CN103175970A - Ca19-9定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种CA19-9定量检测试剂盒,包括:多个浓度不同的CA19-9校准品,CA19-9抗体包被的微孔板,CA19-9抗体的酶标记物,发光底物液和浓缩洗涤液。本发明的CA19-9定量检测试剂盒具有灵敏度高,线性范围宽,光信号持续时间长,分析简便快速,结果稳定,误差小,安全性好,使用期长等有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物物质检测分析领域,特别涉及一种CA19-9定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
在过去二三十年以来,恶性肿瘤发病率一直呈上升的趋势,每年以3%至5%的速度增加,成为人类死亡的重要原因。以2002年为例,当年全世界新发肿瘤是1100万例,死亡病例达到700万,治愈和带瘤生存达2500万。肿瘤的早期诊断和治疗对提高治愈率、改善生活质量和延长生存期至关重要。肿瘤标志物的血清含量水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等有良好的相关性,检测这些肿瘤标志物的血清水平,对相关恶性肿瘤的早期诊断、治疗效果和预后转归判断等有重要参考价值,目前已在临床广泛应用。
肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身合成、释放或者由机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质。1978年由Herberman在美国召开的人类免疫与肿瘤免疫诊断会上提出,次年在英国第7届肿瘤发生生物学和医学会议被确认并开始引用。糖类抗原CA19-9是一种重要的肿瘤标志物之一。CA19-9是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物,为细胞膜上的糖脂质,因由鼠单克隆抗体116NS19-9识别而命名。CA19-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在,分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处,是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原。大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明显增高。如果以正常参考范围上限(37U/mL)为诊断标准,敏感性和特异性均可达90%以上。CA19-9水平与肿瘤的阶段有关,血清中含量的高低提示手术的难易程度。术前CA19-9水平对预后有一定提示作用,低者预后较好,术后CA19-9水平降至正常者生存期长于未下降者。肿瘤复发时,CA19-9可再度升高,并且发生于影像学诊断之前。因此,CA19-9水平还可用作监测肿瘤的复发。
目前发现的用于肿瘤筛查诊断的标志物大都在患者体内含量很低,一般的检测方法不够敏感,难于精确定量测定。因此,敏感、准确、简便、快速的肿瘤标志物检测方法具有十分重要的临床应用价值。
发明内容
本发明实施例提供一种CA19-9定量检测试剂盒及其制备方法,用于解决现有技术中无法实现定量测定微量标志物的技术问题。
本发明提供的一种CA19-9定量检测试剂盒,包括:多个浓度不同的CA19-9校准品,CA19-9抗体包被的微孔板,CA19-9抗体的酶标记物,发光底物液和浓缩洗涤液。
其中,多个CA19-9校准品为6个,浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的包被浓度为5μg/mL。CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体,稀释倍数为1∶2000。发光底物液为鲁米诺发光底物液,鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液,其中底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚,底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。
本发明还提供一种CA19-9定量检测试剂盒的制备方法,包括:制备多个浓度不同的CA19-9校准品;制备CA19-9抗体包被的微孔板;制备CA19-9抗体的酶标记物;制备化学发光底物液;以及制备浓缩洗涤液。
其中,制备多个浓度不同的CA19-9校准品包括:通过稀释配制6个校准品,浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。
制备CA19-9抗体包被的微孔板包括:将浓度为5μg/mLCA19-9抗体加入微孔板,置于4℃冰箱24小时;去除微孔板中的包被液后加入封闭液,置于4℃冰箱封闭24小时;去除微孔板中的封闭液后,置于37℃孵育箱8小时烘干。
制备CA19-9抗体的酶标记物包括:通过戊二醛二步法制得辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体,稀释倍数为1∶2000。
化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液,鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液;底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得,其中鲁米诺浓度为1.8g/L,对碘苯酚浓度为0.2g/L;底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得,其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。
本发明通过采用多个校准品和增强型发光体系,具有灵敏度高,线性范围宽,光信号持续时间长,分析简便快速,结果稳定,误差小,安全性好,使用期长的有益效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明的限定。在附图中:
图1为本发明实施例一的CA19-9定量检测试剂盒的制备方法的流程图。
图2为本发明的试剂盒与进口试剂盒所测CA19-9浓度的相关性分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合附图对本发明实施例作进一步详细说明。在此,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
实施例一
本实施例提供一种CA19-9定量检测试剂盒,包括:多个浓度不同的CA19-9校准品,CA19-9抗体包被的包被微孔板,CA19-9抗体的酶标记物,发光底物液和浓缩洗涤液。
其中,优选CA19-9校准品为6个,浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的浓度为5μg/mL。CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体,稀释倍数为1∶2000。发光底物液为鲁米诺发光底物液,鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液,其中底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚,底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。浓缩洗涤液为30倍浓缩洗涤液,具体为加入浓度为1.5g/L的吐温-20和浓度为0.05%PC300防腐剂的0.3M pH7.4的磷酸盐缓冲液。
该CA19-9定量检测试剂盒的使用步骤包括:
(1)用蒸馏水将30倍浓缩洗涤液稀释30倍,混匀后使用;
(2)在包被微孔板上设多个校准品孔和样品孔,优选为6个校准品孔;
(3)校准品孔加入校准品,样品孔加入待测样品,每孔加入25μL,然后加入CA19-9抗体的酶标记物溶液75μL,37℃温育60分钟。
(4)用洗涤液洗涤微孔板5次,拍干。
(5)每孔加入发光底物A液和B液各50μl,混匀,室温避光放置5~10分钟。
(6)用化学发光分析仪测量各孔的相对发光值(RLU)。
(7)以校准品测定结果绘制剂量-反应曲线。
(8)从剂量-反应曲线上求出对应样本RLU的CA19-9含量,即为该样品的CA19-9浓度。
实施例二
如图1所示,图1是本发明实施例提供的一种CA19-9定量测定试剂盒的制备方法流程图,包括:
步骤S110:制备多个浓度不同的CA19-9校准品;
步骤S120:制备CA19-9抗体包被的包被微孔板;
步骤S130:制备CA19-9抗体的酶标记物;
步骤S140:制备化学发光底物液;
步骤S150:制备浓缩洗涤液。
对于上述方法,详细说明如下:
(一)CA19-9校准品的配制方法
用稀释液配制6管(A、B、C、D、E、F)校准品,稀释液含0.05M pH7.4的PBS,50%小牛血清,2%甘油和0.1%PC300防腐剂。校准品中CA19-9的浓度分别为A管0U/mL、B管5U/mL、C管30U/mL、D管100U/mL、E管200U/mL及F管400U/mL。其中PC300为防腐剂,其活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。这两种成分可以抑制细胞的生长,有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长,是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等的生物防腐剂。本实施例通过采用多个校准品,使得检测结果更准确,更可靠。
(二)CA19-9抗体包被微孔板的制备
微孔板为96孔的不透明聚苯乙烯微孔板。
配制0.05M pH9.6碳酸盐的缓冲液,配制方法是称取2.2克的Na2CO3和1.0克NaHCO3溶于100ml蒸馏水中,混匀备用。
配制0.05M pH7.4PBS封闭液,配置方法是称取0.3克NaH2PO4·2H2O、1.85克KH2PO4·3H2O和1.8克氯化钠溶于200ml蒸馏水中,混匀后加入0.2克牛血清白蛋白和200μl PC300,混匀备用。
包被步骤具体包括:
(1)用缓冲液将CA19-9单抗稀释成包被浓度为5μg/mL的包被液,以每孔100μl方式将包被液加入微孔板,然后置于4℃冰箱24小时。
(2)除去微孔板中的包被液,以每孔150μl加入0.05M pH7.4PBS封闭液,置于4℃冰箱封闭24小时。
(3)除去封闭液后,置于37℃孵育箱8小时烘干。
本申请制备的包被微孔板的产品性能稳定,重复性好。
(三)酶标记CA19-9抗体的制备
标记用酶是辣根过氧化物酶,CA19-9抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。
以戊二醛二步法进行辣根过氧化物酶标记为例说明本发明的酶标记CA19-9抗体。标记方法具体包括:
(1)称取辣根过氧化物酶25mg溶于0.5毫升1.25%戊二醛溶液中(用0.1MpH6.8PBS配制),于室温静置过夜。
(2)次日,将酶与戊二醛反应后的溶液用0.01M Ph7.4PBS充分透析。
(3)将待标记的CA19-9抗体10mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入以上透析好的酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
(7)离心半小时(3000转/分钟),弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于0.5mL的0.15M PH7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析去除铵离子后,离心30分钟(10,000转/分钟)去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。酶标记抗体的最佳使用稀释倍数是用洗涤液作1∶2000稀释。
其中,然后加热搅拌溶解后,室温静置过夜后,上清液即为饱和硫酸铵。取该上清液400毫升加20毫升1M的盐酸,再补加380毫升蒸馏水,混匀后即为半饱和硫酸铵。
(四)化学发光底物液的制备
首先配制0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液。配置方法是:称取0.61克三羟甲基氨基甲烷溶于100毫升蒸馏水中,并加入105微升浓盐酸,混匀后加入50μlPC300防腐剂,混匀备用。
底物液包括底物A液和底物B液。底物A液的配制方法是含1.8g/L鲁米诺和0.2g/L对碘苯酚,用以上配制的0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解。底物B液:含0.5g/L的过氧化脲,用以上配制的0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液做稀释液。使用时A液和B液等量混合后使用,每孔加100μl。
如果发光底物的含量不在合适的范围之内,则发出的光粒子的量不能维持在恒定平台期,会影响前后检测时间差的重复性,即造成批间和批内实验的误差扩大。本发明提供的底物发光的平台期长,灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等特点,产品临床性能优异。
(五)浓缩洗涤液的配制
以100ml浓缩洗液为例,称取0.89克NaH2PO4·2H2O和5.56克KH2PO4·3H2O,加到100ml水中,加入150μl吐温-20和50μl PC300,搅匀。使用时,用蒸馏水作30倍稀释。
通过精密度测定、稳定性试验和临床试验显示本发明提供的CA19-9定量检测试剂盒在精密度高、稳定性强和临床检测效果优异。
(一)精密度测定
批内精密度测定方法是按实施例一所述使用方法,重复10孔检测1份精密度参考品,测定并计算其变异系数(CV)值。精密度(CV%)=(SD/X)×100%,要求CV%≤15%。
批内精密度测定的发光值检测结果
孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
发光值 | 13268 | 15462 | 13354 | 16658 | 13356 | 14589 | 15547 | 12657 | 14475 | 14638 |
计算测定结果得到批内精密度:CV%=(261/8301)×100%=3.1%,结果符合要求。
批间精密度测定方法是按实施例一所述使用方法,作10孔平行测定精密度参考品,重复3次试验,测定并计算其变异系数(CV)值,要求CV%≤15%。
按实施例一所述的使用方法,10孔平行测定质控血清,计算其平均值(X)与标准差(SD),精密度(CV%)=(SD/X)×100%,要求CV%≤15%。
计算测定结果得到批间精密度:CV%={(8592-8293)/8449}×100%=3.5%;批间精密度符合要求。
(二)稳定性实验
将本发明的CA19-9化学发光免疫定量检测试剂盒放入37℃恒温培养箱中,连续保温3天后取出,平衡至室温后,把试剂盒按实施例一所述的使用方法进行检测,逐项检查其物理性能、灵敏度、校准品和精密度符合率等性能指标。
稳定性实验的发光值检测结果如下:
项目 | 检验结果 |
物理性能 | 液体组分澄清,无沉淀和絮状物 |
准确性 | 符合要求 |
剂量-反应曲线的线性 | r=0.9997 |
精密度 | CV=3.6% |
灵敏度: | 0.57U/ml |
质控品测定值: | 19.33U/ml |
(三)临床样本检测
按实施例一所述的使用方法利用本发明试剂盒和进口化学发光诊断试剂盒(西门子试剂盒)检测350份临床样本的CA19-9含量并进行比较。
本发明试剂盒与进口试剂盒测定临床样本的CA19-9比对结果如下:
本发明试剂盒与进口试剂盒测定结果统计如下
灵敏度(阳性符合率)=(148/150)×100%=98.67%
特异度(阴性符合率)=(199/200)×100%=99.50%
总符合率=(347/350)×100%=99.14%
本发明试剂盒与进口试剂盒所测CA19-9浓度的相关性分析如图2所示,其中X轴为进口试剂盒(西门子),Y轴为发明试剂盒,计算得相关系数r=0.9810。
临床样本比对检测结果表明,测定的350例血清样本中,阳性样品符合率98.67%,阴性样品符合率99.50%,总符合率达99.14%。两种试剂盒所测浓度值相关性分析结果表明具有良好的相关性(r=0.9810),结果表明本发明的CA19-9化学发光免疫检测试剂盒与进口同类试剂等效,试剂的各项性能优异。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CA19-9定量检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
多个浓度不同的CA19-9校准品,CA19-9抗体包被的微孔板,CA19-9抗体的酶标记物,发光底物液和浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:
所述多个CA19-9校准品为6个,浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:
所述包被微孔板的包被浓度为5μg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:
所述CA19-9抗体的酶标记物为采用戊二醛二步法标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体,稀释倍数为1∶2000。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:
所述发光底物液为鲁米诺发光底物液,所述鲁米诺发光底物液包括底物A液和底物B液,其中所述底物A液包括1.8g/L的鲁米诺和0.2g/L的对碘苯酚,所述底物B液包括0.5g/L的过氧化脲。
6.一种CA19-9定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于,该方法包括:
制备多个浓度不同的CA19-9校准品;
制备CA19-9抗体包被的微孔板;
制备CA19-9抗体的酶标记物;
制备化学发光底物液;以及
制备浓缩洗涤液。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,制备多个浓度不同的CA19-9校准品包括:
通过稀释配制6个校准品,浓度为0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,制备CA19-9抗体包被的包被微孔板包括:
将浓度为5μg/mLCA19-9抗体加入微孔板,置于4℃冰箱24小时;
去除微孔板中的包被液后加入封闭液,置于4℃冰箱封闭24小时;
去除微孔板中的封闭液后,置于37℃孵育箱8小时烘干。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,制备CA19-9抗体的酶标记物包括:
通过戊二醛二步法制得辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶标记CA19-9抗体,稀释倍数为1∶2000。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:
所述化学发光底物液为鲁米诺化学发光底物液,所述鲁米诺化学发光底物液包括底物A液和底物B液;
所述底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液溶解鲁米诺和对碘苯酚制得,其中鲁米诺浓度为1.8g/L,对碘苯酚浓度为0.2g/L;
所述底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl缓冲液稀释过氧化脲制得,其中过氧化脲的浓度为0.5g/L。
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