemas operativos de tipo UNIX tales como GNU/Linux®. En algunas realizaciones, el sistema operativo se proporciona mediante computación en la nube. Los expertos en la materia también reconocerán que los sistemas operativos de teléfono inteligente móvil adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, SO Symbian® de Nokia®, iOS® de Apple®, SO® Research In Motion® de BlackBerry, Android® de Google®, SO Windows Phone® de Microsoft®, SO Windows Mobile® de Microsoft®, Linux® y WebOS® de Palm®. Los expertos en la materia también reconocerán que los sistemas operativos de dispositivo de transmisión por secuencias de medios adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, Apple TV®, Roku®, Boxee®, Google TV®, Google Chromecast®, Fire® de Amazon y HomeSync® de Samsung®. Los expertos en la materia también reconocerán que los sistemas operativos de consola de videojuegos adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, PS3® de Sony®, PS4® de Sony®, Xbox 360® de Microsoft®, Xbox One de Microsoft, Wii® de Nintendo®, Wii U® de Nintendo® y Ouya®.
En algunas realizaciones, el dispositivo incluye un dispositivo de almacenamiento y/o memoria. El dispositivo de almacenamiento y/o memoria son uno o más aparatos físicos usados para almacenar datos o programas de forma temporal o permanente. En algunas realizaciones, el dispositivo es una memoria volátil y requiere alimentación para mantener la información almacenada. En algunas realizaciones, el dispositivo es una memoria no volátil y retiene la información almacenada cuando no se alimenta el dispositivo de procesamiento digital. En realizaciones adicionales, la memoria no volátil comprende memoria flash. En algunas realizaciones, la memoria no volátil comprende memoria dinámica de acceso aleatorio (DRAM). En algunas realizaciones, la memoria no volátil comprende memoria de acceso aleatorio ferroeléctrica (FRAM). En algunas realizaciones, la memoria no volátil comprende memoria de acceso aleatorio de cambio de fase (PRAM). En otras realizaciones, el dispositivo es un dispositivo de almacenamiento que incluye, a modo de ejemplos no limitantes, CD-ROM, DVD, dispositivos de memoria flash, unidades de disco magnético, unidades de cintas magnéticas, unidades de disco óptico y almacenamiento basado en computación en la nube. En realizaciones adicionales, el dispositivo de almacenamiento y/o memoria es una combinación de dispositivos tales como los divulgados en el presente documento.
En algunas realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital incluye un visualizador para enviar información visual a un usuario. En algunas realizaciones, el visualizador es un tubo de rayos catódicos (c Rt ). En algunas realizaciones, el visualizador es un visualizador de cristal líquido (LCD). En realizaciones adicionales, el visualizador es un visualizador de cristal líquido de transistores de película delgada (TFT-LCD). En algunas realizaciones, el visualizador es un visualizador de diodos emisores de luz orgánicos (OLED). En diversas realizaciones adicionales, un visualizador de OLED es un visualizador de OLED de matriz pasiva (PMOLED) o un visualizador de OLED de matriz activa (AMOLED). En algunas realizaciones, el visualizador es un visualizador de plasma. En otras realizaciones, el visualizador es un proyector de vídeo. En otras realizaciones adicionales, el visualizador es una combinación de dispositivos tales como los divulgados en el presente documento.
En algunas realizaciones, el dispositivo de procesamiento digital incluye un dispositivo de entrada para recibir información procedente de un usuario. En algunas realizaciones, el dispositivo de entrada es un teclado. En algunas realizaciones, el dispositivo de entrada es un dispositivo señalador que incluye, a modo de ejemplos no limitantes, un ratón, bola de seguimiento, panel de seguimiento, palanca de mando, controlador de juegos o lápiz óptico. En algunas realizaciones, el dispositivo de entrada es una pantalla táctil o una pantalla multitáctil. En otras realizaciones, el dispositivo de entrada es un micrófono para captar voz u otra entrada de sonido. En otras realizaciones, el dispositivo de entrada es una cámara de vídeo u otro sensor para captar movimiento o una entrada visual. En realizaciones adicionales, el dispositivo de entrada es un Kinect, Leap Motion o similar. En otras realizaciones adicionales, el dispositivo de entrada es una combinación de dispositivos tales como los divulgados en el presente documento.
Haciendo referencia a la figura 16, en un ejemplo particular, un dispositivo de procesamiento digital1601ilustrativo está programado o configurado de otro modo para hacer funcionar un dispositivo de clasificación de células mediante escaneo por láser. El dispositivo1601puede regular diversos aspectos de la clasificación de células mediante escaneo por láser de la presente divulgación, tal como, por ejemplo, realizando etapas de procesamiento. En esta realización, el dispositivo de procesamiento digital1601incluye una unidad central de procesamiento (CPU, también "procesador" y "procesador de ordenador" en el presente documento)1605, que puede ser un procesador de un único núcleo o de múltiples núcleos, o una pluralidad de procesadores para un procesamiento paralelo. El dispositivo de procesamiento digital1601también incluye memoria o una ubicación de memoria1610(por ejemplo, memoria de acceso aleatorio, memoria de solo lectura, memoria flash), una unidad de almacenamiento electronico1615(por ejemplo, disco duro), una interfaz de comunicación1620(por ejemplo, adaptador de red) para comunicarse con otros uno o más sistemas y unos dispositivos periféricos1625, tales como memoria caché, otros adaptadores de memoria, almacenamiento de datos y/o visualizador electrónico. La memoria1610, la unidad de almacenamiento1615, la interfaz1620y los dispositivos periféricos1625están en comunicación con la CPU1605a través de un bus de comunicación (líneas continuas), tal como una placa base. La unidad de almacenamiento1615puede ser una unidad de almacenamiento de datos (o repositorio de datos) para almacenar datos. El dispositivo de procesamiento digital1601puede acoplarse operativamente a una red informática ("red")1630con la ayuda de la interfaz de comunicación1620. La red1630puede ser Internet, una Internet y/o extranet, o una intranet y/o extranet que está en comunicación con Internet. La red1630es, en algunos casos, una red de telecomunicaciones y/o datos. La red1630puede incluir uno o más servidores informáticos, que puede posibilitar una computación distribuida, tal como la computación en la nube. La red1630, en algunos casos con la ayuda del dispositivo1601, puede implementar una red entre iguales, lo que puede posibilitar que los dispositivos acoplados al dispositivo1601se comporten como un cliente o un servidor.
Continuando haciendo referencia a lafigura 16, la CPU1605puede ejecutar una secuencia de instrucciones legibles por máquina, que puede plasmarse en un programa o software. Las instrucciones pueden almacenarse en una ubicación de memoria, tal como la memoria1610. Las instrucciones pueden dirigirse a la CPU1605, que posteriormente puede programar o configurar de otro modo la CPU1605para implementar métodos de la presente divulgación. Los ejemplos de operaciones realizadas por la CPU1605pueden incluir recuperar, descodificar, ejecutar y escribir en diferido. La CPU1605puede ser parte de un circuito, tal como un circuito integrado. En el circuito pueden incluirse otros uno o más otros componentes del dispositivo1601. En algunos casos, el circuito es un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC) o una matriz de puertas programables en campo (FPGA).
Continuando haciendo referencia a lafigura 16, la unidad de almacenamiento1615puede almacenar archivos, tales como controladores, bibliotecas y programas guardados. La unidad de almacenamiento1615puede almacenar datos de usuario, por ejemplo, preferencias de usuario y programas de usuario. El dispositivo de procesamiento digital1601en algunos casos puede incluir una o más unidades de almacenamiento de datos adicionales que son externas, tal como ubicadas en un servidor remoto que se comunica a través de una intranet o Internet.
Continuando haciendo referencia a lafigura 16, el dispositivo de procesamiento digital1601puede comunicarse con uno o más sistemas informáticos remotos a través de la red1630. Por ejemplo, el dispositivo1601puede comunicarse con un sistema informático remoto de un usuario. Los ejemplos de sistemas informáticos remotos incluyen ordenadores personales (por ejemplo, PC portátil), PC de tipo pizarra o de tipo tabletas (por ejemplo, iPad de Apple®, Galaxy Tab de Samsung®), teléfonos, teléfonos inteligentes (por ejemplo, iPhone de Apple®, dispositivo habilitado para Android, Blackberry®), o asistentes digitales personales.
Los métodos como se describe en el presente documento pueden implementarse por medio de código ejecutable por máquina (por ejemplo, procesador de ordenador) almacenado en una ubicación de almacenamiento electrónico del dispositivo de procesamiento digital1601, tal como, por ejemplo, en la memoria1610o la unidad de almacenamiento electrónico1615. El código ejecutable por máquina o legible por máquina puede proporcionarse en forma de software. Durante su uso, el código puede ser ejecutado por el procesador1605. En algunos casos, el código puede recuperarse de la unidad de almacenamiento1615y almacenado en la memoria1610para un acceso inmediato por el procesador1605. En algunas situaciones, puede excluirse la unidad de almacenamiento electrónico1315, y las instrucciones ejecutables por máquina se almacenan en la memoria1610.
Medio de almacenamiento legible por ordenador no transitorio
En algunas realizaciones, las plataformas, sistemas, medios y métodos divulgados en el presente documento incluyen uno o más medios de almacenamiento legibles por ordenador no transitorios codificados con un programa que incluye instrucciones ejecutables por el sistema operativo de un dispositivo de procesamiento digital opcionalmente interconectado en red. En realizaciones adicionales, un medio de almacenamiento legible por ordenador es un componente tangible de un dispositivo de procesamiento digital. En otras realizaciones adicionales, un medio de almacenamiento legible por ordenador puede ser extraíble opcionalmente de un dispositivo de procesamiento digital. En algunas realizaciones, un medio de almacenamiento legible por ordenador incluye, a modo de ejemplos no limitantes, CD-ROM, DVD, dispositivos de memoria flash, memoria de estado sólido, unidades de disco magnético, unidades de cinta magnética, unidades de disco óptico, sistemas y servicios de computación en la nube y similares. En algunos casos, el programa y las instrucciones se codifican de forma permanente, sustancialmente permanente, semipermanente o no transitoria en los medios.
Programa informático
En algunas realizaciones, las plataformas, sistemas, medios y métodos divulgados en el presente documento incluyen al menos un programa informático o el uso del mismo. Un programa informático incluye una secuencia de instrucciones, ejecutable en la CPU del dispositivo de procesamiento digital, escrita para realizar una tarea especificada. Las instrucciones legibles por ordenador pueden implementarse como módulos de programa, tales como funciones, objetos, interfaces de programación de aplicaciones (API), estructuras de datos y similares, que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. A la luz de la divulgación proporcionada en el presente documento, los expertos en la materia reconocerán que un programa informático puede escribirse en diversas versiones de diversos lenguajes.
La funcionalidad de las instrucciones legibles por ordenador puede combinarse o distribuirse según se desee en diversos entornos. En algunas realizaciones, un programa informático comprende una secuencia de instrucciones. En algunas realizaciones, un programa informático comprende una pluralidad de secuencias de instrucciones. En algunas realizaciones, un programa informático se proporciona desde una ubicación. En otras realizaciones, un programa informático se proporciona desde una pluralidad de ubicaciones. En diversas realizaciones, un programa informático incluye uno o más módulos de software. En diversas realizaciones, un programa informático incluye, en parte o en su totalidad, una o más aplicaciones web, una o más aplicaciones móviles, una o más aplicaciones autónomas, uno o más complementos de navegador web, extensiones, accesorios o suplementos, o combinaciones de los mismos.
Aplicación web
En algunas realizaciones, un programa informático incluye una aplicación web. A la luz de la divulgación proporcionada en el presente documento, los expertos en la materia reconocerán que una aplicación web, en diversas realizaciones, utiliza uno o más marcos de software y uno o más sistemas de bases de datos. En algunas realizaciones, una aplicación web se crea sobre un marco de software tal como .NET de Microsoft® o Ruby on Rails (RoR). En algunas realizaciones, una aplicación web utiliza uno o más sistemas de bases de datos, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, sistemas de bases de datos relacionales, no relacionales, orientados a objetos, asociativos y de XML. En realizaciones adicionales, los sistemas de bases de datos relacionales adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, SQL Server de Microsoft®, mySQL™ y Oracle®. Los expertos en la materia también reconocerán que una aplicación web, en diversas realizaciones, se escribe en una o más versiones de uno o más lenguajes. Una aplicación web puede escribirse en uno o más lenguajes de marcado, lenguajes de definición de presentación, lenguajes de generación de secuencias de comandos de lado de cliente, lenguajes de codificación de lado de servidor, lenguajes de consulta de base de datos, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una aplicación web se escribe en cierta medida en un lenguaje de marcado tal como el lenguaje de marcado de hipertexto (HTML), lenguaje de marcado de hipertexto extensible (XHTML) o lenguaje de marcado extensible (XML). En algunas realizaciones, una aplicación web se escribe en cierta medida en un lenguaje de definición de presentación tal como hojas de estilo en cascada (CSS). En algunas realizaciones, una aplicación web se escribe en cierta medida en un lenguaje de programación de lado de cliente, tal como Javascript asíncrono y XML (AJAX), Actionscript de Flash®, Javascript o Silverlight®. En algunas realizaciones, una aplicación web se escribe en cierta medida en un lenguaje de codificación de lado de servidor, tal como páginas de servidor activo (ASP), ColdFusion®, Perl, Java™, JavaServer Pages (JSP), preprocesador de hipertexto (PHP), Python™, Ruby, Tcl, Smalltalk, WebDNA® o Groovy. En algunas realizaciones, una aplicación web se escribe en cierta medida en un lenguaje de consulta de base de datos, tal como el lenguaje de consulta estructurado (SQL). En algunas realizaciones, una aplicación web integra productos de servidores empresariales tales como Lotus Domino® de IBM®. En algunas realizaciones, una aplicación web incluye un elemento de reproductor de medios. En diversas realizaciones adicionales, un elemento de reproductor de medios utiliza una o más de muchas tecnologías multimedios adecuadas, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, Flash® de Adobe®, HTML 5, QuickTime® de Apple®, Silverlight® de Microsoft®, Java™ y Unity®.
Aplicación móvil
En algunas realizaciones, un programa informático incluye una aplicación móvil proporcionada a un dispositivo de procesamiento digital móvil. En algunas realizaciones, la aplicación móvil se proporciona a un dispositivo de procesamiento digital móvil en el momento en el que se fabrica. En otras realizaciones, la aplicación móvil se proporciona a un dispositivo de procesamiento digital móvil a través de la red informática descrita en el presente documento.
En vista de la divulgación proporcionada en el presente documento, una aplicación móvil se crea mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia usando hardware, lenguajes y entornos de desarrollo conocidos en la técnica. Los expertos en la materia reconocerán que las aplicaciones móviles se escriben en varios lenguajes. Los lenguajes de programación adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, C, C++, C#, Objective-C, Java™, Javascript, Pascal, Object Pascal, Python™, Ruby, VB.NET, w Ml y XHTML/HTML con o sin CSS, o combinaciones de los mismos.
Hay entornos de desarrollo de aplicaciones móviles adecuados disponibles de varias fuentes. Los entornos de desarrollo disponibles comercialmente incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, kit de desarrollo de software para Airplay, alcheMo, Appcelerator®, Celsius, Bedrock, Flash Lite, .NET Compact Framework, Rhomobile y la plataforma móvil WorkLight. Hay otros entornos de desarrollo disponibles sin coste, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, Lazarus, MobiFlex, MoSync y Phonegap. Asimismo, los fabricantes de dispositivos móviles distribuyen kits para desarrolladores de software que incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, kit de desarrollo de software para iPhone y iPad (iOS), kit de desarrollo de software para Android™, kit de desarrollo de software para BlackBerry®, kit de desarrollo de software para BREW, kit de desarrollo de software para SO Palm®, kit de desarrollo de software para Symbian, kit de desarrollo de software para webOS y kit de desarrollo de software para Windows® Mobile.
Los expertos en la materia reconocerán que hay varios foros comerciales disponibles para la distribución de aplicaciones móviles, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, App Store de Apple®, Play de Google®, Chrome WebStore, App World de BlackBerry®, App Store para dispositivos Palm, App Catalog para webOS, Marketplace for Mobile de Windows®, Ovi Store para dispositivos de Nokia®, Apps de Samsung® y la Tienda DSi de Nintendo®.
Aplicación autónoma
En algunas realizaciones, un programa informático incluye una aplicación autónoma, que es un programa que se ejecuta como un proceso informático independiente, no es un suplemento a un proceso existente, por ejemplo, no un complemento. Los expertos en la materia reconocerán que a menudo se compilan aplicaciones autónomas. Un compilador es un programa informático que transforma el código fuente escrito en un lenguaje de programación en código objeto binario, tal como lenguaje ensamblador o código máquina. Los lenguajes de programación compilados adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, C, C++, Objective-C, COBOL, Delphi, Eiffel, Java™, Lisp, Python™, Visual Basic y .NET de VB, o combinaciones de los mismos. La compilación se realiza a menudo, al menos en parte, para crear un programa ejecutable. En algunas realizaciones, un programa informático incluye una o más aplicaciones compiladas ejecutables.
Complemento de navegador web
En algunas realizaciones, el programa informático incluye un complemento de navegador web (por ejemplo, extensión, etc.). En informática, un complemento son uno o más componentes de software que añaden una funcionalidad específica a una aplicación de software más grande. Los creadores de aplicaciones de software soportan complementos para posibilitar que los desarrolladores externos creen capacidades que amplíen una aplicación, para soportar añadir fácilmente nuevas características y reducir el tamaño de una aplicación. Cuando se soportan, los complementos posibilitan personalizar la funcionalidad de una aplicación de software. Por ejemplo, los complementos se usan comúnmente en los navegadores web para reproducir vídeo, generar interactividad, escanear en busca de virus y visualizar tipos de archivo particulares. Los expertos en la materia estarán familiarizados con varios complementos de navegador web, incluyendo, el reproductor Flash® de Adobe®, Silverlight® de Microsoft® y QuickTime® de Apple®. En algunas realizaciones, la barra de herramientas comprende una o más extensiones de navegador web, accesorios o suplementos. En algunas realizaciones, la barra de herramientas comprende una o más barras de explorador, bandas de herramientas o bandas de escritorio.
En vista de la divulgación proporcionada en el presente documento, los expertos en la materia reconocerán que están disponibles diversos marcos de complementos que posibilitan el desarrollo de complementos en diversos lenguajes de programación, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, C++, Delphi, Java™, PHP, Python™ y .NET de VB, o combinaciones de los mismos.
Los navegadores web (también denominados navegadores de Internet) son aplicaciones de software, diseñadas para su uso con dispositivos de procesamiento digital conectados en red, para recuperar, presentar y recorrer recursos de información en la multimalla mundial. Los navegadores web adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, Internet Explorer® de Microsoft®, Firefox® de Mozilla®, Chrome de Google®, Safari® de Apple®, Opera® de Opera Software® y Konqueror de KDE. En algunas realizaciones, el navegador web es un navegador web móvil. Los navegadores web móviles (también denominados micronavegadores, mininavegadores y navegadores inalámbricos) se diseñan para usarse en dispositivos de procesamiento digital móviles, incluyendo, a modo de ejemplos no limitantes, ordenadores de mano, ordenadores de tipo tableta, ordenadores miniportátiles, ordenadores subultraportátiles, teléfonos inteligentes, reproductores de música, asistentes digitales personales (PDA) y sistemas de videojuegos de mano. Los navegadores web móviles adecuados incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, navegador de Android® de Google®, navegador RIM® de BlackBerry, Safari® de Apple®, Blazer de Palm®, navegador WebOS® de Palm®, Firefox® de Mozilla® para móvil, Internet Explorer® Mobile de Microsoft®, Basic Web para Kindle® de Amazon®, navegador de Nokia®, Opera® Mobile de Opera Software® y navegador PSP™ de Sony®.
Módulos de software
En algunas realizaciones, las plataformas, sistemas, medios y métodos divulgados en el presente documento incluyen software, servidores y/o módulos de base de datos, o el uso de los mismos. En vista de la divulgación proporcionada en el presente documento, los módulos de software se crean mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia usando máquinas, software y lenguajes conocidos en la técnica. Los módulos de software divulgados en el presente documento se implementan en una multitud de formas. En diversas realizaciones, un módulo de software comprende un archivo, una sección de código, un objeto de programación, una estructura de programación, o combinaciones de los mismos. En diversas realizaciones adicionales, un módulo de software comprende una pluralidad de archivos, una pluralidad de secciones de código, una pluralidad de objetos de programación, una pluralidad de estructuras de programación, o combinaciones de los mismos. En diversas realizaciones, los uno o más módulos de software comprenden, a modo de ejemplos no limitantes, una aplicación web, una aplicación móvil y una aplicación autónoma. En algunas realizaciones, los módulos de software están en una aplicación o programa informático. En otras realizaciones, los módulos de software están en más de una aplicación o programa informático. En algunas realizaciones, los módulos de software se alojan en una máquina. En otras realizaciones, los módulos de software se alojan en más de una máquina. En realizaciones adicionales, los módulos de software se alojan en plataformas de computación en la nube. En algunas realizaciones, los módulos de software se alojan en una o más máquinas en una ubicación. En otras realizaciones, los módulos de software se alojan en una o más máquinas en más de una ubicación.
