CN102435753A - 糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents
糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102435753A CN102435753A CN2011102577575A CN201110257757A CN102435753A CN 102435753 A CN102435753 A CN 102435753A CN 2011102577575 A CN2011102577575 A CN 2011102577575A CN 201110257757 A CN201110257757 A CN 201110257757A CN 102435753 A CN102435753 A CN 102435753A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hba1c
- add
- container
- fully
- mentioned
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种糖化血红蛋白HBA1C的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含HBA1C磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，HBA1C校准品、HBA1C质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。
Description
技术领域
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中糖化血红蛋白(HBA1C)含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术
糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。糖化血红蛋白于1958年被使用色谱法首次从其它类型的血红蛋白中分离出来，并于1968年被分类为一种糖蛋白。1969年，人们发现糖化血红蛋白在糖尿病患者中的数量增加。1975年研究者们得到了生成糖化血红蛋白的反应式。人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物是糖化血红蛋白，血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，所以可以观测到120天之前的血糖浓度。糖化血红蛋白的英文代号为HBA1C。糖化血红蛋白测试通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。糖化血红蛋白增高对人体的影响是多方面的，它可改变红细胞对氧的亲和力，使组织与细胞缺氧，加速心脑血管并发症的形成；可引起肾小球增厚，诱发糖尿病肾病(DN)；还可引起血脂和血粘滞度增高，是心血管病发生的重要因素。因此，监测糖化血红蛋白不论对糖尿病患者疾病控制情况，并发症的预测情况，还是糖尿病病人的筛选等方面都有重要的意义。从检测角度上来说，目前临床上用于测定HBA1C的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
过去以放免为代表的糖化血红蛋白(HBA1C)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。
磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种糖化血红蛋白(HBA1C)定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行HBA1C检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
本发明提供了一种糖化血红蛋白(HBA1C)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有HBA1C磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，校准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
所述的磁分离试剂含有标记有抗HBA1C单克隆抗体的磁性微球。
所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗HBA1C单克隆抗体。
所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。
所述稀释液是含有BSA溶液。
所述的校准品及质控品是含有一定量的HBA1C抗原的BSA蛋白溶液。
所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。
所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
本发明糖化血红蛋白(HBA1C)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：
1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7.95-8.05之间；
4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；
5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存。
二、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗HBA1C单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
5、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的HBA1C磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。
9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。
第二步：酶反应物制备过程
一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；
3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；
4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得。
二、碱性磷酸酶ALP与抗HBA1C单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；
3、向步骤3获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HBA1C单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置4℃下2小时；
4、将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜，收集保留液；
5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中；
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与HBA1C单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与HBA1C单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。
第三步：
反应增强剂配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。
第四步：
稀释液配制步骤，配制1L：
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；
3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
第五步：
校准品和质控品的配制：
校准品浓度分别为50、150、300、800、1600ng/ml；质控品浓度分别为150、800ng/ml。
第六步：
清洗浓缩液配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第七步：
底物溶液配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
本发明工作原理：本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标HBA1C单抗、结合着磁性微粒的HBA1C单克隆抗体及稳定增强剂。37℃孵育后，磁性微粒上结合的HBA1C单克隆抗体与酶标单克隆抗体分别与HBA1C分子的不同表位结合，形成“三明治”结构。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的HBA1C含量。在检测范围内，发光强度与样本中的HBA1C浓度成正比。
本发明的主要创新之处在于：
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；
3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，校准品、质控品，清洗液浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
具体实施方式
实施例1、
一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表1，以配制1L为例：
1、称取TRIS 4.58g和NaC16.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN 20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
3、调节PH计测量其PH值；用HCl或NaOH调PH，测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求；
4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；
5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为12个月；
磁珠缓冲液表1
二、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/ml；取2mg抗HBA1C单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为4.8mmg/ml)溶于PH 9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
2、计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
3、用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
4、将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到sigma216k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
5、取0.5ml磁珠，磁珠浓度为0.5g/ml，所述的磁珠直径在0.9μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
6、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
7、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37度15分钟，其中TRIS的加样量为1mg抗体加0.15mlTRIS；
8、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的HBA1C磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％ BSA，0.05％吐温-20，0.02％ NaN3，20％乙醇，4℃保存。
10、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀；
11、贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁分离试剂有效期为12个月；
实施例2
一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表2，以配制1L为例：
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
2、用HCl或NaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
3、称取BSA 3g倒入上述容器中；
4、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；
酶反应物稀释液表2
二、碱性磷酸酶(ALP)与抗HBA1C单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centriprep YM10浓缩管中，3000RPM离心大约20分钟，浓缩至1毫升。
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；
3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mg抗HBA1C单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为4.8mg/ml)，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4(硼氢化钠)溶液，混匀，再置4℃下2小时；
4、将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜，收集保留液；5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中；
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶100的比例添加1M Mgcl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与HBA1C单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与HBA1C单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。
实施例3
反应增强剂配制操作规程：配方见(表3)，以配制1L为例：
1、称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷，分子式：(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；
4、最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；
反应增强剂的配制(表3)
实施例4
稀释液配方见(表4)，以配制1L为例：
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；
3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
稀释液的配制(表4)
实施例5
校准品和质控品的配制：
1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表5
| 浓度 | 加入校准品稀释液体积 | 加入X体积 |
| A | V-A*V/X | A*V/X |
| B | V-B*V/X | B*V/X |
| C | V-C*V/X | C*V/X |
| D | V-D*V/X | D*V/X |
| E | V-E*V/X | E*V/X |
| 0F | V-F*V/X | F*V/X |
2、糖化血红蛋白(HBA1C)定量测定试剂盒HBA1C校准品原料(购于PPS公司，浓度为8.6mg/ml)用稀释液(具体配方见实施例4)配制成浓度点为50、150、300、800、1600ng/ml；质控品用稀释液配制的浓度点为150、800ng/ml。
3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
实施例6：
清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；
清洗浓缩液的配制(表6)
实施例7
底物溶液配制操作规程：配方见(表7)，以配制1L为例：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
化学发光底物的配制(表7)
本发明的测试方法如下
1、加15μl HBA1C校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。
2、加45μl酶反应物至每一试管中。
3、加45μl反应增强剂至每一试管中。
4、加30μl磁分离试剂至每一试管中。
5、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟。
6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
7、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。
8、重复步骤6、7、6一遍。
9、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
临床试验：
测定了240份正常人血清样本。血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，得出正常血清参考范围：4-6.5％。测定了妊期孕妇糖尿病患者120例，其中109例HBA1C水平均大于6.5％，发生巨大儿、早产的概率明显大于11例HBA1C小于6.5％的患者。
本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的HBA1C水平也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的HBA1C值作出诊断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的HBA1C浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定，用于其他体液样本中HBA1C浓度测定的可靠性未得到充分确认。
Claims (5)
1.一种糖化血红蛋白HBA1C的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含HBA1C磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，HBA1C校准品、HBA1C质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的HBA1C磁分离试剂含有标记有抗HBA1C单克隆抗体的磁性微球；
所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗HBA1C单克隆抗体；
所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液；
所述稀释液是含有BSA的溶液；
所述的校准品及质控品是含有一定量的HBA1C抗原的BSA溶液；
所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液；
所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：
一、磁分离试剂的制备过程
一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：
1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
3、调节PH，控制PH在7.95-8.05之间；
4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；
5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；
二)、磁分离试剂的制备过程
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗HBA1C单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心30min浓缩至0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；
5、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟，然后加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒；
6、用100ml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；
7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得权利要求1或2所述试剂盒中的磁分离试剂；
二、酶反应物的制备过程
一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：
1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；
3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；
4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；
二)、碱性磷酸酶ALP与抗HBA1C单克隆抗体的偶联
1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；
2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；
3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HBA1C单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置4℃下2小时；
4、将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；
5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中；
6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶ALP与抗HBA1C单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶AALP与抗HBA1C单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶反应物。
三、反应增强剂的制备过程，配制1L：
1、取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中，取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；
四、稀释液的制备过程，配制1L：
1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；
2、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；
3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；
五、HBA1C校准品和HBA1C质控品的配制：
HBA1C校准品中HBA1C抗原的浓度分别为50、150、300、800、1600ng/ml；HBA1C质控品中HBA1C抗原的浓度分别为150、800ng/ml；
六、清洗液浓缩液的制备过程，配制1L：
1、取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3、取0.2ml Proclin-300于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；
