CN105424682A

CN105424682A - 一种贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒

Info

Publication number: CN105424682A
Application number: CN201510788467.1A
Authority: CN
Inventors: 秦枫; 马竹凤; 王静; 张伟; 柳乐; 徐娟; 李庆春
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明公开了一种贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，包括生物素化抗Bevacizumab抗体或Bevacizumab、校准品、质控品、AP-抗人IgG1抗体或AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。通过上述方式，本发明采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

Description

一种贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断领域，特别是涉及一种贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒。

背景技术

近年来，国内外对于治疗性抗体的研究越来越深入，广泛应用于炎症疾病、免疫疾病、传染病以及癌症的治疗，并且进展迅速，涉及到发病机理，临床诊断，临床治疗，预后，遗传，并逐渐发展到对相关药物给药过程中产生的抗体即抗药抗体（ADA）的研究。

血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。VEGF通过血管内皮细胞表面VEGFR2受体激活下游信号，可诱导内皮细胞的生长、迁移和管状形成，促进新生血管形成、提高血管通透性，满足肿瘤细胞对氧和营养的需求。贝伐单抗（Bevacizumab，商品名Avastin）是FDA批准上市的一种重组的人源化单克隆IgG1抗体，分子量为149kDa，由两条重链和两条轻链组成，能够结合VEGF-A全部亚型的作用，阻断VEGF与VEGFR2受体相互作用介导的信号通路，阻断肿瘤血管生成。经临床验证，Bevacizumab能够有效延长癌症患者的生存期，在临床肿瘤的治疗中具有重大意义。目前主要用于治疗各种转移性癌症，如用于联合以5-FU为基础的化疗方案一线治疗转移性结直肠癌以及晚期非小细胞肺癌的治疗。

然而，在使用贝伐单抗治疗期间，会产生针对其自身的ADA，降低贝伐单抗在血浆中的浓度水平，随后疾病症状再次出现，甚至加重。因此评估体内VEGF治疗性抗体及其相对应的ADA水平，对患者进行直接监测，辅助医护人员进行病情精确诊断，十分有必要。目前，对于ADA的检测方法已有报道，主要为酶联免疫吸附法，但该方法存在着不足之处。

ELISA检测ADA，简便易行，特异性高，可为临床对肿瘤单抗药物的使用提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：

（1）检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果；

（2）ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低。

（3）ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。

（4）ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，采用一种新型化学发光法进行测定。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，包括生物素化抗Bevacizumab抗体、Bevacizumab校准品、Bevacizumab质控品、AP-抗人IgG1抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化抗Bevacizumab抗体为偶联有生物素的抗Bevacizumab抗体，所述AP-抗人IgG1抗体为AP标记的抗人IgG1抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化抗Bevacizumab抗体为生物素与抗Bevacizumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

在本发明一个较佳实施例中，所述Bevacizumab校准品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线，所述Bevacizumab质控品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成。

在本发明一个较佳实施例中，所述化学发光底物中包括有3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

提供一种Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗体校准品、抗Bevacizumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化Bevacizumab为偶联有生物素的Bevacizumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化Bevacizumab为生物素与Bevacizumab表面的-NH₂基团反应得到。

在本发明一个较佳实施例中，所述抗Bevacizumab抗体校准品是由抗Bevacizumab抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗Bevacizumab抗体质控品是由抗Bevacizumab抗体配制而成。

本发明的有益效果是：本发明的贝伐单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明Bevacizumab试剂盒的检测原理图；

图2是本发明Anti-Bevacizumab试剂盒的检测原理图；

图3是本发明Bevacizumab试剂盒与国外知名公司同类产品样本比对图；

图4是本发明Bevacizumab试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图；

图5是本发明Anti-Bevacizumab试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的回归线性图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，包括生物素化抗Bevacizumab抗体、Bevacizumab校准品、Bevacizumab质控品、AP-抗人IgG1抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。所述生物素化抗Bevacizumab抗体为偶联有生物素的抗Bevacizumab抗体。所述AP-抗人IgG1抗体为AP标记的抗人IgG1抗体，是将碱性磷酸酶AP与抗人IgG抗体偶联。所述磁微粒试剂为表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。所述清洗液可以是清洗浓缩液，在使用时进行配制。

所述生物素化抗Bevacizumab抗体为生物素与抗Bevacizumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。所述Bevacizumab校准品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线，所述Bevacizumab质控品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成。所述化学发光底物中包括有3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，主要成分为金刚烷（AMPPD），在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现抗药抗体的免疫含量检测的，其检测原理如图1所示：将单抗药物样本Bevacizumab与磁微粒试剂M、生物素化抗Bevacizumab抗体R1混合，得到样本-M-R1复合物，进行洗涤，再加入AP-抗人IgG1抗体R2，得到样本-M-R1-R2复合物，进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

实施例二：

提供一种Anti-Bevacizumab抗药抗体检测试剂盒，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗体校准品、抗Bevacizumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂和清洗液。所述生物素化Bevacizumab为偶联有生物素的Bevacizumab。所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，是将碱性磷酸酶AP与抗ADA（Anti-Bevacizumab）抗体偶联。所述磁微粒试剂为表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。所述清洗液可以是清洗浓缩液，在使用时进行配制。其中ADA指抗药物抗体Anti-DrugAntibody，这里特指Anti-Bevacizumab。

所述生物素化Bevacizumab为生物素与Bevacizumab表面的-NH₂基团反应得到。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。所述抗Bevacizumab抗体校准品是由抗Bevacizumab抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗Bevacizumab抗体质控品是由抗Bevacizumab抗体配制而成。所述化学发光底物中包括有3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，主要成分为金刚烷（AMPPD），在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现ADA免疫含量检测的，其检测原理如图2所示：将抗药物抗体ADA样本与磁微粒试剂M、生物素化BevacizumabR1混合，得到样本-M-R1复合物，进行洗涤，再加入AP-抗ADA抗体R2，得到样本-M-R1-R2复合物，进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

实施例三：

试剂盒的性能评估：

1、本发明的贝伐单抗Bevacizumab试剂盒

（1）样本比对

本发明试剂盒对200例临床血清检测Bevacizumab的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对。结果表明，本发明Bevacizumab试剂盒检测浓度值与国外知名公司同类产品检测浓度值具有良好的相关性，结果如图3所示。

（2）灵敏度：本发明Bevacizumab检测试剂盒LOD为2ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用本发明Bevacizumab试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图4。

（4）准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清一共三份血清（样本A），按照1：9体积比分别添加到两份基础血清中（样本B），混匀后形成六份新样本，分别检测并计算其浓度。血清加样回收率在85%-115%之间。

添加回收实验（加样回收率=添加后样本值/（0.1*样本A+0.9样本B）*100%。

（5）精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在15%以内。

（6）稳定性：将本发明Bevacizumab试剂盒37℃下放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明Bevacizumab试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示，添加物质对本发明Bevacizumab试剂盒检测结果没有影响。

2、本发明的Anti-Bevacizumab抗药抗体检测试剂盒

（1）样本比对

阴、阳性符合率：本发明试剂盒对200例临床血清检测Anti-Bevacizumab的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对，比对结果见下表。结果表明，本发明Anti-Bevacizumab试剂盒阴性符合率99%（99/100），阳性符合率100%（100/100），说明本试剂盒临床符合率高。

（2）灵敏度：本发明Anti-Bevacizumab试剂盒LOD为5ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用Anti-Bevacizumab试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图5。

添加回收实验（加样回收率=添加后样本值/（0.1*样本A+0.9样本B）*100%

（6）稳定性：将本发明Anti-Bevacizumab试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明Anti-Bevacizumab试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示，添加物质对本发明Anti-Bevacizumab试剂盒检测结果没有影响。

本发明的有益效果是：

一、采用此试剂盒进行检查的总反应时间为50min，相比ELISA法极大的节约了时间；

二、此试剂盒采用的是碱性磷酸酶系统，相比辣根过氧化物酶系统的灵敏度高10倍；

三、此试剂盒采用的是全自动磁微粒化学发光法，结果准确，相比免疫荧光不会出现结果误读现象。

四、采用的全自动磁微粒化学发光的反应步骤相比ELISA法的反应步骤要精简，而且实现了全自动化。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，其特征在于，包括生物素化抗Bevacizumab抗体、Bevacizumab校准品、Bevacizumab质控品、AP-抗人IgG1抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化抗Bevacizumab抗体为偶联有生物素的抗Bevacizumab抗体，所述AP-抗人IgG1抗体为AP标记的抗人IgG1抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

2.根据权利要求1所述的贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗Bevacizumab抗体为生物素与抗Bevacizumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。

3.根据权利要求1所述的贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

4.根据权利要求1所述的贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，其特征在于，所述Bevacizumab校准品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线，所述Bevacizumab质控品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成。

5.根据权利要求1所述的贝伐单抗Bevacizumab试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物中包括有3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

6.一种Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，其特征在于，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗体校准品、抗Bevacizumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化Bevacizumab为偶联有生物素的Bevacizumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

7.根据权利要求6所述的Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，其特征在于，所述生物素化Bevacizumab为生物素与Bevacizumab表面的-NH₂基团反应得到。

8.根据权利要求6所述的Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

9.根据权利要求6所述的Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，其特征在于，所述抗Bevacizumab抗体校准品是由抗Bevacizumab抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗Bevacizumab抗体质控品是由抗Bevacizumab抗体配制而成。

10.根据权利要求6所述的Anti-Bevacizumab抗药抗体试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物中包括有3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。