Bases de datos
En algunas realizaciones, las plataformas, sistemas, medios y métodos divulgados en el presente documento incluyen una o más bases de datos o el uso de las mismas. En vista de la divulgación proporcionada en el presente documento, los expertos en la materia reconocerán que muchas bases de datos son adecuadas para el almacenamiento y la recuperación de información. En diversas realizaciones, las bases de datos adecuadas incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, bases de datos relacionales, bases de datos no relacionales, bases de datos orientadas a objetos, bases de datos de objetos, bases de datos de modelos entidad-relación, bases de datos asociativas y bases de datos de XML. Ejemplos no limitantes adicionales incluyen SQL, PostgreSQL, MySQL, Oracle, DB2 y Sybase. En algunas realizaciones, una base de datos se basa en Internet. En realizaciones adicionales, una base de datos se basa en la web. En otras realizaciones adicionales, una base de datos se basa en la computación en la nube. En otras realizaciones, una base de datos se basa en uno o más dispositivos de almacenamiento informático local.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento de macrogel
Como se presenta en la figura6, las partículas opacas y las células pueden separarse en un microcanal de un sustrato para proteger las células frente a la radiación electromagnética durante la extracción. En primer lugar, se añadió aproximadamente 1 g de agarosa (Sigma-Aldrich, n.° de cat.: A9539) a aproximadamente 100 ml de agua destilada. La mezcla se calentó en un horno microondas y la mezcla se agitó intermitentemente para disolver la agarosa. Se añadiron perlas opacas (M-270 Epoxy de Dynabeads, Thermo Fisher, n.° de cat.: 14301 a la mezcla y las perlas se mezclaron para conseguir una distribución uniforme. La mezcla se aplicó sobre la superficie de una matriz de microporos y se dejó que la mezcla entrara en los poros mediante tensión superficial. La mezcla en los poros se dejó enfriar durante al menos aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente y se dejó endurecer dentro de los poros para formar una matriz de microporos infundida con gel. La matriz de microporos infundida con gel puede almacenarse a aproximadamente 4 °C para un uso futuro. Entonces, se creó un depósito en un lado de la matriz de microporos infundida con gel y se añadió tampón QG (QIAGEN, n.° de cat.: 19063). El tampón QG se dejó reposar y se disolvió una porción de la agarosa en un lado del poro durante aproximadamente 5 minutos. El tampón QG se retiró por lavado con PBS (Thermo Fisher, n.° de cat.: 10010023) y con 2 % de BSA (VWR, n.° de cat. 97063-626) y esta etapa se repitió dos veces. Una solución de suspensión celular se añadió al lado del poro que se disolvió (se "grabó"). La solución de suspensión celular se dejó reposar durante aproximadamente 10 minutos y se dejó que las células sedimentaran en los poros. La matriz de microporos se lavó dos veces con PBS y una solución de BSA al 2% paralibrarse de las células adicionales adheridas a la superficie del poro. El poro se invirtió y se dejó reposar durante aproximadamente 10 minutos. Las células sedimentan en el menisco debido a la gravedad.
Ejemplo 2: Aislamiento de microgel
Como se presenta en la figura7B, las partículas opacas y las células pueden separarse en un microcanal de un sustrato para proteger las células frente a la radiación electromagnética durante la extracción. En primer lugar, se añadiron células en PBS y 2 % de BSA a perlas que tienen un núcleo magnético y una cubierta de agarosa (Cube-BioTech) en un volumen de aproximadamente 20 pl del 50 % (V/V) por 50 pl de suspensión celular. La suspensión se cargó sobre una matriz de microporos y se permitió que la suspensión entrase en los poros por acción capilar. Un imán de neodimio potente (forma cilindrica, diámetro de 6,5 mm, longitud de 25 mm, intensidad N52) se aplicó durante aproximadamente 5 minutos a la parte superior de la matriz para hacer que las perlas magnéticas se asentaran sobre el menisco superior. Entonces, se retiró el imán. Se dejó que las células y las perlas se asentaran durante aproximadamente 10 minutos, y se permitió que una capa diferenciada de células se asentara sobre el menisco inferior y que una capa de perlas se asentara en la parte superior.
Ejemplo 3: Espaciador en el poro
Como se presenta en la figura8A, las partículas magnéticas y las células pueden separarse en un microcanal de un sustrato para proteger las células frente a la radiación electromagnética durante la extracción. En primer lugar, se añadieron células en PBS y 2 % de BSA a aproximadamente 10 pl de 0,25 * 109 perlas/ml en 100 pl de sílice transparente (Bangs Laboratories, Inc., n.° de cat.: SS05N, tamaño 3,48 pm) y aproximadamente 2 pl de 2 * 109 perlas/ml en 100 pl de perlas magnéticas opacas (M-270 Epoxi de Dynabeads®, Thermo Fisher, n.° de cat.: 14301). La suspensión se cargó sobre una matriz de microporos y se permitió que la suspensión entrase en los poros por acción capilar. Un imán de neodimio potente (forma cilíndrica, diámetro de 6,5 mm, longitud de 25 mm, intensidad N52) se aplicó durante aproximadamente 5 minutos a la parte superior de la matriz para hacer que las perlas magnéticas se asentaran sobre el menisco superior. Entonces, se retiró el imán. Se dejó que las células y las perlas se asentaran durante aproximadamente 10 minutos, y se permitió que una capa diferenciada de células y perlas de sílice transparente se asentara sobre el menisco inferior y que una capa de perlas se asentara en la parte superior.
Ejemplo 4: Carga secuencial
Como se presenta en la figura9A, las células pueden cargarse en una matriz secuencialmente con perlas opacas o cargarse en un lote mixto para cuantificar células. En primer lugar, cargar la matriz de microporos con células suspendidas en PBS y 2 % de FBS. Dejar que las células se asienten durante 10 minutos. Entonces, añadir perlas a la matriz de microporos con una concentración entre 1 y 2 mil millones por ml. Dejar que el contenido de la micromatriz se asiente durante al menos 10 minutos para permitir que las perlas se asienten en los poros y descansen encima de las células.
Ejemplo 5: Perla colgante
Poner 60 pl de suspensión celular en el fondo de un portaobjetos de vidrio limpio, de tal modo que se invierte la gotita. La gotita permanece en su lugar debido a la hidrofilicidad y la tensión superficial que equilibra la atracción gravitacional. Dejar que la gotita se asiente durante 10 minutos. Aplicar la matriz de microporos a la gota colgante. La matriz de microporos puede aplicarse con una fase de traslación en Z o a mano. El primer extremo, la porción media y el segundo extremo de la matriz de microporos deberían estar sustancialmente en el mismo plano y ser planos cuando se aplican a la gota colgante. Dejar que la suspensión celular entre en la matriz de microporos por acción capilar. Poner un depósito de PDMS en el lado que tocó la gota colgante. Llenar el depósito con 100 pl de tampón para hidratación. Asentar durante 10 minutos antes de someter a formación de imágenes.