七、底物溶液的制备过程，配制1L：
1、取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；
2、取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 480，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
4.如权利要求1-3任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
1)、加15μl HBA1C校准品、HBA1C质控品、待测标本至对应试管底部；
2)、加45μl酶反应物至每一试管中；
3)、加45μl反应增强剂至每一试管中；
4)、加30μl磁分离试剂至每一试管中；
5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；
7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；
8)、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒，发光检测仪检测。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述待测标本为高值HOOK样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102577575A CN102435753A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102577575A CN102435753A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102435753A true CN102435753A (zh) | 2012-05-02 |
Family
ID=45983916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102577575A Pending CN102435753A (zh) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102435753A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102998463A (zh) * | 2012-11-29 | 2013-03-27 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 一种测量糖化血红蛋白的方法及试剂盒 |
| CN110726833A (zh) * | 2018-07-17 | 2020-01-24 | 上海瀚联诊断科技有限公司 | 一种血糖质控液配置方法 |
| CN110806450A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-18 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种糖化血红蛋白的液态校准品 |
| CN112730826A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-30 | 中南大学湘雅三医院 | 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1491359A (zh) * | 2001-05-18 | 2004-04-21 | ���Ͱ����ɷ�����˾ | 免疫测定 |
| CN101432626A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-05-13 | 神谷来克斯公司 | 用于肌钙蛋白分析的高灵敏系统和方法 |
| CN101493467A (zh) * | 2008-01-25 | 2009-07-29 | 上海伊思柏生物科技有限公司 | 定量测定糖化蛋白质的方法 |
| US20110070658A1 (en) * | 2009-05-20 | 2011-03-24 | Relia Diagnostic Systems, Inc. | Systems and methods for determining the percentage of glycated hemoglobin |
| CN201886026U (zh) * | 2010-12-10 | 2011-06-29 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 一种快速定量检测糖化血红蛋白免疫层析试纸条 |
-
2011
- 2011-08-31 CN CN2011102577575A patent/CN102435753A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1491359A (zh) * | 2001-05-18 | 2004-04-21 | ���Ͱ����ɷ�����˾ | 免疫测定 |
| CN101432626A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-05-13 | 神谷来克斯公司 | 用于肌钙蛋白分析的高灵敏系统和方法 |
| CN101493467A (zh) * | 2008-01-25 | 2009-07-29 | 上海伊思柏生物科技有限公司 | 定量测定糖化蛋白质的方法 |
| US20110070658A1 (en) * | 2009-05-20 | 2011-03-24 | Relia Diagnostic Systems, Inc. | Systems and methods for determining the percentage of glycated hemoglobin |
| CN201886026U (zh) * | 2010-12-10 | 2011-06-29 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 一种快速定量检测糖化血红蛋白免疫层析试纸条 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张阳: "糖化血红蛋白检测方法及临床应用", 《现代医药卫生》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102998463A (zh) * | 2012-11-29 | 2013-03-27 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 一种测量糖化血红蛋白的方法及试剂盒 |
| CN110726833A (zh) * | 2018-07-17 | 2020-01-24 | 上海瀚联诊断科技有限公司 | 一种血糖质控液配置方法 |
| CN110726833B (zh) * | 2018-07-17 | 2024-01-09 | 上海瀚联诊断科技有限公司 | 一种血糖质控液配置方法 |
| CN110806450A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-18 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种糖化血红蛋白的液态校准品 |
| CN110806450B (zh) * | 2019-11-14 | 2022-03-25 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种糖化血红蛋白的液态校准品 |
| CN112730826A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-30 | 中南大学湘雅三医院 | 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102435752B (zh) | 人的肌红蛋白(Myoglobin)定量测定试剂盒 | |
| CN102426246A (zh) | 人肌钙蛋白I(Troponin I)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102435738A (zh) | 肌酸激酶同工酶(ck-mb)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426256A (zh) | 糖类抗原19-9(ca19-9)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426245A (zh) | 细胞角质蛋白19片段(cyfra21-1)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102323419B (zh) | 地高辛(Digoxin)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102288766B (zh) | 糖类抗原15-3(ca15-3)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102323418A (zh) | B型利钠肽原前体(proBNP)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426236A (zh) | 胃蛋白酶原ii(pgii)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN107656044A (zh) | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及检测方法 | |
| CN102435741A (zh) | 人高敏c反应蛋白(hs-crp)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102288767B (zh) | 糖类抗原72-4(ca72-4)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426255A (zh) | 游离甲状腺素(ft4)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102323417B (zh) | 胃蛋白酶原i(pgi)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426249A (zh) | 促甲状腺激素(tsh)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102435755A (zh) | 总三碘甲状腺原氨酸(tt3)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102435751B (zh) | C肽(c-p)定量测定试剂盒 | |
| CN102435753A (zh) | 糖化血红蛋白(HbAlc)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102360014A (zh) | 甲胎蛋白(afp)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102323252A (zh) | 糖类抗原125(ca125)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102331502B (zh) | 人s100蛋白(s-100)定量测定试剂盒 | |
| CN101320041B (zh) | 一种快速定量检测c-反应蛋白的胶体金法及其应用 | |
| CN102435739A (zh) | 糖类抗原242(ca242)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102426248A (zh) | 促卵泡生成激素(fsh)定量测定试剂盒及其检测方法 | |
| CN102419372A (zh) | 神经元特异性烯醇化酶(nse)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20120502 |
|
| C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |