JP2010008397A - 光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 - Google Patents
光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010008397A JP2010008397A JP2009001233A JP2009001233A JP2010008397A JP 2010008397 A JP2010008397 A JP 2010008397A JP 2009001233 A JP2009001233 A JP 2009001233A JP 2009001233 A JP2009001233 A JP 2009001233A JP 2010008397 A JP2010008397 A JP 2010008397A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- light
- flow path
- optical
- photodetector
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 title claims abstract description 165
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 112
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims abstract description 98
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 75
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 36
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 35
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 35
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 31
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 claims description 24
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 claims description 24
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 description 26
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 14
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 3
- 230000023077 detection of light stimulus Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 argon ion Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 description 2
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N [(1s,3r)-3-hydroxy-4-[(3e,5e,7e,9e,11z)-11-[4-[(e)-2-[(1r,3s,6s)-3-hydroxy-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-6-yl]ethenyl]-5-oxofuran-2-ylidene]-3,10-dimethylundeca-1,3,5,7,9-pentaenylidene]-3,5,5-trimethylcyclohexyl] acetate Chemical compound C[C@@]1(O)C[C@@H](OC(=O)C)CC(C)(C)C1=C=C\C(C)=C\C=C\C=C\C=C(/C)\C=C/1C=C(\C=C\[C@]23[C@@](O2)(C)C[C@@H](O)CC3(C)C)C(=O)O\1 UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N peridinin Natural products CC(=O)OC1CC(C)(C)C(=C=CC(=CC=CC=CC=C2/OC(=O)C(=C2)C=CC34OC3(C)CC(O)CC4(C)C)C)C(C)(O)C1 UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
- G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
-
- G01N15/149—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
- G01N21/03—Cuvette constructions
- G01N2021/0346—Capillary cells; Microcells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
- G01N21/03—Cuvette constructions
- G01N21/05—Flow-through cuvettes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
- G01N2201/06—Illumination; Optics
- G01N2201/062—LED's
- G01N2201/0623—Use of a reference LED
Abstract
【課題】流路を用いた光学系測定方法において、用いる装置の小型化を図り、用いる光検
出器の波長校正を容易に行うことができる新規技術を提供すること。
【解決手段】流路１１を通流する試料Ｓを光学的に測定する方法に用いる光学的測定装置
１であって、試料Ｓが通流する流路１１と、光学的調整及び／又は前記流路内の画像確認
を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる第１の光源１２
と、前記流路を通流中の試料に対して光を照射するための第２の光源１３と、前記第１の
光源および第２の光源から発せられる光のスペクトル強度を検出する光検出器１４と、を
少なくとも備えた光学的測定装置１を提供する。
【選択図】図１
出器の波長校正を容易に行うことができる新規技術を提供すること。
【解決手段】流路１１を通流する試料Ｓを光学的に測定する方法に用いる光学的測定装置
１であって、試料Ｓが通流する流路１１と、光学的調整及び／又は前記流路内の画像確認
を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる第１の光源１２
と、前記流路を通流中の試料に対して光を照射するための第２の光源１３と、前記第１の
光源および第２の光源から発せられる光のスペクトル強度を検出する光検出器１４と、を
少なくとも備えた光学的測定装置１を提供する。
【選択図】図１
Description
本発明は、流路を用いて試料を光学的に検出するための光学的測定装置に関する。より詳しくは、流路内を通流する試料を光学的に検出するための光学的測定装置、並びに、該光学的測定装置に用いる光検出器の波長校正方法および該波長校正方法を用いた光学的測定方法に関する。
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。このような流路を用いた微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。
フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に流し込み、該微小粒子の列を形成し、整列した該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析を行い、更には、解析結果に基づいて、微小粒子の分取を行う分析手法である。
このフローサイトメトリーを行う装置は、大型で汎用性が低いという問題点があるため、近年では、シリコンやガラス等の無機材料、またはプラスチック等の高分子材料からなる基板内に、微細な流路を形成したマイクロチップを用いる方法が提案されている。
例えば、特許文献１には、基板上に、少なくとも、微粒子含有溶液導入流路と、当該流路の少なくとも一方の側部に配置されたシース流形成流路と、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、該微粒子計測部位の下流に設置された微粒子を分別回収するための２以上の微粒子分別流路と、微粒子計測部位から微粒子分別流路への流路口付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための２以上の電極を有する微粒子分別マイクロチップが提案されている。
また、特許文献２には、試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、その両脇に、対称な形で配置された１対の流体のみが導入される流路と、試料分画部において観察試料を排出するときにのみ試料分画部に外力を導入する手段と、試料分画部から選択された試料のみが層流で回収される試料を含む流体が流れ出るよう前記試料を導入する流路の下流に配置された試料回収流路と、その両脇に、対称な形で配置された必要ない試料が排出される１対の流体の流路を有する細胞分析分離装置が提案されている。
ところで、流路を用いた光学的測定における光検出器の波長校正は、輝線スペクトル発光する光源を用いて、試料が通流前の流路を予め照射して、これを光検出器で測定することにより、光検出器の波長校正を行うことが一般的に行われている。
前記のように、流路を用いた光学的測定における光検出器の波長校正は、輝線スペクトル発光する光源を用いて行うことが一般的であった。
しかし、輝線スペクトル発光する光源を用いて照明する装置の場合には、大きなコンデンサーレンズや放熱対策が必要な場合もあり、装置が大型化する傾向にあった。
また、スペクトル分解能が１０ｎｍ程度またはそれ以上となる検出器を用いる場合、微小な光軸調整ではスペクトルシフトが検出できず、波長校正がかえって難しくなる場合もあった。
更に、輝線スペクトル発光する光源では、流路に対してストロボ照射を行うことが難しいといった問題があった。
そこで、本発明では、流路を用いた光学系測定方法において、用いる装置の小型化を図り、用いる光検出器の波長校正を容易に行うことができる新規技術を提供することを主目的とする。
本願発明者らは、前記の目的を解決するために、用いる光源について、鋭意研究を行った結果、スペクトル幅を持つ光を照射しうる光源に着目することにより、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明では、まず、試料が通流する流路と、
光学的調整及び／又は前記流路内の画像確認を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる第１の光源と、
前記流路を通流中の試料に対して光を照射するための第２の光源と、
前記第１の光源および第２の光源から発せられる光のスペクトル強度を検出する光検出器と、
を少なくとも備えた光学的測定装置を提供する。
本発明に係る光学的測定装置には、前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度に基づいて、前記光検出器の波長校正を行う波長校正手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記波長校正手段が行う具体的な波長校正方法は特に限定されないが、一例としては、前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより、前記光検出器の波長校正を行う方法が挙げられる。
また、本発明に係る光学的測定装置には、前記第１の光源を用いて前記流路を照射することにより前記流路を通じて発せられた光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記画像確認手段が行う具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、前記第１の光源が、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、前記画像確認手段が、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基づいて、前記試料の状態を画像により確認する方法が挙げられる。
更に、本発明に係る光学的測定装置には、前記第１の光源から発せられた光と、前記第２の光源から発せられた光と、を合成する光合成手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記光合成手段に用いる具体的な構成は特に限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターを挙げることができる。
加えて、本発明に係る光学的測定装置には、前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記光分離手段に用いる具体的な構成は特に限定されないが、一例としては、輪帯ミラーを挙げることができる。
以上説明した光学的測定装置に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
光学的調整及び／又は前記流路内の画像確認を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる第１の光源と、
前記流路を通流中の試料に対して光を照射するための第２の光源と、
前記第１の光源および第２の光源から発せられる光のスペクトル強度を検出する光検出器と、
を少なくとも備えた光学的測定装置を提供する。
本発明に係る光学的測定装置には、前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度に基づいて、前記光検出器の波長校正を行う波長校正手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記波長校正手段が行う具体的な波長校正方法は特に限定されないが、一例としては、前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより、前記光検出器の波長校正を行う方法が挙げられる。
また、本発明に係る光学的測定装置には、前記第１の光源を用いて前記流路を照射することにより前記流路を通じて発せられた光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記画像確認手段が行う具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、前記第１の光源が、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、前記画像確認手段が、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基づいて、前記試料の状態を画像により確認する方法が挙げられる。
更に、本発明に係る光学的測定装置には、前記第１の光源から発せられた光と、前記第２の光源から発せられた光と、を合成する光合成手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記光合成手段に用いる具体的な構成は特に限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターを挙げることができる。
加えて、本発明に係る光学的測定装置には、前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離手段を更に備えていてもよい。
この場合、前記光分離手段に用いる具体的な構成は特に限定されないが、一例としては、輪帯ミラーを挙げることができる。
以上説明した光学的測定装置に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
本発明では、次に、発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）で流路を照射する光照射工程と、
該光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と、
を少なくとも行う光検出器の波長校正方法を提供する。
前記波長校正工程で行う波長校正方法は特に限定されないが、例えば、前記スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより前記光検出器の検出波長を校正する方法を用いることができる。
本発明に係る波長校正方法に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
該光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と、
を少なくとも行う光検出器の波長校正方法を提供する。
前記波長校正工程で行う波長校正方法は特に限定されないが、例えば、前記スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより前記光検出器の検出波長を校正する方法を用いることができる。
本発明に係る波長校正方法に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
本発明では、更に、発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）で流路を照射する第１光照射工程と、
該第１光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と
前記流路に試料を通流させる通流工程と、
前記試料に対し光を照射する第２光照射工程と、
前記試料からの光学的情報を前記光検出器において検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う光学的測定方法を提供する。
前記波長校正工程で行う波長校正方法は特に限定されないが、例えば、前記スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより前記光検出器の検出波長を校正する方法を用いることができる。
本発明に係る光学的測定方法では、前記試料が通流中の前記流路に対し発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）を照射する第３光照射工程を更に行ってもよい。
また、本発明に係る光学的測定方法では、前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認工程を更に行ってもよい。
この場合、画像確認工程で行う具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、前記第３光照射工程で、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、前記画像確認工程で、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基づいて、前記試料の状態を画像により確認する方法を採用することができる。
また、本発明に係る光学的測定方法では、前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記光検出器又は前記画像確認を行う画像確認手段の位置調整を行う位置調整工程を更に行ってもよい。
更に、本発明に係る光学的測定方法では、前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程において発せられた光と、前記第２光照射工程において発せられた光と、を合成する光合成工程を更に行ってもよい。
この場合、光合成工程における具体的な光合成方法は特に限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターを用いて光合成を行うことが可能である。
加えて、本発明に係る光学的測定方法では、前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離工程を更に行ってもよい。
この場合、光分離工程における具体的な光分離方法は特に限定されないが、例えば、輪帯ミラーを用いて光分離を行うことが可能である。
以上説明した光学的測定方法に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
該第１光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と
前記流路に試料を通流させる通流工程と、
前記試料に対し光を照射する第２光照射工程と、
前記試料からの光学的情報を前記光検出器において検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う光学的測定方法を提供する。
前記波長校正工程で行う波長校正方法は特に限定されないが、例えば、前記スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより前記光検出器の検出波長を校正する方法を用いることができる。
本発明に係る光学的測定方法では、前記試料が通流中の前記流路に対し発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）を照射する第３光照射工程を更に行ってもよい。
また、本発明に係る光学的測定方法では、前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認工程を更に行ってもよい。
この場合、画像確認工程で行う具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、前記第３光照射工程で、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、前記画像確認工程で、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基づいて、前記試料の状態を画像により確認する方法を採用することができる。
また、本発明に係る光学的測定方法では、前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記光検出器又は前記画像確認を行う画像確認手段の位置調整を行う位置調整工程を更に行ってもよい。
更に、本発明に係る光学的測定方法では、前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程において発せられた光と、前記第２光照射工程において発せられた光と、を合成する光合成工程を更に行ってもよい。
この場合、光合成工程における具体的な光合成方法は特に限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターを用いて光合成を行うことが可能である。
加えて、本発明に係る光学的測定方法では、前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離工程を更に行ってもよい。
この場合、光分離工程における具体的な光分離方法は特に限定されないが、例えば、輪帯ミラーを用いて光分離を行うことが可能である。
以上説明した光学的測定方法に用いることができる前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）の種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する発光ダイオードが好ましい。
ここで、本発明で用いる技術用語の定義付けを行う。本発明における「試料」とは、細胞や微生物、リポソーム、ＤＮＡ、タンパク質などの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子など、流路内を通流可能な物質であれば、全て包含する。
本発明に係る光学的測定装置では、光検出器の波長校正のために、従来の輝線スペクトル発光する光源の代わりに、発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる光源を用いているため、装置の小型化が図れるとともに、容易に光検出器の波長校正を行うことが可能である。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．光学的測定装置
（１）流路１１
（２）第１の光源１２
（３）第２の光源１３
（４）光検出器１４
（５）波長校正手段１５
（６）画像確認手段１６
（７）光合成手段１７
（８）光分離手段１８
２．波長工程方法
（１）光照射工程１０１（光学的測定方法においては、第１光照射工程）
（２）スペクトル強度取得工程１０２
（３）波長校正工程１０３
３．光学的測定方法
（４）通流工程１０４
（５）第２光照射工程１０５
（６）光学的情報検出工程１０６
（７）第３光照射工程１０７
（８）画像確認工程１０８
（９）位置調整工程１０９
（１０）分取工程
（１１）光合成工程１１０
（１２）光分離工程１１１
（１３）光学的測定方法１００の流れ
１．光学的測定装置
（１）流路１１
（２）第１の光源１２
（３）第２の光源１３
（４）光検出器１４
（５）波長校正手段１５
（６）画像確認手段１６
（７）光合成手段１７
（８）光分離手段１８
２．波長工程方法
（１）光照射工程１０１（光学的測定方法においては、第１光照射工程）
（２）スペクトル強度取得工程１０２
（３）波長校正工程１０３
３．光学的測定方法
（４）通流工程１０４
（５）第２光照射工程１０５
（６）光学的情報検出工程１０６
（７）第３光照射工程１０７
（８）画像確認工程１０８
（９）位置調整工程１０９
（１０）分取工程
（１１）光合成工程１１０
（１２）光分離工程１１１
（１３）光学的測定方法１００の流れ
＜１．光学的測定装置＞
図１は、本発明に係る光学的測定装置１の一実施形態を模式的に示す模式図である。
本発明に係る光学的測定装置１は、大別すると、流路１１と、第１の光源１２と、第２の光源１３と、光検出器１４と、を少なくとも備える。また、必要に応じて、波長校正手段１５と、画像確認手段１６と、光合成手段１７と、光分離手段１８と、を更に備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。
図１は、本発明に係る光学的測定装置１の一実施形態を模式的に示す模式図である。
本発明に係る光学的測定装置１は、大別すると、流路１１と、第１の光源１２と、第２の光源１３と、光検出器１４と、を少なくとも備える。また、必要に応じて、波長校正手段１５と、画像確認手段１６と、光合成手段１７と、光分離手段１８と、を更に備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。
（１）流路１１
流路１１には試料Ｓが通流し、その所定部位において、後述する第１の光源１２および第２の光源１３より光照射が行われ、各種光学的情報検出が行われる。
流路１１には試料Ｓが通流し、その所定部位において、後述する第１の光源１２および第２の光源１３より光照射が行われ、各種光学的情報検出が行われる。
本発明に係る光学的測定装置１に用いることができる流路１１の形態は特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ上に形成した流路１１に限らず、図２に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路１１も、本発明に係る光学的測定装置１に用いることができる。
また、前記流路１１の流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路においても、本発明に係る光学的測定装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を用いれば、後述する本発明に係る光学的測定方法をより好適に行うことができる。
なお、基板Ｔ上に形成した流路１１を採用する場合には、流路１１の底面を透過性のある材料で形成することが好ましい。図１に示すように、後述の光検出器１４を、基板Ｔを挟んで第１の光源１２および第２の光源１３と逆側に配置し、流路１１の底面側からの光学的情報を検出できるようにするためである。
（２）第１の光源１２
第１の光源１２は、光学的調整及び／又は流路１１内の画像確認を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode、以下「ＬＥＤ」と称する。）からなる光源である。より具体的には、第１の光源１２から流路１１に向かってＬＥＤを照射し、流路１１を通じて発せられる光学的情報に基づいて、後述する光検出器１４の波長校正や位置調整、後述する画像確認手段１６の位置調整、後述する第２の光源１３や集光レンズａ２と流路１１との位置調整等の光学的調整や、後述する画像確認手段１６を用いて流路１１内の画像確認を行う。
第１の光源１２は、光学的調整及び／又は流路１１内の画像確認を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode、以下「ＬＥＤ」と称する。）からなる光源である。より具体的には、第１の光源１２から流路１１に向かってＬＥＤを照射し、流路１１を通じて発せられる光学的情報に基づいて、後述する光検出器１４の波長校正や位置調整、後述する画像確認手段１６の位置調整、後述する第２の光源１３や集光レンズａ２と流路１１との位置調整等の光学的調整や、後述する画像確認手段１６を用いて流路１１内の画像確認を行う。
本発明に係る光学的測定装置１に用いることができるＬＥＤの種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有するＬＥＤが好ましい。スペクトル幅が１００ｎｍ以上の広いＬＥＤを用いれば、後述する光検出器１４によってスペクトル分解された後の光軸調整を容易にすることができるからである。スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有するＬＥＤの一例としては、白色ＬＥＤ等が挙げられる。
また、スペクトル強度分布が既知のＬＥＤを用いることが好ましい。既知のスペクトル強度分布をもつＬＥＤを用いることで、後述する光検出器１４の波長校正を容易に行うことができるからである。
本発明に係る光学的測定装置１では、光学的調整及び／又は流路１１内の画像確認を行うために、ＬＥＤからなる光源を用いているため、コンデンサーレンズを用いる必要がなく、光学的測定装置１の小型化を実現することができる。
また、ＬＥＤは低発熱であるため、放熱対策などを講じる必要もなく、これもまた、光学的測定装置１の小型化の実現に寄与している。
更に、ＬＥＤを用いることで、後述する第２の光源１３の集光位置の確認や、後述する画像確認手段１６による画像確認および光学的調整が、広い視野に渡って行うことができる。
加えて、ＬＥＤのスペクトルは、輝線ではなくブロードな分布を示すため、後述する光検出器１４の分解能が低い場合であっても、微小な光軸調整に対するスペクトルシフトが検出でき、光検出器１４の波長校正が可能である。
（３）第２の光源１３
第２の光源１３は、流路１を通流中の試料Ｓに対して光を照射し、後述する光検出器１４を用いて、試料Ｓからの光学的情報を得るための光源である。
第２の光源１３は、流路１を通流中の試料Ｓに対して光を照射し、後述する光検出器１４を用いて、試料Ｓからの光学的情報を得るための光源である。
第２の光源１３から照射される光の種類は特に限定されないが、試料Ｓから蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
（４）光検出器１４
光検出器１４は、第１の光源１２および第２の光源１３から発せられた光のスペクトル強度を検出する。より詳細には、第１の光源１２を用いて流路１１を照射することにより流路１１を通じて発せられる光のスペクトル強度、及び、第２の光源１３を用いて流路１１を通流中の試料Ｓを照射することにより試料Ｓから発せられる光のスペクトル強度を検出する。
光検出器１４は、第１の光源１２および第２の光源１３から発せられた光のスペクトル強度を検出する。より詳細には、第１の光源１２を用いて流路１１を照射することにより流路１１を通じて発せられる光のスペクトル強度、及び、第２の光源１３を用いて流路１１を通流中の試料Ｓを照射することにより試料Ｓから発せられる光のスペクトル強度を検出する。
本発明に係る光学的測定装置１１に用いることができる光検出器１４は、光のスペクトル強度の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
また、本発明に係る光学的測定装置１１における光検出器１４の配置箇所は、第１の光源１２および第２の光源１３から発せられた光のスペクトル強度が検出できれば特に限定されないが、図１および図２に示すように、流路１１を挟んで第１の光源１２および第２の光源１３と逆側に配置することが好ましい。光検出器１４を、流路１１を挟んで第１の光源１２および第２の光源１３と逆側に配置することで、第１の光源１２および第２の光源１３をより自由な構成で配置させることができる。
また、第１の光源１２および第２の光源１３側には、光検出器１４のスペースを確保する必要がないため、第１の光源１２および第２の光源１３の個数を増やすことも可能である。逆に、光検出器１４側には、光源のスペースを確保する必要がないため、複数の種類の光検出器１４を配置して、同時に各種測定を行うことも可能である。
（５）波長校正手段１５
波長校正手段１５は、光検出器１４により検出された第１の光源１２から発せられる光のスペクトル強度に基づいて、光検出器１４の波長校正を行う手段である。
波長校正手段１５は、光検出器１４により検出された第１の光源１２から発せられる光のスペクトル強度に基づいて、光検出器１４の波長校正を行う手段である。
波長校正手段１５が行う具体的な波長校正方法は特に限定されないが、一例としては、図３に示すように、光検出器１４により検出された第１の光源１２から発せられる光のスペクトル強度分布（図３中（II）参照）と、予め求めておいた第１の光源１２から発せられるＬＥＤと同一のＬＥＤのスペクトル強度分布（図３中（Ｉ）参照）と、を比較することにより、光検出器１４の波長校正を行う方法を採用することができる。
（６）画像確認手段１６
画像確認手段１６は、本発明に係る光学的測定装置１には必須の手段ではないが、第１の光源１２を用いて流路１１を照射することにより流路１１を通じて発せられた光学的情報に基づいて、流路１１内の画像確認を行う手段である。
画像確認手段１６は、本発明に係る光学的測定装置１には必須の手段ではないが、第１の光源１２を用いて流路１１を照射することにより流路１１を通じて発せられた光学的情報に基づいて、流路１１内の画像確認を行う手段である。
従来の光学的測定のように輝線スペクトル発光する光源を用いて画像確認を行う場合、波長帯域が広いために結像レンズに対する色収差補正が必要となり、光学的測定装置自体が大型化するという問題があった。しかし、本発明に係る光学的測定装置１では、第１の光源としてＬＥＤを用いているため、従来の光源に比べ、波長帯域が非常に狭く抑えられるので、結像レンズに対する色収差補正の必要がなくなり、コンパクトな光学系を構築できるといった効果が生じる。
