CN114859059A - 蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂。该检测试剂中包括致敏原组合物溶液，其中所述致敏原组合物包括：致敏原Bla g 1、Bla g2、Bla g4、Bla g5、Bla g6、Bla g7、Bla g9和Bla g11。相对于其他选择(如混合其中的2种、3种、5种等)具有检测效力高的优势，本发明提供的检测试剂与天然提取物具有同等检测效力，比天然提取物具有更好的存储稳定性；比天然提取物批次间差异小，检测稳定性更好。

Description

蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂。
背景技术
过敏反应，又称变态反应或I型变态反应，是机体受到同一抗原再刺激后引起的组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫应答。引起过敏反应的抗原物质称为过敏原，也称为变应原或者致敏原。当机体吸入、食入、接触或者注入含有致敏成分的物质后会触发机体B细胞产生特异性IgE抗体，IgE与肥大细胞或者嗜碱性粒细胞使机体处于致敏状态，当机体再次暴露该过敏原时就会产生过敏反应，出现临床症状。临床上多数过敏性疾病的患者通常只是做缓解症状的治疗，而没有找到引发过敏的真正原因，因而提供过敏原检测的技术或者方法，为临床医生诊断过敏或明确过敏原提供辅助，从而针对性的预防和治疗过敏状况发生十分重要。
蟑螂是过敏反应的诱因之一，环境中相关过敏原的潜在来源包括蟑螂本身、蜕皮、分泌物、蛋壳和粪便，接触、吸入、食入都可能引发过敏反应，可诱发哮喘、鼻炎、皮炎等过敏反应。我国常见的蟑螂种类包括美国大蠊、德国小蠊和亚洲蟑螂，其中最常见的是德国小蠊。2009年中国过敏原多中心流行病学调查，覆盖华北、华东、华南、西南的17个城市24家中心，共6304例哮喘和/或鼻炎患者参加，德国小蠊引起的过敏患病率为11.5％。过敏性疾病的诊断方法主要有体内试验和体外试验。体外试验主要是基于血清学的IgE检测，对德国小蠊过敏患者进行特异性IgE检测可以评估疾病风险，为脱敏治疗过程提供用药指导。据世界卫生组织过敏原命名小组委员会公布，现已明确的德国小蠊致敏原有Bla g 1-Bla g 9与Bla g 11、Bla g 12共11种，这11种致敏蛋白在德国小蠊体内的含量和主要存在部位不同，其中Bla g 4仅存在于雄性中，且不同致敏蛋白的致敏率从10％～80％不等。
目前临床使用的德国小蠊或蟑螂过敏原特异性IgE检测试剂盒中，所用过敏原均为天然提取物或生物素化天然提取物。过敏原天然提取物组分复杂且组分含量难控，批次间质量控制及标准化难，进而导致检测的准确性和稳定性不高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供批次间差异小，检测稳定性更好的蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂。
本发明提供蟑螂过敏原特异性IgE抗体的检测试剂，其包括致敏原组合物溶液，其中所述致敏原组合物包括：致敏原Bla g 1、致敏原Bla g2、致敏原Bla g4、致敏原Bla g5、致敏原Bla g6、致敏原Bla g7、致敏原Bla g9和致敏原Bla g11。
本发明所述致敏原组合物溶液包括稀释液和：
生物素标记的致敏原Bla g 1、生物素标记的致敏原Bla g2、
生物素标记的致敏原Bla g4、生物素标记的致敏原Bla g5、
生物素标记的致敏原Bla g6、生物素标记的致敏原Bla g7、生物素标记的致敏原Bla g9和生物素标记的致敏原Bla g11。
本发明中，所述致敏原组合物为德国小蠊的致敏原组合物。即本发明所述的致敏原组合物中，致敏原Bla g 1为重组的德国小蠊致敏原Bla g 1，致敏原Bla g2为重组的德国小蠊致敏原Bla g 2，致敏原Bla g4为重组的德国小蠊致敏原Bla g 4，致敏原Bla g5为重组的德国小蠊致敏原Bla g 5，致敏原Bla g6为重组的德国小蠊致敏原Bla g 6，致敏原Bla g7为重组的德国小蠊致敏原Bla g7，致敏原Bla g9为重组的德国小蠊致敏原Bla g9，致敏原Bla g11为重组的德国小蠊致敏原Bla g11。
本发明中，所述生物素为NHS-PEG12-Biotin。
致敏原Bla g 1与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g1与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 2与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g2与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 4与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g4与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 5与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g5与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 6与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g6与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 7与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g7与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 9与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g9与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
致敏原Bla g 11与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；优选的，致敏原Bla g11与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶10。
本发明中，生物素标记的致敏原Bla g 1、生物素标记的致敏原Bla g2、生物素标记的致敏原Bla g4、生物素标记的致敏原Bla g5、生物素标记的致敏原Bla g6、生物素标记的致敏原Bla g7、生物素标记的致敏原Bla g9和生物素标记的致敏原Bla g11的质量比为1∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)∶(0.55～0.7)∶(0.8～1.2)∶(0.55～0.7)∶(0.55～0.7)。优选的，生物素标记的致敏原Bla g 1、生物素标记的致敏原Bla g2、生物素标记的致敏原Bla g4、生物素标记的致敏原Bla g5、生物素标记的致敏原Bla g6、生物素标记的致敏原Bla g7、生物素标记的致敏原Bla g9和生物素标记的致敏原Bla g11的质量比为1∶1∶1∶1∶0.625∶1∶0.625∶0.625。
本发明中，所述致敏原组合物溶液的稀释液为含有1wt％～3wt％牛血清白蛋白、2wt％～3wt％甘油、2wt％～3wt％蔗糖、0.1wt％～0.3wt％Proclin 300、0.1wt％～0.3wt％Triton100的0.1M Tris-NaCl缓冲液。其中，0.1M Tris-NaCl缓冲液的pH值为7.4±0.05，其中NaCl的浓度为0.15mol/L。
本发明中，所述致敏原组合物溶液中，致敏原组合物的浓度为0.2μg/mL～15μg/mL。作为优选，所述致敏原组合物溶液中，致敏原组合物的浓度为5～6μg/mL。优选的，所述致敏原组合物溶液中，致敏原组合物的浓度为5.5μg/mL。
本发明中，所述特异性IgE抗体的致敏原检测试剂中，还包括链霉亲和素包被的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体和底物溶液。
本发明所述特异性IgE抗体的致敏原检测试剂中，所述致敏原组合物溶液、链霉亲和素包被的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体的体积比为40：50：100。
本发明还提供了德国小蠊特异性IgE抗体检测方法，其包括：
步骤1：将待测物、致敏原组合物溶液和链霉亲和素包被的磁微粒混悬液混合，孵育后去上清；
步骤2：加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体，孵育后去上清；
步骤3：加入底物溶液，根据化学发光强度判断检测结果。
本发明中，所述待测物包括来自过敏患者的样品或来自环境的样品。
本发明中，所述根据化学发光强度判断检测结果的方法采用标准曲线法。
本发明提供一种用于蟑螂抗体检测的试剂，其包括致敏原组合物溶液，其中所述致敏原组合物包括：致敏原Bla g 1、致敏原Bla g2、致敏原Bla g4、致敏原Bla g5、致敏原Bla g6、致敏原Bla g7、致敏原Bla g9和致敏原Bla g11。相对于其他选择(如混合其中的2种、3种、5种等)具有检测效力高的优势，本发明提供的检测试剂与天然提取物具有同等检测效力，比天然提取物具有更好的存储稳定性；比天然提取物批次间差异小，检测稳定性更好。
具体实施方式
本发明提供了蟑螂过敏原特异性IgE抗体检测试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。所述重组致敏原Bla g 1、重组致敏原Bla g2、重组致敏原Bla g4、重组致敏原Bla g5、重组致敏原Bla g6、重组致敏原Bla g7、重组致敏原Bla g9和重组致敏原Bla g11均可于市场购得，例如博升生物、INDOOR Biotechnologies等。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1一种用于德国小蠊特异性IgE抗体检测的含过敏原试剂及应用
一、含过敏原试剂：
包含0.8μg/mL生物素标记重组Bla g 1；
0.8μg/mL生物素标记重组Bla g 2；
0.8μg/mL生物素标记重组Bla g 4；
0.8μg/mL生物素标记重组Bla g 5；
0.5μg/mL生物素标记重组Bla g 6；
0.8μg/mL L生物素标记重组Bla g 7；
0.5μg/mL生物素标记重组Bla g 9；
0.5μg/mL生物素标记重组Bla g 11。
即含过敏原试剂的中生物素标记的重组抗原的浓度为5.5μg/mL。稀释液为2％牛血清白蛋白、2.5％甘油、2.5％蔗糖、0.2％Proclin 300、0.2％Triton100的0.1M Tris-NaCl缓冲液(pH＝7.4±0.05，0.15M NaCl)。
二、制备方法：
1.生物素标记重组致敏蛋白的制备：
采用Thermo Scientific公司的生物素化试剂NHS-PEG12-Biotin，分别对8种重组致敏蛋白进行标记，将NHS-PEG12-Biotin试剂用二甲基亚砜配制成20mM，与2mg/ml重组致敏蛋白，按比例混合，室温震荡反应2小时，将反应后的液体用0.01M PBS(pH＝7.2)透析3次，每次透析8小时，即得生物素标记重组致敏蛋白。
其中，重组致敏蛋白与生物素化试剂的比例进行了优选，以摩尔比计，
重组Bla g 1与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 2与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 4与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 5与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 6与生物素化试剂的标记比例为1：20；
重组Bla g 7与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 9与生物素化试剂的标记比例为1：10；
重组Bla g 11与生物素化试剂的标记比例为1：10。
2.含过敏原试剂的稀释液的制备：
(1)取Tris 12.11g、NaCl 8.77g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入600mL纯化水，充分搅拌，使实试剂完全溶解；
(2)调pH，控制pH在7.35～7.45范围内；
(3)取牛血清白蛋白20g、Proclin 300 2mL、Triton100 2mL、甘油25mL和蔗糖25g加入上述烧杯中；
(4)最后定容至1000mL，用0.2μm滤器过滤即得。
3.含过敏原试剂的制备：
将生物素标记重组Bla g 1、生物素标记重组Bla g 2、生物素标记重组Bla g 4、生物素标记重组Bla g 5、生物素标记重组Bla g 6、生物素标记重组Bla g 7、生物素标记重组Bla g 9、生物素标记重组Bla g 11按质量比为1∶1∶1∶1∶0.625∶1∶0.625∶0.625，用上述稀释液配制成5.5μg/mL，即得含过敏原试剂。
三、含过敏原试剂的应用：
所述含过敏原试剂用于德国小蠊特异性IgE抗体检测，应用方法如下：
(1)40μl所述含过敏原试剂与50μl链霉亲和素包被的磁微粒混悬液和50μl过敏患者样本混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(2)加入100μl辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体，混合，37℃孵育15min，磁分离去上清；
(3)加入底物溶液，测定化学发光强度；
(4)根据校准曲线和算法可得待测样本中IgE的浓度。
试验例1 8种重组致敏蛋白标记生物素时标记比例的比较
实验方法参见实施例1，其中所列样本的浓度值为Phadia Immuno CAP德国小蠊过敏原特异性IgE检测试剂测定的结果。实验结果如下表1：
表1. 8种重组致敏蛋白标记生物素时标记比例的比较
Figure BDA0003622056020000061
Figure BDA0003622056020000071
Figure BDA0003622056020000081
Figure BDA0003622056020000091
结果显示：重组致敏蛋白与生物素化试剂的标记比例不同反应性存在差异，其中重组Bla g 1、重组Bla g 2、重组Bla g 4、重组Bla g 5、重组Bla g 7、重组Bla g 9和重组Bla g 11比例为1∶10时检测获得的效果最好，重组Bla g 6比例为1∶20时检测获得的效果最好。
试验例2实施例1含过敏原试剂与生物素化天然提取物存储稳定性的比较
实验方法参见实施例1。实验结果如下表2：
表2.安图含过敏原试剂与生物素化天然提取物存储稳定性的比较
Figure BDA0003622056020000092
Figure BDA0003622056020000101
结果显示：与常规生物素化天然提取物相比，安图含过敏原试剂的存储稳定性更好。
试验例3实施例1含过敏原试剂与生物素化天然提取物检测效力的比较
实验方法参见实施例1。实验结果及符合率统计如下表3.1、3.2：
表3.1.安图含过敏原试剂与与生物素化天然提取物检测效力的比较
Figure BDA0003622056020000102
Figure BDA0003622056020000111
表3.2.符合率统计结果
Figure BDA0003622056020000112
结果显示：安图含过敏原试剂与常规生物素化天然提取物具有相当的检测效力。
试验例4实施例1含过敏原试剂与生物素化天然提取物批次间的比较
实验方法参见实施例1。实验结果如下表4：
表4.安图含过敏原试剂与生物素化天然提取物批次间的比较
Figure BDA0003622056020000121
结果显示：与常规生物素化天然提取物相比，安图含过敏原试剂批次间差异小，检测稳定性更好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.蟑螂过敏原特异性IgE抗体的检测试剂，其特征在于，包括致敏原组合物溶液，其中所述致敏原组合物包括：致敏原Bla g 1、致敏原Bla g2、致敏原Bla g4、致敏原Bla g5、致敏原Bla g6、致敏原Bla g7、致敏原Bla g9和致敏原Bla g11。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述致敏原组合物溶液包括稀释液和：
生物素标记的致敏原Bla g1、生物素标记的致敏原Bla g2、
生物素标记的致敏原Bla g4、生物素标记的致敏原Bla g5、
生物素标记的致敏原Bla g6、生物素标记的致敏原Bla g7、
生物素标记的致敏原Bla g9和生物素标记的致敏原Bla g11。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述致敏原组合物为德国小蠊的致敏原组合物。
4.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述生物素为NHS-PEG12-Biotin。
5.根据权利要求2～4任一项所述的检测试剂，其特征在于，
致敏原Bla g1与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g2与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g4与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g5与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g6与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g7与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g9与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)；
致敏原Bla g11与NHS-PEG12-Biotin的摩尔比为1∶(8～12)。
6.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，生物素标记的致敏原Bla g1、生物素标记的致敏原Bla g2、生物素标记的致敏原Bla g4、生物素标记的致敏原Bla g5、生物素标记的致敏原Bla g6、生物素标记的致敏原Bla g7、生物素标记的致敏原Bla g9和生物素标记的致敏原Bla g11的质量比为1∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)∶(0.8～1.2)∶(0.55～0.7)∶(0.8～1.2)∶(0.55～0.7)∶(0.55～0.7)。
7.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述稀释液为含有1wt％～3wt％牛血清白蛋白、2wt％～3wt％甘油、2wt％～3wt％蔗糖、0.1wt％～0.3wt％Proclin 300、0.1wt％～0.3wt％Triton100的0.1M Tris-NaCl缓冲液。
8.根据权利要求1～7任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述致敏原组合物溶液中，致敏原组合物的浓度为0.2μg/mL～15μg/mL。
9.根据权利要求1～8任一项所述的检测试剂，其特征在于，还包括链霉亲和素包被的磁微粒混悬液、辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体和底物溶液。
10.非诊断目的的德国小蠊特异性IgE抗体检测方法，其特征在于，包括：
步骤1：将待测物、致敏原组合物溶液和链霉亲和素包被的磁微粒混悬液混合，孵育后去上清；
步骤2：加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgE抗体，孵育后去上清；
步骤3：加入底物溶液，根据化学发光强度判断检测结果。
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