Ejemplo 6: Inundación
El depósito de PDMS (diámetro de 7 mm y altura de 3 mm) se fijó a la parte superior de una matriz de vidrio de microporos. Se añadiron aproximadamente 60 pm de suspensión celular (de una concentración diferente) a la parte superior de la matriz de vidrio de microporos. Se extrajeron aproximadamente 10 pl de suspensión celular desde la parte superior de una matriz de vidrio de microporos. El depósito de PDMS se llenó con aproximadamente 100 pl de tampón para mantener los poros hidratados. Se dejó asentar durante aproximadamente 10 minutos antes de someter a formación de imágenes.
Ejemplo 7: Sonicación
Se añadiron aproximadamente 100 pl de tampón (PBS 0,2 % de BSA) a un microchip de vidrio de 20 pm. Retirar aproximadamente 20 pl de tampón del depósito de PDMS. Se añadiron aproximadamente 15 pl de perlas resuspendidas a una concentración conocida. Esperar aproximadamente 10 minutos. Se sometió a formación de imágenes con microscopía. El sonicador Tide (frecuencia de sonicador 40 kHz) se aplicó en el lado del chip. Esperar aproximadamente 10 minutos. Se sometió a formación de imágenes con microscopía. Se aplicó un imán de neodimio potente en la parte inferior del chip para tirar de las perlas hacia el fondo. Se sometió a formación de imágenes con microscopía.
Ejemplo 8: Desplazamiento de fluorescencia
Una matriz de microporos se cargó con células y perlas COMPEL™ (5 j l de 0,6 * 109 en 100 j l de suspensión celular, Bangs Laboratories, Inc., n.° de cat.: UMC3F, tamaño 2,85 jim, emisión fluorescente: color verde) suspendida en PBS y 2 % de FBS. Un imán de neodimio potente (forma cilindrica, diámetro de 6,5 mm, longitud de 25 mm, intensidad N52) se añadió en la parte superior de la matriz durante aproximadamente 5 minutos para hacer que las perlas magnéticas se asentaran sobre el menisco superior. Se retiró el imán y se dejó que las células y las perlas se asentaran durante aproximadamente 10 minutos. Las células asentadas en el menisco inferior se sometieron a formación de imágenes.
Ejemplo 9: Extracción
La figura 15 muestra los ajustes de potencia de pulso óptimos para la extracción por láser de células a partir de una matriz de microcanales. Se llevó a cabo un estudio para determinar los ajustes de láser de extracción que permitirían la expulsión de fluido desde pocillos deseados dentro de una matriz de microcanales. El estudio se llevó a cabo usando un láser de fibra dopada con iterbio de duración de pulso ajustable de nanosegundos YLPN-1-1x120-100-M de IPG Photonics. El láser se enfocó en un diámetro de haz de 6,55 jm y se escaneó transversalmente a una matriz de microcanales usando un escáner galvanométrico SCANLab HurrySCAN II 14. La luz de extracción se enfocó sobre una superficie plana usando una lente Linos F-Theta-Ronar con una distancia focal de 163 mm. La dirección de los pulsos de láser de extracción se controló usando un controlador inteligente Ethernet Lanmark Maestro 3000 LEC-1 con una placa de extensión de láser IPG Photonics incorporada. El controlador se programó usando el software Lanmark WinLase LAN v 5.1.9.17. La duración de pulso se estableció arbitrariamente a 4 ns. La velocidad de repetición de pulsos se estableció a 100 kHz.
Se realizaron ensayos con diferentes niveles de potencia de láser promedio. Como se muestra en el cuadro izquierdo de la figura15, una potencia de láser promedio de 2,0 W dió como resultado una expulsión solo marginal de fluido desde los microcanales deseados (zonas puntuales de luz en la matriz de microcanales). Como se muestra en el cuadro derecho, una potencia de láser promedio de 3,3 W dio como resultado la expulsión completa de fluido desde los microcanales deseados. Como se muestra en el cuadro central, se determinó que la potencia de láser promedio óptima era de 2,3 W, correspondiente a una energía de 23 jJ por cada pulso de láser.
Aunque en el presente documento se han mostrado y descrito las realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones estén cubiertos por las mismas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un aparato (1100) que comprende:
una fuente de luz de excitación (1110) configurada para emitir un haz de excitación para generar luz de fluorescencia a partir de partículas objetivo ubicadas en una pluralidad de canales;
un detector (1170) configurado para recibir la luz de fluorescencia, en donde el detector comprende una matriz de detectores de dispositivo acoplado por carga (CCD) o una matriz de detectores de metal-óxido-semiconductor complementario (CMOS);
un láser de extracción (1130) configurado para proporcionar un haz de extracción para retirar partículas objetivo de la pluralidad de canales;
un escáner (1440) acoplado a la fuente de luz de excitación y al láser de extracción,
en donde el escáner está configurado para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción a lo largo de la pluralidad de canales; y
una circuitería acoplada al detector y al láser de extracción, en donde la circuitería está configurada para controlar el láser de extracción para retirar selectivamente las partículas objetivo de la pluralidad de canales en respuesta a la luz de fluorescencia detectada;
en donde el aparato está configurado para escanear y retirar las partículas objetivo de la pluralidad de canales a una velocidad dentro de un intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 100.000.000 de partículas objetivo por segundo,
en donde el escáner, el haz de excitación y el haz de extracción se disponen con una óptica para escanear con el haz de excitación y el haz de extracción a lo largo de la pluralidad de canales, estando el haz de excitación separado del haz de extracción, y
en donde las ópticas comprenden una lente objetivo (1150) y en donde la fuente de excitación, la lente objetivo y el detector se disponen en una configuración confocal.
2. El aparato de la reivindicación 1, en donde el aparato está configurado para escanear y retirar las partículas objetivo de la pluralidad de canales a una velocidad dentro del intervalo de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 20.000.000 de partículas objetivo por segundo.
3. El aparato de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el escáner (1440) se acopla ópticamente a la fuente de luz de excitación (1110) y al láser de extracción (1130) para escanear simultáneamente el haz de excitación y el haz de extracción a lo largo de la pluralidad de canales.
4. El aparato de la reivindicación 1, en donde se genera una pluralidad de haces de extracción con las ópticas y en donde la pluralidad de haces de extracción se separan entre sí y se modulan independientemente.
5. El aparato de la reivindicación 1, en donde las ópticas están configuradas para enfocar simultáneamente el haz de excitación a un primer canal de la pluralidad de canales y el haz de extracción a un segundo canal de la pluralidad de canales, en donde el primer canal se separa opcionalmente del segundo canal una distancia dentro de un intervalo de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 5 mm.
6. El aparato de la reivindicación 1, en donde el escáner (1440) comprende una o más superficies de espejo sustancialmente planas, y en donde el haz de excitación y el haz de extracción se disponen para reflejarse desde las una o más superficies de espejo sustancialmente planas.
7. El aparato de la reivindicación 1, en donde el escáner (1440) comprende un primer escáner para reflejar y escanear con el haz de excitación y un segundo escáner para reflejar y escanear con el haz de extracción, en donde la circuitería está configurada para coordinar el escaneo del haz de excitación con el primer escáner y el escaneo del haz de extracción con el segundo escáner para retirar selectivamente partículas objetivo de la pluralidad de canales, en donde el primer escáner y el segundo escáner se ubican opcionalmente en un lado de un sustrato que define la pluralidad de canales, y en donde el primer escáner y el segundo escáner se ubican opcionalmente en lados opuestos de un sustrato que comprende la pluralidad de canales.
8. El aparato de la reivindicación 7, en donde el primer escáner y el segundo escáner se seleccionan cada uno del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico, un modulador acústico-óptico, sistema de procesamiento de luz digital (DLPS) y un escáner resonante.
9. El aparato de la reivindicación 1, en donde el escáner (1440) se selecciona del grupo que consiste en un escáner poligonal, un escáner galvanométrico y un modulador acústico-óptico.
10. El aparato de la reivindicación 1, en donde la circuitería y el detector (1170) están configurados para detectar una presencia de las partículas objetivo en la pluralidad de canales cuando la fluorescencia de las partículas objetivo excede una cantidad umbral, en donde se usa un nivel de fluorescencia para generar una respuesta de fluorescencia de las partículas objetivo, y en donde la circuitería y el detector están configurados para irradiar selectivamente cada canal de la pluralidad de canales basándose en la respuesta de fluorescencia, en donde la duracción de tiempo que transcurre entre la fluorescencia y la irradiación se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 10 ns a aproximadamente 100 ps.
11. El aparato de la reivindicación 1, en donde la fuente de luz de excitación (1110), el láser de extracción (1130) y la circuitería se sincronizan con un reloj compartido.
12. El aparato de la reivindicación 1, en donde la fuente de luz de excitación (1110) está configurada para emitir una pluralidad de longitudes de onda, en donde cada una de la pluralidad de longitudes de onda comprende un pico separado de otros picos de la pluralidad de longitudes de onda.
13. El aparato de la reivindicación 1, en donde la fuente de luz de excitación (1110) se selecciona del grupo que consiste en LED y láseres.
14. El aparato de la reivindicación 1, en donde la lente objetivo comprende una óptica F-theta, opcionalmente en donde la óptica F-theta produce un plano focal que es sustancialmente plano.
15. El aparato de la reivindicación 1, que comprende además un espejo poligonal rotatorio (1140), en donde el espejo poligonal rotatorio escanea luz desde el haz de excitación a lo largo de un plano focal curvo perpendicular al eje de rotación del espejo poligonal rotatorio.
ES17870339T 2016-11-14 2017-11-13 Aparatos para clasificar partículas objetivo Active ES2989473T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662421979P 2016-11-14 2016-11-14
PCT/US2017/061414 WO2018089953A1 (en) 2016-11-14 2017-11-13 Methods and apparatuses for sorting target particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2989473T3 true ES2989473T3 (es) 2024-11-26

Family

ID=62109405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17870339T Active ES2989473T3 (es) 2016-11-14 2017-11-13 Aparatos para clasificar partículas objetivo

Country Status (6)

Country Link
US (6) US10350595B2 (es)
EP (2) EP3538277B1 (es)
JP (2) JP7086092B2 (es)
CN (2) CN115254210A (es)
ES (1) ES2989473T3 (es)
WO (1) WO2018089953A1 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9657290B2 (en) 2012-07-03 2017-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scalable bio-element analysis
US10526600B2 (en) 2015-02-22 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Micro-screening apparatus, process, and products
ES2989473T3 (es) 2016-11-14 2024-11-26 Orca Biosystems Inc Aparatos para clasificar partículas objetivo
WO2020047508A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Orca Biosystems, Inc. Ultrafast particle sorting
CN110433878B (zh) * 2019-08-21 2021-06-25 北京工业大学 一种基于vcsel耦合阵列的光学相位差的液体检测芯片
EP4028165A1 (en) * 2019-09-10 2022-07-20 Orca Biosystems, Inc. Mesh for cell layer preparation
CN110864610B (zh) * 2019-11-04 2021-08-03 杭州都市高速公路有限公司 基于3d扫描重构混凝土表面三维粗糙度的测试方法
US11803043B2 (en) * 2019-12-17 2023-10-31 University Of Washington System and apparatus for dynamically shaped focal surface with a scanning microscope
WO2021127276A1 (en) * 2019-12-18 2021-06-24 Orca Biosystems, Inc. Cell sorting systems and methods for enhancing cell yield
WO2021178566A1 (en) * 2020-03-04 2021-09-10 Orca Biosystems, Inc. Particle sorting systems and methods
CN111855542A (zh) * 2020-07-02 2020-10-30 江南大学 一种快速细胞计数装置及计数方法
CN111811998B (zh) * 2020-09-01 2020-12-01 中国人民解放军国防科技大学 一种目标波段下强吸收性生物颗粒组分的确定方法
CN113092569B (zh) * 2021-04-08 2023-07-18 成都理工大学 一种确定稀有金属伟晶岩成矿年龄的方法
CN113340894B (zh) * 2021-05-28 2023-04-07 上海睿钰生物科技有限公司 一种非透明微粒的检测方法
US11982621B2 (en) 2022-10-01 2024-05-14 Photothermal Spectroscopy Corp. Autofluorescence photothermal characterization systems and methods

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4115535A (en) 1977-06-22 1978-09-19 General Electric Company Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles
FI841023A0 (fi) 1984-03-14 1984-03-14 Labsystems Oy Foerfarande foer utfoering av immunobestaemningar
FI842992A0 (fi) 1984-07-26 1984-07-26 Labsystems Oy Immunologiskt definitionsfoerfarande.
ATE48477T1 (de) * 1984-09-11 1989-12-15 Partec Ag Verfahren und vorrichtung zur sortierung von mikroskopischen partikeln.
FI844027A7 (fi) 1984-10-12 1986-04-13 Labsystems Oy Immunologiskt bestaemningsfoerfarande.
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
FI850481A0 (fi) 1985-02-06 1985-02-06 Labsystems Oy Foerfarande foer bestaemning av motmedel eller antigener.
