JP4509166B2 - 微小粒子の測定方法、及び測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、微小粒子測定方法、及び微小粒子測定用基板、並びに微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、微小粒子が導入される試料用流路に対する光の出射タイミングを制御可能な微小粒子測定方法等に関する。

従来、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などの微小粒子を判別するため、微小粒子の分散液を流路内に導入し、流路内へ導入された微小粒子を光学的に測定する装置が用いられている。

一例として、合成粒子を大きさや形状に応じて判別するパーティクルアナライザーがある。パーティクルアナライザーは、Heプラズマ中で微小粒子を１個ずつ励起、発光させて分光検出することにより、微小粒子の元素組成や粒径、粒子数の測定を行うものである。

また、生体関連微小粒子については、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学測定が広く行われている。フローサイトメトリーは、測定対象とする細胞やマイクロビーズ等の微小粒子を、フローセルにおいてシース液の層流の中心に流し、光学検出部において光を微小粒子に照射して、微小粒子から生じる散乱光や蛍光を検出することにより、微小粒子の大きさや構造等を測定するものである。

近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、ガラスやプラスチック製の基板上に設けられた流路内において、このような微小粒子の光学測定を行うためのマイクロチップが開発されてきている。

このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（micro-total-analysis system）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、微小粒子の光学測定の高速化、集積化、あるいは測定装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことなどの理由から、特に、貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。

特許文献１には、流路内において微小粒子の光学測定と分類を行うためのマイクロチップ（当該文献、図１７、粒子分類システム１７００参照）が開示されている。この粒子分類システム１７００は、平行に動作する複数の分類モジュール１７０１（試料用流路）を備え、入力領域１７１０から各分類モジュール１７０１に試料を導入して、粒子の所定の特性を検出領域１７２０において同時並行的に測定するものである。これにより、粒子の高速な測定及び分類を可能としている。

特表２００５−５３８７２７号公報

特許文献１に開示されるマイクロチップのように、基板上に複数の試料用流路を設け、同時並行的に微小粒子の光学測定を行う場合には、測定のための光を各試料用流路に対し走査して照射することが有効と考えられる。

各試料用流路に対して別個独立に光を照射して測定を行う場合には、それぞれの試料用流路について、光源と、光源からの光を試料用流路に導光する光学系が必要となる。これに対して、複数の試料用流路に対して光を走査して照射することで、単一の光源及び光学系によって測定を行うことができるため、装置の構成を簡易にでき、装置の製造コストを抑えることが可能となるためである。

本発明は、このように基板上に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う際に、高い測定精度を得ることが可能な測定方法、及び測定用基板、並びに測定装置を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本発明は、基板上に所定間隔に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う微小粒子測定方法において、前記試料用流路同士間と同一の所定間隔をもって、前記試料用流路に併設された少なくとも二以上の参照領域に対し、前記光を順次照射し、該参照領域によって前記光に生じる光学特性の変化を検知することにより、前記試料用流路に対する前記光の出射タイミングを制御することを特徴とする微小粒子測定方法を提供する。
この微小粒子測定方法において、前記試料用流路に対する前記光の出射タイミングは、一の前記参照用領域による前記光学特性の変化の検知時間と、他の前記参照領域による該検知時間と、の時間差と、前記試料用流路の数と、に基づいて、制御を行うものである。
本微小粒子測定方法において、前記参照領域は、参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質を導入可能な参照用流路とすることができ、これにより該参照用微粒子又は／及び参照用蛍光物質によって誘起される前記光学特性の変化の検知によって、記試料用流路に対する前記光の出射タイミングを制御することができる。

また、本発明は、併せて、基板上に所定間隔に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う微小粒子測定装置であって、前記試料用流路同士間と同一の所定間隔をもって、前記試料用流路に併設された少なくとも二以上の参照領域に対し、前記光を順次照射する光照射部と、該参照領域によって前記光に生じる光学特性の変化を検知する光検出部と、該光検出部からの出力に基づいて、前記試料用流路に対する前記光の出射タイミングを制御する光制御部と、を備えることを特徴とする微小粒子測定装置をも提供する。

ここで、本発明おいて、「微小粒子」とは、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などの微小粒子が広く含まれる。対象とする細胞には、細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。生体高分子物質には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。

また、「参照領域」とは、微小粒子の光学測定のための光を照射されて、該光の光学特性に変化を生じさせえるような領域をいうものとする。ここでいう「光学特性の変化」とは、光の散乱や回折、偏向、吸光などによる波長変化や偏向変化、強度変化等を含み、より広義には、照射された光を吸収して異なる波長の蛍光を発する変化をも含むものとする。同様に、「参照用微小粒子」及び「参照用蛍光物質」とは、このような光の光学特性の変化を生じさせるような物質が広く包含されるものとする。

