CN105334317A

CN105334317A - 一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN105334317A
Application number: CN201510788511.9A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 柳乐; 秦枫; 崔利歌; 赵转; 王健; 王静; 马竹凤; 黄琪; 赵婷
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2016-02-17

Abstract

本发明公开了一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括生物素化LKM-1抗原、校准品、质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，检测方法是通过试剂盒中试剂对样本进行检测。通过上述方式，本发明采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点。同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间近在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

Description

一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断技术领域，特别是涉及一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，国内外对于自身免疫性肝病的研究越来越深入，并且进展迅速，涉及到发病机理、临床诊断、临床治疗、预后、遗传、以及相关自身抗体及靶抗原的研究。

肝肾微粒体（Liver-kidneymicrosomal,LKM）自身抗体和肝脏炎症疾病有关，LKM自身抗体与自身免疫型慢性活动性肝炎有关，也称为LKM-1自身抗体。LKM-1是一种分子量为50KDa的蛋白，最先被发现于鼠肝中，作为细胞色素P450db1。近来研究报道表明，三种P450细胞色素（A2,D6和C9）可以作为肝炎疾病的自身抗原。三种细胞色素均属于药物代谢酶，可以被自身抗体识别。

类似LKM-1类循环抗体目前已成为检测和诊断自免肝的一类重要靶标，对于自免肝类疾病的诊断变得越来越重要，治疗方式更多的是通过免疫抑制进行，而病毒诱导的肝炎往往是通过注射干扰素进行治疗。因此，区分病毒诱导性肝炎和自身免疫肝炎，对于疾病的治疗十分重要。研究报道，感染病毒性肝炎患者，往往伴随有自身免疫肝炎的发生，因此在进行干扰素治疗前，进行自身免肝诊断是十分有必要的。

目前报道的关于检测LKM-1自身抗体的方法主要有间接荧光抗体（IFA）技术、放射免疫技术（RIA）、电子显微免疫印迹分析技术、酶联免疫分析（ELSIA）。传统的酶联免疫包含LKM阳性参考血清IgG碎片纯化、IgG碎片固相化包被、以及样本反应阶段。

然而，对于此病的检测，这些方法都存在着不足之处：

一、间接免疫荧光法

该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的：

（1）运用此法可能出现假阳性。

（2）在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别。

（3）操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，也不太适用于标本量较多的实验室。

（4）荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。

（5）结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足。

二、酶联免疫吸附法

ELISA检测抗LKM-1抗体，简便易行，特异性高，与间接免疫荧光法联合检测，可为临床对PBC的诊断和治疗提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：

（1）检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果。

（2）ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低。

（3）ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。

（4）ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，包括生物素化LKM-1抗原、校准品、质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化LKM-1抗原为偶联有生物素的LKM-1抗原，所述AP-抗人IgG抗体是AP标记的抗人IgG抗体，所述磁微粒试剂是表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化LKM-1抗原是生物素与LKM-1抗原分子表面的-NH₂基团反应得到的。

在本发明一个较佳实施例中，所述校准品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述质控品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒具有超顺磁性。

在本发明一个较佳实施例中，所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

提供一种用抗肝肾微粒体1抗体试剂盒进行检测的方法，包括步骤为：将样本与磁微粒试剂、生物素化LKM-1抗原混匀得到第一复合物，对所述第一复合物进行洗涤，再加入AP-抗人IgG抗体混匀，得到第二复合物，对所述第二复合物进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

在本发明一个较佳实施例中，所述方法包括步骤为：将样本与磁微粒试剂、生物素化LKM-1抗原混匀，在37℃下孵育15min，得到第一复合物，对所述第一复合物洗涤3次，再加入AP-抗人IgG抗体，混匀并在37℃下孵育15min，得到第二复合物，对所述第二复合物洗涤3次，再加入化学发光底物，混匀并在37℃下孵育5min，测定发光结果。

本发明的有益效果是：本发明的抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒及检测方法，采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点。同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间近在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒进行全自动化学发光检测的原理图；

图2是本发明抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，包括生物素化LKM-1抗原（R1）、校准品、质控品、AP-抗人IgG抗体（R2）、磁微粒试剂（M）、化学发光底物和清洗液。所述生物素化LKM-1抗原为偶联有生物素的LKM-1抗原。所述AP-抗人IgG抗体是AP标记的抗人IgG抗体，是将碱性磷酸酶AP与抗人IgG抗体偶联。所述磁微粒试剂是表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。

所述生物素化LKM-1抗原是生物素与LKM-1抗原分子表面的-NH₂基团反应得到的。所述校准品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述质控品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒具有超顺磁性，表面含有亲和素SA基团。所述化学发光底物的主要成分为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，即为金刚烷AMPPD，在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

请参阅图1，提供一种基于磁微粒化学发光检测原理来实现血清中抗LKM-1抗体含量检测方法，其检测原理如图所示，包括步骤为：将样本与磁微粒试剂M、生物素化LKM-1抗原R1混合并混匀，在37℃下孵育15min，得到样本-M-R1复合物，洗涤3次，再加入酶结合物AP-抗人IgG抗体R2，混匀并在37℃下孵育15min，得到样本-M-R1-R2复合物，洗涤3次，再加入化学发光底物，混匀并在37℃下孵育5min，测定发光结果。

实施例二：

本发明抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒的性能评估：

（1）样本比对

阴、阳性符合率：本发明试剂盒217例临床血清检测抗LKM-1抗体的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对，比对结果见下表。结果表明，本发明抗LKM-1抗体试剂盒阳性符合率90.0%（45/50），阴性符合率99%(211/213)，说明本试剂盒临床符合率高。

（2）灵敏度：本检测试剂盒的LOD为0.145RU/mL，而酶联免疫法的灵敏度为2RU/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/40、1/80、1/200、1/400，用试剂盒检测稀释样本，以稀释比例和检测浓度做回归曲线。求出相关系数R的平方值。结果见图2，表明抗LKM-1抗体试剂盒的线性相关系数为0.999，结果大于0.9900，斜率为1.003。

（4）准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清一共三份血清（样本A），按照1：9体积比分别添加到两份基础血清中（样本B），混匀后形成六份新样本，分别检测并计算其浓度。结果血清加样回收率在85%-115%之间。注：加样回收率=添加后样本值/（0.1*样本A+0.9样本B）*100%。

（5）精密度：对三种浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在10%以内。

（6）稳定性：抗LKM-1抗体检测试剂盒（磁珠，R1，R2）37℃下放置7天，测定高、中、低3种浓度质控的信号保留率。结果均＞95%，表明试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、甘油三脂、RF、HAMA，检测结果显示，添加物质对本试剂盒检测结果没有影响。

本发明的有益效果是：

一、本发明完成所有流程出结果时间为50min，相比ELISA大大缩短了反应时间；

二、本发明采用碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD系统，相比ELISA检测系统的灵敏度高10倍；

三、本发明为全自动封闭操作系统，可靠性高，稳定性好，检测结果重复性好；

四、本发明从稀释、加样、孵育、清洗以及检测等步骤中均实现了全自动化，避免了人为操作带来的结果偏差。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，其特征在于，包括生物素化LKM-1抗原、校准品、质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化LKM-1抗原为偶联有生物素的LKM-1抗原，所述AP-抗人IgG抗体是AP标记的抗人IgG抗体，所述磁微粒试剂是表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。

2.根据权利要求1所述的抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化LKM-1抗原是生物素与LKM-1抗原分子表面的-NH₂基团反应得到的。

3.根据权利要求1所述的抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述校准品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述质控品是由含抗LKM-1抗体的人血清配制而成。

4.根据权利要求1所述的抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒具有超顺磁性。

5.根据权利要求1所述的抗肝肾微粒体1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

6.一种用抗肝肾微粒体1抗体试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括步骤为：将样本与磁微粒试剂、生物素化LKM-1抗原混匀得到第一复合物，对所述第一复合物进行洗涤，再加入AP-抗人IgG抗体混匀，得到第二复合物，对所述第二复合物进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤为：将样本与磁微粒试剂、生物素化LKM-1抗原混匀，在37℃下孵育15min，得到第一复合物，对所述第一复合物洗涤3次，再加入AP-抗人IgG抗体，混匀并在37℃下孵育15min，得到第二复合物，对所述第二复合物洗涤3次，再加入化学发光底物，混匀并在37℃下孵育5min，测定发光结果。