CN105277689A - 纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的试剂盒及方法,所述试剂盒包括的试剂有:生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液、IgE校准品、IgE质控品,采用此试剂盒对待测血清的总IgE进行纳米磁微粒化学发光法定量检测。通过上述方式,本发明在化学发光免疫分析基础上,通过引入具有高比表面积和磁分离作用的纳米磁微粒作为固相载体,从而提高抗体/抗原包被量的同时,简化了反应过程中的清洗步骤,加快了检测的速度。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析领域,特别是涉及一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的试剂盒及方法。
背景技术
免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE,IgE)是人体免疫球蛋白的一种,在正常人体内的含量很低,人体内IgE含量的提高提示I型过敏的发生。过敏性疾病是指患者吸入、摄入、食入或者注入含有致敏成分的物质(过敏原)后触发机体B细胞产生特异性IgE抗体,IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合从而使机体处于致敏状态。当相同的过敏原再次刺激机体,就可与IgE抗体结合从而引发过敏反应及相关症状,如过敏性哮喘、枯草热、荨麻疹、过敏性鼻炎、湿疹等I型过敏性疾病。IgE抗体介导的I型过敏反应性疾病相当普遍,世界各国过敏反应疾病的总发病率约为15%-30%,我国大约有5-10%的人受过敏的袭扰,是当前世界性的重大卫生学问题,被世界卫生组织(WHO)列为二十一世纪重点防治的三大疾病之一。因此,临床上,总IgE检测常作为过敏反应性疾病的初筛试验。
化学发光免疫分析是目前发展最快、最先进的免疫测定技术,其灵敏度和精确度与传统的酶联免疫法、放射免疫法、荧光法高出几个数量级。其以灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点被广大研究人员所认可,并正逐渐替代传统的生物检测技术。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法,研发和优化了与血清学抗体反应原理相关的各种关键技术,从而提高了针对临床患者体内总IgE抗体的检测灵敏度和准确性,开发出灵敏、稳定的纳米磁微粒化学发光诊断试剂。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的试剂盒,包括的试剂有:生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液、IgE校准品、IgE质控品。
在本发明一个较佳实施例中,所述生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液的浓度为0.1~1.0ug/ml,所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.1~1.0mg/ml,所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液的浓度为0.1~2.0ug/ml。
在本发明一个较佳实施例中,所述IgE校准品的浓度为:2IU/ml、10IU/ml、50IU/ml、200IU/ml、1000IU/ml、5000IU/ml,所述IgE校准品是IgE蛋白与0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的;所述IgE质控品的浓度为:10IU/ml、200IU/ml,所述IgE质控品是IgE蛋白与0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的。
在本发明一个较佳实施例中,所述生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液的制备过程为:鼠抗人IgE抗体以1:20摩尔比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中,再用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析得到。
在本发明一个较佳实施例中,所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为:将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀,再用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬,混匀磁分离沉出,并重复清洗,清洗后的纳米磁微粒分散于0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
在本发明一个较佳实施例中,所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液的制备过程为:用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体稀释。
提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的方法,包括步骤为:
(1)将待测血清样本与生物素标记的鼠抗人IgE抗体、链霉亲和素标记的纳米磁微粒共孵育得到第一溶液;
(2)在外加磁场作用下,磁分离洗涤去除所述第一溶液中多余的生物素标记的鼠抗人IgE抗体得到第二溶液;
(3)向所述第二溶液中加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗并孵育得到第三溶液,形成抗IgE抗体-IgE-抗IgE二抗的双抗夹心结构;
(4)在外加磁场作用下,磁分离洗涤去除所述第三溶液中未结合的酶标抗体和杂质,得到第四溶液;
(5)向所述第四溶液中加入酶促化学发光底物,测定发光强度;
(6)利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线,根据步骤(5)得到的发光强度对照所述标准曲线,计算得出待测血清样本中总IgE的含量。
在本发明一个较佳实施例中,步骤(1)和步骤(3)中所述的孵育条件是在37℃下反应15-30分钟;步骤(2)和步骤(4)中所述的磁分离操作为将溶液置于磁场中静置2分钟,弃去上清后加入清洗液,之后重复此操作2次。
在本发明一个较佳实施例中,所述定量检测方法在全自动化学发光仪Lumiray系列上进行,所述全自动化学发光仪Lumiray系列为Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260或Lumiray1280。
在本发明一个较佳实施例中,所述定量检测方法包括的步骤为:
(1)将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别;
(2)将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓,识别校准品信息,分配校准品位置;
(3)将质控物或待测样本置于仪器样本仓,编辑检测信息;
(4)启动运行程序,所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
本发明的有益效果是:本发明的纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法,在化学发光免疫分析基础上,通过引入具有高比表面积和磁分离作用的纳米磁微粒作为固相载体,从而提高抗体/抗原包被量的同时,简化了反应过程中的清洗步骤,加快了检测的速度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图,其中:
图1是本发明实施例三中IgE标准曲线图;
图2是本发明实施例四最低检测限实验中AB两点浓度-发光值拟合曲线图;
图3是本发明实施例四方法与PhadiaUniCAP系统测值结果比对图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:
提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的试剂盒,包括如下试剂:
(1)生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液,浓度为0.2ug/ml;
(2)链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液,浓度为0.4mg/ml;
(3)碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液,浓度为0.2ug/ml;
(4)6个不同浓度水平的IgE校准品:2IU/ml,10IU/ml,50IU/ml,200IU/ml,1000IU/ml,5000IU/ml;
(5)2个浓度水平的IgE质控品:10IU/ml,200IU/ml。
实施例二:
本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清总IgE试剂盒的制备包括如下步骤:血清总IgE试剂盒的制备:
(1)配制缓冲液:
配制0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液,0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液。
0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液的配制:取容量1L的烧杯,加入800ml去离子水,称取2.56gNa2HPO4·12H2O、0.44gNaH2PO4·2H2O和9gNaCl,加入到烧杯中,搅拌使其充分溶解,用HCl或NaOH调节pH值至7.4±0.05,加入质量分数为2%的甘露醇、质量分数为1%的甘油,搅拌0.5h至完全溶解,加去离子水定容至1L。
0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液的配制:取容量1L的烧杯,加入800ml去离子水,称取12.11gTris(三羟甲基氨基甲烷)加入到烧杯中,搅拌使其充分溶解,用HCl或NaOH调节pH值至7.4±0.05,加入质量分数为2%的BSA、质量分数为0.3%的Proclin300,搅拌0.5h至完全溶解,加去离子水定容至1L。
0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液的配制:取容量1L的烧杯,加入800ml去离子水,称取9.76gMES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、9gNaCl加入到烧杯中,搅拌使其充分溶液,用HCl或NaOH调节pH值至6.0±0.05,加入质量分数为1%的BSA、质量分数为0.1%的Tween-20,搅拌0.5h至完全溶解,加去离子水定容至1L。
(2)制备生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液
将鼠抗人IgE抗体以1:20的比例加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中,室温条件下充分混合反应30分钟,反应后的溶液用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析。BCA法测定生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液的浓度,并调整其浓度到0.2ug/ml。
(3)制备链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液
将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀出来,用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬,充分混匀15分钟后磁分离沉出,弃去上清,再用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬,如此重复清洗5次,清洗后的纳米磁微粒分散于0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,浓度为0.4mg/ml。
(4)制备碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液;
用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液将碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体稀释到0.2ug/ml。
(5)制备IgE校准品
取IgE蛋白,用0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制成2、10、50、200、1000、5000IU/ml的校准点。
(6)制备IgE质控品;
取IgE蛋白,用0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制成10、200IU/ml的质控品。
(7)试剂盒组装;
将生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液、IgE校准品和质控品组装成试剂盒。
实施例三:
提供了一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清总IgE试剂盒的检测方法,检测在全自动化学发光仪Lumiray系列(Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260、Lumiray1280等)上进行,具体仪器操作步骤如下:
(1)将试剂盒放入全自动化学发光分析/测定仪试剂仓相应位置,试剂盒信息通过条形码扫描仪输入仪器系统,也可通过仪器配套软件设定。
(2)将校准品置于仪器样本仓。通过条形码扫描仪识别校准品信息,并在仪器系统中分配校准品位置。
(3)将质控物/待测样本置于仪器样本仓,通过仪器配套软件编辑相应检测信息。
(4)启动运行程序,所有校准品/质控物/待检样本处理步骤将自动执行。
本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光定量检测血清总IgE试剂盒还可以在半自动化学发光仪上实现,具体的样本检测步骤如下:
(1)在检测管中依次加入10ul待测血清或IgE校准品、50ul生物素标记的鼠抗人IgE抗体、50ul链霉亲和素标记的纳米磁微粒,混匀后,在37℃下共孵育15分钟,样本中总IgE抗体被捕获,并固着在纳米磁微粒表面。
(2)外加磁场作用下,磁微粒沉降下来,去除上清,加入500ul清洗液,去除磁场后,震荡使磁微粒重悬;重复此清洗步骤3次以除去未结合的生物素标记的鼠抗人IgE抗体。
(3)加入100ul碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液,混匀,37℃下孵育15分钟,形成抗IgE抗体-IgE-抗IgE二抗的双抗夹心结构。
(4)外加磁场作用下,磁微粒沉降下来,去除上清,加入500ul清洗液,去除磁场后,震荡使磁微粒重悬;重复此清洗步骤3次以除去未结合的酶标抗体及其它杂质。
(5)加入150ul酶促化学发光底物,去除磁场,充分混匀后,测定发光值。
(6)以实施例二中制备的一系列已知浓度的IgE校准品进行检测,得各浓度校准品的发光值如下表所示,用四参数拟合方式绘制IgE标准曲线,具体参阅图1。
(7)对于待测样本的发光值,对照图1中的IgE标准曲线计算得样本中总IgE含量。
本发明的工作原理:待测血清样本与生物素标记的鼠抗人IgE抗体、链霉亲和素标记的纳米磁微粒共孵育,待测血清样本中总IgE抗体与生物素标记的鼠抗人IgE抗体特异性结合,同时借助生物素-链霉亲和素放大体系,血清样本中总IgE结合到固相载体纳米磁微粒上;外加磁场作用下,磁分离洗涤去除多余的生物素标记的鼠抗人IgE抗体;加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗,形成抗IgE抗体-IgE-抗IgE二抗的双抗夹心结构;外加磁场作用下,多次磁分离洗涤去除未结合的酶标抗体及其它杂质;加入酶促化学发光底物,测定发光强度;使用已知浓度的校准品标准曲线,根据发光强度对照标准曲线,计算得出待测样本中总IgE的含量;
实施例四:
本发明所制备的试剂盒的性能检测:
最低检测限(LOD)
测试方法:以S0为样本(A点)进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的发光值(RLU),计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD,S1(B点)重复测试5次,根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的RLU值代入上述方程中,求出对应的浓度值。下表为AB点测试得到的发光值。
请参阅图2,AB两点拟合曲线如图所示,将A点的M+2SD代入AB两点拟合得到的曲线中,得该试剂盒的最低检测限LOD=0.1IU/ml。
精密度
测试方法:用正常人血清配制成高、中、低三个待测样本,在同一次实验中测定IgE含量,每个样本重复测定10次,计算批内变异系数(CV);不同天测定IgE含量,每次实验每个样本重复测定10次,共完成8次测试,得到80个数据,计算批间变异系数(CV)。本发明试剂盒测得的样本批内和批间精密度如下表所示。
干扰
测试方法:选取高、中、低三份血清样本,分别对每份血清样本进行不同比例的胆红素、血红蛋白、甘油三脂添加,测定添加前后样本测值的偏差。结果表明:样本中胆红素≤20mg/dL,血红蛋白≤500mg/dL,甘油三酯≤700mg/dL时,对测定结果无影响。
交叉
测试方法:选取高、中、低三份血清样本,分别对每份血清样本进行大于生理浓度的IgA、IgM、IgD、IgG添加,测定添加前后样本测值的偏差。结果表明,未见交叉反应。
方法学比对
测试方法:选取100份血清样本,分别用本发明制备得到的试剂盒和PhadiaUniCAP测定系统进行测定,对两类系统的测定结果进行比对。以本发明方法测得的血清IgE浓度为横坐标,以PhadiaUniCAP测定系统测得的结果为纵坐标,对所得的100个坐标点进行线性回归分析,如图3所示,得相关方程y=1.074x-16.704,相关系数为0.9939。此结果表明,本发明方法与PadiaUniCAP系统测定结果具有很好的一致性。
本发明与现有技术相比,有如下优点:
本发明采用酶促化学发光技术,采用碱性磷酸酶-AMPPD发光体系,以碱性磷酸酶为发光标记物,不含致癌物质,无放射污染,试剂有效期长;以AMPPD为发光底物,产生连续稳定的发光,试剂线性范围极广,避免了采用传统发光标记物因发光不稳定导致的结果不稳定的缺陷。
本发明以纳米磁微粒为固相载体,反应过程中纳米磁微粒上的抗人IgE抗体与待测样本中的IgE抗体结合,之后在外加磁场作用下,不需离心分离,即可将待测样本中的IgE抗体与其它物质充分分离,大大缩短了反应过程,加快了检测速度。
本发明在具有高比表面积的纳米磁微粒基础上还采用了链霉亲和素-生物素放大系统,极大提高了纳米磁微粒上待测物IgE抗体的结合量,降低了试剂的使用量,提高反应的灵敏度,研究表明本发明所涉及试剂盒检测仅需试剂量为10ul,同时试剂盒最低检测限可低至0.1IU/ml。
本发明所涉及试剂盒可在半自动化学发光平台检测,也可在全自动化学发光平台检测。借助于全自动化学发光平台Lumiray,可实现样本自动连续加载,加样、反应、清洗等步骤紧密衔接,缩短反应过程的同时最大限度降低人为操作不稳定带来的检测可靠性低等缺陷。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的试剂盒,其特征在于,包括的试剂有:生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液、IgE校准品、IgE质控品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液的浓度为0.1~1.0ug/ml,所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.1~1.0mg/ml,所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液的浓度为0.1~2.0ug/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述IgE校准品的浓度为:2IU/ml、10IU/ml、50IU/ml、200IU/ml、1000IU/ml、5000IU/ml,所述IgE校准品是IgE蛋白与0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的;所述IgE质控品的浓度为:10IU/ml、200IU/ml,所述IgE质控品是IgE蛋白与0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的鼠抗人IgE抗体溶液的制备过程为:鼠抗人IgE抗体以1:20摩尔比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中,再用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析得到。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为:将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀,再用0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬,混匀磁分离沉出,并重复清洗,清洗后的纳米磁微粒分散于0.1M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液的制备过程为:用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体稀释。
7.提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总IgE的方法,其特征在于,包括步骤为:
(1)将待测血清样本与生物素标记的鼠抗人IgE抗体、链霉亲和素标记的纳米磁微粒共孵育得到第一溶液;
(2)在外加磁场作用下,磁分离洗涤去除所述第一溶液中多余的生物素标记的鼠抗人IgE抗体得到第二溶液;
(3)向所述第二溶液中加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗并孵育得到第三溶液,形成抗IgE抗体-IgE-抗IgE二抗的双抗夹心结构;
(4)在外加磁场作用下,磁分离洗涤去除所述第三溶液中未结合的酶标抗体和杂质,得到第四溶液;
(5)向所述第四溶液中加入酶促化学发光底物,测定发光强度;
(6)利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线,根据步骤(5)得到的发光强度对照所述标准曲线,计算得出待测血清样本中总IgE的含量。
8.根据权利要求7所述的定量检测方法,其特征在于,步骤(1)和步骤(3)中所述的孵育条件是在37℃下反应15-30分钟;步骤(2)和步骤(4)中所述的磁分离操作为将溶液置于磁场中静置2分钟,弃去上清后加入清洗液,之后重复此操作2次。
9.根据权利要求7所述的定量检测方法,其特征在于,所述定量检测方法在全自动化学发光仪Lumiray系列上进行,所述全自动化学发光仪Lumiray系列为Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260或Lumiray1280。
10.根据权利要求9所述的定量检测方法,其特征在于,包括的步骤为:
(1)将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别;
(2)将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓,识别校准品信息,分配校准品位置;
(3)将质控物或待测样本置于仪器样本仓,编辑检测信息;
(4)启动运行程序,所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
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