CN111289759A - Saa检测试剂盒及saa定量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SAA检测试剂盒及SAA定量检测的方法。在SAA检测试剂盒试剂盒内部设置多根单人份的试剂条，本实施的试剂条设置有样本孔、标记抗体试剂孔、抗体试剂孔、清洗液孔、抗体试剂孔、磁微粒试剂孔、发光检测孔、样本稀释液孔、底物液孔和预留空孔。SAA检测试剂盒还包括分别预存于相应的孔位中的标记抗体试剂、包被抗体试剂、磁微粒试剂和发光底物，标记抗体试剂为标记酶与SAA抗体的结合物，包被抗体试剂为FITC包被的SAA抗体的结合物，磁微粒试剂为包被有抗FITC抗体的磁微粒的复合物。本发明的试剂盒与市场上的SAA磁微粒化学发光法测定试剂盒相比，灵敏度更高，且有效避免了人血清中的生物素干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种SAA检测试剂盒及SAA定量检测的方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)属于急性时相反应蛋白，炎症或感染急性期在48-72h内迅速升高，并在疾病的恢复期下降。与C反应蛋白(CRP)类似，血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，但SAA比CRP更灵敏。所以血清淀粉样蛋白A的检测对疾病早期诊疗具有十分重要的意义。
目前常用的SAA的检测方法有如下几种：酶联免疫分析法(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法和磁微粒化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法的检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。
现有技术中，利用磁微粒化学发光免疫分析法进行SAA含量测定时，大多采用SAA捕获抗体与磁微粒直接包被(如公开号为CN110244063A、CN109254159A和CN108169219A的中国专利申请文件)后进行SAA的含量测定。由于试剂的灵敏度主要取决于分子的布朗运动规律，进而导致使用磁微粒直接包被法的SAA检测试剂灵敏度偏低。也有厂商使用生物素-亲和素体系进行SAA捕获抗体与磁微粒间接包被(CN209764885U)以获得较高的试剂灵敏度，但由于人血液中本身就存在生物素，因而在使用SAA试剂盒检测人血清时，易受到人血清中的生物素干扰，进而造成假阴性。
发明内容
为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种SAA检测试剂盒，其检测灵敏度高，且能有效避免人血清中的生物素干扰。
本发明的SAA检测试剂盒包括至少一根试剂条，每根所述试剂条上设置有至少一个孔位，所述SAA检测试剂盒还包括分别预存于不同的孔位中的标记抗体试剂、包被抗体试剂、磁微粒试剂和发光底物，所述标记抗体试剂包含标记酶与SAA抗体的结合物，所述包被抗体试剂包含包被有FITC的SAA抗体，所述磁微粒试剂包含包被有抗FITC抗体的磁微粒。本发明通过FITC-抗FITC结合体系将SAA抗体间接连接于磁微粒上，对SAA抗体的结合力强，工艺稳定，包被抗体试剂和标记抗体试剂与SAA结合形成“三明治”复合物，与市场上的SAA磁微粒化学发光法测定试剂盒相比，灵敏度更高，且有效避免了人血清中的生物素干扰。
进一步的，所述标记抗体试剂由所述标记酶与所述SAA抗体结合后溶解于试剂缓冲液中制备得到，所述标记酶与所述SAA抗体的质量比为1:0.5-5。
进一步的，所述包被抗体试剂是通过将SAA抗体与FITC的溶液混匀，制备得到FITC-抗体的结合物溶液，再将其溶解于试剂缓冲液中制备得到。
更进一步的，制备所述FITC-抗体的结合物溶液的所述SAA抗体与FITC溶液的质量比为1:1.3-1:1.8，所述包被抗体试剂中的FITC-抗体的结合物的质量浓度为0.1-10μg/ml。
更进一步的，所述试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述试剂缓冲液中还包含BSA和Proclin300。
进一步的，所述磁微粒的粒径为0.5μm-20μm，所述磁微粒的表面经羧基、氨基或巯基中的至少一种基团修饰。
更进一步的，所述磁微粒与所述抗FITC抗体按质量比1:0.01-0.1制备得到磁微粒试剂半成品，所述磁微粒试剂是通过将所述磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中制备得到，所述磁珠缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述磁珠缓冲液中还包含Casein、和Proclin300。
进一步的，，所述SAA检测试剂盒还包括单独存放于一个孔位中的样本稀释液，所述样本稀释液中包含有牛血清白蛋白、酪蛋白和蔗糖，所述样本稀释液为PBS或Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述SAA检测试剂盒还包括单独存放于一个孔位中的清洗液。
本发明还提供了一种SAA定量检测的方法，包括如下步骤：
(1)制备标记抗体试剂
将标记酶与SAA抗体按质量比为1:0.5-5结合后溶解于试剂缓冲液中，即制备得到标记抗体试剂，所述试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
(2)制备包被抗体试剂
将SAA抗体与FITC溶液按质量比为1:1.3-1:1.8混匀后，制备得到FITC-抗体的结合物溶液，再将其溶解于试剂缓冲液中，即制备得到包被抗体试剂。
(3)制备磁微粒试剂
将磁微粒与抗FITC抗体按质量比1:0.01-0.1混合，制备得到磁微粒试剂半成品，再将所述磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中，即制备得到磁微粒试剂，所述磁珠缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述磁珠缓冲液中还包含Casein和Proclin300。
(4)标准曲线的绘制：
将SAA标准品采用胎牛血清缓冲液分别配制为不同浓度的SAA标准溶液，将步骤(1)制备得到的标记抗体试剂和步骤(2)制备得到的包被抗体试剂加入SAA标准溶液中，充分反应后，加入步骤(3)制备得到的磁微粒试剂，在磁场中进行固液分离并洗涤后，加入发光底物，充分反应后，进行发光值的检测，根据不同浓度的SAA标准溶液检测得到的发光值，即可计算出SAA浓度-发光值的标准曲线。
(5)将步骤(1)制备得到的标记抗体试剂和步骤(2)制备得到的包被抗体试剂同时加入待测样品中，充分混合、反应后，加入步骤(3)制备得到的磁微粒试剂，在磁场中进行固液分离并洗涤后，加入发光底物，充分反应后，进行发光值的检测，依据步骤(4)得到的标准曲线，即可计算得到待测样品中SAA的含量。
本发明的技术原理为：异硫氰酸荧光素(FITC)包被的SAA抗体与结合有标记酶的标记抗体与待测物中的SAA结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁微粒，通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体免疫复合物结合在磁微粒上。在磁场中进行固液分离并洗涤，将多余的抗原和酶标抗体洗掉。加入发光底物后，发光底物在标记酶的作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应。在检测范围内，发光强度与样本中的SAA浓度成正比。使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可计算出样本中的SAA含量。
本发明具有如下有益效果：
①本发明的试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种新的反应体系，其检测灵敏度高、检测范围扩大，反应时间缩短，从开始加样到检测结果，时间少于15min，明显快于同类试剂盒，检测效率高。
②本发明的试剂盒通过将FITC抗体与磁微粒偶联，结合有FITC的SAA抗体能结合于磁微粒上，本发明的方法偶联效率高，结合牢固，且工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。
③本发明的试剂盒可以支持血清、血浆、全血等多种样本类型，对血浆和全血中SAA含量的结果有非常好的一致性。
附图说明
图1为本发明的试剂条的结构示意图；
图2为利用本发明的试剂盒计算得到的SAA浓度-发光值的标准曲线图；
图3为利用本发明的试剂盒对血浆与全血检测结果的相关性分析图；
图4为利用本发明的试剂盒与市售商品的检测结果的相关性分析图。
图中：
1-样本孔、2-标记抗体试剂孔、3-清洗液孔、4-包被抗体试剂孔、5-磁微粒试剂孔、6-发光检测孔、7-样本稀释液孔、8-底物液孔。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明各个实施例中的原料来源均为市售：辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶购自BBI生命科学有限公司、鼠抗人SAA抗体购自杭州华葵金配生物科技有限公司、异硫氰酸荧光素(FITC)和抗FITC抗体购自Sigma、APS-5购自LUMIGEN公司、磁微粒购自日本JSR。
实施例1：标记抗体试剂的制备
将辣根过氧化物酶与鼠抗人SAA抗体按质量比为1:1进行结合得到酶-抗体结合物溶液后，将其与试剂缓冲液按照一定比例投入到试剂缓冲液中，即制备得到标记抗体试剂。终体系中，SAA抗体的浓度为0.5μg/ml。
本实施例的试剂缓冲液为0.01M Tris-HCl缓冲液，其中含5％BSA和1‰Proclin300。本实施例的鼠抗人SAA抗体的型号为M3371。本实施例的标记酶也可替换为碱性磷酸酶。
实施例2：包被抗体试剂的制备
首先用实施例1的试剂缓冲液将FITC(异硫氰酸荧光素)配制成浓度为5.0mg/mL的FITC溶液，然后按照鼠抗人SAA抗体：FITC溶液为1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8-9的PBS缓冲液平衡，然后使用PD10分离柱进行分离纯化，制备得到FITC-抗体的结合物溶液，取适量的FITC-抗体的结合物溶液，按照最终质量浓度为0.8μg/ml投入到实施例1的试剂缓冲液中，即完成包被抗体试剂的制备。
实施例3：磁微粒试剂的制备
将表面改性的磁微粒与抗FITC抗体按质量比1:0.025制备得到磁微粒试剂半成品，再将磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中即制备得到磁微粒试剂，终体系中的磁微粒试剂半成品的质量浓度为0.5mg/ml。
本实施例的磁珠缓冲液为Tris-HCl缓冲液，其中含2％Casein、1‰Proclin300。
本实施例的磁微粒的粒径为0.5μm-20μm，其可为表面修饰有-COOH、-NH2、或-SH基团的改性磁珠。本实施例的磁微粒型号为MS160。
实施例4：样本稀释液和清洗液的制备
本发明的样本稀释液为0.02M PBS缓冲液，其中含5％牛血清白蛋白(BSA)、2％酪蛋白(Casein)及15％蔗糖。
本发明的清洗液为0.01M Tris-HCl缓冲液。
实施例5：发光底物溶液的制备
将发光底物APS-5用缓冲液配制成质量浓度为5％的发光底物溶液。本实施例中所用的缓冲液为0.01M Tris-HCl。
本实施例的发光底物也可选用Lumi-Phos530、AMPPD或APS-5等碱性磷酸酶发光底物或辣根过氧化物酶发光底物进行替换。
实施例6：SAA检测试剂盒中的反应试剂的分装
本发明的SAA检测试剂盒，在其内部设置多根单人份的试剂条，每根试剂条上均设置有多个孔位，本实施例中的孔位数为16个，也可根据需要增加或减少孔位数。参见附图1所示，本实施的试剂条的第一孔位为样本孔1，用于存放待测的样本；第二孔位为标记抗体试剂孔2，用于存放标记抗体试剂孔；第三孔位、第四孔位和第五孔位为清洗液孔3，用于存放清洗液；第六孔位为包被抗体试剂孔4，用于存放包被抗体试剂；第七孔位为磁微粒试剂孔5，用于存放磁微粒试剂；第十孔位为发光检测孔6，为黑杯；第十一孔位为样本稀释液孔7，用于存放样本稀释液；第十三孔位为底物液孔8，用于存放发光底物溶液；剩余孔位均为预留空孔。
本发明的试剂条中的各个反应试剂按照以下分装量进行分装：
表1试剂条中各个试剂的分装孔位及分装量
| 试剂组分名称 | 孔位号 | 分装量(μl) |
| 标记抗体试剂 | 2 | 50 |
| 清洗液 | 3、4、5 | 400 |
| 包被抗体试剂 | 6 | 50 |
| 磁微粒试剂 | 7 | 50 |
| 样本稀释液 | 11 | 50 |
| 底物溶液 | 13 | 100 |
实施例7：校准品溶液的制备及标准曲线的绘制
将SAA抗原溶解于校准品缓冲液，配制成不同浓度的试剂盒校准品，本实施例的试剂盒校准品中SAA抗原的终浓度分别为1050μg/ml、700μg/ml、400μg/ml、100μg/ml、20μg/ml、5μg/ml、1μg/ml及0μg/ml。
本实施例的校准品缓冲液溶液是在1L胎牛血清中加入1mL Proclin300，完全混匀后经0.22um滤膜过滤而成。
将实施例1制备得到的标记抗体试剂、实施例2制备得到的包被抗体试剂与本实施例的各个SAA校准品同时加入发光检测孔，并混合均匀，充分反应后，加入实施例3制备得到的磁微粒试剂，在磁场中进行固液分离并洗涤后，加入实施例5制备的发光底物溶液，充分反应后，进行发光值的检测，即制备得到SAA浓度-发光值的标准曲线，参见图2所示。
实施例8：SAA检测试剂盒的性能验证
1、SAA检测试剂盒的灵敏度分析：
对不含SAA抗原的空白缓冲液测定20次，计算信号均值和标准差，以信号均值+2标准差代入标准曲线，计算得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度。结果分析灵敏度≤1μg/ml。
2、对抗生物素的抗干扰性能性能：
使用添加回收的方法检测本发明的试剂盒对抗生物素干扰的能力，结果为生物素浓度在50ng/ml浓度以内，对本试剂盒检测SAA没有显著影响。
3、对血浆、全血检测结果对比：
收集30份具有同源性的血浆和全血(即血浆和全血样本来自于同一个人)，检测结果如图3所示，结果显示二者斜率为1.003，且相关性＞0.99，说明利用本发明的试剂盒对血浆和全血检测结果具有良好的一致性。
4、利用本发明试剂盒与市售的试剂盒进行SAA检测结果的相关性分析：
利用本发明试剂盒检测100例西门子试剂临床定值样本，其临床数据相关性如图4所示，检测结果表明，本发明试剂盒与西门子的SAA检测试剂盒的检测结果的临床相关性大于0.99，由此说明本发明的试剂盒的检测结果具有足够的可信度和准确度。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种SAA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一根试剂条，每根所述试剂条上设置有至少一个孔位，所述SAA检测试剂盒还包括分别预存于不同的孔位中的标记抗体试剂、包被抗体试剂、磁微粒试剂和发光底物，
所述标记抗体试剂包含标记酶与SAA抗体的结合物，
所述包被抗体试剂包含包被有FITC的SAA抗体，
所述磁微粒试剂包含包被有抗FITC抗体的磁微粒。
2.根据权利要求1所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述标记抗体试剂由所述标记酶与所述SAA抗体结合后溶解于试剂缓冲液中制备得到，所述标记酶与所述SAA抗体的质量比为1:0.5-5。
3.根据权利要求1所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗体试剂是通过将SAA抗体与FITC的溶液混匀，制备得到FITC-抗体的结合物溶液，再将其溶解于试剂缓冲液中制备得到。
4.根据权利要求3所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，制备所述FITC-抗体的结合物溶液的所述SAA抗体与FITC溶液的质量比为1:1.3-1:1.8，所述包被抗体试剂中的FITC-抗体的结合物的质量浓度为0.1-10μg/ml。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述试剂缓冲液中还包含BSA和Proclin300。
6.根据权利要求1所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.5μm-20μm，所述磁微粒的表面经羧基、氨基或巯基中的至少一种基团修饰。
7.根据权利要求6所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒与所述抗FITC抗体按质量比1:0.01-0.1制备得到磁微粒试剂半成品，所述磁微粒试剂是通过将所述磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中制备得到，所述磁珠缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述磁珠缓冲液中还包含Casein、和Proclin300。
8.根据权利要求1所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述SAA检测试剂盒还包括单独存放于一个孔位中的样本稀释液，所述样本稀释液中包含有牛血清白蛋白、酪蛋白和蔗糖，所述样本稀释液为PBS或Tris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求1所述的SAA检测试剂盒，其特征在于，所述SAA检测试剂盒还包括单独存放于一个孔位中的清洗液。
10.一种SAA定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备标记抗体试剂
将标记酶与SAA抗体按质量比为1:0.5-5结合后溶解于试剂缓冲液中，即制备得到标记抗体试剂，所述试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
(2)制备包被抗体试剂
将SAA抗体与FITC溶液按质量比为1:1.3-1:1.8混匀后，制备得到FITC-抗体的结合物溶液，再将其溶解于试剂缓冲液中，即制备得到包被抗体试剂。
(3)制备磁微粒试剂
将磁微粒与抗FITC抗体按质量比1:0.01-0.1混合，制备得到磁微粒试剂半成品，再将所述磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中，即制备得到磁微粒试剂，所述磁珠缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述磁珠缓冲液中还包含Casein和Proclin300。
(4)标准曲线的绘制：
将SAA标准品采用胎牛血清缓冲液分别配制为不同浓度的SAA标准溶液，将步骤(1)制备得到的标记抗体试剂和步骤(2)制备得到的包被抗体试剂加入SAA标准溶液中，充分反应后，加入步骤(3)制备得到的磁微粒试剂，在磁场中进行固液分离并洗涤后，加入发光底物，充分反应后，进行发光值的检测，根据不同浓度的SAA标准溶液检测得到的发光值，即可计算出SAA浓度-发光值的标准曲线。
(5)将步骤(1)制备得到的标记抗体试剂和步骤(2)制备得到的包被抗体试剂同时加入待测样品中，充分混合、反应后，加入步骤(3)制备得到的磁微粒试剂，在磁场中进行固液分离并洗涤后，加入发光底物，充分反应后，进行发光值的检测，依据步骤(4)得到的标准曲线，即可计算得到待测样品中SAA的含量。
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