CN110806450B - 一种糖化血红蛋白的液态校准品 - Google Patents

一种糖化血红蛋白的液态校准品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种糖化血红蛋白的液态校准品包括以下组分：磷酸盐缓冲液、氯化钠、氯化钾、甘氨酸、Triton X‑100、BSA、NaN3和HBA1C。本发明的液体糖化血红蛋白校准品，能在液态下保持其蛋白含量的稳定。经试验测定在2～8℃条件下本发明的液体糖化血红蛋白校准品的在40天之内能保持蛋白含量不变，在37℃条件下在一周之内的蛋白含量保持不变，且最高蛋白含量可达14.5％。与市售的干粉校准品比较，本发明的校准品具有蛋白含量高，稳定性好，在一周之内不需经冷藏，改善了校准品的储存条件，大大的降低了生产运输和储存成本。

Description

一种糖化血红蛋白的液态校准品
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白的液态校准品。
背景技术
糖化血红蛋白(GHb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。它是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。因此，GHb可有效地反映糖尿病患者过去1～2个月内血糖控制的情况。GHb由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c约占70％，且结构稳定，因此被用作糖尿病控制的监测指标。
目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类：一类是基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同，如离子层析法、电泳等方法；另一类是基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中高效液相离子层析法(HPLC)被公认为金标准。
市面上常用的糖化血红蛋白校准品大都为冻干品，需冻干冷藏的苛刻生产条件，并且在使用前需要进行复溶。然而冻干粉在复溶过程中蛋白晶体不稳定，导致降低其蛋白含量。因此，使用冻干粉形态的糖化血红蛋白校准品进行检测往往会造成检测结果不准确。由此寻找一种形态稳定不易分解的糖化血红蛋白的液态校准品成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种糖化血红蛋白的液态校准品，本发明克服了传统校准品需要冻干储存的缺点，改善了校准品的生产存储条件，为医疗领域的项目检测提供了方便。
本发明采取的技术方案为：一种糖化血红蛋白的液态校准品，包括以下组分：磷酸盐缓冲液、氯化钠、氯化钾、甘氨酸、Triton X-100、BSA、NaN3和HBA1C。
优选地，所述糖化血红蛋白的液态校准品包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液10～100mmol/L、氯化钠0.1～20g/L、氯化钾0.05～3g/L、甘氨酸1～10g/L、Triton X-100 0.1～10g/L、BSA 0.5～10g/L、NaN3 0.1～3g/L和HBA1C 5.5～14.5％，所述的校准品的pH值为7.0～9.0。
优选地，所述糖化血红蛋白的液态校准品包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液20～50mmol/L、氯化钠5～10g/L、氯化钾0.05～2g/L、甘氨酸5～10g/L、Triton X-100 0.1～5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.1～2g/L和HBA1C 8.5～14.5％，所述的校准品的pH值为7.0～8.5。
优选地，所述糖化血红蛋白的液态校准品包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液50mmol/L、氯化钠9g/L、氯化钾0.4g/L、甘氨酸5g/L、Triton X-100 0.5g/L、BSA 5g/L、NaN30.5g/L和HBA1C 10.5％，所述的校准品的pH值为7.0～8.5。
优选地，所述糖化血红蛋白的液态校准品还包括去离子水。
本发明还提供一种如上所述糖化血红蛋白的液态校准品的制备方法，包括以下步骤：
S1：按照上述配方称量所需试剂加入到容器中，溶解充分混匀，调节溶液的pH值，经0.22μm滤膜过滤后，获得校准稀释液；所述校准稀释液包括以下组分：磷酸盐缓冲液、氯化钠、氯化钾、甘氨酸、Triton X-100、BSA、NaN3。
S2：取糖化血红蛋白加入上述步骤S1制备的校准稀释液中，调整浓度为5.5～14.5％，即得所述糖化血红蛋白校准液。
优选地，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液10～100mmol/L、氯化钠0.1～20g/L、氯化钾0.05～3g/L、甘氨酸1～10g/L、Triton X-100 0.1～10g/L、BSA0.5～10g/L、NaN3 0.1～3g/L，所述的校准稀释液的pH值为7.0～9.0。
优选地，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液20～50mmol/L、氯化钠5～10g/L、氯化钾0.05～2g/L、甘氨酸5～10g/L、Triton X-100 0.1～5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.1～2g/L和HBA1C 8.5～14.5％，所述的校准稀释液的pH值为7.0～8.5。
优选地，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液50mmol/L、氯化钠9g/L、氯化钾0.4g/L、甘氨酸5g/L、Triton X-100 0.5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.5g/L和HBA1C 10.5％，所述的校准稀释液的pH值为7.0。