CN1030139A (zh) 1986-05-22 1989-01-04 尤尼利弗公司 一种新的免疫测定方法
EP0247796A1 (en) 1986-05-22 1987-12-02 Unilever Plc Solid phase immunoassay method
CN1032399A (zh) 1986-05-22 1989-04-12 尤尼利弗公司 免疫测定方法
JPH0750113B2 (ja) 1988-12-02 1995-05-31 日本電信電話株式会社 レーザ磁気免疫測定法
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5351332A (en) 1992-03-18 1994-09-27 Galileo Electro-Optics Corporation Waveguide arrays and method for contrast enhancement
US5639606A (en) 1993-04-06 1997-06-17 The University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5643765A (en) 1993-04-06 1997-07-01 University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5876978A (en) 1993-04-06 1999-03-02 Medical College Of Ohio Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5585069A (en) * 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
US6794127B1 (en) 1997-06-16 2004-09-21 Diversa Corporation Capillary array-based sample screening
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
ATE220456T1 (de) * 1997-11-12 2002-07-15 Pe Corp Ny Serpentinenförmiger elektroforetischer kanal mit selbstkorrigierenden kurven
US6663659B2 (en) 2000-01-13 2003-12-16 Mcdaniel David H. Method and apparatus for the photomodulation of living cells
US6027873A (en) 1999-03-19 2000-02-22 Genencor International, Inc. Multi-through hole testing plate for high throughput screening
ES2237420T5 (es) 1999-04-15 2010-03-03 Crucell Holland B.V. Produccion de proteina recombinante en una celula humana.
SE9901339D0 (sv) 1999-04-15 1999-04-15 Astra Ab New expression systems
AU1796101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Diversa Corporation Capillary array-based sample screening
US6482652B2 (en) * 2000-03-23 2002-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological particle sorter
DE10043042C2 (de) 2000-09-01 2003-04-17 Bruker Daltonik Gmbh Verfahren zum Belegen eines Probenträgers mit Biomolekülen für die massenspektrometrische Analyse
AU2002213043A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-15 Protasis Corporation Fluid separation conduit cartridge
US20100261159A1 (en) 2000-10-10 2010-10-14 Robert Hess Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof
EP1330306A2 (en) 2000-10-10 2003-07-30 BioTrove, Inc. Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof
CA2393374A1 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
US20020155439A1 (en) 2000-12-04 2002-10-24 Ana Rodriguez Method for generating a library of mutant oligonucleotides using the linear cyclic amplification reaction
US20030124516A1 (en) 2001-04-27 2003-07-03 Genoptix, Inc. Method of using optical interrogation to determine a biological property of a cell or population of cells
US20050009101A1 (en) * 2001-05-17 2005-01-13 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
JP3863493B2 (ja) 2001-05-18 2006-12-27 株式会社エスアールエル イムノアッセイ法
US7179423B2 (en) * 2001-06-20 2007-02-20 Cytonome, Inc. Microfluidic system including a virtual wall fluid interface port for interfacing fluids with the microfluidic system
AU2002353107A1 (en) * 2001-12-11 2003-07-09 Sau Lan Tang Staats Microfluidic devices and methods for two-dimensional separations
US7452725B2 (en) 2002-01-10 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Flow sorting system and methods regarding same
US9943847B2 (en) * 2002-04-17 2018-04-17 Cytonome/St, Llc Microfluidic system including a bubble valve for regulating fluid flow through a microchannel
US7157274B2 (en) * 2002-06-24 2007-01-02 Cytonome, Inc. Method and apparatus for sorting particles
US20030224531A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-04 Brennen Reid A. Microplate with an integrated microfluidic system for parallel processing minute volumes of fluids
US6838056B2 (en) 2002-07-08 2005-01-04 Innovative Micro Technology Method and apparatus for sorting biological cells with a MEMS device
US7122384B2 (en) 2002-11-06 2006-10-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Resonant light scattering microparticle methods
DE602004024874D1 (de) * 2003-03-28 2010-02-11 Inguran Llc Eschlechts-sortierten tierspermien
US7745221B2 (en) * 2003-08-28 2010-06-29 Celula, Inc. Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network
US20050232821A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-20 Carrillo Albert L High density plate filler
US20050196376A1 (en) 2004-03-03 2005-09-08 G. L. Loomis & Associates, Inc. Preparation of polymerizable compositions
AU2005290314A1 (en) 2004-09-28 2006-04-06 Singulex, Inc. System and method for spectroscopic analysis of single particles
US7572640B2 (en) 2004-09-28 2009-08-11 Singulex, Inc. Method for highly sensitive detection of single protein molecules labeled with fluorescent moieties
EP1874677B1 (en) 2005-04-14 2013-03-20 Gyros Patent Ab Microfluidic device with meander
WO2006122311A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Microfluidic chip
US9388374B2 (en) * 2005-07-07 2016-07-12 Emd Millipore Corporation Microfluidic cell culture systems
WO2007019479A2 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 Helicos Biosciences Corporation Multi-channel flow cells
US20070059683A1 (en) 2005-09-15 2007-03-15 Tom Barber Veterinary diagnostic system
EP1962687A2 (en) * 2005-10-06 2008-09-03 Optiscan Biomedical Corporation Fluid handling cassette system for body fluid analyzer
ES2671355T3 (es) 2005-12-29 2018-06-06 Anthrogenesis Corporation Poblaciones de células madre placentarias
US8460879B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8296088B2 (en) * 2006-06-02 2012-10-23 Luminex Corporation Systems and methods for performing measurements of one or more materials
JP2010512534A (ja) 2006-12-12 2010-04-22 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ ラベル粒子を検出するマイクロエレクトロニクスセンサデバイス
US8168120B1 (en) * 2007-03-06 2012-05-01 The Research Foundation Of State University Of New York Reliable switch that is triggered by the detection of a specific gas or substance
US20080268440A1 (en) * 2007-04-26 2008-10-30 Liu Timothy Z Biomolecule immobilization on surface via hydrophobic interactions
UA91357C2 (ru) * 2007-09-24 2010-07-26 Алексей Эдуардович Чертилин Шлюз для извлечения тяжелых минералов из потока пульпы
JP4509166B2 (ja) * 2007-11-02 2010-07-21 ソニー株式会社 微小粒子の測定方法、及び測定装置
US8632768B2 (en) 2008-05-30 2014-01-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Human facilitating cells
US9132394B2 (en) * 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
EP2340300B1 (en) 2008-09-24 2013-12-18 Straus Holdings Inc. Method for detecting analytes
US8546128B2 (en) * 2008-10-22 2013-10-01 Life Technologies Corporation Fluidics system for sequential delivery of reagents
JP5382852B2 (ja) * 2009-02-06 2014-01-08 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 使い捨てチップ型フローセルとそれを用いたフローサイトメーター
CN102459565A (zh) * 2009-06-02 2012-05-16 尹特根埃克斯有限公司 具有隔膜阀的流控设备
TW201105971A (en) * 2009-07-06 2011-02-16 Sony Corp Microfluidic device having onboard tissue or cell sample handling capability
DE102009040716B4 (de) 2009-09-10 2011-07-14 Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Verwendung von CD154 zur Identifizierung und Abtrennung von nicht-regulatorischen T-Zellen aus einem Gemisch mit regulatorischen T-Zellen
JP5791634B2 (ja) * 2010-01-29 2015-10-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ
JP2011174736A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Seiko Epson Corp 検体の充填方法、チップキット、遠心機およびマイクロ流体チップ
CA2791565C (fr) * 2010-03-02 2018-08-28 Universite Technologie De Compiegne - Utc Boite multi-reacteurs pour culture cellulaire dynamique
JP5497587B2 (ja) * 2010-03-23 2014-05-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ マイクロ流路チップ及びマイクロアレイチップ
US8957928B2 (en) 2010-06-04 2015-02-17 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
WO2012030995A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Optical system for high resolution thermal melt detection
TR201007549A2 (tr) 2010-09-15 2011-01-21 �Novat�F B�Yoteknoloj� Organ�Zasyonu T�Caret L�M�Ted ��Rket� Emici boncuklar ile santrifüje gereksinimi ortadan kaldıran yoğunlaştırma yöntemi ve kitleri.
