CN104880564A - 一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

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CN104880564A CN201510219441.5A CN201510219441A CN104880564A CN 104880564 A CN104880564 A CN 104880564A CN 201510219441 A CN201510219441 A CN 201510219441A CN 104880564 A CN104880564 A CN 104880564A
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Abstract

本发明公开了一种检测抵抗素的试剂盒，包括：抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。本发明提供的检测抵抗素的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的抵抗素含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。

Description

一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，特别是涉及一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
抵抗素(resisting，RST)是2001年发现的一种白色脂肪细胞特异表达和分泌的激素蛋白。因它有降低胰岛素敏感性的作用，故将其命名为抵抗素，它属于抵抗素样分子家族(resistin-like molecules，RELMs)分泌型蛋白质家族成员。人类抵抗素是一种12.5kDa的蛋白质，其前体含有108个氨基酸，其在人体内细胞中合成后，被分泌到血液中。抵抗素具有类似炎症因子的蛋白分子结构，与单核巨噬细胞的功能有关，能影响多形核白细胞的趋化运动和氧化爆发，导致患者免疫功能紊乱，在免疫炎症反应中发挥重要作用，此外，有研究显示，且抵抗素水平与体重指数和内脏脂肪含量正相关，通常情况下通过检测抵抗素的水平来检测脂肪在人体内的沉积情况。
在正常情况下，其在人体血液中的含量很低，一般小于14ng/mL，而在消化性溃疡急性穿孔患者、溃疡性结肠炎或肥胖患者血液中抵抗素的水平较高，约为100-300ng/ml。通过检测以急症腹痛为主诉的患者血清中抵抗素的水平可以实现对消化性溃疡急性穿孔、溃疡性结肠炎及肥胖等疾病的早期诊断和排查，为该类疾病的诊断治疗提供数据支撑。
目前，检测抵抗素的方法主要有胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。胶乳增强免疫比浊法存在检测线性范围窄、阳性率低等缺点；ELISA法存在灵敏度低、线性范围窄、不易实现全自动化等缺陷；从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种检测抵抗素的定量检测试剂盒，具有简便、快速、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点，以克服现有技术的不足。
本发明的第二个目的是提供了上述检测抵抗素的试剂盒的制备方法和检测方法。
本发明的第三个目的是提供了检测抵抗素的试剂盒的检测方法。
本发明采用化学发光免疫分析技术对人血清中抵抗素的水平进行定量检测，实现对 消化性溃疡急性穿孔、溃疡性结肠炎及肥胖等疾病的早期诊断和排查。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测抵抗素的试剂盒，所述试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。
作为优选，所述试剂盒还包括用于稀释所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体的稀释液，所述稀释液为pH值为7.5～8.5、含质量比为0.3～0.7％的牛血清白蛋白BSA和0.05～0.3％的叠氮化钠防腐剂NaN3的0.05～0.2M Tris-HCl缓冲液。
作为优选，所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液中，配制成0.5～2μg/mL的磁微粒溶液。
在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的待测样品基质中快速分离、纯化出目的待测物是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。作为优选，所述磁微粒为0.7～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物。优选地，所述活性基团为羧基。
作为优选，所述异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
作为优选，所述碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成0.25～0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
作为优选，所述化学发光底物液是0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷。
更为优选的是，所述化学发光底物液是0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷。
作为优选，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0.1～0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01～0.04％的吐温20和15～20％的氯化钠。
更为优选的是，所述清洗液为0.1M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百 分比为0.02％的吐温20和15％的氯化钠。
作为优选，所述试剂盒还包括抵抗素系列校准品，所述校准品浓度范围为0～50ng/mL。
作为优选，本发明提供的试剂盒还包括反应试管，其材料选自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至少一种。
本发明提供的试剂盒的检测原理为：将待测样本，FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和ALP标记的抵抗素单克隆抗体溶液混合温育，荧光素(FITC)和碱性磷酸酶(ALP)标记的一对抗抵抗素单克隆抗体与样本中抵抗素抗原分子结合，形成免疫复合物。然后加入包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒表面。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与抵抗素抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的抵抗素含量。
一种检测抵抗素的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)将试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记；
2)加校准品和待测样本至对应试管中，加FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和ALP标记的抵抗素单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，然后加入抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗操作，共清洗3次；
3)加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
有益效果：本发明提供的检测抵抗素的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血样品中的抵抗素含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。 而且，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明提供的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测，适合在国内的各级医院推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例试剂盒中抵抗素的浓度－发光值曲线图；
图2为本发明实施例A，B点连点拟合曲线图(单位：ng/ml)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1检测抵抗素的试剂盒的制备
一、抵抗素校准品的制备
用pH＝7.5，0.1M Tris-HCl缓冲液将抵抗素纯品稀释成6个水平的冻干校准品，用纯水复溶后的目标浓度分别为0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述抵抗素校准品的原料为标准级，纯度不低于99％。
二、抗异硫氰酸荧光素(FITC)多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备
将粒径为1μm的磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH＝4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL；每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体2mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒；然后加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH＝8.0，含质量比为0.5％的牛血清白蛋白(BSA)和0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液清洗4次，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成1μg/mL的工作液。该包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒溶液在4℃保存，不应冻存，用时混匀。磁微粒为0.7μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物；活性基团为羧基。
三、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备
将抵抗素单克隆抗体置于透析袋，在用0.2M pH＝9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析； 用0.2M pH＝9.0的NaHCO3溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抵抗素单克隆抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20小时后，在0.2M pH＝9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体；用含有质量百分含量为0.5％的牛血清白蛋白和质量百分含量为0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，得到浓度为0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
四、碱性磷酸酶(ALP)标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备
用去离子水配制14.00mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取抵抗素单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入14.00mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液(加入量为抗体体积1/100)，混匀，在室温下放置30分钟，即得活化后的抵抗素单克隆抗体。
取碱性磷酸酶预先装在尖底试管里(碱性磷酸酶与抵抗素单克隆抗体的质量比为1:1)，用无水二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的试管中加入Sulfo-SMCC溶液(加入量为ALP体积1/20)，混匀，在室温下放置15分钟，即得活化后的碱性磷酸酶溶液。
在上述活化后的抵抗素单克隆抗体中加入1M的MgCl2溶液(加入量为抗体体积1/500)，再继续加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14～16小时，即得碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100)，使用Superdex200制备级16/70(或相近)柱子，使用pH＝7.0去离子水配制的质量百分浓度为2％的三乙醇胺溶液进行平衡，流速1ml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值，收集280nm处吸光值大于0.02的管份，计算碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体的浓度。用含有质量百分浓度为0.5％的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2％的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释该碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体，得到浓度为0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
五、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备
用0.2MpH＝9.3的Tris-HCl缓冲液配制二氧杂环乙烷化合物(APCL)终浓度为0.3mg/mL的溶液。
六、清洗液的配制
向0.1M、pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中，吐温20的质量百分浓度为0.02％，氯化钠的质量百分浓度为15％；
七、将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒，组装成试剂盒后需要抽检合格后才能出厂。
实施例2：检测抵抗素的试剂盒的制备
与实施例1基本一样，所不同的是，抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液配制成0.5μg/mL的磁微粒溶液；异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液；碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25μg/mL碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液；化学发光底物液是0.1M，pH值为10的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2mg/mL的二氧杂环乙烷；清洗液为0.2M，pH值为9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01％的吐温20和20％的氯化钠。磁微粒为3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物；活性基团为羧基。
实施例3检测抵抗素的试剂盒的制备
与实施例1基本一样，所不同的是，抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液配制成2μg/mL的磁微粒溶液；异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液；碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液；化学发光底物液是0.3M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液，并含有0.4mg/mL的二氧杂环乙烷；清洗液为0.1M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.04％的吐温20和17％的氯化钠。磁微粒为1.5μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物；活性基团为羧基。
实施例4本发明制备的试剂盒的检测
1、采样：取全血或血清1ml；
2、样品检测： 
试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀，但是不能使用磁力搅拌器搅拌；清洗液：用去离子水将清洗液稀释15倍，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记。
加50μl校准品和待测样本至对应试管中，每个样品应更换移液器头避免交叉污染。加50μl FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和50μL ALP标记的抵抗素单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)，置37±0.5℃水浴15min。 然后加入50μl抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)，置37±0.5℃水浴5分钟，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀2分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴。加300μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒(2000转/分)。重复上述清洗操作，共清洗3次。
加100μl碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀3秒，在5分钟内用发光检测仪进行检测。利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，参见图1，再根据待测样本的相对发光强度(RLU)可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
按照本领域中常规的制造及检定规程对本发明的试剂盒进行检定，结果如下：
1、试剂盒精密度测定
将本发明提供的试剂盒取两批，分别测定低、、中、高不同浓度(分别为25ng/ml、135ng/ml、180ng/ml)的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为4.24％、2.31％和1.94％。
表1 分析内精密度与精确度测试
2、试剂盒准确度测定
准确性是指测量值接近真值的程度，通常用回收率表示。
回收试验：先将抵抗素纯品配制成浓度为400-800ng/mL的高标溶液。将人血清样本分成两份，一份直接测定，另一份中加入一定体积的高标溶液(高标溶液体积与人血清体积比例为1:20，加入高标溶液后，待测物的总浓度必须在试剂盒测定线性范围以内)，同时测定两份样本，每个样本重复测定3次，按下面的公式计算回收率。
R = C × ( V 0 + V ) - C 0 × V 0 V × C S × 100 %
式中：R—回收率； 
V—加高标溶液的体积；
V0—人血清样本的体积；
C—人血清样本中加入高标溶液后的浓度；
C0—人血清样本的浓度；
Cs—高标溶液的浓度。
结果如表3所示，抵抗素的回收率在85％～115％之间。
表3、准确度测定
3、最低检测限 
最低检测限是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量。用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度(RLU)值，计 算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入所述一次方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限，经检测，抵抗素的最低检测线为10.00ng/ml。
(1)A点发光值
A点发光均值：X＝1419SD＝298X+2SD＝2014
(2)B点发光值
B点发光均值：X＝9659
(3)A,B点连点拟合曲线，参见图2。
(4)灵敏度＝0.018ng/Ml
4、试剂盒稳定性试验：
试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。
2.根据权利要求1 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于稀释所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体的稀释液，所述稀释液为pH 值为7.5～8.5、含质量比为0.3～0.7% 的牛血清白蛋白BSA和0.05～0.3% 的叠氮化钠防腐剂NaN3的0.05～0.2M Tris-HCl缓冲液。
3.根据权利要求2 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液中，配制成0.5～2μg/mL 的磁微粒溶液。
4.根据权利要求2 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成0.25～0.5μg/mL 异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
5.根据权利要求2 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成0.25～0.5μg/mL 碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
6.根据权利要求1 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是0.1～0.3M，pH 值为8～10 的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL 的二氧杂环乙烷。
7.根据权利要求1 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0.1～0.2M，pH 值为8～9 的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01～0.04% 的吐温20 和15～20% 的氯化钠。
8.根据权利要求1 所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抵抗素系列校准品，所述校准品浓度范围为0～50ng/mL。
9.权利要求1~8任一项所述的一种检测抵抗素的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）抵抗素校准品的制备；2) 抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备；3）异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备；4）碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备；5）碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备；6）清洗液的配制；7）将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒。
10.权利要求1~8任一项一种检测抵抗素的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗FITC 多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记；
2）加校准品和待测样本至对应试管中，加FITC 标记的抵抗素单克隆抗体溶液和ALP 标记的抵抗素单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，然后加入抗FITC 多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5℃水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗操作，共清洗3 次；
3）加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量- 反应曲线的回归方程，再根据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
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