本発明により、基板上に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う際に、高い測定精度を得ることが可能な測定方法、及び測定用基板、並びに測定装置が提供される。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

図１は、本発明に係る微小粒子測定装置の構成を示す模式図である。

図中、符号１で示す微小粒子測定装置は、微小粒子（試料）を導入可能な試料用流路１１１が配設された微小粒子測定用基板１１（以下、単に「基板１１」という）と、微小粒子の光学測定のためのレーザー光L₁（図中、黒矢印参照）を放射するレーザー光源１２と、レーザー光L₁を基板１１上の各試料用流路１１１に対し走査する走査部１３と、レーザー光L₁を試料用流路１１１の所定位置に集光するための対物レンズ１4と、レーザー光源１２からのレーザー光L_１を平行光線にするためのコリメータレンズ１５と、を備えている。

レーザー光源１２、走査部１３、対物レンズ１４、コリメータレンズ１５を含む光検出部は、さらに、試料用流路１１１に対する測定光L_１の照射により、試料用流路１１１内に導入された微小粒子から発生する検出対象光L_２（図中、斜線矢印参照）を検出するための検出器１６を有している。

レーザー光L₁（以下、「測定光L_１」という）は、測定対象とする微小粒子及び測定目的に応じ、種々の波長を選択して用いればよく、レーザー光源１２も、アルゴンやヘリウム等のガスレーザーや半導体レーザー（LD）、発光ダイオード（LED）等公知の光源を適宜選択して使用することができる。

例えば、微小粒子の元素組成を測定する目的では、各元素の吸収波長に対応した波長の測定光L_１が選択される。また、複数の蛍光色素で標識した微小粒子の蛍光を測定する場合には、各蛍光色素の励起波長に応じた波長の測定光L_１が使用される。

走査部１３は、レーザー光源１２から発せられる測定光L_１の光路上にポリゴンミラーやガルバノミラー、音響光学素子、電気光学素子等として配置され、測定光L_１を一定周期で試料用流路１１１に対し走査する。例えば、ダイクロイックミラーでは1kHz程度、２４面体ポリゴンミラーでは20kHz程度での走査が可能である。測定光L_１の照射は、測定光L_１が試料用流路１１１に対して垂直に照射され、各試料用流路１１１上の結像面において測定光L_１のスポット幅が一定となるようなテレセントリック光学系により行うことが望ましい。

検出器１６は、微小粒子から発生する検出対象光L_２を検出、増幅して電気信号へと変換し、図示しない解析部へ出力する。解析部は、入力される電気信号に基づいて、微小粒子の光学特性を解析し、測定結果を出力する。図１では、検出器１６としてマルチチャンネルフォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）を用い、検出対象光L_２を分光器１７によりグレーティングし、波長ごとに検出する場合を示した。

微小粒子の光学特性解析のためのパラメーターは、測定対象とする微小粒子及び測定目的に応じ、微小粒子の大きさを測定する前方散乱光や、構造を測定する側方散乱光、蛍光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光などであってよい。また蛍光は、コヒーレントな蛍光であっても、インコヒーレントな蛍光であってもよい。

さらに、微小粒子測定装置１には、上記特許文献１に開示されるような、測定結果に基づく微小粒子の分類（分取）を行うための構成を設けることもできる。ここでは詳細な説明を省略するが、分取を行う場合には、試料用流路１１１を送流される微小粒子から所望の光学特性を備える微小粒子を分別、回収するため、試料用流路１１１に連通させて分取用流路を配設する。そして、試料用流路１１１と分取用流路との接続部において微小粒子の送流方向の制御を行うための駆動性部材（アクチュエーター）を基板１１上に配し、これを上記解析部からの分取信号に基づき制御することにより分取を行う。

本発明に係る微小粒子測定装置１は、以上の構成に加えて、試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射タイミングを制御する光制御部１８を備えている。光制御部１８は、検出器１６から出力される電気信号に基づいて、レーザー光源１２を制御して、各試料用流路１１１に対し走査、照射される測定光L_１の出射タイミングの制御を行う。なお、ここでは、解析部と光制御部１８は別体であるものとして説明したが、一体に構成することも当然に可能である。

図２は、本発明に係る基板１１の構成を示す模式図（上面図）である。

符号１１で示す基板には、微小粒子が導入される試料用流路１１１が所定間隔で配設されている。図１及び図２では、基板１１上に試料用流路１１１を計１２本配設した場合を例示したが、配設される試料用流路１１１の本数は二以上の任意数であってよい。

基板１１は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳ）であって測定光L_１を透過可能であり、測定光L_１に対して波長分散が少なく光学誤差の少ない材質を用いて形成される。

基板１１の材質をガラスとする場合には、ウェットエッチングやドライエッチングによって流路（試料用流路１１１及び後述する参照用流路１１２）を転写する。また、プラスチック製とする場合には、ナノインプリントや成型によって流路を形成する。これによって、誤差５μｍ以内の精度で、均一な幅の流路を、所定間隔で形成することができる。

測定対象となる微小粒子を含む分散溶媒は、試料用流路１１１の一端に設けられた試料注入口１１１１から、各試料用流路１１１内に導入される。

この際、微小粒子は、図示しないフロー系によって各試料用流路１１１内に一つずつ配列させることが可能である。フロー系は、微小粒子を含む分散溶媒を層流として送出するノズルと、溶媒のみを層流として送出するノズルからなり、これら２つのノズルによって溶媒層流（シース流）の中央に分散溶媒の層流を作り出す。そして、例えば、微小粒子の分散溶媒を送出する際にノズルにわずかな圧力差を加えることにより、微小粒子を層流中に一つずつ配列させる。これにより、試料用流路１１１内の中央に一つずつ配列させた微小粒子に、測定光L_１を照射し、光学測定を行うことができる。

試料用流路１１１内に導入された微小粒子は、図中矢印Ｆ方向に試料用流路１１１内を送流され、検出領域Ｄ（図中点線参照）において、測定光L_１を照射される。照射後、微小粒子は、さらに矢印Ｆ方向に送流され、試料用流路１１１の他端に設けられた試料排出口１１１２から基板１１外へ排出される。

測定光L_１の照射は、走査部１３により各試料用流路１１１対し、レーザー光源１２から放射される測定光L_１を走査することによって行われる（図１参照）。図２中、点線矢印Ｓは、測定光L_１の走査線を現している。測定光L_１は、図２中基板１１下方から上方へ走査されるものとして説明する。なお、走査は、走査線Ｓ上を一方向に行われる必要はなく、双方向（往復）に行うことも可能である。

基板１１には、測定光L_１の走査において、各試料用流路１１１に対し適切なタイミングで測定光L_１を出射することを可能にするため、試料用流路１１１の外側に、参照用流路１１２，１１２を配している。

参照用流路１１２，１１２は、測定光L_１の走査方向Ｓにおいて、試料用流路１１１の両端に設けられており、それぞれ隣り合う試料用流路１１１に対し、試料用流路１１１同士間と同一の所定間隔をもって配置されている。

参照用流路１１２，１１２には、参照用微小粒子及び／又は参照用蛍光物質が導入される。参照用微小粒子及び参照用蛍光物質は、測定光L_１を照射されることにより、測定光L_１の光学特性に変化を生じさせ得るものであれば特に限定されず、通常使用されるマイクロビーズや蛍光色素を用いることができる。なお、ここで「光学特性の変化」とは、測定光L_１の散乱や回折、偏向、吸光などによる波長変化や偏向変化、強度変化等を含み、より広義には、照射された光を吸収して異なる波長の蛍光を発する変化をも含むものとする。

例えば、参照用微小粒子としてマイクロビーズを参照用流路１１２内に導入した場合、マイクロビーズによる散乱により測定光L_１の光学特性に変化が生じる。また、使用する測定光L_１の波長を励起波長とする蛍光物質を参照用蛍光物質として参照用流路１１２内に導入すれば、測定光L_１の照射よって異なる波長（発光波長）を有する蛍光が発生する。

参照用微小粒子を含む分散溶媒又は／及び参照用蛍光物質を含む溶液は、参照用流路１１２の一端に設けられた参照物質注入口１１２１から、参照用流路１１２内に導入する。導入は、送液される溶媒又は溶液を他端に設けた参照物質排出口（図示せず）から基板１１外へ排出することで、測定の間継続して行うことができる。また、図２に示すように、参照用流路１１２の他端を閉塞し、一回的に溶媒又は溶液を注入、充填してもよい。

また、参照用微小粒子及び参照用蛍光物質は、予め参照用流路１１２内に導入しておいてもよく、例えば、参照物質注入口１１２１を設けず、基板１１の製造当初に参照用微小粒子及び参照用蛍光物質を参照用流路１１２内に充填しておくこともできる。また、参照用微小粒子及び参照用蛍光物質は、単一物質であっても複数の物質を組み合わせて用いてもよく、参照用微小粒子と参照用蛍光物質の両方を参照用流路１１２内に導入してもよい。

参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質によるこのような測定光L_１の光学特性の変化は、試料導入流路１１１内の微小粒子から発生する検出対象光L_２と同様の検出系により検知することができる。

具体的には、測定光L_１の参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質に対する照射により発生した光を、対物レンズ１４により集光し、走査部１３及び分光器１７を経て、検出器１６により検出し、電気信号へと変換する（図１参照）。

そして、光制御部１８は、この電気信号の出力を受け、測定光L_１の光学特性の変化を検知し、レーザー光源１２を制御して、試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射タイミングの制御を行う。

光学特性の変化を検知するためのパラメーターは、使用する参照用微小粒子及び参照用蛍光物質に応じ、波長や偏向角、強度等とする。例えば、参照用微小粒子としてマイクロビーズを用いる上記の例では、マイクロビーズによる散乱を検知する。また、参照用蛍光物質を用いる場合には、発光波長に対応する蛍光の検知を行う。

以下、光制御部１８による測定光L_１の出射タイミングの制御について具体的に説明する。

図３は、基板１１の検出領域Ｄを拡大して示す模式図（上面図）である。

図中、符号L_１は、測定光L_１の試料用流路１１１（反応領域Ｄ）上の結像面におけるレーザースポットを表している。測定光L_１は、図中下方から上方へ向かって走査線Ｓ上を走査され、参照用流路１１２、各試料用流路１１１、及び、参照用流路１１２に対して照射される。

試料用流路１１１及び参照用流路１１２，１１２は、図中符号ｌで示す所定間隔で配設されている。

参照用流路１１２，１１２には、参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質が導入されており、参照用流路１１２，１１２対し測定光L_１が照射されると、参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質によって測定光L_１に光学特性の変化が生じる。

光制御部１８は、検出器１６からの電気信号からこの光学特性の変化を検知して、測定光L_１が参照用流路１１２，１１２間を走査されるのに要する時間Ｔを算出する。

具体的には、一の参照用流路１１２による光学特性の変化が検知された時間を時間０として、他方の参照用流路１１２による光学特性変化が検知されるまでの時間Ｔを得る。図３では、図中下方の参照用流路による光学特性変化の検知時間が時間０、上方の参照用流路による同変化の検知時間が時間Ｔとなる。

そして、光制御部１８は、得られた時間Ｔから以下の式（１）に基づいて測定光L_１の出射タイミングを算出する。

ここで、「ｍ」は試料用流路１１１の本数、「tk」はk番目に測定光L_１を照射される試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射時間を表す。なお、試料用流路１１１の本数ｍは、使用する基板１１に応じて予め測定装置１の光制御部１８に対し設定、記憶されるものである。

具体的には、図３（試料用流路１１１の本数ｍ＝１２）では、図中下方の試料用流路１１１から順に時間Ｔ／１３，２Ｔ／１３，３Ｔ／１３，４Ｔ／１３，５Ｔ／１３，６Ｔ／１３，７Ｔ／１３，８Ｔ／１３，９Ｔ／１３，１０Ｔ／１３，１１Ｔ／１３，１２Ｔ／１３において、測定光L_１が出射される。各時間における測定光L_１の出射時間は極めて短時間であり、例えば約1μ秒程度である。

上記の通り、試料用流路１１１及び参照用流路１１２，１１２は、所定間隔ｌで等間隔に配設されているため、算出される各時間は、測定光L_１のレーザースポットの中心が、各試料用流路１１１の幅方向中央に一致する時間とみなすことができる。

従って、このタイミングで測定光L_１を出射させることで、レーザースポットがランド（基板の流路間領域）に位置する場合や、レーザースポットの中心が試料用流路１１１の中央から外れている場合に、不要な測定光L_１の照射を行うことなく、適切なタイミングで測定光L_１を各試料用流路１１１に照射することが可能となる。

このように本発明に係る微小粒子測定装置１では、基板上に配設された参照流路による測定光L_１の光学特性の変化を検知して、各試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射タイミングの制御を行うことが可能であるため、微小粒子測定装置１への基板１１の取り付け位置にずれが生じている場合にも、適切なタイミングで測定光L_１を各試料用流路１１１に照射し、高い測定精度を得ることが可能である。

図４に、測定光L_１の走査線Ｓに対し、試料用流路１１１及び参照用流路１１２が直交せず、斜めの状態で取り付けられた基板１１を示す。図は、検出領域Ｄの拡大模式図である。

上述の通り、基板上の流路は、エッチングやナノインプリント等によって誤差５μｍ以内の精度で、均一な間隔で形成することができる。このため、基板そのものの大きさや、流路の幅や本数などを同一の設計とした基板を使用する限り、基板上の試料用流路に対する測定光の照射タイミングは一義的に決定することができる。しかし、この場合には、図４に示すように、基板の取り付け位置にずれが生じると、試料用流路に対し適切なタイミングで測定光を照射することができず、正確な測定結果を得られないおそれが生じる。

これに対して、本発明に係る微小粒子測定装置１では、図４に示すように走査線Ｓに対し試料用流路１１１及び参照用流路１１２が斜めに取り付けられたり、上下方向にずれて取り付けられた場合であっても、測定光L_１出射のタイミングを測定光L_１が参照用流路１１２，１１２間を走査されるのに要する時間Ｔに基づいて算出することによって、適切なタイミングで測定光L_１を照射することが可能となる。

さらに、本発明に係る微小粒子測定装置１では、レーザースポットがランドに位置する場合や、レーザースポットの中心が試料用流路１１１の中央から外れている場合に、不要な測定光L_１の照射を行うことがないため、試料用流路１１１対して複数の測定光を照射して測定を行う場合に、光の干渉（クロストーク）を抑え、高い測定感度を得ることができる。

図５に、試料用流路１１１対して複数の測定光を照射して測定を行う場合の検出領域Ｄの拡大模式図を示す。図中、符号Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３は、各測定光の試料用流路１１１（反応領域Ｄ）上の結像面におけるレーザースポットを表している。

例えば、複数の蛍光色素で標識された微小粒子の蛍光特性を測定する場合、各蛍光色素の励起波長に対応する波長を放射する複数のレーザー光源を用いて、複数の測定光を微小粒子に照射する。図５では、３つの測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３を用いる場合を示したが、測定光の数は必要に応じ任意に設定できる。測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３は、例えば、それぞれ波長405nm，473nm，658nmとすることができる。

測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３は、それぞれ走査線Ｓ_１，Ｓ_２，Ｓ_３を走査されて、各試料用流路１１１に対し照射される。測定光Ｌ_１−２及び測定光Ｌ_１−３は、それぞれのレーザー光源からの光を、図１で示した走査部１３により、測定光Ｌ_１と一体に走査してもよく、また、測定光Ｌ_１−２及び測定光Ｌ_１−３に個別に走査部を設けて走査してもよい。装置の構成を簡略とするためには、同一の走査部により、測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３を一体に走査することが好ましい。

このように、測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３の３つの測定光を走査して測定を行う場合、各測定光の照射によって異なる試料用流路１１１から同時に検出対象光が発生すると、検出対象光間のクロストークによってノイズが生じ、測定感度が低下してしまうおそれがある。

例えば、測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３が、図５に示す位置を走査される場合において、その全てが出射されていると、各測定光が照射される試料用流路１１１内の微小粒子からそれぞれ検出対象光Ｌ_２，Ｌ_２−２，Ｌ_２−３が発生することとなり、測定対象光間のクロストークが生じることとなる。

クロストークを回避するためには、各試料用流路１１１から発生する検出対象光を個別の検出器により検出する必要があるが、この場合には、装置の構成が複雑となるため、製造コスト上の問題が生じる。

従って、測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３は、微小粒子から検出対象光を発生させることができ、発生させた検出対象光を検出できる限りにおいて、各測定光の出射時間を短くすることで、異なる試料用流路１１１から同時に測定対象光が発生するのを回避することが望ましい。

本発明に係る微小粒子測定装置１では、測定光のレーザースポットの中心が、各試料用流路１１１の幅方向中央に一致するタイミングで測定光の出射を行うものである。例えば、図５では、試料用流路１１１の幅方向中央にレーザースポットの中心が位置する測定光Ｌ_１のみが出射され、レーザースポットの中心が試料用流路１１１の中央から外れている測定光Ｌ_１−２，Ｌ_１−３は出射されない。

これにより、微小粒子測定装置１では、異なる試料用流路１１１から同時に測定対象光が発生するのを回避し、測定対象光間のクロストークの発生を抑えることができ、高い測定感度を得ることが可能となる。

なお、異なる波長の測定光Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３を、個別に設けた走査部により走査する場合には、波長ごとに異なる光学特性の変化を誘起し得る参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質を参照用流路１１２，１１２に導入して、光制御部１８において各測定光の特性変化を個別に検知し、それぞれの出射タイミングの制御を行うことが必要となる。