WO2012167142A2 (en) 2011-06-02 2012-12-06 Raindance Technolgies, Inc. Enzyme quantification
US9879224B2 (en) 2011-10-27 2018-01-30 The Regents Of The University Of California Label-free identification of stem cell-differentiated cells
CN103163275B (zh) 2011-12-16 2016-08-24 同方威视技术股份有限公司 物品表面危险物质的检测装置及检测方法
US9657290B2 (en) 2012-07-03 2017-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scalable bio-element analysis
EP2695655A1 (de) 2012-08-09 2014-02-12 F. Hoffmann-La Roche AG Mehrteilige Vorrichtung zur Gewinnung von Plasma aus Vollblut
US9746457B2 (en) 2012-11-30 2017-08-29 Vestion, Inc. Cardiac stem cells and methods of identifying and using the same
KR102164270B1 (ko) 2013-03-25 2020-10-12 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코 세포의 선별 방법
US9612245B2 (en) 2013-07-03 2017-04-04 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Multiple-pulse pumping for enhanced fluorescence detection and molecular imaging in cells and tissue
CN103389287B (zh) * 2013-07-17 2015-08-12 福建师范大学 一种适用于活体肝表面成像的高分辨光学系统
US10577638B2 (en) * 2013-09-23 2020-03-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems, devices, and methods for microbial detection and identification, and antimicrobial susceptibility testing
WO2015069742A1 (en) 2013-11-05 2015-05-14 The Johns Hopkins University Tissue array for cell spheroids and methods of use
US20170052106A1 (en) * 2014-04-28 2017-02-23 The Broad Institute, Inc. Method for label-free image cytometry
EP2975874A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-20 Deutsche Telekom AG Method for preventing fraud or misuse based on a risk scoring approach when using a service of a service provider, system for preventing fraud or misuse, and mobile communication network for preventing fraud or misuse
EP3188840A1 (en) 2014-09-07 2017-07-12 Selexis S.A. Microfluidic methods and cartridges for cell separation
MX383271B (es) 2014-09-17 2025-03-13 Univ Johns Hopkins Reactivos y metodos para identificar, enriquecer y/o expandir celulas t especificas de antigeno.
US10040067B2 (en) * 2014-11-10 2018-08-07 Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie—Hans-Knöll-Institut Device and method for extracting individual picoliter droplets from microfluidic emulsions for further analysis and scale-up
EP3245002A4 (en) * 2015-01-14 2018-08-01 Pixcell Medical Technologies Ltd. Disposable cartridge for sample fluid analysis
US20160243168A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Cantex Pharmaceuticals, Inc. Adoptive cell transfer methods
US10526600B2 (en) 2015-02-22 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Micro-screening apparatus, process, and products
GB2556436B (en) * 2015-03-06 2022-01-26 Micromass Ltd Cell population analysis
WO2016182034A1 (ja) * 2015-05-12 2016-11-17 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム
WO2018053485A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Micro-screening and sorting apparatus, process, and products
CN110736695A (zh) * 2016-09-30 2020-01-31 多伦多大学管理委员会 用于鉴定和靶向异质群体中的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统
ES2989473T3 (es) 2016-11-14 2024-11-26 Orca Biosystems Inc Aparatos para clasificar partículas objetivo
US20200362334A1 (en) * 2017-12-07 2020-11-19 The Broad Institute, Inc. High-throughput methods for identifying gene interactions and networks

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018089953A1 (en) 2018-05-17
US20210016277A1 (en) 2021-01-21
JP2022137016A (ja) 2022-09-21
US20180353960A1 (en) 2018-12-13
US12226770B2 (en) 2025-02-18
US20240075471A1 (en) 2024-03-07
US20250235862A1 (en) 2025-07-24
US10722885B2 (en) 2020-07-28
EP3538277A1 (en) 2019-09-18
EP3538277A4 (en) 2020-05-27
JP2020514732A (ja) 2020-05-21
US11471885B2 (en) 2022-10-18
CN110198786A (zh) 2019-09-03
US10350595B2 (en) 2019-07-16
EP4434632A1 (en) 2024-09-25
US11759779B2 (en) 2023-09-19
JP7503596B2 (ja) 2024-06-20
EP3538277B1 (en) 2024-05-29
JP7086092B2 (ja) 2022-06-17
US20230173486A1 (en) 2023-06-08
US20200061612A1 (en) 2020-02-27
CN115254210A (zh) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2989473T3 (es) Aparatos para clasificar partículas objetivo
Norregaard et al. Manipulation and motion of organelles and single molecules in living cells
Abdelfattah et al. Neurophotonic tools for microscopic measurements and manipulation: status report
JP2021104056A (ja) 生物学的実体におけるコンホメーションのハイスループット分析のためのシステムおよび方法
JP2024509592A (ja) 生物学的物質を分析するシステム及び方法
Zhou et al. Digital lasing biochip for tumor-derived exosome analysis
Shin et al. Near infrared-triggered liposome cages for rapid, localized small molecule delivery
Niora et al. Biosensing with NV-centers in optically trapped nanodiamonds
US20210361584A1 (en) Optically-induced auto-encapsulation
Rabiee et al. Advancing Multicolor Super-Resolution Volume Imaging: Illuminating Complex Cellular Dynamics
Liu et al. Timing and Operating Mode Design for Time‐Gated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Wang et al. Optical micromanipulation of active cells with minimal perturbations: direct and indirect pushing
Palikaras et al. Multiphoton fluorescence light microscopy
DeWitt et al. Tunable collagen microfluidic platform to study nanoparticle transport in the tumor microenvironment
WO2024256656A1 (en) Method for identifying and separating a specific component of interest from a plurality of components, and device
Woitas Development of fluidic devices for use in Transient Absorption Microscopy towards the study of Amphotericin B
Wang Key Components for Automated Laser Surgery on Neurites of Caenorhabditis elegans
Ibeneche Cell freezing in response to advanced glucose starvation: a novel cytoplasmic state in fission yeast
TW202440035A (zh) 分析物偵測之系統及方法
Ishii et al. An Optically Controlled 3D Cell Culturing System
Peters Fluorescence Photobleaching and Photoactivation Techniques
Singh Optical Methods For Deep-Tissue Imaging, Precise Mapping Of Cellular Topography And Single-Molecule Stoichiometry Analysis
Bockenhauer Sensing Conformational Dynamics of Single Trapped Proteins in Solution
Cabriel et al. A038-Event-based Single-Molecule Localization Microscopy for fast and dense high resolution imaging
Casey et al. Laser-based techniques for non-destructive surgery on individual cells