CN104820102A - 一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于化学发光法的基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、稀释液、清洗液、Lp-PLA2系列校准品和CRP系列校准品。本发明提供的检测Lp-PLA2和CRP的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的Lp-PLA2和CRP含量，确保了检测的灵敏度，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。

Description

一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒及方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体地涉及一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒及方法和应用。

背景技术

缺血性脑卒中是临床上的一种常见病、多发病，其常见的病因为动脉粥样硬化导致管腔狭窄和脑血栓形成，造成局部脑供血区血流中断，发生脑组织缺血、缺氧、软化坏死。大量研究标明动脉粥样硬化本身是一个炎症的过程，持续的低水平炎症预示着心脑血管疾病发生的可能性。Lp-PLA2为新近发现的炎症标志物，属于磷脂酶A2超家族中的非钙离子依赖型磷酸酯酶，主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)分泌，并受炎症介质的调节。CRP是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心脑血管疾病最强有力的预测因子之一，对心血管、脑血管以及外周血管疾病有着最好的预测及预后效果。

有研究表明，缺血性脑卒中发生后，患者Lp-PLA2及CRP水平都明显升高，其水平随神经功能缺损程度增加而呈递增趋势，差异有统计学意义。同时血清CRP水平对预测脑梗死体积也具有重要意义。Lp-PLA2及CRP的同时检测有助于更加全面地判断脑梗的严重程度并对其防治与预后提供实验室参考。

目前通过联合检测Lp-PLA2与CRP两个指标实现对缺血性脑卒中的诊断的检测方法主要有胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。胶乳增强免疫比浊法存在检测线性范围窄、阳性率低等缺点；ELISA法存在灵敏度低、线性范围窄、不易实现全自动化等缺陷；从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于化学发光法的基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，该检测试剂盒的检测具有简便、快速、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点，可以有效地用于脑卒中发生后神经功能损伤程度和梗死体积评价。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于化学发光法的基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，所述的试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、稀释液、清洗液、Lp-PLA2系列校准品和CRP系列校准品。本发明的试剂盒的反应试管的材料选自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至少一种。

其中，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒由羧基修饰的磁微粒表面共价结合抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体制备得到，其中，所述的磁微粒粒径为0.7～1μm，内核为四氧化三铁表面包裹有羧基基团。在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的待测样品基质中快速分离、纯化出目的待测物是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。

具体地，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于所述稀释液中，配制成0.5～2μg/mL的磁微粒溶液；所述异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液；所述的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0.25～0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液。

优选地，所述的异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液通过透析法制备得到。

优选地，所述的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体通过分别活化Lp-PLA2单克隆抗体、CRP单克隆抗体以及碱性磷酸酶溶液后，分别将活化后的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶溶液混合后得到。

所述的化学发光底物液为0.1～0.3M、pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，所述化学发光底物液含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷。

所述的稀释液为0.05～0.5M、pH值为7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液且所述稀释液含0.4～0.6wt％的牛血清白蛋白BSA和0.05～0.3wt％的叠氮化钠；所述的清洗液为0.1～0.2M、pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液含有0.01～0.04wt％的吐温20和15～20wt％的氯化钠。

所述的Lp-PLA2系列校准品和CRP系列校准品的浓度范围分别为0～50ng/mL和0～100ng/mL。

本发明还提出了一种利用上述的试剂盒来检测Lp-PLA2和CRP含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将试剂盒中的所有试剂取出后平衡到室温；使用前将抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；

(2)待测样本或校准品、FITC标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和ALP标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本或校准品、FITC标记的CRP单克隆抗体溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，然后向各个试管中加入抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；倒出上清液，然后加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗操作，共清洗3次；

(3)加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。

本发明进一步提出了上述试剂盒在制备用于脑卒中发生后神经功能损伤程度和梗死体积评价的试剂上的应用。

本发明提供的试剂盒的检测原理如图1所示，其中发光标记物1为异硫氰酸荧光素，发光标记物2为碱性磷酸酶，将待测样本、FITC标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和ALP标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本、FITC标记的CRP单克隆抗体溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育。然后加入包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，然后加入包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒表面。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与Lp-PLA2与CRP抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本中的Lp-PLA2与CRP含量。

有益效果：本发明的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血样品中的Lp-PLA2和CRP含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。而且，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明提供的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测，适合在国内的各级医院推广使用。

附图说明

图1为化学发光法检测原理图。

图2Lp-PLA2标准曲线。

图3CRP标准曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1检测Lp-PLA2和CRP的试剂盒的制备。

(一)Lp-PLA2和CRP校准品的制备：

用pH＝7.5、0.1M Tris-HCl缓冲液分别将Lp-PLA2和CRP纯品稀释成6个水平的冻干校准品，用纯水复溶后的目标浓度分别为0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述Lp-PLA2和CRP校准品的原料为标准级，纯度不低于99％。

(二)抗异硫氰酸荧光素(FITC)多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：

将粒径为1μm的磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH＝4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL；每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体2mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒；然后加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH＝8.0，含质量比为0.5％的牛血清白蛋白(BSA)和0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液清洗4次，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成1μg/mL的工作液。该包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒溶液在4℃保存，不应冻存，用时混匀。磁微粒为0.7μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物；其中，活性基团为羧基。

(三)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和CRP单克隆抗体溶液的制备：

将Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体分别置于透析袋，在用0.2MpH＝9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析；用0.2M pH＝9.0的NaHCO₃溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20小时后，在0.2MpH＝9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体；用含有质量百分含量为0.5％的牛血清白蛋白和质量百分含量为0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体，分别得到浓度均为0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体四、碱性磷酸酶(ALP)标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备

用去离子水配制14.00mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体分别预先装在尖底试管里，加入14.00mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液(加入量为抗体体积1/100)，混匀，在室温下放置30分钟，即得活化后的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体。

取碱性磷酸酶预先装在尖底试管里(碱性磷酸酶与Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体的质量比分别为1:1和1:1)，用无水二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的试管中加入Sulfo-SMCC溶液(加入量为ALP体积1/20)，混匀，在室温下放置15分钟，即得活化后的碱性磷酸酶溶液。

在上述活化后的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体中加入1M的MgCl₂溶液(加入量为抗体体积1/500)，再继续加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14～16小时，即得碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液。

安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100)，使用Superdex200制备级16/70(或相近)柱子，使用pH＝7.0去离子水配制的质量百分浓度为2％的三乙醇胺溶液进行平衡，流速1ml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值，收集280nm处吸光值大于0.02的管份，分别计算碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体的浓度。用含有质量百分浓度为0.5％的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液分别稀释该碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体，分别得到浓度均为0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液。

(五)碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备：

用0.2MpH＝9.3的Tris-HCl缓冲液配制二氧杂环乙烷化合物(APCL)终浓度为0.3mg/mL的溶液。

(六)清洗液的配制：

向0.1M、pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中，吐温20的质量百分浓度为0.02％，氯化钠的质量百分浓度为15％；

(七)将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒，组装成试剂盒后需要抽检合格后才能出厂。

实施例2检测Lp-PLA2和CRP的试剂盒的制备。

与实施例1基本一样，所不同的是，抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液配制成0.5μg/mL的磁微粒溶液；异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液；异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液；碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液；碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液；化学发光底物液是0.1M、pH值为10的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2mg/mL的二氧杂环乙烷；清洗液为0.2M、pH值为9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01％的吐温20和20％的氯化钠。磁微粒为3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物；活性基团为羧基。

实施例3本发明制备的试剂盒(实施例2制备的试剂盒)的检测。

1、采样：取全血或血清1ml；

2、样品检测：

试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀，但是不能使用磁力搅拌器搅拌；清洗液：用去离子水将清洗液稀释15倍，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记。

将50μl校准品或待测样本与50μl FITC标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和ALP标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将50μl校准品或待测样本与FITC标记的CRP单克隆抗体溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育，每个样品应更换移液器头避免交叉污染。用多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)，置37±0.5℃水浴15min。然后加入50μl抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)，置37±0.5℃水浴5分钟，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀2分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴。加300μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)。重复上述清洗操作，共清洗3次。

加100μl碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀3秒，在5分钟内用发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，参见图2和图3。按照本领域中常规的制造及检定规程对本发明的试剂盒进行检定，对其准确度、精确度和稳定性进行测试。

(1)准确度和精密度

选择高、中、低三个浓度的标准品，各含有Lp-PLA2和CRP浓度为200ng/ml和300ng/ml，100ng/ml和150ng/ml，50ng/ml和50ng/ml。用本发明设计的化学发光试剂盒和市场上的常规检测试剂盒(检测Lp-PLA2用ELISA法，检测CRP用胶乳增强免疫比浊法)进行同时检测，每个浓度检测10次，将所得结果进行比较，确定本试剂盒的准确度和精密度，得到的检测结果如下表：

表1.Lp-PLA2检测结果比较

对本组数据做配对样本的T检验，得P＞0.05，得出两组结果之间的差别无统计学意义，说明两种方法无论在高、中或者低浓度的Lp-PLA2检测中，均有较好的一致性，本专利设计的检测方法的准确度与市售检测试剂盒相似。

表2.CRP检测结果比较

对本组数据做配对样本的T检验，得P＞0.05，得出两组结果之间的差别无统计学意义，说明两种方法无论在高、中或者低浓度的CRP检测中，均有较好的一致性，本专利设计的检测方法的准确度与市售检测试剂盒相似。

同时，本方法在多浓度下两指标的重复检测结果的变异系数均小于10％，具有较好精密度。

(2)试剂盒稳定性试验：

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于化学发光法的基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、稀释液、清洗液、Lp-PLA2系列校准品和CRP系列校准品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒由羧基修饰的磁微粒表面共价结合抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体制备得到，其中，所述的磁微粒粒径为0.7~1μm，内核为四氧化三铁表面包裹有羧基基团。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于所述稀释液中，配制成0.5～2μg/mL 的磁微粒溶液；所述异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0.25～0.5μg/mL 异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液；所述的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0.25~0.5μg/mL 碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的异硫氰酸荧光素标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和异硫氰酸荧光素标记的CRP单克隆抗体溶液通过透析法制备得到。

5.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述的碱性磷酸酶标记的Lp-PLA2单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CRP单克隆抗体通过分别活化Lp-PLA2单克隆抗体、CRP单克隆抗体以及碱性磷酸酶溶液后，分别将活化后的Lp-PLA2单克隆抗体和CRP单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶溶液混合后得到。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液为0.1~0.3M、pH值为8~10 的Tris-HCl缓冲液，所述化学发光底物液含有0.2～0.4mg/mL 的二氧杂环乙烷。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的稀释液为0.05～0.5M 、pH 值为7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液且所述稀释液含0.4～0.6 wt% 的牛血清白蛋白BSA和0.05～0.3wt% 的叠氮化钠；所述的清洗液为0.1～0.2M、pH 值为8～9 的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液含有0.01～0.04wt% 的吐温20 和15～20wt% 的氯化钠。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的Lp-PLA2系列校准品和CRP系列校准品的浓度范围分别为0～50ng/mL和0～100ng/m L。

9.一种利用权利要求1所述的试剂盒来检测Lp-PLA2和CRP含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将试剂盒中的所有试剂取出后平衡到室温；使用前将抗FITC 多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；

（2）待测样本或校准品、FITC 标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液和ALP标记的Lp-PLA2单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本或校准品、FITC 标记的CRP单克隆抗体溶液分别与和ALP标记的CRP单克隆抗体溶液混合温育，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，然后向各个试管中加入抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；倒出上清液，然后加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗操作，共清洗3次；

（3）加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。

10.权利要求1所述的试剂盒在制备用于脑卒中发生后神经功能损伤程度和梗死体积评价的试剂上的应用。