CN112748248A - 一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒 - Google Patents

一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测试剂技术领域，特别涉及一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒。该试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的牛奶过敏原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体、校准品、生物素标记的抗人IgE抗体；其中，生物素标记的牛奶过敏原包括生物素标记α‑乳白蛋白、生物素标记β‑乳球蛋白、生物素标记α‑酪蛋白、生物素标记β‑酪蛋白、生物素标记κ‑酪蛋白及生物素标记牛血清白蛋白。本发明对牛奶过敏蛋白进行分别标记，并按特定比例进行标记，混合配制牛奶过敏蛋白制备抗原溶液的方法，可以提高检测灵敏度，防止单类抗体检测漏诊的问题；与胶体金、免疫印迹法等手工实验相比，具有反应时间短、操作简便、通量大的优点。

Description

一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂技术领域，特别涉及一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒。
背景技术
牛奶是很多国家的重要营养来源，是婴幼儿最常见的食物。牛奶被认为是全球引起婴幼儿过敏的常见食物，各地发病率从1％到7.5％不等。在中国，部分地区的牛奶过敏也很严重。在对中国的食物过敏儿童的研究中发现，牛奶过敏在自我报告型过敏原中排名第三，患病率约10.8％。大多数牛奶过敏的患者在3岁-5岁会产生耐受，不再受到牛奶过敏的困扰，然而仍有15％-20％的患者对牛奶过敏会持续更久。
牛奶过敏症状因患者而异，通常包括胃肠道症状，如恶心和腹泻，皮肤病症状，哮喘，鼻炎和全身过敏反应。引起食物过敏的免疫机制主要有三个方面：1.IgE介导，以急性发作为特点，可累及一个或多个器官。皮肤以荨麻疹和血管神经性水肿为主要表现；呼吸系统以鼻结膜炎和哮喘为主要表现；胃肠道以恶心、呕吐和腹泻为主要特征；2.非IgE或细胞介导，以迟发或慢性发作为特点，常见临床表现为小肠结肠炎和直肠炎；3.IgE和非IgE混合介导，临床表现为延迟或慢性发作，以特异性皮炎或一种嗜酸性胃肠病为表现。据研究牛奶过敏中有54％的患者过敏反应是由IgE介导，有46％的患者过敏反应是由非IgE介导。目前，临床较为普及的诊断方法主要是皮肤点刺试验(SPT)和血清总IgE、牛奶特异性IgE检测。
免疫球蛋白E抗体(IgE)是变态反应疾病的重要介质，介导I型速发型过敏反应。IgE具有亲细胞性，其Fc段与肥大细胞或嗜酸性粒细胞表面受体结合，致使肥大细胞或嗜碱性粒细胞致敏，处于致敏状态的细胞，如牛奶过敏原再次进入机体，位于细胞表面的IgE抗体结合牛奶致敏蛋白的抗原表位，形成“抗原桥”结果，致使细胞膜发生复杂的级联反应，致敏细胞脱壳粒释放生物活性介质，活性介质作用于靶组织或器官导致临床症状。
目前牛奶过敏原检测的试剂盒，主要有免疫印迹、胶体金、酶联免疫分析法、磁微粒化学发光法和荧光免疫分析法。牛奶特异性检测试剂盒均有各自方法的优缺点，需要进一步优化。
公开(公告)号CN108333367A的发明专利公开了一种食品过敏原特异性IgE检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括磁微粒、食品过敏原、酶标抗人IgE抗体和底物；其中，所述食品过敏原修饰有生物素，所述酶标抗人IgE抗体修饰有碱性磷酸酶。该发明使用的抗原为食物抗原提取物，不同的食物致敏蛋白种类不同，如牛奶主要的致敏蛋白包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白及酪蛋白等，不同致敏蛋白的丰度不同。作为体外检测用抗原食物物种的不同，采集地点不同，提取方法不同，标记条件不同等得到的致敏蛋白种类和含量差异较大。从而导致试剂盒检测灵敏度及检测结果差异大。
公开(公告)号CN102636650A的发明专利公开了一种牛奶过敏原检测板，该发明在PVC垫板上两端分别设置待测样本区和吸附区，而在其间依次设置有分别将酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白标记胶体金，混合制备的胶体金标记抗原，在硝酸纤维素膜上分别包被混合牛奶过敏原的检测区和包被抗-β乳球蛋白抗体的质控区。制备方法包括：矩形PVC垫板上两端分别设置吸水材料的待测样本区和吸附区，待测样本区和吸附区中间依次设置有胶体金标记抗原，在硝酸纤维素膜上分别包被牛奶中酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白组成牛奶过敏原的检测区T和包被抗-β乳球蛋白抗体的质控区C，其中，在经膜处理液浸泡过的硝酸纤维素膜上，将牛奶过敏原4和抗-β乳球蛋白抗体，按照顺序分别点样于规划的检测区T和质控区C，牛奶过敏原的总蛋白浓度和抗-β乳球蛋白抗体总蛋白浓度均为1.8-2.2毫克/毫升，一次点样，每个点样孔0.2毫升，室温温育2小时；蒸馏水及膜处理液冲洗后，用2％聚乙烯醇溶液室温封闭1小时；弃去封闭液，蒸馏水、膜处理液冲洗，干燥后裁剪置于PVC垫板上；另将酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白分别标记胶体金，混合制备胶体金标记抗原，并置于PVC垫板上。但该发明使用的胶体金的方法，手工实验，操作复杂，通量小；仅能对牛奶特异性IgE检测为定性结果，不能准确定量。而且牛奶中酪蛋白存在不同的分型，不同亚型的酪蛋白丰度及蛋白性质存在较大差异，用无分型的酪蛋白做抗原，检测结果可能存在漏检风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒。该检测试剂盒制备时对牛奶过敏蛋白进行分别标记，并按特定比例进行标记，混合配制牛奶过敏蛋白制备抗原溶液的方法，可以提高检测灵敏度，防止单类抗体检测漏诊的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒，该试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的牛奶过敏原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体、校准品、生物素标记的抗人IgE抗体；其中，生物素标记的牛奶过敏原包括生物素标记α-乳白蛋白、生物素标记β-乳球蛋白、生物素标记α-酪蛋白、生物素标记β-酪蛋白、生物素标记κ-酪蛋白及生物素标记牛血清白蛋白；以摩尔比计，
生物素与α-乳白蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与β-乳球蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与α-酪蛋白的标记比例为1:(8～12)；
生物素与β-酪蛋白的标记比例为1:(8～12)；
生物素与κ-酪蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与牛血清白蛋白的标记比例为1:(18～22)。
优选地，生物素与α-乳白蛋白的标记比例为1:20；
生物素与β-乳球蛋白的标记比例为1:20；
生物素与α-酪蛋白的标记比例为1:10；
生物素与β-酪蛋白的标记比例为1:10；
生物素与κ-酪蛋白的标记比例为1:20；
生物素与牛血清白蛋白的标记比例为1:20。
针对目前牛奶特异性IgE检测试剂盒由于抗原选择的差异导致的灵敏度、漏检、定量检测问题。本发明对牛奶抗原进行了针对性的优化，选择分别标记生物素的牛奶过敏原α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白及牛血清白蛋白的抗原按照一定比例进行混合添加的方式，科学利用链霉亲和素制备磁微球、辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体的化学发光免疫分析法，全自动操作，保证检测结果的准确性，测试通量，提升检测结果的灵敏度。
作为优选，链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.1～3.0mg/mL。
优选地，链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.5～1.8mg/mL。
作为优选，生物素标记的牛奶过敏原的浓度为0.1～10μg/mL。
优选地，生物素标记的牛奶过敏原的浓度为0.5～5.8μg/mL。
作为优选，辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体的浓度为0.3～2mg/mL。
作为优选，链霉亲和素包被的磁微粒采用含1％～5％马血清、2％～15％甘油及2％～10％蔗糖、pH＝7～8的磷酸盐缓冲液制备成混悬液。
作为优选，生物素标记的牛奶过敏原的制备方法为：将生物素和牛奶过敏原混合，室温反应0.5～3小时。
作为优选，生物素标记的牛奶过敏原采用含1％～5％马血清、2％～15％甘油及2％～10％蔗糖、pH＝7～8的磷酸盐缓冲液配制成溶液。
在本发明提供的实施例中，生物素为Sulfo-NHS-LC-Biotin。
本发明提供了一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒，该试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的牛奶过敏原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体、校准品、生物素标记的抗人IgE抗体；其中，生物素标记的牛奶过敏原包括生物素标记α-乳白蛋白、生物素标记β-乳球蛋白、生物素标记α-酪蛋白、生物素标记β-酪蛋白、生物素标记κ-酪蛋白及生物素标记牛血清白蛋白。相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1)经过对牛奶过敏蛋白进行分别标记，并按特定比例进行标记，混合配制牛奶过敏蛋白制备抗原溶液的方法，可以提高检测灵敏度，防止单类抗体检测漏诊的问题；
2)与胶体金、免疫印迹法等手工实验相比，具有反应时间短、操作简便、通量大的优点。
具体实施方式
本发明公开了一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒
一、试剂盒组成：
包括1mg/mL链霉亲和素包被的磁微粒、3μg/mL生物素标记的牛奶过敏原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体1mg/mL、校准品0IU/mL、0.35IU/mL、0.7IU/mL、3.5IU/mL、17.5IU/mL、100IU/mL、生物素标记的抗人IgE抗体3μg/mL。
其中，生物素标记的牛奶过敏原包括生物素标记α-乳白蛋白、生物素标记β-乳球蛋白、生物素标记α-酪蛋白、生物素标记β-酪蛋白、生物素标记κ-酪蛋白及生物素标记牛血清白蛋白。
二、制备方法：
1、链霉亲和素包被的磁微粒混悬液的制备：
将100mg/mL链霉亲和素包被的磁微粒进行磁分离，用含5％马血清、2％甘油及10％蔗糖的磷酸盐缓冲液(pH＝7～8)重悬，反复洗涤4次(5-10min/次)，磁分离，最终将磁微粒重悬于含5％马血清、2％甘油及10％蔗糖的磷酸缓冲液(pH＝7～8)，即得到浓度为0.5-1.8mg/mL的链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液。
2、生物素标记的牛奶过敏原溶液的制备：
因6种蛋白等电点、分子量、氨基酸组成各不相同，故采用分别标记方式。标记步骤如下：
取Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素加入二甲基亚砜，配制成20mmol的生物素，加入5.0mg牛奶过敏原，在室温反应3小时。反应结束后，体系在磷酸盐缓冲液中4℃透析过夜，即得生物素标记的牛奶过敏原，用含5％马血清、2％甘油及10％蔗糖的磷酸盐缓冲液(pH＝7)配制成3μg/mL溶液，即得生物素标记的牛奶过敏原。
其中，将以上各牛奶过敏蛋白选择最优的生物素标记比例，以摩尔比计，
生物素与α-乳白蛋白的标记比例为1:20；
生物素与β-乳球蛋白的标记比例为1:20；
生物素与α-酪蛋白的标记比例为1:10；
生物素与β-酪蛋白的标记比例为1:10；
生物素与κ-酪蛋白的标记比例为1:20；
生物素与牛血清白蛋白的标记比例为1:20。
3、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体的制备
将抗人IgE标记的辣根过氧化物酶用含5％马血清的磷酸盐缓冲液(pH＝7)配制成1mg/mL的浓度，即得。
4、校准品的制备
用人IgE抗原用含5％马血清的磷酸盐缓冲液(pH＝7)进行稀释成0IU/mL，0.35IU/mL、0.7IU/mL、3.5IU/mL、17.5IU/mL、100IU/mL的梯度校准品，即得。
5、生物素标记的抗人IgE抗体的制备
取Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素加入二甲基亚砜，配制成20mmol的生物素，加入5.0mg抗人IgE抗体，在室温反应3小时。反应结束后，体系在磷酸盐缓冲液中4℃透析过夜，即得生物素标记的抗人IgE抗体，用含5％马血清、2％甘油及10％蔗糖的磷酸盐缓冲液(pH＝7)配制成3μg/mL溶液，即得生物素标记的抗人IgE抗体。
三、牛奶过敏原特异性IgE的检测方法
(1)将梯度校准品与链霉亲和素包被的磁微粒混悬液和生物素标记的抗人IgE抗体混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(2)加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体，混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(3)加入底物溶液，测定化学发光强度，即得校准曲线；
(4)将待测样品与链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液和生物素标记的牛奶过敏原溶液混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(5)加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体，混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(6)加入底物溶液，测定化学发光强度；
(7)根据标准曲线，计算得到所述待测样本中IgE的浓度。
试验例1不同牛奶过敏原蛋白对牛奶过敏样本的反应性比较
实验方法参见实施例1。实验结果如下：
表1不同牛奶过敏原蛋白对牛奶过敏样本的反应性比较
Figure BDA0002855708480000071
Figure BDA0002855708480000081
结果显示：不同牛奶致敏蛋白对样本的反应性不一致，缺少组分或组分量不够会照成样本反应性低或漏检。
试验例2不同牛奶过敏原使用的生物素比例的比较
实验方法参见实施例1。实验结果如下：
表2不同牛奶过敏原使用的生物素比例的比较
Figure BDA0002855708480000082
Figure BDA0002855708480000091
结果显示：不同牛奶致敏蛋白的性质不同，生物素标记的比例不同反应性存在差异。
试验例3实施例1抗原混合物与常规牛奶提取物比较
实验方法参见实施例1。实验结果如下：
表3安图组分抗原混合物与常规牛奶提取物比较
Figure BDA0002855708480000092
Figure BDA0002855708480000101
结果显示：与常规牛奶提取物比较，安图组分抗原混合物的一致性更高。试验例4实施例1抗原混合物与常规牛奶提取物符合率分析
实验方法参见实施例1。实验结果如下：
表4安图组分抗原混合物的常规牛奶提取物符合率分析
Figure BDA0002855708480000102
结果显示：按照一直浓度的牛奶致敏蛋白进行混合后，灵敏度及特异性交常规试剂有提升。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的牛奶过敏原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体、校准品、生物素标记的抗人IgE抗体；其中，生物素标记的牛奶过敏原包括生物素标记α-乳白蛋白、生物素标记β-乳球蛋白、生物素标记α-酪蛋白、生物素标记β-酪蛋白、生物素标记κ-酪蛋白及生物素标记牛血清白蛋白；以摩尔比计，
生物素与α-乳白蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与β-乳球蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与α-酪蛋白的标记比例为1:(8～12)；
生物素与β-酪蛋白的标记比例为1:(8～12)；
生物素与κ-酪蛋白的标记比例为1:(18～22)；
生物素与牛血清白蛋白的标记比例为1:(18～22)。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.1～3.0mg/mL。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.5～1.8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的牛奶过敏原的浓度为0.1～10μg/mL。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的牛奶过敏原的浓度为0.5～5.8μg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体的浓度为0.3～2mg/mL。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒采用含1％～5％马血清、2％～15％甘油及2％～10％蔗糖、pH＝7～8的磷酸盐缓冲液制备成混悬液。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的牛奶过敏原的制备方法为：将生物素和牛奶过敏原混合，室温反应0.5～3小时。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的牛奶过敏原采用含1％～5％马血清、2％～15％甘油及2％～10％蔗糖、pH＝7～8的磷酸盐缓冲液配制成溶液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素为Sulfo-NHS-LC-Biotin。
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