CN103197084B - 一种稳定的糖化血清蛋白检测试剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定的糖化血清蛋白的检测试剂及其应用，本试剂采用双试剂，将NBT储存在试剂R1的中性pH环境中从而解决了NBT在碱性环境中易析出，体系浑浊等问题。并且采用新的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214，显著改善测定的性能，而且对维护体系的透明有良好效果。试剂的准确度和稳定性良好，完全可以满足临床需要。
Description
技术领域
本发明涉及用于临床测定血清、血浆中糖化血清蛋白的含量的检测试剂及其应用。
背景技术
糖化血清蛋白（也称果糖胺）是血清中各种蛋白质在高糖作用下发生的非酶促糖化反应产物，血清蛋白糖化主要发生在蛋白质分子的赖氨酸残基上，其中以白蛋白为主，血清白蛋白的的半衰期为l7-19 d，测定GSP可反映测定前2～3周的平均血糖水平，因此在糖尿病(DM)的诊断，在近期监控和疗效评价方面有较大的意义。
目前检测GSP的方法很多，但各有利弊，如层析法操作步骤繁琐，且对设备要求高，不适合作为常规实验室的检测方法，而酶法试剂昂贵，不适合基层医院开展，NBT还原法被临床采用已经30多年了，NBT法测试血清中糖化血清蛋白含量的基本原理如下：血清果糖胺是一种大分子酮胺类化合物，在碱性条件下可将四氮唑蓝还原成紫色甲月替，其生成量与血清果糖胺成正比。用比色法在540nm（530~550nm）处，以糖化血清蛋白为校准品，测定反应中甲月替的生成量，从而得出血清果糖胺的浓度。本法具有价格低廉、结果准确快速、重复性好、可自动化批量分析、反映病情变化比糖化血红蛋白快而且费用低等优点，被临床采用已经30多年了，但是它也存在不少的问题和缺点，致实验结果不很稳定，临床评价欠佳。它主要有以下几个问题：标准的基质效应；容易受血清中还原性物质干扰；体系浑浊等。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定的糖化血清蛋白检测试剂，本发明为双试剂，将NBT储存在试剂R1的中性pH环境中，试剂R2提供反应所需的碱性环境，从而解决了NBT在碱性环境中易析出，体系浑浊等问题，本发明采用新的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214，不仅显著改善测定的性能，而且对维护体系的透明，防止出现脂浊，效果明显，相比之前所用的Brij35、Tritonx-100、聚乙烯醇单烷醚等有更好的效果，并且显著改善了试剂的稳定性；采用生理盐水配制的人血清白蛋白（40g/L）作为基质，加入适量果糖胺纯品（Sigma）并添加防腐剂，制成糖化血清蛋白测试的液体标准品和质控品，最大程度上消除基质效应对测试造成的影响，并且使用方便。
本发明的技术方案如下：
一种稳定的糖化血清蛋白检测试剂，其包括体积比为4:1的试剂R1、试剂R2及其对应的标准和质控血清：
所述试剂R1的组成为：
Tris-HCl缓冲液 pH=7.5，25℃ 0.1mol/L
NBT（氯化硝基氮蓝四唑） 0.408g/L
烷基糖苷APG1214 5g/L
胆酸钠 1g/L
尿酸酶 2.5KU/L
防腐剂NaN3 0.5g/L；
所述试剂R2的组分为：
碳酸钠缓冲液 pH=10.6，25℃ 0.4mol/L
防腐剂NaN3 0.5g/L；
所述标准和质控血清由下列方法制备而成：
标准血清的制备：向生理盐水配制的浓度为40g/L人血清白蛋白溶液中加入果糖胺纯品并添加防腐剂、稳定剂，使果糖胺浓度为292μmol/L，其在标准血清中的浓度为1g/L；质控血清制备过程同标准血清，其靶值及允许范围为 (220-330) μmol/L，优选275μmol/L。优选的，所述防腐剂为NaN3。
本发明同时提供了一种该试剂在检测糖化血清蛋白中的应用。
本发明采用液体双试剂NBT法测试血清中的糖化血清蛋白含量。与国内常见试剂盒相比，本试剂采用双试剂，将NBT储存在试剂R1的中性pH环境中从而解决了NBT在碱性环境中易析出，体系浑浊等问题。并且采用新的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214，显著改善测定的性能，而且对维护体系的透明有良好效果。试剂的准确度和稳定性良好，完全可以满足临床需要。
附图说明
图1为九强果糖胺试剂盒与实施例1试剂相关性实验图。
图2为不同表面活性剂对试剂影响图。
图3为试剂的稳定性对比实验图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例所描述的糖化血清蛋白的检测试剂，包括试剂R1、试剂R2及其对应的标准和质控血清：
1）其R1的组成为：
Tris-HCl缓冲液(pH=7.5，25℃) 0.1mol/L
NBT（氯化硝基氮蓝四唑） 0.408g/L
烷基糖苷APG1214 5 g/L
胆酸钠 1g/L
尿酸酶 2.5KU/L
防腐剂NaN3 0.5g/L
2）试剂R2的组分为：
碳酸钠缓冲液(pH=10.6，25℃) 0.4mol/L
防腐剂NaN3 0.5g/L。
3）标准和质控血清：
向生理盐水配制的人血清白蛋白（40g/L）溶液中加入适量果糖胺纯品（Sigma）并添加1g/L的NaN3 ，使果糖胺的浓度为292μmol/L。质控血清制造过程与标准血清相同，其靶值为275μmol/L。
4）糖化血清蛋白检测试剂，在使用时，测定方法如下：
本实施例描述的糖化血清蛋白检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：
表1 糖化血清蛋白检测试剂检测方法
计算：糖化血清蛋白含量（μmol/L）＝（?A测定/min÷?A标准/min）×C标准。
相关性实验
利用上述配方中配比配制试剂，与国家食品药品监督管理局认可的九强公司的果糖胺测定试剂盒 (NBT法，液体单试剂)进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表2所示，如图1所示，并获得了两种试剂的相关性曲线，通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9993，说明了两者有极大的相关性。
表2 实施例1试剂与九强果糖胺测定试剂盒 (NBT法)对比检测结果
不同表面活性剂对试剂稳定性的影响
将如下5种试剂：
A试剂：按实施例1配方配制，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；B试剂：除R1中表面活性剂由烷基糖苷APG1214改为Brij35外，其余均与实施例1相同，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；C试剂：除R1中表面活性剂由烷基糖苷APG1214改为Tritonx-100外，其余均与实施例1相同，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；D试剂：除R1中表面活性剂由烷基糖苷APG1214改为聚乙烯醇单烷醚外，其余均与实施例1相同，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；E试剂：除R1中不加表面活性剂由烷基糖苷APG1214外，其余均与实施例1相同，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天分别取出A、B、C、D、E中的一组来检测定值血清（理论浓度为260μmol/L），检测结果如图2所示：可以看出，加入表面活性剂可显著改善试剂的稳定性，但烷基糖苷APG1214比Brij35、Tritonx-100、聚乙烯醇单烷醚效果更好，试剂更稳定。
试剂的稳定性对比试验
对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6mL；并且取13组九强的果糖胺（GSP）测定试剂盒作对照，每组20ml。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测定值血清（理论浓度为260μmol/L），检测结果如图3所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比九强的果糖胺试剂盒更加稳定，说明新的表面活性剂烷基糖苷APG1214可以显著改善试剂的稳定性。
通过以上相关性和稳定性试验验证，说明本发明与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，是一种更加稳定、良好的糖化血清蛋白检测试剂。
Claims (4)
1.一种稳定的糖化血清蛋白检测试剂，其包括体积比为4:1的试剂R1、试剂R2及其对应的标准和质控血清：
所述试剂R1的组成为：
Tris-HCl缓冲液 pH=7.5，25℃ 0.1mol/L
NBT（氯化硝基氮蓝四唑） 0.408g/L
烷基糖苷APG1214 5g/L
胆酸钠 1g/L
尿酸酶 2.5KU/L
防腐剂NaN3 0.5g/L；
所述试剂R2的组分为：
碳酸钠缓冲液 pH=10.6，25℃ 0.4mol/L
防腐剂NaN3 0.5g/L；
所述标准和质控血清由下列方法制备而成：
标准血清的制备：向生理盐水配制的浓度为40g/L人血清白蛋白溶液中加入果糖胺纯品并添加防腐剂、稳定剂，使果糖胺浓度为292μmol/L，质控血清制备过程同标准血清，其靶值及允许范围为 (220-330) μmol/L。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述防腐剂为NaN3 ，其在标准血清中的浓度为1g/L。
3. 根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，质控血清的靶值为275μmol/L。
4.权利要求1-3中任一项所述的检测试剂在检测糖化血清蛋白中的应用。
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