JP5529505B2 - 蛍光分析装置のための機器セットアップシステム - Google Patents
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Description
本出願は、いずれも参照により本明細書に援用されている、2008年11月13日に出願された米国特許仮出願第61/199,312号の優先権を主張するものである。
本明細書で使用されている「基準物質」は、測定応答と測定されている物質の値との間に既知の関係を確立するのに使用することができる任意の物質を指す。基準物質は、既知の特性を有する物質に対する機器の応答を確立するのに使用することができる既知の蛍光特性を有する標準物質である。
以下により十分に記載されている通り、色素標識分析試薬のスピルオーバ値および他の蛍光特性は、通常、同じ色素で標識された標準粒子を使用して実験的に決定される。一般に、色素が検出試薬に結合されるか、または粒子を標識するのに使用される場合、色素の発光スペクトル、および延いてはスピルオーバは変更し、分析に使用される場合の色素の実際のスピルオーバは、標準粒子を使用して決定されるスピルオーバとは異なる。分析に使用される場合、すなわち抗体に結合する、つまりは細胞に結合する場合、最後の分析条件下で色素の蛍光特性に極めて近似する蛍光特性を示す標準粒子を使用することが望ましい。色素標識分析試薬の蛍光特性に極めて近似する蛍光特性を示すようになされた標準粒子は、本明細書では「スペクトル一致」標準物質(spectrally matched standard)または「蛍光一致」標準物質と呼ばれる。そのような標準物質は、当技術分野で周知である。例には、色素標識合成ビーズまたは染色された細胞から生成された蛍光一致標準物質が含まれる。
補正とは、一次色素以外の色素からのスピルオーバに因る寄与、すなわち二次色素からの寄与を、検出器チャネル内で検出された総光量から効率的に除去する行程を指す。したがって、補正後、単一の検出器チャネルから検出される光量は、単一の色素、具体的には一次色素により発せられた光の測定値を表す。補正は、独立した色素の各々の測定を実施することにより、複数の染色された粒子からのデータの分析を容易にする。
Oi=ΣSij・Dj(1)
と表すことができる。ここで、合計は、検出されるn個の色素全体に亘るものである。式(1)は、各検出器チャネルにつき1個の、n個の連立方程式をもたらす。
O=S・D (2)
と表すことができ、補正蛍光値Dが、上記式の両辺をスピルオーバ行列の逆数で左乗算すること
S-1・O=D (3)
により得られる。
スピルオーバ行列の逆数は、補正行列と呼ばれる。
フローサイトメータをセットアップする通常の方法には、光検出器利得が設定された後に決定される、各色素に対するスピルオーバ値(係数)の実験的決定が含まれる。実際には、この実験的決定は、通常、分析に使用される色素の蛍光特性に極めて近似するようになされた蛍光一致標準物質を使用して行われる。文脈から明らかな場合、色素で均一に標識された(染色された)粒子またはビーズの集団を使用して測定される、色素からのスピルオーバおよび色素のスピルオーバは、本明細書では同じ意味で使用される。
MFIと記される色素の測定蛍光強度は、光検出器利得に依存している。蛍光強度の利得独立性の較正測定値は、同一の機器設定および条件下で測定される基準物質に対して、いずれも同一検出器チャネルで測定される、基準物質の測定蛍光強度に対する色素の測定蛍光強度の比率として定義される。
特定の光検出器利得設定で集団から測定される未較正MFIは、式(5)を変換して、
二次チャネル内へのj番の色素の較正スピルオーバは、本明細書では、ABD単位で測定された一次チャネルの較正発光に対する、ABD単位で測定された二次チャネルの色素標識粒子集団の較正発光の比率、すなわちいずれもABD単位で較正され示される、一次チャネルのMFIに対する二次チャネルの色素標識粒子集団のMFIの比率と定義される。したがって、i番の検出器チャネル内へのj番の色素の較正スピルオーバNSijは、
NS=RFI-1・S・RFI (11)
および
S=RFI・NS・RFI-1 (12)
で示されており、式中、Sは、スピルオーバ係数Sijのn×n行列であり、NSは、較正スピルオーバ係数NSijのn×n行列であり、RFIは、i番の対角要素上に基準蛍光強度値RFIiを、かつ全非対角要素上にゼロを有するn×n行列である。
本発明の方法を使用して、機器セットアップは、以下のステップの1つまたは複数を含む。
2.光検出器利得設定を含む最初の機器設定を選択するステップ
3.選択された機器設定下で基準物質の蛍光を測定するステップ
4.選択された機器設定を調整するステップ
5.利得依存性の未較正スピルオーバ値を計算するステップ
6.選択された機器設定の補正を計算するステップ
ステップ2および3は、基準物質の蛍光の最初の測定後に、機器設定の調整を可能にするために繰り返されてもよい。これらのステップの各々は、以下により詳細に記載されている。
蛍光分析試薬の較正発光値および較正スピルオーバ値は、本明細書に記載の通り、各検出チャネルで、同一の機器設定下で、蛍光一致標準物質などの基準物質のMFIおよび色素標識集団のMFIを測定することにより得られる。較正値は、上記の通り計算される。
光検出器利得設定の最初の設定を含む最初の機器設定は、検討される分析に有用である可能性がある設定の近似として選択されることが好ましい。最初の設定は、その特定の分析に使用される試薬の期待蛍光に基づいて推定されたか、または恐らく以前に実施された実験で得られたデータを使用して実験的に決定された、機器に記憶されている初期値である可能性がある。光検出器利得設定の最初の設定を選択する方法は、当技術分野で周知である。
最初の機器設定を使用して、各検出器チャネルで基準物質の平均蛍光強度(MFI)が測定される。これらの測定値は、選択された検出器利得設定下で基準物質から観察される蛍光を示す、利得依存性の未較正測定値である。
分析試薬で染色された細胞集団の期待蛍光が、「尺度上に」または機器のダイナミックレンジ内にない場合、光検出器利得設定は調整されてもよい。色素標識分析試薬で染色された細胞集団のMFIは、対応する蛍光一致標準物質から測定されたMFIに比例すると考えられる。この比例は、実験的に決定することができるか、または細胞上または標準物質上の色素分子の相対平均数が既知であれば、推定することができる。選択された機器設定下で蛍光一致標準物質から測定されると考えられるMFIは、(所定の較正スピルオーバ値の一部として決定される)蛍光一致標準物質に対して決定される所定の較正蛍光値と、選択された機器設定下で測定される基準物質の蛍光値とから計算することができる。色素標識分析試薬で染色された細胞集団の期待MFIは、次いで、蛍光一致標準物質の計算されたMFIから推定される。期待データがデータ領域の所望の領域内に入らない場合は、1つまたは複数の光検出器利得を調整することができる。例えば、データが点のプロットで表示された場合、陰性試料からのデータは、軸に圧縮されていないことが望ましい。光検出器利得を増加させて、データを軸から離して移動させることができる。
前述の通り、利得依存性のスピルオーバ値は、所定の較正スピルオーバ値と利得設定とから計算される。特定の最初の光検出器利得設定下で、利得依存性の基準物質の蛍光のみを測定すれば十分である。
補正は、計算された利得依存性のスピルオーバ値から計算される。補正行列は、スピルオーバ行列の値を計算し、次いでスピルオーバ行列を反転させて補正行列を得るか、または同等に、補正行列内の値を直接計算するかのいずれかにより決定される。補正行列は、後の使用のために、機器またはソフトウェア内に記憶されていることが好ましい。
本実施例は、蛍光色素のスピルオーバを測定するのに有用で、好適な蛍光一致標準物質の調製を記載する。標準物質は、蛍光標識CD4特異的抗体を使用して染色された、固定ヒト血液中のCD4+リンパ球を含む。
好適なCD4特異的抗体は、いずれもBD Biosciences社(San Jose、CA)から入手可能で、種々の色素標識で標識されている、クローンSK3とクローンRPA−T4とから生成されたものを含む。色素標識製剤に加えて、これらの抗体もまた、精製抗体としてかつビオチンで標識されて入手可能であり、そのいずれかを使用して、新しい抗体‐色素複合体を生成することができる。これら2つの抗体のためにBD Biosciences社から入手可能な抗体‐色素複合体の例を、以下の表に示す。
(好ましくはEDTAで採取された)全血の試料(50〜200μL)が、30〜60分間、暗所で、血液0.1ml当たり1μg以下の色素複合体濃度で、抗体‐色素複合体で染色される。
基準物質の新しい製品ロットは、または新しい基準物質も、例えば基準物質の古いロットが時間と共に使い尽くされた場合など、最初に配合された基準物質の交換が必要になる場合があることが予想される。本発明の方法により、最小限の労力で、古い基準物質を新しい基準物質と交換することが可能になる。
Claims (22)
- 複数の検出器チャネルを使用して複数の蛍光色素を分析する機器において、一次検出チャネルで発光する蛍光色素の二次検出チャネル内へのスピルオーバを決定する方法であって、
a)前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルに光を放つ前記蛍光色素および前記基準物質の前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルでの発光を前記機器により測定することによって、較正スピルオーバ値を決定するステップであって、
(i)前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルにおいて各々検出された、前記蛍光色素の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比と、前記基準物質の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比を乗ずること、または、
(ii)前記一次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比と、前記二次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比を乗ずること、
によって前記較正スピルオーバ値は計算され、
b)調整された光検出器利得設定に前記機器を設定して使用し、第一の基準値を得る前記一次検出チャネル前記基準物質の発光および第二の基準値を得る前記二次検出チャネルにおける前記基準物質の発光を、前記機器によって測定するステップと、
c)前記較正スピルオーバ値と前記第一の基準値および前記第二の基準値を乗ずることによって、前記蛍光色素の前記二次検出チャネルへのスピルオーバ値を決定して前記蛍光物質のスピルオーバ値を得るステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記基準物質は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記機器がフローサイトメータであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 調整可能な光検出器利得を有する複数の検出器チャネルを使用して複数の蛍光色素を分析する機器において、一次検出チャネルで発光する蛍光色素の二次検出チャネル内への、光検出器利得設定の第2の設定以降の最後の設定に特異的なスピルオーバ値を決定する方法であって、
a)光検出器利得設定の第一の設定に調整された前記機器を使用して、前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルに光を放つ前記蛍光色素および前記基準物質の前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルでの発光を前記機器により測定することによって、較正スピルオーバ値を決定するステップであって、
(i)前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルにおいて各々検出された、前記蛍光色素の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比と、前記基準物質の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比を乗ずること、または、
(ii)前記一次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比と、前記二次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比を乗ずること、
によって前記較正スピルオーバ値は計算され、
b)光検出器利得設定の前記最後の設定に調整された前記機器を設定して使用して、第一の基準値を得る前記一次検出チャネルおよび第2の基準値を得る前記二次検出チャネルにおける前記基準物質の発光を、前記機器によって測定するステップと、
c)前記蛍光物質のスピルオーバ値を得るために、前記較正スピルオーバ値と前記第一の基準値および前記第二の基準値を係ることによって、前記蛍光色素の前記二次検出チャネルへのスピルオーバ値を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 光検出器利得設定の前記第1の設定と光検出器利得設定の前記第2の設定以降の最後の設定とは異なることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記蛍光色素からの前記発光の測定は、前記第一検出チャネルおよび前記第二検出チャネル内で、蛍光一致標準物質を使用して実施されることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、前記蛍光色素で標識された粒子を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、前記蛍光色素で標識されたハードダイ粒子を含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、血液試料中の細胞を含み、前記細胞は、前記蛍光色素で標識された抗体で染色されていることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記細胞は、固定ヒト血液試料中のCD4 + リンパ球であり、前記抗体はCD4に結合していることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記基準物質は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子を含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記機器はフローサイトメータであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 調整可能な光検出器利得を有する複数の検出器チャネルを使用して、複数の蛍光色素を分析する機器において、第一検出チャネルにおいて光を放つ蛍光色素の第二検出チャネルへの光検出器利得設定の第2の設定以降の最後の設定に特異的なスピルオーバ値を決定する方法であって、
前記機器によって、前記蛍光色素のために既定の較正スピルオー値が決定されており、前記機器を使用して光検出増幅設定の最初の設定に調整され、前記第一検出チャネルおよび前記第二検出チャネル内で光を放つ前記蛍光物質および前記基準物質の前記第一検出チャネルおよび前記第二検出チャネルにおける発光であり、
(i)前記一次検出チャネルおよび前記二次検出チャネルにおいて各々検出された、前記蛍光色素の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比と、前記基準物質の前記発光の前記一次検出チャネルに対する前記検出二次チャネルの比を乗ずること、または、
(ii)前記一次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比と、前記二次検出チャネルで測定された発光の前記基準物質に対する前記蛍光色素の比を乗ずること、
によって、蛍光前記既定の較正スピルオーバ値は計算され、
前記方法は、
a)光検出器利得設定の前記最後の設定に調整された前記機器を設定して使用して、第一の基準値を得る前記一次検出チャネルおよび第2の基準値を得る前記二次検出チャネルにおける前記基準物質の発光を、前記機器によって測定するステップと、
b)既定のスピリオーバ値と第一の基準値および第二の基準値の比を乗じて決定されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 光検出器利得設定の前記第1の設定と光検出器利得設定の前記第2の設定以降の最後の設定とは異なることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記蛍光色素からの前記発光の測定は、前記第一検出チャネルおよび前記第二検出チャネル内で、蛍光一致標準物質を使用して実施されることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、前記蛍光色素で標識された粒子を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、前記蛍光色素で標識されたハードダイ粒子を含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記蛍光一致標準物質は、血液試料中の細胞を含み、前記細胞は、前記蛍光色素で標識された抗体で染色されていることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記細胞は、固定ヒト血液試料中のCD4+リンパ球であり、前記抗体はCD4に結合していることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記基準物質は、複数の蛍光色素で標識された微小粒子を含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記機器はフローサイトメータであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 調整可能な光検出器利得を有する複数の検出器チャネルを使用して、複数の蛍光色素を分析する機器において、補正を決定する方法であって、前記光検出器の各々に対して、前記蛍光色素の1つは一次色素であり、前記方法は、
a)請求項1の方法を使用して、前記蛍光色素の各々に対する前記検出チャネルの各々内への、光検出器利得設定の前記最後の設定に特異的なスピルオーバ値を得るステップと、
b)前記スピルオーバ値から、光検出器利得設定の前記最後の設定に対する前記補正を計算するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
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