JP6699102B2 - 微小粒子測定装置及び情報処理方法 - Google Patents
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Description
本技術は、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、細胞等の微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法に関する。
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。
このような微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析、分取を行う分析手法である。
例えば細胞の蛍光を検出する場合、蛍光色素により標識した細胞にレーザー光などの適当な波長かつ強度を有する励起光を照射する。そして、蛍光色素から発せられる蛍光をレンズなどで集光し、フィルタ又はダイクロイックミラーなどの波長選択素子を用いて適当な波長域の光を選択し、選択された光をＰＭＴ（photo multiplier tube）などの受光素子を用いて検出する。このとき、波長選択素子と受光素子とを複数組み合わせることによって、細胞に標識された複数の蛍光色素からの蛍光を同時に検出し、解析することも可能である。さらに、複数波長の励起光を組み合わせることで解析可能な蛍光色素の数を増やすこともできる。
フローサイトメトリーにおける蛍光検出には、フィルタなどの波長選択素子を用いて不連続な波長域の光を複数選択し、各波長域の光の強度を計測する方法の他に、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測する方法もある。蛍光スペクトルの計測が可能なスペクトル型フローサイトメトリーでは、微小粒子から発せられる蛍光を、プリズム又はグレーティングなどの分光素子を用いて分光する。そして、分光された蛍光を、検出波長域が異なる複数の受光素子が配列された受光素子アレイを用いて検出する。受光素子アレイには、ＰＭＴ又はフォトダイオードなどの受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、あるいはＣＣＤ又はＣＭＯＳなどの２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが用いられている。
フローサイトメトリーなどに代表される微小粒子の解析では、分析対象となる微小粒子にレーザーなどの光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する光学的手法が多く用いられている。そして、検出された光学的情報をもとに、解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析が行われる。
微小粒子の光学的解析においては、実際に被検対象となる微小粒子の光学的測定の前に、その精度等の検証や装置の動作確認・標準化等のために、クオリティーコントロール（ＱＣ：Quality Control）を行う場合がある。このクオリティーコントロールにおいては、通常、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数のビーズ（３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等）や広範囲のスペクトルが得られる一種類のビーズ（アラインチェックビーズ、Ultra Rainbow蛍光粒子等）等が用いられている。
複数の蛍光色素間で測定を行う際に、蛍光補正を行う技術として、例えば、特許文献１には、フローサイトメーターによって得られた蛍光標識被験細胞の二次元相関図から当該蛍光標識被験細胞に関する蛍光集団の重心値を算出し、重心値に該当する蛍光標識被験細胞の蛍光値と所定の行列式を用いて蛍光値の補正計算を行うようなプログラムを開発することにより、複数の蛍光色素間や、複数のレーザー光を用いて蛍光の測定を行う際にも蛍光補正が可能であり、また、被験細胞の測定処理が終了した後でも試料の再調製を行うことなく蛍光補正を実施することが可能な技術が開示されている。
ＰＭＴのような多チャンネル型の光検出器では、それぞれのチャンネルにおいて感度比を持っているため、そのままの出力では、正しいスペクトル表示ができない場合がある。これを解消するために、光検出器の製造時において、それぞれのチャンネルの感度を測定し、その出力比で出力を校正する方法が採用されている。
しかしながら、それぞれのチャンネルにおける感度は、光電面の波長感度、光電面の劣化、ダイノードの特性変動、光学的特性の変化等により変化する場合があるため、製造時における情報を基に校正する方法のみでは、まだまだ正確なスペクトル表示ができないといった問題があった。
そこで、本技術では、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、正確なスペクトルが得られる技術を提供することを主目的とする。
本願発明者らは、前記の目的を解決するために鋭意研究を行った結果、感度補正係数を特定する手法を工夫することで、その感度補正係数を用いて得られるスペクトル情報の精度向上に成功し、本技術を完成させるに至った。
即ち、本技術では、まず、微小粒子からの光を検出する検出部と、
前記検出部により検出された値を感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する情報処理部と、
を備え、
前記感度補正係数は、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を前記検出部で検出した値に基づいて特定される微小粒子測定装置を提供する。
本技術に係る微小粒子測定装置の前記検出部は、異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することができる。
この場合、前記蛍光基準粒子としては、該蛍光基準粒子が発する蛍光の所定の波長域幅が、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーするものを選択することができる。
前記所定の波長域幅としては、例えば、４００〜８００ｎｍとすることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置の前記情報処理部において、前記検出部により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成することもできる。
前記検出部により検出された値を感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する情報処理部と、
を備え、
前記感度補正係数は、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を前記検出部で検出した値に基づいて特定される微小粒子測定装置を提供する。
本技術に係る微小粒子測定装置の前記検出部は、異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することができる。
この場合、前記蛍光基準粒子としては、該蛍光基準粒子が発する蛍光の所定の波長域幅が、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーするものを選択することができる。
前記所定の波長域幅としては、例えば、４００〜８００ｎｍとすることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置の前記情報処理部において、前記検出部により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成することもできる。
本技術では、次に、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理部を備え、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理装置を提供する。
本技術に係る情報処理装置で用いる前記複数の受光素子としては、それぞれ異なる検出波長域を有するものを用いることができる。
この場合、前記蛍光基準粒子としては、該蛍光基準粒子が発する蛍光の所定の波長域幅が、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーするものを選択することができる。
前記所定の波長域幅としては、例えば、４００〜８００ｎｍとすることができる。
本技術に係る情報処理装置には、前記感度補正係数を記憶する記憶部を備えることもできる。
本技術に係る情報処理装置の前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子のリファレンス値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出することができる。
また、前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子を前記検出部で検出した初期値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出することもできる。
更に、前記情報処理部は、特定の受光素子で検出される値と各受光素子で検出される値とに基づいて、感度補正係数を算出することもできる。
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理装置を提供する。
本技術に係る情報処理装置で用いる前記複数の受光素子としては、それぞれ異なる検出波長域を有するものを用いることができる。
この場合、前記蛍光基準粒子としては、該蛍光基準粒子が発する蛍光の所定の波長域幅が、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーするものを選択することができる。
前記所定の波長域幅としては、例えば、４００〜８００ｎｍとすることができる。
本技術に係る情報処理装置には、前記感度補正係数を記憶する記憶部を備えることもできる。
本技術に係る情報処理装置の前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子のリファレンス値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出することができる。
また、前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子を前記検出部で検出した初期値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出することもできる。
更に、前記情報処理部は、特定の受光素子で検出される値と各受光素子で検出される値とに基づいて、感度補正係数を算出することもできる。
本技術では、更に、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理工程を行い、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理方法を提供する。
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理方法を提供する。
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
本技術によれば、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、精度の高いスペクトルを得ることができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置１
（１）検出部１１
（２）処理部１２
（３）光照射部１３
（４）分取部１４
（５）記憶部１５
（６）流路Ｐ
（７）表示部１６
（８）ユーザーインターフェース１７
２．情報処理装置１０
（１）処理部１２
３．情報処理方法
１．微小粒子測定装置１
（１）検出部１１
（２）処理部１２
（３）光照射部１３
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（５）記憶部１５
（６）流路Ｐ
（７）表示部１６
（８）ユーザーインターフェース１７
２．情報処理装置１０
（１）処理部１２
３．情報処理方法
＜１．微小粒子測定装置１＞
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図２は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の特性を光学的に測定する装置であって、検出部１１と、処理部１２と、を少なくとも有する。また、必要に応じて、光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、流路Ｐ、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などを備えていてもよい。以下、各部について、詳細に説明する。
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図２は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の特性を光学的に測定する装置であって、検出部１１と、処理部１２と、を少なくとも有する。また、必要に応じて、光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、流路Ｐ、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などを備えていてもよい。以下、各部について、詳細に説明する。
（１）検出部１１
検出部１１では、微小粒子や蛍光基準粒子からの光の検出が行われる。本技術に用いることができる検出部１１は、微小粒子からの光の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
検出部１１では、微小粒子や蛍光基準粒子からの光の検出が行われる。本技術に用いることができる検出部１１は、微小粒子からの光の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置１では、検出部１１を、異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することが好ましい。検出部１１を異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することで、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測することができる。具体的には、例えば、ＰＭＴ又はフォトダイオードなどの受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、ＣＣＤ又はＣＭＯＳなどの２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが挙げられる。
また、本技術に係る微小粒子測定装置１における検出部１１の設置箇所は、微小粒子からの光の検出ができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば図１及び図２に示すように、流路Ｐを挟んで後述する光照射部１３と逆側に配置することが好ましい。検出部１１を、流路Ｐを挟んで光照射部１３と逆側に配置することで、検出部１１や光照射部１３をより自由な構成で配置させることができるからである。また例えば、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、流路Ｐを基準に光照射部１３と同じ側や９０度側面の側に検出部１１を配置してもかまわない。
（２）処理部１２
処理部１２では、情報処理及び前記検出部や後述する光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などの制御が行われる。情報処理としては、前記検出部１１により検出された値を感度補正係数で補正して、スペクトルデータの生成が行われる。そして、この感度補正係数は、蛍光基準粒子からの光を前記検出部１１で検出した値に基づいて特定される。
処理部１２では、情報処理及び前記検出部や後述する光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などの制御が行われる。情報処理としては、前記検出部１１により検出された値を感度補正係数で補正して、スペクトルデータの生成が行われる。そして、この感度補正係数は、蛍光基準粒子からの光を前記検出部１１で検出した値に基づいて特定される。
本技術で用いる蛍光基準粒子とは、所定の波長域幅の蛍光を発する粒子である。蛍光基準粒子は、微小粒子測定装置１の種類や前記検出部１１の種類、測定対象となる微小粒子の種類、測定目的等に応じた波長域幅の蛍光を発する粒子を、自由に選択することができる。
蛍光基準粒子としては、例えば、アラインチェックビーズ、Ultra Rainbow蛍光粒子等を用いることが可能である。蛍光基準粒子として用いることができる条件としては、補正対象となるＰＭＴ感度の波長域幅で蛍光強度が十分に得られることである。また、例えば、蛍光色素で標識されたビーズ等の粒子を用いることも可能である。本技術で使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridininchlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、Cy3、Cy5、Cy7等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
蛍光基準粒子が発する蛍光の波長域幅は、前記検出部１１が異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される場合、複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーすることが好ましく、全部をカバーすることがより好ましい。感度補正係数は、蛍光基準粒子からの光を前記検出部１１で検出した値に基づいて特定されるため、蛍光基準粒子が発する蛍光の波長域幅がカバーする検出波長域を有する受光素子の感度補正係数が特定される。そのため、蛍光基準粒子が発する蛍光の波長域幅がカバーする検出波長域を有する受光素子が多い方が、１種類の蛍光基準粒子によって、感度補正係数を特定できる受光素子の数も多くなる。例えば、一般的なフローサイトメーターであれば、波長域幅が４００〜８００ｎｍの蛍光を発する粒子を選択することが好ましい。
前記検出部１１が異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される場合、処理部１２で行うスペクトルデータの生成は、前記検出部１１により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正して行うことが好ましい。前記検出部１１が異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される場合、光電面の波長感度、光電面の劣化、ダイノードの特性変動、光学的特性の変化等により、それぞれのチャンネルにおける感度が、各々異なる変化を起こす場合があるため、受光素子毎に特定された感度補正係数を用いることで、より精度の高いスペクトルデータを生成することができる。
感度補正係数の特定方法としては、微小粒子測定装置１の種類や前記検出部１１の種類、測定対象となる微小粒子の種類、測定目的等に応じて、自由な算出方法で特定することができる。例えば、蛍光基準粒子のリファレンス値と、蛍光基準粒子から検出される検出値と、からに基づいて、感度補正係数を算出する方法、蛍光基準粒子を前記検出部で検出した初期値と、前記蛍光基準粒子から検出される検出値と、からに基づいて、感度補正係数を算出する方法、特定の受光素子で検出される値と、各受光素子で検出される値と、に基づいて、感度補正係数を算出する方法、などを挙げることができる。以下、感度補正係数の具体的な特定方法について、一例を挙げて説明する。
（ａ）測定１回目の補正係数の算出方法例
ある固定値のＰＭＴ ＨＶ（High Voltage）（例えばControl Voltage：２．５Ｖ）にて、所定の数（例えば、１００００個）の蛍光基準粒子について、スペクトルを計測する。得られたスペクトルの統計を基に、例えば、下記の式（１）を用いて、各チャンネルの補正係数を算出する。なお、下記式（１）における「中央値（Median）」は、「平均値」を用いることも可能である。
ある固定値のＰＭＴ ＨＶ（High Voltage）（例えばControl Voltage：２．５Ｖ）にて、所定の数（例えば、１００００個）の蛍光基準粒子について、スペクトルを計測する。得られたスペクトルの統計を基に、例えば、下記の式（１）を用いて、各チャンネルの補正係数を算出する。なお、下記式（１）における「中央値（Median）」は、「平均値」を用いることも可能である。
測定１回目の補正係数の算出方法例を用いて算出した感度補正係数を用いて、ＱＣ（Quality Control）から得られた値を補正して生成したスペクトルデータの例を図３に示す。図３に示す通り、補正前のスペクトルデータは、基準スペクトルの形状と異なる形状を示しているが、感度補正係数を用いて補正を行うことで、基準スペクトルと同一の形状のスペクトルデータを得られる。
（ｂ）測定２回目以降の補正係数の算出方法例
二回目以降に感度補正係数を算出する場合は、初回の感度補正係数を記憶しその値に基づき算出しても良い。例えば、ある固定値のＰＭＴ ＨＶ（High Voltage）（例えばControl Voltage：２．５Ｖ）にて、所定の数（例えば、１００００個）の蛍光基準粒子について、スペクトルを計測する。得られたスペクトルの統計及び前記初回測定のスペクトル統計を基に、例えば、下記の式（２）を用いて、各チャンネルの補正係数を算出する。なお、下記式（２）における「中央値（Median）」は、「平均値」を用いることも可能である。
二回目以降に感度補正係数を算出する場合は、初回の感度補正係数を記憶しその値に基づき算出しても良い。例えば、ある固定値のＰＭＴ ＨＶ（High Voltage）（例えばControl Voltage：２．５Ｖ）にて、所定の数（例えば、１００００個）の蛍光基準粒子について、スペクトルを計測する。得られたスペクトルの統計及び前記初回測定のスペクトル統計を基に、例えば、下記の式（２）を用いて、各チャンネルの補正係数を算出する。なお、下記式（２）における「中央値（Median）」は、「平均値」を用いることも可能である。
測定２回目以降の補正係数の算出方法例を用いて算出した感度補正係数を用いて、ＱＣ（Quality Control）から得られた値を補正して生成したスペクトルデータの例を図４に示す。図４に示す通り、まず、２回目以降の補正前スペクトルデータは、図３に示す１回目の補正前スペクトルデータに比べても変化している。また、補正前のスペクトルデータは、基準スペクトルの形状と異なる形状を示しているが、感度補正係数を用いて補正を行うことで、基準スペクトルと同一の形状のスペクトルデータが得られる。
前記数式（１）及び（２）における基準チャンネルとは、例えば、複数あるチャンネルのうち、強度が高く、ＳＮ比の良いチャンネルを選択することができる。
（ｃ）その他
前記数式（１）及び（２）で算出した感度補正係数を使用すると、例えば、下記のような判別にも応用することができる。
前記数式（１）及び（２）で算出した感度補正係数を使用すると、例えば、下記のような判別にも応用することができる。
例えば、初回測定で算出したチャンネルＡの感度補正係数と基準チャンネルの感度補正係数との比が、２回目測定で算出したチャンネルＡの感度補正係数と基準チャンネルの感度補正係数との比と、大きく異なる場合、例えば、蛍光基準粒子以外の別の粒子を誤って使用して感度補正係数を求めてしまった、劣化した蛍光基準粒子を使用して感度補正係数を求めてしまった、チャンネルの劣化が著しい、等の可能性が考えられる。
そこで、例えば、下記数式（３）のように、予め、閾値αを設定しておき、初回測定で算出したチャンネルＡの感度補正係数と基準チャンネルの感度補正係数との比が、２回目測定で算出したチャンネルＡの感度補正係数と基準チャンネルの感度補正係数との比と、閾値αを超えて変化した場合、即ち、下記数式（３）の範囲外の場合には、エラー等の警告を発するように設定することも可能である。
（３）光照射部１３
光照射部１３では、微小粒子や蛍光基準粒子への光の照射が行われる。光照射部１３から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、または、半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
光照射部１３では、微小粒子や蛍光基準粒子への光の照射が行われる。光照射部１３から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、または、半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
（４）分取部１４
分取部１４では、前記検出部１１により検出された値を前記処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて、微小粒子の分取が行われる。例えば、分取部１４では、スペクトルデータから解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、微小粒子の分取を行うことができる。
分取部１４では、前記検出部１１により検出された値を前記処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて、微小粒子の分取が行われる。例えば、分取部１４では、スペクトルデータから解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、微小粒子の分取を行うことができる。
より具体的には、図２に示すように、例えば、所定の振動数で振動する振動素子１４ａなどを用いて、流路Ｐの全体若しくは一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１４ａは特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴の大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
次に、前記処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電する（図２中符号１４ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１４ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
（５）記憶部１５
本技術に係る微小粒子測定装置１では、感度補正係数を記憶する記憶部１５を備えることができる。記憶部１５には、感度補正係数以外にも、前記検出部１１で検出された値、前記処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、各チャンネルの基準スペクトル等、測定に関わるあらゆる事項を記憶することも可能である。
本技術に係る微小粒子測定装置１では、感度補正係数を記憶する記憶部１５を備えることができる。記憶部１５には、感度補正係数以外にも、前記検出部１１で検出された値、前記処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、各チャンネルの基準スペクトル等、測定に関わるあらゆる事項を記憶することも可能である。
本技術に係る微小粒子測定装置１において、記憶部１５は必須ではなく、外部の記憶装置を接続してもよい。記憶部１５としては、例えば、ハードディスクなどを用いることができる。
（６）流路Ｐ
本技術に係る微小粒子測定装置１では、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。
本技術に係る微小粒子測定装置１では、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。
流路Ｐは、微小粒子測定装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップなどを微小粒子測定装置１に設置して解析又は分取を行うことも可能である。
流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、図２に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路Ｐも、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる。
また、前記流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る微小粒子測定装置１により好適に用いることができる。
（７）表示部１６
表示部１６では、前記検出部１１で検出された値、前記処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、算出された感度補正係数、各チャンネルの基準スペクトル等、測定に関わるあらゆる事項を表示することができる。
表示部１６では、前記検出部１１で検出された値、前記処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、算出された感度補正係数、各チャンネルの基準スペクトル等、測定に関わるあらゆる事項を表示することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置１において、表示部１６は必須ではなく、外部の表示装置を接続してもよい。表示部１６としては、例えば、ディスプレイやプリンタなどを用いることができる。
（８）ユーザーインターフェース１７
ユーザーインターフェース１７は、ユーザーが操作するための部位である。ユーザーは、ユーザーインターフェース１７を通じて、前記処理部にアクセスし、本技術に係る微小粒子測定装置１の各部を制御することができる。
ユーザーインターフェース１７は、ユーザーが操作するための部位である。ユーザーは、ユーザーインターフェース１７を通じて、前記処理部にアクセスし、本技術に係る微小粒子測定装置１の各部を制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置１において、ユーザーインターフェース１７は必須ではなく、外部の操作装置を接続してもよい。ユーザーインターフェース１７としては、例えば、マウスやキーボードなどを用いることができる。
＜２．情報処理装置１０＞
図５は、本技術に係る情報処理装置１０の第１実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図であり、図６は、本技術に係る情報処理装置１０の第２実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る情報処理装置１０は、処理部１２を少なくとも有する。また、必要に応じて、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などを備えていてもよい。以下、各部について、詳細に説明する。なお、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７については、前述した微小粒子測定装置１の記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
図５は、本技術に係る情報処理装置１０の第１実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図であり、図６は、本技術に係る情報処理装置１０の第２実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る情報処理装置１０は、処理部１２を少なくとも有する。また、必要に応じて、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などを備えていてもよい。以下、各部について、詳細に説明する。なお、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７については、前述した微小粒子測定装置１の記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
（１）処理部１２
処理部１２では、情報処理及び前記検出部や後述する光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などの制御が行われる。情報処理としては、蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数の特定が行われる。そして、この感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される。
処理部１２では、情報処理及び前記検出部や後述する光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７などの制御が行われる。情報処理としては、蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数の特定が行われる。そして、この感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される。
なお、蛍光基準粒子の詳細や、処理部１２で行う感度補正係数の特定の詳細は、前述した微小粒子測定装置１で用いる蛍光基準粒子や処理部１２で行う感度補正係数の特定方法と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
本技術では、図５及び図６に示すように、情報処理装置１０内に、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７を備えていても良く、また、図６に示すように、情報処理装置１０と、フローサイトメーターの各部（検出部１１、光照射部１３、分取部１４等）とをネットワークを介して接続することも可能である。更に、図示しないが、情報処理装置１０の外部に、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７を備え、これらを、それぞれネットワークを介して接続することも可能である。
＜３．情報処理方法＞
本技術に係る情報処理方法は、情報処理工程を少なくとも行う方法である。情報処理工程で行う具体的な情報処理方法は、前述した情報処理装置１０の処理部１２で行われる情報処理方法と同一である。以下、本技術に係る情報処理方法を用いた微小粒子測定の流れの一例について、図７及び図８を参照しながら説明する。
本技術に係る情報処理方法は、情報処理工程を少なくとも行う方法である。情報処理工程で行う具体的な情報処理方法は、前述した情報処理装置１０の処理部１２で行われる情報処理方法と同一である。以下、本技術に係る情報処理方法を用いた微小粒子測定の流れの一例について、図７及び図８を参照しながら説明する。
Ａ．初回微小粒子測定の流れの一例
図７は、本技術に係る情報処理方法を用いた初回微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
図７は、本技術に係る情報処理方法を用いた初回微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
（１）蛍光基準粒子の初回通流（Ｓ１）
まず、蛍光基準粒子を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態の層流を形成する。
まず、蛍光基準粒子を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態の層流を形成する。
（２）蛍光基準粒子への初回光照射（Ｓ２）
層流中に整列した蛍光基準粒子に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
層流中に整列した蛍光基準粒子に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
（３）蛍光基準粒子からの光情報の初回検出（Ｓ３）
前記光照射Ｓ２によって、所定の数の蛍光基準粒子から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
前記光照射Ｓ２によって、所定の数の蛍光基準粒子から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
（４）感度補正係数の初回算出（Ｓ４）
前記初回検出Ｓ３によって得られた値の統計から、例えば、前記数式（１）を用いて、初回の感度補正係数を算出する。
前記初回検出Ｓ３によって得られた値の統計から、例えば、前記数式（１）を用いて、初回の感度補正係数を算出する。
（５）微小粒子の通流（Ｓ５）
次に、測定対象となる微小粒子（サンプル）を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態のサンプル流を形成する。
次に、測定対象となる微小粒子（サンプル）を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態のサンプル流を形成する。
（６）微小粒子への初回光照射（Ｓ６）
サンプル流中に整列した微小粒子（サンプル）に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
サンプル流中に整列した微小粒子（サンプル）に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
（７）微小粒子からの光情報の初回検出（Ｓ７）
前記光照射Ｓ６によって、微小粒子（サンプル）から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
前記光照射Ｓ６によって、微小粒子（サンプル）から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
（８）スペクトルデータの生成（Ｓ８）
前記初回検出Ｓ７によって得られた値を、前記初回算出Ｓ４によって得られた初回の感度補正係数で補正することによりスペクトルデータを生成する。
前記初回検出Ｓ７によって得られた値を、前記初回算出Ｓ４によって得られた初回の感度補正係数で補正することによりスペクトルデータを生成する。
Ｂ．２回目以降の微小粒子測定の流れの一例
図８は、本技術に係る情報処理方法を用いた２回目以降の微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
図８は、本技術に係る情報処理方法を用いた２回目以降の微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
（１）蛍光基準粒子の２回目通流（Ｓ９）
蛍光基準粒子を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態の層流を形成する。
蛍光基準粒子を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態の層流を形成する。
（２）蛍光基準粒子への２回目光照射（Ｓ１０）
層流中に整列した蛍光基準粒子に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
層流中に整列した蛍光基準粒子に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
（３）蛍光基準粒子からの光情報の２回目検出（Ｓ１１）
前記光照射Ｓ１０によって、所定の数の蛍光基準粒子から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
前記光照射Ｓ１０によって、所定の数の蛍光基準粒子から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
（４）感度補正係数の２回目算出（Ｓ１２）
前記２回目検出Ｓ１１によって得られた値の統計、及び、前記初回検出Ｓ３によって得られた値の統計から、例えば、前記数式（２）を用いて、２回目の感度補正係数を算出する。
前記２回目検出Ｓ１１によって得られた値の統計、及び、前記初回検出Ｓ３によって得られた値の統計から、例えば、前記数式（２）を用いて、２回目の感度補正係数を算出する。
（５）感度補正係数の比較（Ｓ１３）
前記１回目の感度補正係数と２回目の感度補正係数とを比較し、例えば、前記数式（３）を満たすか否かの判定を行う。数式（３）を満たさない場合は、警告を発して測定を停止又は終了する。数式（３）を満たす場合には、次の微小粒子の通流Ｓ１４へと移る。
前記１回目の感度補正係数と２回目の感度補正係数とを比較し、例えば、前記数式（３）を満たすか否かの判定を行う。数式（３）を満たさない場合は、警告を発して測定を停止又は終了する。数式（３）を満たす場合には、次の微小粒子の通流Ｓ１４へと移る。
（６）微小粒子の通流（Ｓ１４）
次に、測定対象となる微小粒子（サンプル）を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態のサンプル流を形成する。
次に、測定対象となる微小粒子（サンプル）を、フローセル（流路Ｐ）内に通流させ、流体中に整列させた状態のサンプル流を形成する。
（７）微小粒子への２回目光照射（Ｓ１５）
サンプル流中に整列した微小粒子（サンプル）に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
サンプル流中に整列した微小粒子（サンプル）に対し、光照射部１３によって、光を照射する。
（８）微小粒子からの光情報の２回目検出（Ｓ１６）
前記光照射Ｓ１５によって、微小粒子（サンプル）から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
前記光照射Ｓ１５によって、微小粒子（サンプル）から発せられた光情報を、検出部１１によって検出する。
（９）スペクトルデータの生成（Ｓ１７）
前記２回目検出Ｓ１６によって得られた値を、前記２回目算出Ｓ１２によって得られた２回目の感度補正係数で補正することによりスペクトルデータを生成する。
前記２回目検出Ｓ１６によって得られた値を、前記２回目算出Ｓ１２によって得られた２回目の感度補正係数で補正することによりスペクトルデータを生成する。
以上のように、３回目以降は、Ｓ９〜Ｓ１７を繰り返すことにより、微小粒子測定を行うことができる。
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
微小粒子からの光を検出する検出部と、
前記検出部により検出された値を感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する情報処理部と、
を備え、
前記感度補正係数は、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を前記検出部で検出した値に基づいて特定される微小粒子測定装置。
（２）
前記検出部は、異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される、（１）記載の微小粒子測定装置。
（３）
前記所定の波長域幅は、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーする、（２）記載の微小粒子測定装置。
（４）
前記所定の波長域幅は４００〜８００ｎｍである、（１）から（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
前記情報処理部は、前記検出部により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する、（１）から（４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（６）
所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理部を備え、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理装置。
（７）
前記複数の受光素子は、それぞれ異なる検出波長域を有する、（６）記載の情報処理装置。
（８）
前記所定の波長域幅は、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーする、（７）記載の情報処理装置。
（９）
前記所定の波長域幅は４００〜８００ｎｍである、（６）から（８）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１０）
前記感度補正係数を記憶する記憶部を有する、（６）から（９）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１１）
前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子のリファレンス値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１０）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１２）
前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子を前記検出部で検出した初期値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１１）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１３）
前記情報処理部は、特定の受光素子で検出される値と各受光素子で検出される値とに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１２）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１４）
所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理工程を行い、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理方法。
（１）
微小粒子からの光を検出する検出部と、
前記検出部により検出された値を感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する情報処理部と、
を備え、
前記感度補正係数は、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を前記検出部で検出した値に基づいて特定される微小粒子測定装置。
（２）
前記検出部は、異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される、（１）記載の微小粒子測定装置。
（３）
前記所定の波長域幅は、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーする、（２）記載の微小粒子測定装置。
（４）
前記所定の波長域幅は４００〜８００ｎｍである、（１）から（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
前記情報処理部は、前記検出部により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する、（１）から（４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（６）
所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理部を備え、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理装置。
（７）
前記複数の受光素子は、それぞれ異なる検出波長域を有する、（６）記載の情報処理装置。
（８）
前記所定の波長域幅は、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーする、（７）記載の情報処理装置。
（９）
前記所定の波長域幅は４００〜８００ｎｍである、（６）から（８）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１０）
前記感度補正係数を記憶する記憶部を有する、（６）から（９）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１１）
前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子のリファレンス値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１０）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１２）
前記情報処理部は、前記蛍光基準粒子を前記検出部で検出した初期値と前記蛍光基準粒子から検出される検出値とからに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１１）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１３）
前記情報処理部は、特定の受光素子で検出される値と各受光素子で検出される値とに基づいて、感度補正係数を算出する、（６）から（１２）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１４）
所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出部で検出した値に基づいて、感度補正係数を特定する情報処理工程を行い、
前記感度補正係数は、前記検出部を構成する複数の受光素子それぞれに対して特定される情報処理方法。
１ 微小粒子測定装置
１１ 検出部
１２ 処理部
１３ 光照射部
１４ 分取部
１５ 記憶部
Ｐ 流路
１６ 表示部
１７ ユーザーインターフェース
１０ 情報処理装置
１１ 検出部
１２ 処理部
１３ 光照射部
１４ 分取部
１５ 記憶部
Ｐ 流路
１６ 表示部
１７ ユーザーインターフェース
１０ 情報処理装置
Claims (6)
- 微小粒子からの光を検出する、複数の受光素子から構成される検出部と、
前記検出部により検出された値を受光素子毎に特定された感度補正係数で補正し、スペクトルデータを生成する情報処理部と、
を備え、
各受光素子の前記感度補正係数は、
基準となる受光素子によって、４００〜８００ｎｍの波長域幅のスペクトルが得られる一種類の蛍光基準粒子から取得された値と、
補正対象となる受光素子によって、前記蛍光基準粒子から取得された値と、
に基づいて特定される微小粒子測定装置。 - 前記複数の受光素子は、それぞれ異なる検出波長域を有する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
- 前記所定の波長域幅は、前記複数の受光素子の検出波長域それぞれに対して少なくとも一部をカバーする、請求項１又は２に記載の微小粒子測定装置。
- 前記感度補正係数を記憶する記憶部を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の微小粒子測定装置。
- 前記情報処理部は、特定の受光素子で検出される値と各受光素子で検出される値とに基づいて、感度補正係数を算出する、請求項１から４のいずれか一項に記載の微小粒子測定装置。
- ４００〜８００ｎｍの波長域幅のスペクトルが得られる一種類の蛍光基準粒子からの光を複数の受光素子から構成される検出部で検出した値に基づいて、受光素子毎に感度補正係数を特定する情報処理工程を行い、
各受光素子の前記感度補正係数は、
基準となる受光素子によって、前記蛍光基準粒子から取得された値と、
補正対象となる受光素子によって、前記蛍光基準粒子から取得された値と、
に基づいて特定される情報処理方法。
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