図６は、他の実施形態に係る基板１１の検出領域Ｄを拡大して示す模式図（上面図）である。

図６中、符号L_１は、測定光L_１の試料用流路１１１（反応領域Ｄ）上の結像面におけるレーザースポットを表している。図３と同様に、試料用流路１１１及び参照用流路１１２，１１２は、図中符号ｌで示す所定間隔で配設されている。

ただし、本図では、参照用流路１１２，１１２が、測定光L_１の走査方向Ｓにおいて、試料用流路１１１の一方側に、それぞれが隣り合うように配置されている。

この場合、光制御部１８は、得られた時間Ｔから以下の式（２）に基づいて測定光L_１の出射タイミングを算出することとなる。

ここで、「ｍ」は試料用流路１１１の本数、「tk」はk番目に測定光L_１を照射される試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射時間を表す。

時間Ｔは、先に説明したように、光制御部１８が、検出器１６からの電気信号から参照用流路１１２，１１２による光学特性の変化を検知して算出するものであり、一の参照用流路１１２による光学特性の変化が検知された時間を時間０とした場合、他方の参照用流路１１２による光学特性変化が検知されるまでの時間を表す。すなわち、時間Ｔは、測定光L_１が参照用流路１１２，１１２間を走査されるのに要する時間に対応する。

図６（試料用流路１１１の本数ｍ＝１２）においては、各試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射時間は、具体的には、図中下方の試料用流路１１１から順に時間２Ｔ／１３，３Ｔ／１３，４Ｔ／１３，５Ｔ／１３，６Ｔ／１３，７Ｔ／１３，８Ｔ／１３，９Ｔ／１３，１０Ｔ／１３，１１Ｔ／１３，１２Ｔ／１３，１３Ｔ／１３となる。

このように、参照用流路１１２，１１２の配設位置は、測定光L_１の走査方向Ｓに従って所定間隔ｌで配設されていることを条件に任意に設定することができる。この場合、参照用流路１１２，１１２の配設位置に応じて、出射タイミングの算出式（上記式（１）及び（２））を適宜修正することで、測定光L_１のレーザースポットの中心が、各試料用流路１１１の幅方向中央に一致するタイミングで測定光L_１を出射させることが可能である。

また、参照用流路１１２，１１２は、常に２本である必要はなく、３以上とすることも可能である。この場合にも、出射タイミングの算出式（上記式（１）及び（２））は、参照用流路１１２，１１２の配設位置及び数に応じて適宜修正すればよい。

図７は、他の実施形態に係る基板１１の構成を示す模式図（上面図）である。図８には、この基板１１の検出領域Ｄの拡大模式図（上面図）を示す。

符号１１で示す基板には、図２と同様に、試料用流路１１１が所定間隔ｌ（図８参照）で配設されている。試料用流路１１１内への微小粒子の導入方法、測定光L_１の走査方向Ｓ等についても図２で説明した通りである。

ただし、図７では、測定光L_１の走査において、各試料用流路１１１に対し適切なタイミングで測定光L_１を出射するための構成として、参照用流路１１２，１１２に替えて、参照領域１１３，１１３を試料用流路１１１の外側に配している。

参照領域１１３，１１３は、測定光L_１の走査方向Ｓにおいて、試料用流路１１１の両端に設けられており、それぞれ隣り合う試料用流路１１１に対し、試料用流路１１１同士間と同一の所定間隔ｌ（図８参照）をもって配置されている。

参照領域１１３，１１３も、参照用流路１１２，１１２と同様に、測定光L_１を照射されることにより、測定光L_１に対し散乱や回折、偏向、吸光などによる波長変化や偏向変化、強度変化、さらには、照射された光を吸収して異なる波長の蛍光を発する変化などを生じさせ得る領域である。

このような測定光L_１の光学特性の変化を誘起し得る領域は、測定光L_１を散乱、回折、偏向、吸光し得る物質を基板１１表面に固定化することにより形成できる。例えば、スパッタや蒸着により金属膜や誘電体膜を成膜する方法や、蛍光物質や色素を固着させる方法により形成する。

また、基板１１表面の微細構造によって領域を形成することもできる。微細構造は、基板表面の微細溝やピット埋め込みにより形成する。この場合、測定光に対し、その波長に応じた異なる反射角や透過回折角度を与え得るため、特に図５で説明したように、波長の異なる複数の測定光を、個別に設けた走査部により走査して測定を行う場合、各測定光の特性変化を個別に検知することができ、有用となる。

金属膜や誘電体膜、及び、微細構造は、パターニング化して形成させてもよい。これにより、チップが汚くても複数のパターンを持つことから複数の信号パターンが得られ、光ディスクなどに用いられているエラー訂正が可能だったり、より正確な位置を特定できるアドレスの代わりにできる。

参照用領域１１３の配設位置及び数は、測定光L_１の走査方向Ｓに従って所定間隔ｌで配設されていることを条件に、任意に設定することができる点は、参照用流路１１２で説明したのと同様である。この場合、出射タイミングの算出式（上記式（１）及び（２））を、配設位置及び数に応じて適宜修正することで、適切なタイミングで測定光L_１を出射させることが可能である。

次に、光制御部１８による測定光L_１の出射タイミングの制御手順を、図９に示すフローチャートに基づき、図３の例を参照しながら説明する。

まず、測定開始後、１回目の走査では、測定光L_１の照射タイミングを得ることを目的として、測定光L_１の走査が行われる（「ステップ１a」）。この際、測定光L_１の照射により微小粒子から発生する検出対象光L_２の検出は行われないことが望ましい。

この１回目の走査（「ステップ１a」）において、光制御部１８は、継続的に測定光L_１を出射させる。これにより、測定光L_１は、図３中下方から上方に、参照用流路１１２、各試料用流路１１１、参照用流路１１２の順で順次照射される。

光制御部１８は、この参照用流路１１２，１１２に対する測定光L_１の照射によって生じる測定光L_１の光学特性の変化を検知し、測定光L_１が参照用流路１１２，１１２間を走査されるのに要した時間Ｔ_１を得る。図３では、下方の参照用流路１１２による光学特性の変化が検知された時間を時間０として、上方の参照用流路１１２による同変化が検知された時間が時間Ｔ_１となる。

次に「ステップ１ｂ」において、光制御部１８は、得られた時間Ｔ_１から以下の式（１）に基づき測定光L_１の出射タイミングを算出する。

ここで、「ｍ」は試料用流路１１１の本数、「tk」はk番目に測定光L_１を照射される試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射時間を表す。

そして、２回目の走査において、光制御部１８は、図３中下方の参照用流路１１２による光学特性変化を検知した時間を新たに時間０として、得られた各時間において測定光L_１を出射させる（「ステップ２a」）。

図３（試料用流路１１１の本数ｍ＝１２）では、下方の試料用流路１１１から順に、時間Ｔ_１／１３，２Ｔ_１／１３，３Ｔ_１／１３，４Ｔ_１／１３，５Ｔ_１／１３，６Ｔ_１／１３，７Ｔ_１／１３，８Ｔ_１／１３，９Ｔ_１／１３，１０Ｔ_１／１３，１１Ｔ_１／１３，１２Ｔ_１／１３において、測定光L_１を出射させる。これにより、各試料用流路１１１内の微小粒子の測定が行われる。

２回目の走査において時間０を得るため、光制御部１８は、１回目の走査の終了後、２回目の走査を開始時には、測定光L_１の出射を維持したままとする。そして、測定光L_１が下方の参照用流路１１２に照射され、光学特性の変化が検知され、時間０が得られた後、光制御部１８は、上記の各時間においてのみ測定光L_１を出射させて２回目の走査を行う。

さらに、光制御部１８は、２回目の走査において、測定光L_１が参照用流路１１２，１１２間を走査されるのに要した時間Ｔ_２を得る（「ステップ２a」）。

このため、光制御部１８は、時間１２Ｔ_１／１３に最後の試料用流路１１１に対し測定光L_１を出射させた後は、測定光L_１の出射を維持したままとする。これにより、光制御部１８は、測定光L_１が上方の参照用流路１１２に照射されて生じる光学特性の変化を検知し、時間Ｔ_２を得る。

以後同様にして、光制御部１８は、（Ｎ−１）回目の走査（「ステップ（Ｎ−１）a」）で得られた時間Ｔ_Ｎ−１に基づき、Ｎ回目の走査のための測定光L_１の出射タイミングを算出し（「ステップ（Ｎ−１）ｂ」）、算出された出射タイミングに従ってＮ回目の走査を行う（「ステップＮa」）。

このように微小粒子測定装置１では、走査回ごとに測定光L_１の出射タイミングの制御を行うことにより、常に測定光L_１のレーザースポットの中心が、各試料用流路１１１の幅方向中央に一致するタイミングにおいて測定光L_１を出射させ、走査を行うことが可能とされている。

これは、特に、測定光L_１の走査周期にずれが生じた場合に有効となる。図１において説明した通り、測定光L_１はレーザー光源１２から発せられる測定光L_１の光路上にダイクロイックミラーやポリゴンミラー、ガルバノミラー、音響光学素子、電気光学素子等として配置された走査部１３によって試料用流路１１１に対し走査される。ダイクロイックミラーでは1kHz程度、２４面体ポリゴンミラーでは20kHz程度での走査が可能であり、これらの走査周期は高い精度で制御され得るものであるが、駆動装置の不安定さに起因して、完全な一定周期を維持することは技術的に困難である。

このため、予め固定値として設定された出射タイミングにより各試料用流路１１１に対し測定光L_１を照射する場合には、測定中に走査部１３の走査周期にずれが生じると、測定光L_１のレーザースポットがランド（基板の流路間領域）や、試料用流路１１１の中央から外れた位置にあるような不適切なタイミングで測定光L_１の出射が行われ、正確な測定結果を得られないおそれが生じる。

これに対して、本発明にかかる微小粒子測定装置１では、光制御部１８が、（Ｎ−１）回目の走査で得た時間Ｔ_Ｎ−１に基づいて、Ｎ回目の走査における各試料用流路１１１に対する測定光L_１の出射タイミングを制御するため、測定中に走査部１３の走査周期にずれが生じた場合にも、常に測定光L_１のレーザースポットの中心を、各試料用流路１１１の幅方向中央に一致させて出射させることができるため、正確な測定結果を得ることが可能である。

以上、図３に示した基板１１を例に、光制御部１８による測定光L_１の出射タイミングの制御手順を説明したが、図６に示した他の形態に係る基板１１においても、同様の制御を行うことが可能である。

本発明に係る微小粒子測定方法は、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などの光学測定のために用いることが可能である。

本発明に係る微小粒子測定装置の構成を示す模式図である。 本発明に係る基板１１の構成を示す模式図（上面図）である。 基板１１の検出領域Ｄの拡大模式図（上面図）である。 測定光L_１の走査線Ｓに対し、試料用流路１１１及び参照用流路１１２が直交せず、斜めの状態で取り付けられた基板１１の検出領域Ｄを拡大して示す模式図（上面図）である。 試料用流路１１１対して複数の測定光を照射して測定を行う場合の基板１１の検出領域Ｄを拡大して示す模式図（上面図）である。 他の実施形態に係る基板１１の検出領域Ｄの拡大模式図（上面図）である。 他の実施形態に係る基板１１の構成を示す模式図（上面図）である。 図７に示す基板１１の検出領域Ｄの拡大模式図（上面図）である。 光制御部１８による測定光L_１の出射タイミングの制御手順を示すフローチャートである。

符号の説明

１ 微小粒子測定装置
１１ 基板
１２ レーザー光源
１３ 走査部
１４ 対物レンズ
１５ コリメータレンズ
１６ 検出器
１７ 分光器
１８ 光制御部
１１１ 試料用流路
１１２ 参照用流路
１１３ 参照領域
Ｄ 検出領域
Ｌ_１，Ｌ_１−２，Ｌ_１−３ レーザー光（測定光）
Ｌ_２，Ｌ_２−２，Ｌ_２−３ 検出対象光
Ｓ，Ｓ_１，Ｓ_２，Ｓ_３ 走査線

Claims (4)

1. 基板上に所定間隔に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う微小粒子測定方法において、
   前記試料用流路同士間と同一の所定間隔をもって、前記試料用流路に併設された少なくとも二以上の参照領域に対し、前記光を順次照射し、
   該参照領域によって前記光に生じる光学特性の変化を検知することにより、前記試料用流路に対する前記光の出射タイミングを制御することを特徴とする微小粒子測定方法。
2. 一の前記参照用領域による前記光学特性の変化の検知時間と、
   他の一の前記参照領域による該検知時間と、の時間差と、
   前記試料用流路の数と、に基づいて、前記制御を行うことを特徴とする請求項１記載の微小粒子測定方法。
3. 前記参照領域は、参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質を導入可能な参照用流路であり、
   前記光学特性の変化は、前記参照用微小粒子又は／及び参照用蛍光物質によって誘起されるものであることを特徴とする請求項２記載の微小粒子測定方法。
4. 基板上に所定間隔に配設された複数の試料用流路に対し光を走査して、該試料用流路内に導入された微小粒子の光学測定を行う微小粒子測定装置であって、
   前記試料用流路同士間と同一の所定間隔をもって、前記試料用流路に併設された少なくとも二以上の参照領域に対し、前記光を順次照射する光照射部と、
   該参照領域によって前記光に生じる光学特性の変化を検知する光検出部と、
   該光検出部からの出力に基づいて、前記試料用流路に対する前記光の出射タイミングを制御する光制御部と、
   を備えることを特徴とする微小粒子測定装置。