本发明还提供了如上所述的所述糖化血红蛋白的液态校准品在检测糖化血红蛋白试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：本发明的液体糖化血红蛋白校准品，能在液态下保持其蛋白含量的稳定。经试验测定在2～8℃条件下本发明的液体糖化血红蛋白校准品的在40天之内能保持蛋白含量不变，在37℃条件下在一周之内的蛋白含量保持不变，且最高蛋白含量可达14.5％。与市售的干粉校准品比较，本发明的校准品具有蛋白含量高，稳定性好，在一周之内不需经冷藏，改善了校准品的储存条件，大大的降低了生产运输和储存成本。
附图说明
图1为试验组与对照组每个样本测值的相关系数示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种液态HBA1C校准品及其制备方法，具体步骤如下：
一、HBA1C校准稀释液准备：
1.稀释液配方(1L)
Figure BDA0002273386830000041
2.制备校准稀释液：按照上述配方称量所需试剂加入到烧杯中，溶解充分混匀，将溶液的pH值调节至8.0，定容至1L，经0.22μm滤膜过滤后存放于2～8℃。
二、糖化血红蛋白制备：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，采用亲和离子层析法制备得到纯度达96％以上的人糖化血红蛋白。
在室温条件下，取糖化血红蛋白加入上述制备的校准稀释液中，调整使其浓度为5.5％；
三、用高效液相离子层析法(HPLC)，对HBA1C校准品浓度进行测定，测定3次，取平均值作为校准品靶值。
实施例2
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的稀释液(1L)配方如下：
Figure BDA0002273386830000042
Figure BDA0002273386830000051
本实施例的Ph值为7.0；糖化血红蛋白浓度为5.5％。
实施例3
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的稀释液(1L)配方如下：
Figure BDA0002273386830000052
本实施例的pH值为9.0；糖化血红蛋白浓度为8.5％。
实施例4
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的稀释液(1L)配方如下：
Figure BDA0002273386830000053
Figure BDA0002273386830000061
本实施例的pH值为7.5；糖化血红蛋白浓度为10.5％。
实施例5
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的稀释液(1L)配方如下：
Figure BDA0002273386830000062
本实施例的pH值为8.5；糖化血红蛋白浓度为14.5％。
实施例6准确度检测
设置实验组与对照组，实验组为实施例1制备的液体糖化血红蛋白校准品，对照组为干粉糖化血红蛋白校准品。按照HBA1C生化试剂(广州科方生物技术股份有限公司，货号：HA2119)检测操作步骤，用上述HBA1C校准品校准试剂检测42份临床全血样本，实验结果如下表1与图1：
表1：一致性评价对比结果
Figure BDA0002273386830000071
由表1和图1结果可知，试验组与对照组每个样本测值的差值符合正态分布，说明两者测值没有系统性偏差；超出一致性界限范围的值共0个，符合预期要求(>95％数据在一致性界限内)，相关性判定系数R2＝0.9764＞0.95，说明该回归模型拟合度高，两种试剂相关性好；可以判断试验组与对照组测值具有一致性。
实施例7
将本发明实施例1～5制备的液体标准品与对照组的干粉标准品分别放入2～8℃冰箱保存和37℃恒温箱中保存，随后每天分别抽取一瓶进行平行检测，并记录数据，结果如表2～9所示。
表2-1液体5.5％校准品稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000081
表2-2干粉5.5％校准品复溶后稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000082
表3-1液体8.5％校准品稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000083
表3-2干粉8.5％校准品复溶后稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000091
表4-1液体10.5％校准品稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000092
表4-2干粉105％校准品复溶后稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000093
表5-1液体14.5％校准品稳定性测试(2-8℃)
Figure BDA0002273386830000094
表5-2干粉14.5％校准品复溶后稳定性测试(2-8℃)
1天 2天 3天 4天 5天 6天 7天 8天 9天 10天 11天 12天
14.4 14.5 14.6 14.5 14.6 14.5 14.5 14.6 14.3 14.3 14.2 14.3
13天 14天 15天 16天 17天 18天 19天 20天 21天 22天 23天 24天
14.1 14.1 13.9 13.8 1.34 13.5 13.4 12.8 12.8 12.9 12.5 12.5
25天 26天 27天 28天 29天 30天 31天 32天 33天 34天 35天 36天
12.1 12.1 11.8 11.7 11.4 11.1 11.1 10.7 10.5 10.2 9.8 9.9
表6-1液体5.5％校准品稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000101
表6-2干粉5.5％校准品复溶后稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000102
表7-1液体8.5％校准品稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000103
表7-2干粉8.5％校准品复溶后稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000104
表8-1液体10.5％校准品稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000105
表8-2干粉10.5％校准品复溶后稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000106
表9-1液体14.5％校准品稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000107
表9-2干粉14.5％校准品复溶后稳定性测试(37℃)
Figure BDA0002273386830000108
有上表2～9的结果可以看出，本发明的液体糖化血红蛋白校准品比干粉的稳定性较好，其随着蛋白浓度的增加，干粉校准品随着时间的递增其蛋白含量随之降低，而本发明的液体校准品蛋白含量基本保持不变，表明其具有很强的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种糖化血红蛋白的液态校准品，其特征在于，包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液10～100mmol/L、氯化钠0.1～20g/L、氯化钾0.05～3g/L、甘氨酸1～10g/L、Triton X-1000.1～10g/L、BSA 0.5～10g/L、NaN3 0.1～3g/L和HBA1C 5.5～14.5％，所述的校准品的pH值为7.0～9.0。
2.如权利要求1所述的糖化血红蛋白的液态校准品，其特征在于，包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液20～50mmol/L、氯化钠5～10g/L、氯化钾0.05～2g/L、甘氨酸5～10g/L、Triton X-100 0.1～5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.1～2g/L和HBA1C 8.5～14.5％，所述的校准品的pH值为7.0～8.5。
3.如权利要求2所述的糖化血红蛋白的液态校准品，其特征在于，包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液50mmol/L、氯化钠9g/L、氯化钾0.4g/L、甘氨酸5g/L、Triton X-100 0.5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.5g/L和HBA1C 10.5％，所述的校准品的pH值为7.0。
4.一种如权利要求1所述糖化血红蛋白的液态校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：按照配方称量所需试剂加入到容器中，溶解充分混匀，调节溶液的pH值，经0.22μm滤膜过滤后，获得校准稀释液；所述校准稀释液的配方包括以下组分：磷酸盐缓冲液、氯化钠、氯化钾、甘氨酸、Triton X-100、BSA、NaN3；
S2：取糖化血红蛋白加入上述步骤S1制备的校准稀释液中，调整浓度为5.5～14.5％，即得所述糖化血红蛋白校准液。
5.如权利要求4所述的液态校准品的制备方法，其特征在于，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液10～100mmol/L、氯化钠0.1～20g/L、氯化钾0.05～3g/L、甘氨酸1～10g/L、Triton X-100 0.1～10g/L、BSA 0.5～10g/L、NaN3 0.1～3g/L，所述的校准稀释液的pH值为7.0～9.0。
6.如权利要求5所述的液态校准品的制备方法，其特征在于，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液20～50mmol/L、氯化钠5～10g/L、氯化钾0.05～2g/L、甘氨酸5～10g/L、Triton X-100 0.1～5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.1～2g/L和HBA1C 8.5～14.5％，所述的校准稀释液的pH值为7.0～8.5。
7.如权利要求6所述的液态校准品的制备方法，其特征在于，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液50mmol/L、氯化钠9g/L、氯化钾0.4g/L、甘氨酸5g/L、Triton X-100 0.5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.5g/L和HBA1C 10.5％，所述的校准稀释液的pH值为7.0～8.5。
8.如权利要求6所述的液态校准品的制备方法，其特征在于，所述校准稀释液包括以下含量的组分：磷酸盐缓冲液50mmol/L、氯化钠9g/L、氯化钾0.4g/L、甘氨酸5g/L、Triton X-100 0.5g/L、BSA 0.5～5g/L、NaN3 0.5g/L和HBA1C 10.5％，所述的校准稀释液的pH值为7.0。
9.如权利要求1～3任一项所述的糖化血红蛋白的液态校准品在检测糖化血红蛋白试剂盒中的应用。
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