本発明に係る光学的測定装置１１に用いることができる画像確認手段１６は、流路１１内の画像確認を行うことができれば、その種類は特に限定されず、公知のデバイスを自由に選択して採用することができる。例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）やComplementary Metal Oxide Semiconductor（ＣＭＯＳ）などのエリア撮像素子を用いた検出器を挙げることができる。
画像確認手段１６が行う具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、第１の光源１２を用いて、試料Ｓの通流に合わせたストロボ照射を行うことにより、試料Ｓから発せられる光学的情報に基づいて、試料Ｓの位置、速度、形状、色などの状態を画像により確認する方法が挙げられる。
また、画像確認手段１６は、流路１１を通流する試料Ｓの状態を画像により確認するだけでなく、第１光源１２から流路１１に向かってＬＥＤを照射することにより流路１１を通じて発せられる光学的情報に基づいて、光検出器１４の波長校正や位置調整、画像確認手段１６の位置調整、第２の光源１３や集光レンズａ２と流路１１との位置調整等の光学的調整を行うために、試料Ｓを流路１１内に通流させる前に用いることもできる。
（７）光合成手段１７
光合成手段１７は、前記第１の光源１２から発せられた光と、前記第２の光源１３から発せられた光と、を合成する手段である。光合成手段１７は、本発明に係る光学的測定装置１には必須の手段ではないが、光合成手段１７を備えることで、以下の効果を奏することができる。
光合成手段１７は、前記第１の光源１２から発せられた光と、前記第２の光源１３から発せられた光と、を合成する手段である。光合成手段１７は、本発明に係る光学的測定装置１には必須の手段ではないが、光合成手段１７を備えることで、以下の効果を奏することができる。
本発明に係る光学的測定装置１は２つの光源（第１の光源１２、第２の光源１３）を有するため、流路１１の同一箇所に光を照射する場合には、少なくともいずれかは、流路１１に対し、斜めからの照射になってしまう。流路１１に対し、斜めからの光照射では、光の散乱や反射などが生じる場合があり、光のスペクトル強度検出や画像検出に影響を及ぼす場合がある。そこで、２つの光源（第１の光源１２、第２の光源１３）から発せられた光を合成し、流路１１に対し垂直方向から光を照射する方法が考えられる。
しかし、従来の光学的測定のように、輝線スペクトル発光する光源と励起レーザー光源とを用いて行う場合、輝線スペクトル発光波長のうち励起光（レーザーなど）の波長と重なる部分に関しては、光合成することができず、光量の利用効率が低下する場合があった。
一方、本発明に係る光学的測定装置１では、第１の光源としてＬＥＤを用いているため、励起光（レーザーなど）との合成が可能であり、光の散乱や反射などによる光のスペクトル強度検出や画像検出への影響を低減させることができる。その結果、効率的かつ精度の高い光学的測定を行うことが可能となる。
また、第１の光源１２から発せられたＬＥＤと、第２の光源１３から発せられた励起光と、を合成し、流路１１に対し垂直方向から光を照射することで、前記画像確認手段１６による画像確認において、モニター画像の視野が明るくなり、視認性が向上するという効果も生じる。
更に、第１の光源１２から発せられるＬＥＤ発光波長を、第２の光源１３から発せられる励起光波長に比べ、十分に長い波長とすることで、光合成手段１７によって効率的に両波長を合成することができる。その結果、ＬＥＤ光量と励起光量は、共に利用効率が上昇するといった効果も生じる。
本発明に係る光学的測定装置１１に用いることができる光合成手段１７は、前記第１の光源１２から発せられた光と、前記第２の光源１３から発せられた光と、を合成することができれば、その種類は特に限定されず、公知のデバイスを自由に選択して採用することができる。例えば、ダイクロイックミラー（ＤＣＭ）やビームスプリッターなどを挙げることができる。
（１８）光分離手段１８
光分離手段１８は、流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する手段である。前記光合成手段１７を用いて第１の光源１２と第２の光源１３のそれぞれから発せられた光が合成され、流路１１の同一箇所を通過した光は、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する必要がある。
光分離手段１８は、流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する手段である。前記光合成手段１７を用いて第１の光源１２と第２の光源１３のそれぞれから発せられた光が合成され、流路１１の同一箇所を通過した光は、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する必要がある。
本発明に係る光学的測定装置１１に用いることができる光分離手段１８は、流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離することができれば、その種類は特に限定されず、公知のデバイスを自由に選択して採用することができる。例えば、ビームスプリッター、輪帯ミラーなどを挙げることができる。
ビームスプリッターを用いる場合、例えば、片側のみＡＲコート（Anti Reflection Coating）することで、所定の光量を前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６へ分離することができる。光分離の割合は、本発明に係る光学的測定装置１では、前記画像確認手段１６へ３％〜５％の分離で、流路１１の配置や流路１１内部の様子の画像確認には十分である。
また、流路１１の位置調整のために前記画像確認手段１６を用いる場合には、図４に示すように、光分離手段１８として輪帯ミラーを用いることが好ましい。輪帯ミラーを用いれば、中心部の光は１００％全て光検出器１４へ抜けるため、光検出器１４における光検出精度が向上すると共に、輪帯部の光は画像確認手段１６に確実に分離されるため、流路１１の位置調整に必要な光量は十分に確保できる。
より具体的に説明すると、例えば、輪帯ミラーの輪帯部において画像確認手段１６へ分離された光によって流路１１の位置をモニターしながら位置補正を行うことができる。そして同時に、輪帯ミラーの中心部の光は１００％全て光検出器１４へ抜けるため、流路１１を通流する試料からの蛍光補足効率を向上させることができる。
＜波長校正方法＞
図５は、本発明に係る波長校正方法１０のフロー図である。
本発明に係る波長校正方法は、大別して、光照射工程１０１と、スペクトル強度取得工程１０２と、波長校正工程１０３と、を少なくとも行う方法である。以下、各工程について、詳細に説明する。
図５は、本発明に係る波長校正方法１０のフロー図である。
本発明に係る波長校正方法は、大別して、光照射工程１０１と、スペクトル強度取得工程１０２と、波長校正工程１０３と、を少なくとも行う方法である。以下、各工程について、詳細に説明する。
（１）光照射工程１０１
光照射工程１０１は、流路１に対してＬＥＤを照射する工程である。
光照射工程１０１は、流路１に対してＬＥＤを照射する工程である。
本発明に係る波長校正方法１０に用いることができるＬＥＤの種類は特に限定されないが、本発明においては、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有するＬＥＤが好ましい。スペクトル幅が１００ｎｍ以上の広いＬＥＤを用いれば、後述するスペクトル強度取得工程１０２において、光検出器１４によってスペクトル分解された後の光軸調整を容易にすることができるからである。スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有するＬＥＤの一例としては、白色ＬＥＤ等が挙げられる。
また、スペクトル強度分布が既知のＬＥＤを用いることが好ましい。既知のスペクトル強度分布をもつＬＥＤを用いることで、後述する波長校正工程１０３において、波長校正を容易に行うことができるからである。
本発明に係る波長校正方法１０では、ＬＥＤを用いているため、コンデンサーレンズを用いる必要がない。また、ＬＥＤは低発熱であるため、放熱対策などを講じる必要もない。
更に、ＬＥＤを用いることで、後述する光学的測定方法１００の画像確認工程１０８や、位置調整工程１０９を、広い視野に渡って行うことができる。
加えて、ＬＥＤのスペクトルは、輝線ではなくブロードな分布を示すため、後述する光学的測定方法１００に用いる光検出器１４の分解能が低い場合であっても、微小な光軸調整に対するスペクトルシフトが検出でき、光検出器１４の波長校正が可能である。
（２）スペクトル強度取得工程１０２
スペクトル強度取得工程１０２は、光照射工程１０１により流路１１を通じて発せられる光のスペクトル強度を取得する工程である。
スペクトル強度取得工程１０２は、光照射工程１０１により流路１１を通じて発せられる光のスペクトル強度を取得する工程である。
スペクトル強度取得工程１０２では、光のスペクトル強度の検出ができれば、その取得方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定法、散乱光測定法、透過光測定法、反射光測定法、回折光測定法、紫外分光測定法、赤外分光測定法、ラマン分光測定法、ＦＲＥＴ測定法、ＦＩＳＨ測定法その他各種スペクトラム測定法、複数の色素を検出できる、いわゆるマルチカラー検出法等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
（３）波長校正工程１０３
波長校正工程１０３では、スペクトル強度取得工程１０２において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器１４の波長校正を行う工程である。
波長校正工程１０３では、スペクトル強度取得工程１０２において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器１４の波長校正を行う工程である。
波長校正工程１０３では、光検出器１４の波長校正を行うことができれば、その方法は特に限定されないが、一例としては、図３に示すように、スペクトル強度取得工程１０２において取得したスペクトル強度分布（図３中（II）参照）と、予め求めておいた光照射工程１０１において照射したＬＥＤと同一のＬＥＤのスペクトル強度分布（図３中（Ｉ）参照）と、を比較することにより、光検出器１４の波長校正を行う方法を採用することができる。
＜光学的測定方法＞
図６は、本発明に係る光学的測定方法１００のフロー図である。
本発明に係る光学的測定方法１００は、大別して、第１光照射工程１０１と、スペクトル強度取得工程１０２と、波長校正工程１０３と、通流工程１０４と、第２光照射工程１０５と、光学的情報検出工程１０６と、を少なくとも行う方法である。また、必要に応じて、第３光照射工程１０７、画像確認工程１０８、位置調整工程１０９、光合成工程１１０、光分離工程１１１等をそれぞれ行うことも可能である。以下、各工程について、詳細に説明する。なお、第１光照射工程１０１、スペクトル強度取得工程１０２、波長校正工程１０３は、それぞれ前述した波長校正方法１０における光照射工程１０１、スペクトル強度取得工程１０２、波長校正工程１０３に該当するため、ここでは説明を割愛する。
図６は、本発明に係る光学的測定方法１００のフロー図である。
本発明に係る光学的測定方法１００は、大別して、第１光照射工程１０１と、スペクトル強度取得工程１０２と、波長校正工程１０３と、通流工程１０４と、第２光照射工程１０５と、光学的情報検出工程１０６と、を少なくとも行う方法である。また、必要に応じて、第３光照射工程１０７、画像確認工程１０８、位置調整工程１０９、光合成工程１１０、光分離工程１１１等をそれぞれ行うことも可能である。以下、各工程について、詳細に説明する。なお、第１光照射工程１０１、スペクトル強度取得工程１０２、波長校正工程１０３は、それぞれ前述した波長校正方法１０における光照射工程１０１、スペクトル強度取得工程１０２、波長校正工程１０３に該当するため、ここでは説明を割愛する。
（４）通流工程１０４
通流工程１０４は、測定対象の試料Ｓを流路１１中へ通流させる工程である。
通流工程１０４は、測定対象の試料Ｓを流路１１中へ通流させる工程である。
試料Ｓの流路１１中への通流方法は特に限定されないが、例えば、整流を促す流体媒体（シース流）で試料Ｓを挟み込みながら搬送する方法が挙げられる。このように搬送すれば、試料Ｓを含むサンプル流の層流を形成することができ、より好適である。前記流体媒体は試料Ｓを含むサンプル流の整流を促す機能を有すれば、その種類は特に限定されないが、例えば、試料Ｓが細胞である場合には、生理食塩水等を用いることができる。
試料Ｓには、後述する光学的情報検出工程１０６において、光学的情報が検出できるように、蛍光色素等の蛍光物質、放射性物質、インターカレーター、またはマイクロビーズなどの標識物質で修飾しておくことが好ましい。例えば、蛍光色素を用いる場合、その種類は特に限定されず、公知のあらゆる蛍光色素を用いることができる。例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridinin chlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、 Cy3、Cy5、Cy7等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
なお、蛍光タンパク質のように、試料Ｓ自体が発光する場合には、標識物質で修飾する必要はない。また、物質自体流路１１内で物質間相互作用を進行させることにより、ＦＲＥＴの原理のように、その物質の蛍光色等を変化させることができる物質等を試料Ｓとして用いる場合も、標識物質で試料Ｓを修飾する必要はない。
（５）第２光照射工程１０５
第２光照射工程は、流路１１を通流中の試料Ｓに対して、光を照射する工程である。第２照射工程１０５は、通流工程１０４を経た後であれば、その工程順は特に限定されず、例えば、第１光照射工程１０１と同時に行うことも可能である。
第２光照射工程は、流路１１を通流中の試料Ｓに対して、光を照射する工程である。第２照射工程１０５は、通流工程１０４を経た後であれば、その工程順は特に限定されず、例えば、第１光照射工程１０１と同時に行うことも可能である。
第２光照射工程１０５において、照射する光の種類は特に限定されないが、試料Ｓから蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
（６）光学的情報検出工程１０６
光学的情報検出工程１０６は、第２光照射工程１０５で光を照射することにより、流路１１を通流中の試料Ｓから発せられる光学的情報を、光検出器１４を用いて検出する工程である。光学的情報検出工程１０６は、第２光照射工程１０５を経た後であれば、他の各工程順に関係なく行うことが可能であるが、前記波長校正工程１０３と同時、若しくは前記波長校正工程１０３を経た後に行うことが好ましい。試料Ｓからの光学的情報の検出の精度を向上させるためである。
光学的情報検出工程１０６は、第２光照射工程１０５で光を照射することにより、流路１１を通流中の試料Ｓから発せられる光学的情報を、光検出器１４を用いて検出する工程である。光学的情報検出工程１０６は、第２光照射工程１０５を経た後であれば、他の各工程順に関係なく行うことが可能であるが、前記波長校正工程１０３と同時、若しくは前記波長校正工程１０３を経た後に行うことが好ましい。試料Ｓからの光学的情報の検出の精度を向上させるためである。
光学的情報検出工程１０６では、試料Ｓからの光学的情報が検出できれば、その取得方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定法、散乱光測定法、透過光測定法、反射光測定法、回折光測定法、紫外分光測定法、赤外分光測定法、ラマン分光測定法、ＦＲＥＴ測定法、ＦＩＳＨ測定法その他各種スペクトラム測定法、複数の色素を検出できる、いわゆるマルチカラー検出法等を用いた方法等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
（７）第３光照射工程１０７
第３光照射工程１０７は、試料Ｓが通流中の流路１１に対して、ＬＥＤを照射する工程である。
第３光照射工程１０７は、試料Ｓが通流中の流路１１に対して、ＬＥＤを照射する工程である。
第３光照射工程１０７で照射するＬＥＤの種類は特に限定されず、公知のＬＥＤを自由に選択して用いることができる。例えば、第１光照射工程１０１で用いるＬＥＤをそのまま用いれば、ＬＥＤ光源を複数、準備する必要がなく、好適である。
なお、第３照射工程１０７は、通流工程１０４を経た後であれば、例えば図６に示すように、第２照射工程１０５と同時又はその前後に行ってもよく、また、光学的情報検出工程１０６と同時又はその前後に行ってもよい。また、通流工程１０４を経た後に、前記第１照射工程１０１を行う場合には、第１照射工程１０１が、同時に、第３照射工程１０７の役割を果たすことも可能である。
（８）画像確認工程１０８
画像確認工程１０８は、第３光照射工程１０７でのＬＥＤ照射により、流路１１を通じて発せられた光学的情報に基づいて、流路１１内の画像確認を行う工程である。
画像確認工程１０８は、第３光照射工程１０７でのＬＥＤ照射により、流路１１を通じて発せられた光学的情報に基づいて、流路１１内の画像確認を行う工程である。
画像確認工程１０８では、流路１１内の画像確認を行うことができれば、その確認方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）やComplementary Metal Oxide Semiconductor（ＣＭＯＳ）などのエリア撮像素子を用いた確認方法を挙げることができる。
画像確認工程１０８における具体的な画像確認方法は特に限定されないが、一例としては、第３光照射工程１０７で、試料Ｓの通流に合わせたＬＥＤのストロボ照射を行い、このストロボ照射に伴って試料Ｓから発せられる光学的情報に基づいて、試料Ｓの位置、速度、形状、色などの状態を画像により確認する方法が挙げられる。
なお、画像確認工程１０８は、第３光照射工程１０７を経た後であれば、例えば、第２照射工程１０５と同時又はその前後に行ってもよく、また、光学的情報検出工程１０６と同時又はその前後に行ってもよい。
（９）位置調整工程１０９
位置調整工程１０９は、第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７を行うことにより、流路１１を通して発せられる光学的情報に基づいて、光検出器１４又は画像確認を行う画像確認手段１５の位置調整を行う工程である。
位置調整工程１０９は、第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７を行うことにより、流路１１を通して発せられる光学的情報に基づいて、光検出器１４又は画像確認を行う画像確認手段１５の位置調整を行う工程である。
より詳細には、第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において流路１１に向かってＬＥＤを照射することにより、流路１１を通じて発せられる光学的情報に基づいて、光検出器１４、画像確認手段１６、第２光照射工程１０５を行う光源１３や集光レンズａ２と流路１１との位置調整等を行う。
なお、位置調整工程１０９は、第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７を経た後であれば、行う順番は特に限定されないが、例えば図６に示すように、スペクトル強度取得工程１０２と同時又はその前に行うことが好ましい。スペクトル強度取得工程１０２の後に行うと、光検出器１４や画像確認手段１６の位置を変更することにより、得られるスペクトル強度が変化してしまう可能性があるからである。
（１０）分取工程
本発明では必須ではないが、光学的情報検出工程１０６及び／又は画像確認工程１０８を経た後、分取工程を行うことができる。分取工程では、光学的情報検出工程１０６及び／又は画像確認工程１０８で得られた試料Ｓの光学的情報に基づいて、試料Ｓの分取を行う。
本発明では必須ではないが、光学的情報検出工程１０６及び／又は画像確認工程１０８を経た後、分取工程を行うことができる。分取工程では、光学的情報検出工程１０６及び／又は画像確認工程１０８で得られた試料Ｓの光学的情報に基づいて、試料Ｓの分取を行う。
具体的な一例を挙げると、光学的情報検出工程１０６及び／又は画像確認工程１０８で得られた試料Ｓの大きさ、形態、内部構造等の情報に基づいて、図示しないが、流路１１の下流に分取のための流路を形成し、偏向板Ｄ等を用いて試料Ｓを分取することができる。
（１１）光合成工程１１０
光合成工程１１０は、前記第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において発せられた光と、前記第２光照射工程１０５において発せられた光と、を合成する工程である。光合成工程１１０は、本発明に係る光学的測定方法１００には必須の工程ではないが、光合成工程１１０を行うことで、以下の効果を奏することができる。
光合成工程１１０は、前記第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において発せられた光と、前記第２光照射工程１０５において発せられた光と、を合成する工程である。光合成工程１１０は、本発明に係る光学的測定方法１００には必須の工程ではないが、光合成工程１１０を行うことで、以下の効果を奏することができる。
本発明に係る光学的測定方法１００では、光を照射する工程が少なくとも２工程以上あるため（第１光照射工程１０１、第２光照射工程１０５、第３光照射工程１０７）、これらの工程を同時に行うことにより光を照射する場合には、少なくともいずれかは、流路１１に対し、斜めからの照射になってしまう。流路１１に対し、斜めからの光照射では、光の散乱や反射などが生じる場合があり、光のスペクトル強度検出や画像検出に影響を及ぼす場合がある。そこで、それぞれの工程において発せられた光を合成し、流路１１に対し垂直方向から光を照射する方法が考えられる。
しかし、従来の光学的測定のように、輝線スペクトル発光する光源と励起レーザー光源とを用いて行う場合、輝線スペクトル発光波長のうち励起光（レーザーなど）の波長と重なる部分に関しては、光合成することができず、光量の利用効率が低下する場合があった。
一方、本発明に係る光学的測定方法１００では、第１光照射工程１０１および第３光照射工程１０７においてＬＥＤを用いているため、励起光（レーザーなど）との合成が可能であり、光の散乱や反射などによる光のスペクトル強度検出や画像検出への影響を低減させることができる。その結果、効率的かつ精度の高い光学的測定を行うことが可能となる。
また、第３光照射工程１０７において発せられたＬＥＤと、第２光照射工程１０５において発せられた励起光と、を合成し、流路１１に対し垂直方向から光を照射することで、前記画像確認工程１０８による画像確認において、モニター画像の視野が明るくなり、視認性が向上するという効果も生じる。
更に、第１光照射工程１０１および第３光照射工程１０７において発せられるＬＥＤ発光波長を、第２光照射工程１０５において発せられる励起光波長に比べ、十分に長い波長とすることで、光合成工程１１０によって効率的に両波長を合成することができる。その結果、ＬＥＤ光量と励起光量は、共に利用効率が上昇するといった効果も生じる。
本発明に係る光学的測定方法１００における光合成工程１１０の具体的方法は、前記第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において発せられた光と、前記第２光照射工程１０５において発せられた光と、を合成することができれば、その方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、ダイクロイックミラー（ＤＣＭ）やビームスプリッターなどを用いた光合成方法を挙げることができる。
（１２）光分離工程１１１
光分離工程１１１は、前記流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する工程である。前記光合成工程１１０において、前記第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において発せられた光と、前記第２光照射工程１０５において発せられた光とが合成され、流路１１の同一箇所を通過した光は、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する必要がある。
光分離工程１１１は、前記流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する工程である。前記光合成工程１１０において、前記第１光照射工程１０１及び／又は前記第３光照射工程１０７において発せられた光と、前記第２光照射工程１０５において発せられた光とが合成され、流路１１の同一箇所を通過した光は、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離する必要がある。
本発明に係る光学的測定方法１００における光分離工程１１１の具体的方法は、流路１１を通過した光を、前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６への光に分離することができれば、特に限定されず、公知の方法を自由に選択して採用することができる。例えば、ビームスプリッター、輪帯ミラーなど用いた方法を挙げることができる。
ビームスプリッターを用いる場合、例えば、片側のみＡＲコート（Anti Reflection Coating）することで、所定の光量を前記光検出器１４への光と前記画像確認手段１６へ分離することができる。光分離の割合は、本発明に係る光学的測定方法１００では、前記画像確認手段１６へ３％〜５％の分離で、流路１１の配置や流路１１内部の様子の画像確認には十分である。
また、流路１１の位置調整のために前記画像確認工程１０８を行う場合には、輪帯ミラーを用いて光分離工程１１１を行うことが好ましい。輪帯ミラーを用いれば、中心部の光は１００％全て光検出器１４へ抜けるため、光検出器１４における光検出精度が向上すると共に、輪帯部の光は画像確認手段１６に確実に分離されるため、流路１１の位置調整に必要な光量は十分に確保できる。
より具体的に説明すると、例えば、輪帯ミラーの輪帯部において画像確認手段１６へ分離された光によって流路１１の位置をモニターしながら位置補正を行うことができる。そして同時に、輪帯ミラーの中心部の光は１００％全て光検出器１４へ抜けるため、流路１１を通流する試料からの蛍光補足効率を向上させることができる。
（１３）光学的測定方法１００の流れ
以上説明した光学的測定方法１００の具体的な流れの一例について、本発明に係る光学的測定装置１を記載した図１を用いて説明する。
以上説明した光学的測定方法１００の具体的な流れの一例について、本発明に係る光学的測定装置１を記載した図１を用いて説明する。
まず、第１の光源１２を用いて基板Ｔに形成した流路１１にＬＥＤ照射を行い（第１光照射工程１０１）、流路１１が画像確認手段１６に投影されるように画像確認手段１６の位置を調整する。このようにして、流路１１と画像確認手段１６の位置関係が調整できる（位置調整工程１０９）。
続いて、スペーシャルフィルターｄ１を除去した状態で、流路１１を透過したＬＥＤ光を光検出器１４上に投影する。この時、光検出器の表面に紙などを置くことでスペクトル分解されたＬＥＤ光が投影されている状態を観察し易くすることができる。ＬＥＤ光と同時に流路１１の影像が投影されるが、この影像が検出器１４の中心に配置され、明確に見えるように光検出器１４の位置を調整する。このようにして、流路１１と光検出器１４の位置関係が調整できる（位置調整工程１０９）。
次に、ＬＥＤ光に加えて、第２の光源１３から流路１１に対して、例えば、レーザーを集光照射する。この時、流路１１を透過したレーザーの一部は、ビームスプリッターｂ２で反射し、大部分がバンドカットフィルターｃ１でカットされるが、ごく一部はバンドカットフィルターｃ１を透過して画像確認手段１６に到達する。画像確認手段１６に到達したレーザーのスポットが所望の流路１１の位置に、所望のスポットサイズで照射されるように、画像確認手段１６の画像を見ながらレーザーの位置や集光レンズａ２の位置を調整する。このようにして、第２の光源１３と流路１１の位置関係が調整できる（位置調整工程１０９）。このように、第２の光源１３からの照射だけでは、画像確認手段１６の画面上で流路１１のどの位置に照射されているかの配置が確認できないが、第１の光源１２を用いてＬＥＤ照射を行うことにより、流路１１と光照射スポットの位置関係を容易に確認することができる。
次に、一旦外しておいたスペーシャルフィルターｄ１を再び取り付け、第１の光源を消灯する。この状態で流路１１に、例えば、蛍光色素等を修飾した試料Ｓを通流させる。すると、第２の光源１３から照射されるレーザーＬにより励起発光した蛍光の一部が回折格子に到達し、スペクトル分解されて光検出器１４上に投影される。この投影された蛍光スペクトルが光検出器１４上の有効エリア内に投影されるようにスペーシャルフィルターｄ１の位置を調整する。このようにして、流路１１におけるレーザー照射位置とスペーシャルフィルターｄ１の位置関係が調整できる。
次に、流路１１内の試料Ｓを一旦排出し、第２の光源を消灯し、再び第１の光源１２により流路１１をＬＥＤ照射する（第１光照射工程１０１）。流路１１を透過したＬＥＤ光の一部は光検出器１４上でスペクトル分解されて投影される。光検出器１４上に載せた紙などを除去した上で、このスペクトル強度分布を光検出器１４で取得する（スペクトル強度取得工程１０２）。そして、検出したスペクトル分布と予め求めておいたＬＥＤ発光スペクトル分布とを比較することで、光検出器１４の検出波長を校正することができる（波長校正工程１０３）。
次に、第１の光源１２を消灯して、流路１１内に、例えば、蛍光色素等を修飾した試料Ｓを通流させる（通流工程１０４）。流路１１中を通流する試料Ｓに対し、第２の光源を用いて、例えば、レーザー光Ｌを集光照射すると（第２光照射工程１０５）、レーザーＬにより励起発光した蛍光の一部が回折格子に到達し、スペクトル分解されて光検出器１４で検出できる（光学的情報検出工程１０６）。
一方で、第１の光源を用いて、流路１１に対して試料Ｓの通流に合わせたＬＥＤストロボ照射を行う（第３光照射工程１０７）。この時、前記レーザー光Ｌの集光照射（第２光照射工程１０５）と、ＬＥＤのストロボ照射（第３光照射工程１０７）を同時に行う場合には、ビームスプリッターやＤＣＭを用いて、レーザー光ＬとＬＥＤを光合成することも可能である（光合成工程１１０）。この場合、光路合成して流路１１に入射した光は、例えば、流路１１から出射した光を集光レンズａ３で捕捉し、片側のみＡＲコートしたビームスプリッターや輪帯ミラーなどの光分離手段１８を用いて、所定の光量を画像確認手段１６に分離する（光分離工程１１１）。
そして、ＬＥＤのストロボ照射により流路１１を通じて発せられる光学的情報を画像確認手段１６により確認することで、試料Ｓの位置、速度、形状、色などの状態を画像により確認することができる（画像確認工程１０８）。なお、この時、ＬＥＤストロボ照射することにより、ＬＥＤのスペクトルが、光学的情報検出工程１０６において検出した値に、重畳することがあるため注意が必要である。
以上、一連の工程後、更に、基板Ｔを交換して別の測定を行う場合には、第１の光源を用いて新しい基板Ｔ上に形成した流路１１をＬＥＤ照射し、流路１１が画像確認手段１６の画面の決まった位置にくるように調整することで再現性よく再び、光学的測定を行うことができる。このように、第２の光源１３や光検出器１４等の位置は、画像確認手段１６に対して相対的に調整された状態なので、画像確認手段１６の画面上の確認だけで容易に調整ができる。
実施例１では、白色ＬＥＤを用いて、本発明に係る光検出器の波長校正を行った。
まず、白色ＬＥＤからの発光スペクトルを一般的な分光光度計を用いて測定した。これにより、スペクトル分布中に存在するピークの波長や半値幅（強度が半値となる波長）等が得られた。
測定結果を図７に示す。図７に示すように、第１ピーク波長が４７０ｎｍ、第２ピーク波長が５６０ｎｍとなっていた。また半値強度となる波長は、第１ピークの両サイドに対しては４５５ｎｍと４８０ｎｍ、第２ピークの長波長側に対しては６５０ｎｍという値が得られた。なお、第２ピークの短波長側の半値波長は第１ピークにより持ち上げられているため値は得られなかった。
次に、図１に示す本発明に係る光学的測定装置において、第１の光源としてこの白色ＬＥＤからなる光源を設置し、マルチチャンネルＰＭＴでのスペクトル強度分布測定を行った。
測定結果を図８に示す。この測定結果を、前記図７で示すスペクトル強度分布にフィッティングさせることで、マルチチャンネルＰＭＴの波長校正を行った。より具体的には、図３に示すように、フィッティング波長として、４００ｎｍと７００ｎｍの２点を用いて、マルチチャンネルＰＭＴの波長校正を行った。
なお、本実施例では、２点のフィッティング波長を用いて波長校正を行ったが、より精度を高めるためには、複数の波長でフィッティングを行うこともできる。また、スペクトル強度を検出する光検出器として非線形性がある場合であっても、多項式近似によるフィッティングを行うことで、より正確に校正を行うことができる。
実施例２では、本発明に係る光学的測定装置１を用いて、本発明に係る光学的測定方法における光合成および光分離を行い、画像確認を行った。本実施例では、第１の光源から出射するＬＥＤの一例として、波長６３０ｎｍ中心に半値幅２０ｎｍ程度の波長帯域のＬＥＤ光を、第１の光源から出射する光の一例として、波長４８８ｎｍの励起レーザー光を用いた。
まず、第１の光源１２から出射した前記ＬＥＤと、第２の光源１３から出射した前記励起レーザー光を、ＤＣＭ（光合成手段１７）を用いて光路合成した。光路合成した光を、集光レンズａ２を通して流路１１に照射した。この際、光合成されたＬＥＤにより、流路１１を十分に照明することが確認できた。
次に、流路１１から出射した光を集光レンズａ３で捕捉し、片面のみＡＲコートしたビームスプリッターを用いて、４％程度の光量をＣＣＤ（画像確認手段１６）側へ分離した。この分離した光線束をＣＣＤ（画像確認手段１６）上に結像することで、流路１１の配置や流路１１の内部の様子をモニターすることができた。
次に、前記ビームスプリッターの代わりに、輪帯ミラー（光分離手段１８）を配置して、流路１１から出射した光を、輪帯部分をＣＣＤ（画像確認手段１６）へ、中心部分を光検出器１４へ、それぞれ分離した。ＣＣＤ（画像確認手段１６）上の画像は、中心のみ抜けた画像であったが、流路１１の位置調整は、問題なく行うことができた。また、中心部の光は、１００％光検出器１４側へ抜けるため、光検出器１４における蛍光捕捉効率が著しく向上した。
実施例２の結果から、第１の光源１２から発せられる光の波長を、第２の光源１３から発せられる光の波長より長くすることで、光合成手段１７を用いて、高効率を維持しつつ光合成できることが分かった。また、画像確認手段１６へ分離する光量は、４％程度でも画像確認には十分であり、光検出器１４側への光量損失が、ごく僅かですむことも分かった。
１ 光学的測定装置
１１ 流路
１２ 第１の光源
１３ 第２の光源
１４ 光検出器
１５ 波長校正手段
１６ 画像確認手段
１７ 光合成手段
１８ 光分離手段
Ｔ 基板
Ｓ 試料
Ｌ レーザー
１０ 波長校正方法
１００ 光学的測定方法
１０１ 光照射工程、第１光照射工程
１０２ スペクトル強度取得工程
１０３ 波長校正工程
１０４ 通流工程
１０５ 第２光照射工程
１０６ 光学的情報検出工程
１０７ 第３光照射工程
１０８ 画像確認工程
１０９ 位置調整工程
１１０ 光合成工程
１１１ 光分離工程
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５ 集光レンズ
ｃ１、ｃ２ バンドカットフィルター
ｄ１ スペーシャルフィルター
１１ 流路
１２ 第１の光源
１３ 第２の光源
１４ 光検出器
１５ 波長校正手段
１６ 画像確認手段
１７ 光合成手段
１８ 光分離手段
Ｔ 基板
Ｓ 試料
Ｌ レーザー
１０ 波長校正方法
１００ 光学的測定方法
１０１ 光照射工程、第１光照射工程
１０２ スペクトル強度取得工程
１０３ 波長校正工程
１０４ 通流工程
１０５ 第２光照射工程
１０６ 光学的情報検出工程
１０７ 第３光照射工程
１０８ 画像確認工程
１０９ 位置調整工程
１１０ 光合成工程
１１１ 光分離工程
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５ 集光レンズ
ｃ１、ｃ２ バンドカットフィルター
ｄ１ スペーシャルフィルター
Claims (20)
- 試料が通流する流路と、
光学的調整及び／又は前記流路内の画像確認を行うための発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）からなる第１の光源と、
前記流路を通流中の試料に対して光を照射するための第２の光源と、
前記第１の光源および第２の光源から発せられる光のスペクトル強度を検出する光出器と、
を少なくとも備えた光学的測定装置。 - 前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度に基づいて、前記光検出器の波長校正を行う波長校正手段を更に備えた請求項１記載の光学的測定装置。
- 前記波長校正手段は、前記光検出器により検出された第１の光源から発せられる光のスペクトル強度分布と、予め求めておいた前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）のスペクトル強度分布と、を比較することにより、前記光検出器の波長校正を行う請求項２記載の光学的測定装置。
- 前記第１の光源を用いて前記流路を照射することにより前記流路を通じて発せられた光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認手段を更に備えた請求項１から３のいずれか一項に記載の光学的測定装置。
- 前記第１の光源は、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、
前記画像確認手段は、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基
づいて、前記試料の状態を画像により確認する請求項４記載の光学的測定装置。 - 前記第１の光源から発せられた光と、前記第２の光源から発せられた光と、を合成する光合成手段を更に備えた請求項１から５のいずれか一項に記載の光学的測定装置。
- 前記光合成手段は、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターからなる請求項６記載の光学的測定装置。
- 前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離手段を更に備えた請求項４から７のいずれか一項に記載の光学的測定装置。
- 前記光分離手段は、輪帯ミラーからなる請求項８記載の光学的測定装置。
- 前記発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）は、スペクトル強度分布が１００ｎｍ以上のスペクトル幅を有する請求項１から９のいずれか一項に記載の光学的測定装置。
- 発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）で流路を照射する光照射工程と、
該光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と、
を少なくとも行う光検出器の波長校正方法。 - 発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）で流路を照射する第１光照射工程と、
該第１光照射工程により前記流路を通して発せられる光のスペクトル強度を取得するスペクトル強度取得工程と、
該スペクトル強度取得工程において取得したスペクトル強度分布に基づいて、光検出器の検出波長を校正する波長校正工程と
前記流路に試料を通流させる通流工程と、
前記試料に対し光を照射する第２光照射工程と、
前記試料からの光学的情報を前記光検出器において検出する光学的情報検出工程と、
を少なくとも行う光学的測定方法。 - 前記試料が通流中の前記流路に対し発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）を照射する第３光照射工程を更に行う請求項１２記載の光学的測定方法。
- 前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記流路内の画像確認を行う画像確認工程を更に行う請求項１３記載の光学的測定方法。
- 前記第３光照射工程では、前記試料の通流に合わせたストロボ照射を行い、
前記画像確認工程では、前記ストロボ照射により前記試料から発せられる光学的情報に基づいて、前記試料の状態を画像により確認する請求項１４記載の光学的測定方法。 - 前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程により前記流路を通して発せられる光学的情報に基づいて、前記光検出器又は前記画像確認を行う画像確認手段の位置調整を行う位置調整工程を更に行う請求項１２から１５のいずれか一項に記載の光学的測定方法。
- 前記第１光照射工程及び／又は前記第３光照射工程において発せられた光と、前記第２光照射工程において発せられた光と、を合成する光合成工程を更に行う請求項１２から１６のいずれか一項に記載の光学的測定方法。
- 前記光合成工程では、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッターを用いて光合成を行う請求項１７記載の光学的測定方法。
- 前記流路を通過した光を、前記光検出器への光と前記画像確認手段への光に分離する光分離工程を更に行う請求項１４から１８のいずれか一項に記載の光学的測定装置。
- 前記光分離工程では、輪帯ミラーを用いて光分離を行う請求項１９記載の光学的測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009001233A JP4600573B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-01-07 | 光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 |
| US12/472,760 US8263956B2 (en) | 2008-05-29 | 2009-05-27 | Optical flow channel measuring instrument |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008141042 | 2008-05-29 | ||
| JP2009001233A JP4600573B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-01-07 | 光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010008397A true JP2010008397A (ja) | 2010-01-14 |
| JP4600573B2 JP4600573B2 (ja) | 2010-12-15 |
Family
ID=41378624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009001233A Expired - Fee Related JP4600573B2 (ja) | 2008-05-29 | 2009-01-07 | 光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8263956B2 (ja) |
| JP (1) | JP4600573B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013113664A (ja) * | 2011-11-28 | 2013-06-10 | Yokogawa Electric Corp | レーザガス分析装置 |
| JP2014081275A (ja) * | 2012-10-16 | 2014-05-08 | Hioki Ee Corp | 測光装置の分光感度特性の補正方法及び測光装置 |
| JP2017021045A (ja) * | 2016-09-29 | 2017-01-26 | ソニー株式会社 | 情報処理装置 |
| WO2019207988A1 (ja) * | 2018-04-25 | 2019-10-31 | ソニー株式会社 | 微小粒子分取装置及び微小粒子分取方法 |
| USRE49543E1 (en) | 2011-09-13 | 2023-06-06 | Sony Corporation | Fine particle measuring apparatus |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2375386B1 (es) * | 2010-07-21 | 2012-09-27 | Abengoa Solar New Technologies, S.A. | Reflectómetro portátil y método de caracterización de espejos de centrales termosolares. |
| US10505234B2 (en) | 2011-03-14 | 2019-12-10 | Battelle Memorial Institute | Battery cell and n situ battery electrode analysis method |
| US10598609B2 (en) | 2011-03-14 | 2020-03-24 | Battelle Memorial Institute | Universal liquid sample device and process for high resolution transmission electron microscope imaging and multimodal analyses of liquid sample materials |
| US8555710B2 (en) * | 2011-03-14 | 2013-10-15 | Battelle Memorial Institute | Systems and methods for analyzing liquids under vacuum |
| US9274059B2 (en) | 2011-03-14 | 2016-03-01 | Battelle Memorial Institute | Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in-situ |
| US9395351B2 (en) * | 2013-12-16 | 2016-07-19 | Sunpower Corporation | Solar glass angle of incidence reflectance |
| WO2015130423A1 (en) * | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Life Technologies Corporation | Systems, methods, and apparatuses for optical systems in flow cytometers |
| KR102258807B1 (ko) * | 2015-02-24 | 2021-06-09 | (주)미디어에버 | 미세 먼지 및 미생물 검출 장치 |
| WO2018072201A1 (en) * | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Honeywell International Inc. | Compact ultraviolet light adsorption sensing system |
| GB202006458D0 (en) | 2020-05-01 | 2020-06-17 | Micron Agritech Ltd | A faecal egg counting slide |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04270961A (ja) * | 1991-02-27 | 1992-09-28 | Toa Medical Electronics Co Ltd | フローイメージサイトメータ |
| JPH05346390A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置 |
| JPH0643090A (ja) * | 1992-04-01 | 1994-02-18 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置 |
| JP2002540391A (ja) * | 1999-03-19 | 2002-11-26 | サイトメトリクス インコーポレイテッド | 反射撮像分光光度計を較正するためのシステムおよび方法 |
| JP2007500529A (ja) * | 2003-07-31 | 2007-01-18 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 生体管構造を流れる流体の性状を決定する開口数可変の方法および装置 |
| WO2008035336A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Seethrough Ltd. | Device and method for inspecting a hair sample |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6115119A (en) * | 1997-10-21 | 2000-09-05 | Bigelow Laboratory For Ocean Science | Device and method for studying particles in a fluid |
| JP4093740B2 (ja) | 2001-09-27 | 2008-06-04 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 微粒子分別マイクロチップと微粒子分別装置 |
| JP3898103B2 (ja) | 2002-08-26 | 2007-03-28 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 細胞分析分離装置 |
| US7692773B2 (en) | 2003-08-05 | 2010-04-06 | Luminex Corporation | Light emitting diode based measurement systems |
| JP5023507B2 (ja) * | 2006-02-17 | 2012-09-12 | 横河電機株式会社 | 波長校正方法及び波長校正装置 |
-
2009
- 2009-01-07 JP JP2009001233A patent/JP4600573B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-27 US US12/472,760 patent/US8263956B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04270961A (ja) * | 1991-02-27 | 1992-09-28 | Toa Medical Electronics Co Ltd | フローイメージサイトメータ |
| JPH0643090A (ja) * | 1992-04-01 | 1994-02-18 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置 |
| JPH05346390A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置 |
| JP2002540391A (ja) * | 1999-03-19 | 2002-11-26 | サイトメトリクス インコーポレイテッド | 反射撮像分光光度計を較正するためのシステムおよび方法 |
| JP2007500529A (ja) * | 2003-07-31 | 2007-01-18 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 生体管構造を流れる流体の性状を決定する開口数可変の方法および装置 |
| WO2008035336A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Seethrough Ltd. | Device and method for inspecting a hair sample |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE49543E1 (en) | 2011-09-13 | 2023-06-06 | Sony Corporation | Fine particle measuring apparatus |
| JP2013113664A (ja) * | 2011-11-28 | 2013-06-10 | Yokogawa Electric Corp | レーザガス分析装置 |
| JP2014081275A (ja) * | 2012-10-16 | 2014-05-08 | Hioki Ee Corp | 測光装置の分光感度特性の補正方法及び測光装置 |
| JP2017021045A (ja) * | 2016-09-29 | 2017-01-26 | ソニー株式会社 | 情報処理装置 |
| WO2019207988A1 (ja) * | 2018-04-25 | 2019-10-31 | ソニー株式会社 | 微小粒子分取装置及び微小粒子分取方法 |
| US11686662B2 (en) | 2018-04-25 | 2023-06-27 | Sony Corporation | Microparticle sorting device and method for sorting microparticles |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8263956B2 (en) | 2012-09-11 |
| US20090294702A1 (en) | 2009-12-03 |
| JP4600573B2 (ja) | 2010-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4600573B2 (ja) | 光学的測定装置、並びに光検出器の波長校正方法及び光学的測定方法 | |
| JP5381741B2 (ja) | 光学的測定装置及び光学的測定方法 | |
| JP4602975B2 (ja) | 粒子分類システム用光検出器 | |
| US9816913B2 (en) | Microparticle measuring apparatus | |
| JP4067826B2 (ja) | 撮像システム及びその撮像方法 | |
| JP5160158B2 (ja) | 画像化システム及びその方法 | |
| US8553229B2 (en) | Fine particle optical measuring method in fluidic channels | |
| JP5433517B2 (ja) | 解析装置及び解析方法 | |
| JP2009270990A (ja) | 流路を用いた光学的測定方法、および光学的測定装置 | |
| WO2021200411A1 (ja) | 情報処理装置、情報処理方法、プログラム及び光学測定システム | |
| JP2020122803A (ja) | 微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法 | |
| US6580081B1 (en) | Arrangement for the detection of fluorescene radiation of matrix-shaped speciman carriers | |
| KR101632672B1 (ko) | 공초점 분광 현미경 | |
| JP6860015B2 (ja) | 微小粒子測定装置及び微小粒子測定方法 | |
| KR20030079577A (ko) | 레이저 유발 표면형광 검출 장치 | |
| JP6699102B2 (ja) | 微小粒子測定装置及び情報処理方法 | |
| JP2021063664A (ja) | 情報処理装置、粒子測定装置、情報処理方法、粒子測定方法、及びコンピュータプログラム | |
| WO2022080482A1 (ja) | 粒子検出装置、粒子検出システム、及び粒子検出方法 | |
| JP2007101476A (ja) | ラマンスペクトル取得方法 | |
| US11686662B2 (en) | Microparticle sorting device and method for sorting microparticles | |
| WO2023189819A1 (ja) | 粒子分取システム、及び粒子分取方法 | |
| WO2020179237A1 (ja) | 微小粒子測定装置、微小粒子分取装置、微小粒子測定システム及び微小粒子分取システム | |
| US20230221251A1 (en) | Apparatus and method for fluorescence excitation and detection | |
| JPH10227694A (ja) | 発光現象識別装置 | |
| JP2005321347A (ja) | 光検出装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100323 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100713 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100809 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100831 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100913 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131008 Year of fee payment: 3 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4600573 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131008 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |