CN107247138B - 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法 - Google Patents

一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107247138B
CN107247138B CN201710602083.5A CN201710602083A CN107247138B CN 107247138 B CN107247138 B CN 107247138B CN 201710602083 A CN201710602083 A CN 201710602083A CN 107247138 B CN107247138 B CN 107247138B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liquid
coating
plate
dimer
microlitres
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710602083.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107247138A (zh
Inventor
王贤俊
何丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201710602083.5A priority Critical patent/CN107247138B/zh
Publication of CN107247138A publication Critical patent/CN107247138A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107247138B publication Critical patent/CN107247138B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于测定D‑二聚体含量的化学发光板的包被方法，其包括以下步骤：①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，②选取聚苯乙烯微孔板，③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗3次，每次5min；④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1.5h，用清洗液清洗3次，每次5min；⑤再每孔加入50微升的保护液，低温，风干。本发明的包被方法能够准确地对D‑二聚体的含量进行定量定性分析，该化学发光板的包被方法能够提升检测试剂盒的性能指标，使其具有较高的灵敏度，较宽的线性范围等特点。

Description

一种用于测定D-二聚体含量的化学发光板的包被方法
技术领域
本发明涉及D-二聚体含量检测技术领域，尤其是一种用于测定D-二聚体含量的化学发光板的包被方法。
背景技术
目前，D-二聚体的含量检测是深静脉血栓，肺栓塞，弥漫性血管内凝血等疾病的关键指标。这些疾病会造成体内凝血系统或纤溶系统的激活，从而造成D-二聚体水平的升高，而且这种凝血系统或纤溶系统的激活与疾病的病期、严重程度、治疗情况密切相关，因而在这些疾病中检测D-二聚体的水平，可以作为疾病分期、判断预后和指导治疗的一项评判标志。
目前，应用较多的D-二聚体检测方法主要有：酶联免疫吸附试验、乳胶颗粒凝集试验、免疫过滤胶体金染色法、双抗体RBC凝集法和放免法。临床最常用的是：酶联免疫吸附试验、乳胶颗粒凝集试验和免疫过滤胶体金染色法，其中乳胶颗粒凝集试验法测定速度快，但敏感度不如酶联免疫吸附试验法；酶联免疫吸附试验法敏感度高，但检测时耗时较长。
化学发光免疫分析是灵敏度较高的一种检测技术，其具有标记物稳定性好，无污染，操作简单等优点，该方法能够很好的弥补上述其他方法的不足。包被抗体的化学发光板是化学发光免疫分析检测试剂盒中重要的一部分，它是检测D-二聚体含量的基体，对于该发光板包被的处理能够反应该检测试剂盒的性能指标。该检测试剂盒的性能指标的准确度和灵敏度等性能的好坏，对于血清中D-二聚体含量的测定发挥重要的作用，能为临床诊断、监测治疗提供科学依据。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种用于测定D-二聚体含量的化学发光板的包被方法，该化学发光板的包被方法能够准确地对血清中D-二聚体的含量进行定量定性分析，该化学发光板的包被方法能够提升检测试剂盒的性能指标，使其具有较高的灵敏度，较宽的线性范围等特点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种测定D-二聚体含量中化学发光板的包被方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，所述包被液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、2.5ug/mL的D-二聚体抗体、质量分数为0.05％的Brij-35、质量分数为1.5％的蔗糖、质量分数为2％的甘油、质量分数为0.03％的PC-300组成；所述2.5ug/mL的D-二聚体抗体制备过程如下：选取D-二聚体抗体，加入50微升复合酶液，酶切过程中温度条件为37℃，时间为2h；所述清洗液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.03％的Tween-80组成；所述复合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比例为0.5∶0.1；所述偶联液采用2mM的N，N’-羰基二咪唑的醇溶液；所述保护液采用质量分数为60％的甘油-磷酸盐缓冲液；
②选取材质为96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，
③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1.5h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保护液，低温，风干。
采用上述方案，本发明的发光板的包被方法对于某些干扰物有较好的抵抗能力，如类风湿因子等，其灵敏度高、简便快速、抗干扰能力强，在D-二聚体含量的测定中发挥重要作用，能够为临床诊断、监测治疗提供科学依据。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为本发明具体实施例6试剂方法与参考方法检测结果相关分析图，采用化学发光仪，对40个血清样本进行测定，并对其进行相关分析。其中相关系数：r2＝0.996，线性方程为：y＝1.008x-0.004。
具体实施方式
本发明的保护范围不局限于下述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。本发明的具体实施例所采用的测定D-二聚体含量中化学发光板的包被方法，其包括以下步骤：
①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，其中，
包被液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、2.5ug/mL的D-二聚体抗体、质量分数为0.05％的Brij-35、质量分数为1.5％的蔗糖、质量分数为2％的甘油、质量分数为0.03％的PC-300组成；所述2.5ug/mL的D-二聚体抗体制备过程如下：选取D-二聚体抗体，加入50微升复合酶液，酶切过程中温度条件为37℃，时间为2h；所述清洗液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.03％的Tween-80组成；所述复合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比例为0.5∶0.1；所述偶联液采用2mM的N，N’-羰基二咪唑的醇溶液；所述保护液采用质量分数为60％的甘油-磷酸盐缓冲液；
②选取材质为96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，
③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1.5h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保护液，低温，风干。
具体实施例1
自4℃冰箱中取出D-二聚体的测定试剂盒，该试剂盒中包括有D-二聚体抗体酶结合物、D-二聚体抗体包被板、校准品、质控品、浓缩洗涤液、洗涤稀释液、发光底物A和发光底物B，D-二聚体抗体酶结合物中D-二聚体抗体浓度为2.5ug/mL，D-二聚体抗体包被板为白色不透明的96孔聚苯乙烯塑料板，D-二聚体标准品的校准品浓度分别为0ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，D-二聚体标准品的稀释液采用质量分数为0.9％的生理盐水，质控品包括D-二聚体抗原、质量分数为0.1％的BSA、质量分数为0.9％的氯化钠、10mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％的PC-300，浓缩洗涤溶液包括150mM的pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％的PC-300，150mM的pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中含有体积分数为0.1％的Brii-35，洗涤稀释液采用由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾组成的磷酸盐缓冲液，发光底物A包括20mM的3-氨基邻苯二甲酰肼、15g/L的甘氨酸、5mM的硫酸镁的100mM碳酸钾，发光底物B包括体积分数为10％的过氧化氢、15mM的磷酸缓冲液。
试剂盒取出后，室温平衡15分钟，然后按下表程序进行操作：
D-二聚体加样测定程序表
单位：μL
注：待测样品的浓度计算按下列方法进行：用化学发光分析仪中的数据处理程序(拟合类型：线性拟合，坐标选择：log(X)-log(Y)，实验方法：夹心法。)直接给出校准曲线及样品的浓度值。
该包被板的类风湿因子干扰试验：板一包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为0.5∶0.1处理过的；板二包被液中的抗体是由胃蛋白酶处理过的；板三包被液中的抗体是由木瓜蛋白酶处理过的；板四包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为0.5∶0.3处理过的；板五包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为0.5∶0.5处理过的；同体积的混合血清分别加入不同浓度的类风湿因子，如50U/L，120U/L，150U/L；检测结果如下表。
名称 50(U/L) 120(U/L) 150(U/L)
板一 49.5 120.3 159.9
板二 45.1 113.5 100.7
板三 45.9 115.1 99.8
板四 51.9 127.9 149.6
板五 52.9 124.1 151.2
通过试验结果综合比较表明，板一的实际浓度与理论浓度的差异较小，并且在测定类风湿因子小于120U/L时无干扰。
具体实施例2
通过上述具体实例1的结果，选择包被板一继续检测该包被板的溶血干扰，脂血干扰，胆红素干扰试验：将15mg/L的血红蛋白(Hb)配制成不同浓度的血红蛋白(Hb)，分别加入同体积的无溶血血清中，检测其D-二聚体的含量；将一定浓度的脂肪乳取不同体积加入到相同体积的混合血清中，检测其D-二聚体的含量；将一定浓度的胆红素取不同体积加入到相同体积的混合血清中，检测其D-二聚体的含量；检测结果如下表。
通过试验结果综合比较表明，加入不同浓度干扰物情况下，检测目的物质实际浓度与理论浓度的差异比较，当血红蛋白(Hb)浓度小于10mg/L，甘油三酯(TG)浓度小于2.50ug/mL，胆红素浓度小于4.00ug/mL对D-二聚体的含量检测无干扰。
具体实施例3
精密度的检测：对化学发光板的批内精密度和批间精密度的进行测定，结果如下：
批内精密度：对某一血清样本测定10次，对下述数据计算，批内精密度差异结果为1.74％，测得差异较小。
批间精密度：选取3个不同批次的发光板，分别对某一血清样本测定10次，结果如下表格所示，分别算出3批浓度的差异结果为2.98％，3.09％，1.13％；3个3个不同批次的发光板相比较，差异变化较小。
具体实施例4
包被液中抗体酶切条件的筛选：由于类风湿因子容易与抗体结合，对目的物的测定结果产生较多干扰，利用酶切抗体的方式，增强该板的抗干扰能力，对D-二聚体的含量进行测定，酶切条件和结果如下表：
综合上述试验结果表明：酶切条件在37℃，时间为2h时，理论浓度与实际浓度差异最小。
具体实施例5
包被过程中偶联条件的筛选：由于抗体在结合过程中的结合速度受时间和温度条件影响较大，为了使操作简便，提升包被效率，对D-二聚体的含量进行测定，偶联条件和结果如下表：
综合上述试验结果表明：偶联条件在室温，时间为1.5h时，理论浓度与实际浓度差异最小。
具体实施例6
相关性检测：选取40个血清样本，分别用已有酶联免疫方法的检测试剂盒作为参考方法与上述制备发光板的检测结果作为试验方法，二者进行相关分析，结果显示线性关系良好，检测结果如下：

Claims (1)

1.一种用于测定D-二聚体含量的化学发光板的包被方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，所述包被液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、2.5μg/mL的D-二聚体抗体、质量分数为0.05％的Brij-35、质量分数为1.5％的蔗糖、质量分数为2％的甘油、质量分数为0.03％的PC-300组成；所述2.5μg/mL的D-二聚体抗体制备过程如下：选取D-二聚体抗体，加入50微升复合酶液，酶切过程中温度条件为37℃，时间为2h；所述清洗液由15mM的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.03％的Tween-80组成；所述复合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比例为0.5∶0.1；所述偶联液采用2mM的N，N’-羰基二咪唑的醇溶液；所述保护液采用质量分数为60％的甘油-磷酸盐缓冲液；
②选取材质为96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，
③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1.5h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；
⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保护液，低温，风干。
CN201710602083.5A 2017-07-21 2017-07-21 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法 Active CN107247138B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710602083.5A CN107247138B (zh) 2017-07-21 2017-07-21 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710602083.5A CN107247138B (zh) 2017-07-21 2017-07-21 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107247138A CN107247138A (zh) 2017-10-13
CN107247138B true CN107247138B (zh) 2019-01-29

Family

ID=60014657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710602083.5A Active CN107247138B (zh) 2017-07-21 2017-07-21 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107247138B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107703291A (zh) * 2017-11-23 2018-02-16 中山市创艺生化工程有限公司 用于发光免疫分析法的浓缩缓冲液及其制备方法
CN108445214A (zh) * 2018-02-02 2018-08-24 浙江艾明德生物科技有限公司 一种定量检测d-二聚体的试剂盒及制备方法
CN111812330A (zh) * 2020-06-23 2020-10-23 江苏奥雅生物科技有限公司 一种用于d-二聚体检测的试剂盒
CN115290892B (zh) * 2022-06-28 2023-04-21 北京美联泰科生物技术有限公司 一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101819202A (zh) * 2010-05-06 2010-09-01 上海太阳生物技术有限公司 D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)
CN102346192A (zh) * 2010-07-27 2012-02-08 希森美康株式会社 D二聚体测定用试剂
CN104977404A (zh) * 2015-07-07 2015-10-14 宁波瑞源生物科技有限公司 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂
CN105102981A (zh) * 2012-09-28 2015-11-25 积水医疗株式会社 免疫学检测方法和免疫学检测试剂
CN105597846A (zh) * 2015-10-26 2016-05-25 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 一种d-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片
CN205301329U (zh) * 2015-12-22 2016-06-08 天津脉络生物科技有限公司 D-二聚体和纤维蛋白原elisa试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7749722B2 (en) * 2005-12-15 2010-07-06 Mitsubishi Kagaku Istron, Inc. Measuring method using whole blood

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101819202A (zh) * 2010-05-06 2010-09-01 上海太阳生物技术有限公司 D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)
CN102346192A (zh) * 2010-07-27 2012-02-08 希森美康株式会社 D二聚体测定用试剂
CN105102981A (zh) * 2012-09-28 2015-11-25 积水医疗株式会社 免疫学检测方法和免疫学检测试剂
CN104977404A (zh) * 2015-07-07 2015-10-14 宁波瑞源生物科技有限公司 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂
CN105597846A (zh) * 2015-10-26 2016-05-25 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 一种d-二聚体定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片
CN205301329U (zh) * 2015-12-22 2016-06-08 天津脉络生物科技有限公司 D-二聚体和纤维蛋白原elisa试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A rapid and quantitative D-Dimer assay in whole blood and plasma on the point-of-care PATHFAST analyzer;Teruko Fukuda et al;《Thrombosis Research》;20070220;第120卷;第695-701页

Also Published As

Publication number Publication date
CN107247138A (zh) 2017-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thachil et al. D-dimer testing: laboratory aspects and current issues
CN107247138B (zh) 一种用于测定d-二聚体含量的化学发光板的包被方法
CN102393456B (zh) 一种用于检测hps的试剂盒
CN101881777A (zh) 超敏c反应蛋白检测方法及超敏c反应蛋白检测试剂盒
CN104977400A (zh) 一种不孕不育联合检测试剂盒及其检测方法
CN102866256B (zh) 一种超敏c反应蛋白检测方法及检测试剂
CN109212204A (zh) 一种乳胶免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒
CN107525933A (zh) 一种d‑二聚体的测定试剂盒及其应用方法
CN104569410B (zh) 一种快速定量检测d-二聚体的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
CN109613232A (zh) 一种完全均相测定脂联素的检测试剂盒及检测方法
JP4272066B2 (ja) Ｃａ１９−９の測定による敗血症の検出方法
CN106645745A (zh) 一种快速定量检测微量白蛋白的均相荧光免疫试剂及制备与检测方法
CN111999506B (zh) 一种d-二聚体检测试剂盒及其制备方法
CN106526198A (zh) 一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白（pa）的方法
CN104833810A (zh) 一种补体c3检测方法
CN105203533A (zh) 一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂
JP4272065B2 (ja) Ｃａ１２５の測定による敗血症の検出方法
CN107525936A (zh) 一种提升胶乳免疫比浊法中肌钙蛋白抗体稳定性的组合物
CN107576803A (zh) 一种s100蛋白检测试剂盒及其制备和使用方法
Coen Herak et al. Evaluation of the Innovance D-DIMER analytical performance
CN106501526A (zh) 一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白（pa）的试剂盒
CN103558398B (zh) 一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
Legnani et al. A new rapid bedside assay for quantitative testing of D-Dimer (Cardiac D-Dimer) in the diagnostic work-up for deep vein thrombosis
CN103175970A (zh) Ca19-9定量检测试剂盒及其制备方法
CN110346569A (zh) 一种胸苷激酶化学发光法检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant