CN106995491B

CN106995491B - 澳洲坚果过敏原

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Publication number: CN106995491B
Application number: CN201611025289.8A
Authority: CN
Inventors: W·聚尔; S·罗韦尔; Y·登诺
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2036-11-16
Also published as: CN106995491A

Abstract

本发明涉及一种多肽，其包含选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH 6.3至8.7于2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH 6.5至7.9于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质或其抗原性变体，优选在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质或其抗原性变体。

Description

澳洲坚果过敏原

本发明涉及一种多肽，其包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH6.3至8.7于2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH 6.5至7.9于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质或其抗原变体，优选在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质或其抗原变体。

对树坚果的过敏反应可以是严重的和危及生命的。这适用于常见的品种，例如榛子，花生，核桃，也适用于澳洲坚果，其为澳大利亚常青树(四叶澳洲坚果(Macadamiatetraphylla)和澳洲坚果(M. integrifolia))的果实。

澳洲坚果(就植物学而言，其是种子)不像许多其它树坚果一样是常见的食物，但其越来越频繁地被生吃或烘焙食用，并且常常被添加至各种食物例如小吃棒、谷物和混合坚果。碎澳洲坚果膳食正在成为烘焙食品中日益流行的成分，冷压澳洲坚果油亦如此。绝非少数情况的是，澳洲坚果常常可用作坚果混合物的一部分，并因此在先前不进口其的国家中销售。

在敏化个体中因暴露于澳洲坚果而引起的过敏反应可包括严重的症状(Pallares,D.E.(2000):Allergy to macadamia nut.Ann Allergy Asthma Immunol2000；85(5):385-6)。因此，患有过敏的受试者知晓过敏原的来源是至关重要的，因为他们需要避免接触含有任何过敏原或已接触过任何过敏原的食品、化妆品和其它产品。

过敏可以使用常规皮肤点刺试验来诊断，所述试验涉及将怀疑患有过敏的受试者的皮肤暴露于潜在致敏性果实的提取物，并用合适的对照进行补充。然而，假阴性结果经常发生，因为某些过敏原可能以不足够低的浓度存在于这些提取物中(Sicherer,S.H.,Teuber,S.S. (2004):Current approach to the diagnosis and management ofadverse reactions to foods.Journal of Allergy and Clinical Immunology 2004；114.5,1146–50)。另外，特定的过敏原可以在提取物中进行蛋白水解(Rancé,F.,Juchet,A.,Brémont,F.,Dutau,G. (1997):Correlation between skin prick tests usingcommercial extracts and fresh foods,specific IgE and food challenges.Allergy1997；52.10,1031–5)。此外，基于全提取物的测定由于交叉反应性而不够特异。

因此，期望基于针对特异性过敏原的抗体例如IgE或IgG的检测来设计测定。这样的测定涉及将包含抗体的患者样品暴露于固定化的过敏原，随后进行检测，任选地定量结合至固定化的过敏原的IgE抗体(Volcheck,G.W.(2009):Clinical Allergy,Diagnosisand Management)。

主要过敏原已在一系列坚果中被鉴定。例如，花生过敏的绝大多数病例与对储存蛋白Ara h 2、Ara h 7和Ara h 6的敏感性相关。因此，已经设计了基于针对这些过敏原的IgE抗体的检测的合理可靠的测定(Codreanu,F.,Collignon,O.,Roitel,O.,Thouvenot,B.,Sauvage, C.,Vilain,A.C.,Cousin,M.O.,Decoster,A.,Renaudin,J.M.,Astier, C.,Monnez,J.M.,Vallois,P.,Morisset,M.,Moneret-Vautrin,D.A., Brulliard,M.,Ogier,V.,Castelain,M.C.,Kanny,G.,Bihain,B.E., Jacquenet,S.(2011):A novelimmunoassay using recombinant allergens simplifies peanut allergydiagnosis.Int Arch Allergy Immunol 2011；154(3):216-26；EP15075033.9)。

相比之下，关于澳洲坚果过敏原的身份的信息非常少。迄今为止，描述用于诊断澳洲坚果过敏的免疫测定的现有技术文献的作者必须依赖于全坚果提取物或部分纯化的提取物。例如，Ghorbani等人进行了基于检测食品中残留的澳洲坚果蛋白质的免疫测定(Ghorbani,M., Morgan,M.R.A.(2010):Protein characterisation and immunochemicalmeasurements of residual macadamia nut proteins in foodstuffs.Food AgrImmunol 2010；21:347-360)。

Herbst等人使用来自引起患者显示过敏症状的单一批次的澳洲坚果的全坚果提取物(Herbst,R.A.,Wahl,R.,Frosch,P.J.(2010): Specific IgE reactivity andidentification of potential allergens in macadamia allergy.J Eur AcadDermatol Venereol 2010； 24(11):1361-3)。

Sathe等人报道了从包括澳洲坚果的各种树坚果制备的全提取物的溶解并将其用于Western印迹中(Sathe,S.K.,Venkatachalam,M., Sharma,G.M.,Kshirsagar,H.H.,Teuber,S.S.,Roux,K.H.(2009): Solubilization and electrophoreticcharacterization of select edible nut seed proteins.J Agric Food Chem 2009；57(17):7846-56)。

在缺乏特异性过敏原的情况下，提供足够可靠的诊断是不可行的。全坚果提取物或部分纯化的提取物与类似于皮肤点刺试验的缺点的限制(例如不稳定性和不足的特异性，更具体地说是假阴性结果)有关。

因此，本发明涉及的问题是提供一种用于诊断过敏，优选坚果过敏，更优选澳洲坚果过敏的方法，以及用于这样的方法的试剂，相较于现有技术测定，所述方法具有改善的诊断可靠性(特别是灵敏度)。

本发明涉及的另一个问题是提供用于鉴别诊断过敏，优选坚果过敏例如树坚果过敏的测定，更优选用于区分对澳洲坚果的过敏与对非澳洲坚果的坚果的过敏的测定，和/或用于监测患有这种过敏的个体的治疗。

本发明涉及的另一个问题是提供可用于这样的测定的试剂，用于制备这样的试剂的方法和用于这样的诊断的方法。本发明涉及的另一个问题是提供用于治疗患有对澳洲坚果的过敏的患者的治疗方法和药物组合物。

本发明涉及的问题通过所附的独立和从属权利要求的主题来解决。

在第一方面，本发明涉及的问题通过一种多肽来解决，所述多肽包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH 6.3至8.7于2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH 6.5至7.9于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质或其变体，优选在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质或其变体。所述多肽是来自四叶澳洲坚果(Macadamiatetraphylla)和澳洲坚果(M.integrifolia)优选澳洲坚果的多肽。

在优选的实施方案中，多肽是分离的和/或重组的多肽。

在另一个优选的实施方案中，多肽是融合多肽，其优选包含用于检测或纯化的标签。

在第二方面，该问题通过一种核酸来解决，所述核酸编码根据本发明的多肽，其优选在载体中，更优选在细胞中的载体中。

在另一个优选的实施方案中，多肽是固定化的。

在第三方面，该问题通过一种医疗器械来解决，所述医疗器械包含根据本发明的多肽，其中所述医疗器械优选是诊断上有用的载体，更优选选自包含珠子、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选选自包含蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和微量滴定板的组。

在第四方面，该问题通过包括以下步骤的方法来解决：在样品，优选来自哺乳动物，更优选来自人的样品中检测与根据本发明的多肽结合的抗体，所述方法优选用于诊断坚果过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。

在第五方面，该问题通过包括下列步骤的治疗疾病的方法来解决：向受试者施用或使来自受试者的样品接触根据本发明的多肽，

其中所述疾病优选是坚果过敏，更优选是树坚果过敏，最优选是澳洲坚果过敏。

在第六方面，该问题通过一种抗体来解决，所述抗体结合选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH 6.3至8.7于2D SDS PAGE 中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH6.5至7.9于2D SDS PAGE 中电泳的20至25kDa的蛋白质或其变体，

优选在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质，

其中任选地所述抗体处于与所述澳洲坚果蛋白或其变体的复合物中。在优选的实施方案中，结合澳洲坚果蛋白的抗体是分离的抗体。

在第七方面，该问题通过用于诊断疾病的测试试剂盒来解决，所述试剂盒包含根据本发明的多肽和任选地用于检测包含所述多肽和根据本发明的抗体的复合物的工具。

在第八方面，该问题通过用于分离抗体的方法来解决，所述抗体结合选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH 6.3至8.7于2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH 6.5至7.9于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质或其抗原性片段，所述方法包括下列步骤：

a)在适于形成复合物的条件下，使包含所述抗体的样品与澳洲坚果蛋白或其变体接触，

b)分离在步骤a)中形成的复合物，

c)解离在步骤b)中分离的复合物，和

d)使澳洲坚果蛋白与所述抗体分离。

在第九方面，该问题通过一种药物组合物或疫苗来解决，所述药物组合物或疫苗包含根据本发明的多肽，任选地另外包含药学上可接受的载物。

在优选的实施方案中，所述样品是包含抗体的体液，所述体液优选选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组，更优选为全血。

在优选的实施方案中，所述抗体是IgE或IgG，例如IgG4，优选 IgE抗体。

在第十面，该问题通过根据本发明的多肽用于诊断过敏，优选坚果过敏，更优选树坚果过敏，最优选澳洲坚果过敏的用途来解决。

本发明基于本发明人的令人惊讶的发现：在澳洲坚果中存在一系列特异性过敏原，其显示针对来自患有坚果过敏的患者的血清的反应性，并且可用于诊断和治疗坚果过敏，特别是澳洲坚果过敏。此外，这些过敏原可用于区分坚果过敏，特别是区分对澳洲坚果的过敏与对非澳洲坚果的坚果的过敏。就发明人所知，这些抗原在本领域的现有技术中还没有被描述。

在优选的实施方案中，本文所用的术语“树坚果”是选自包含以下的组的坚果：澳洲坚果，榛子，花生，核桃，杏仁，美洲山核桃，腰果，巴西坚果，栗子，松子，开心果，MongongoYeheb坚果，石栗和智利榛子。

本发明涉及诊断上有用的载体，优选为固相载体，用于使特异性捕获抗体的工具(所述工具与所述载体缔合)与来自受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人受试者的体液样品接触。载体可以直接与样品接触，并且允许用于特异性捕获抗体的工具暴露于样品中的任何抗体。在优选的实施方案中，固相载体是诊断装置，更优选选自包含珠子、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选选自包含蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和微量滴定板的组。

在最优选的实施方案中，诊断上有用的载体是线印迹(Raoult,D., and Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and otherantibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65； WO2013041540)。在优选的实施方案中，本文所用的术语“线印迹”是指已用一种或多种用于捕获抗体的工具(优选各自为多肽)包被的测试条，更优选是基于膜的。如果使用两种或更多种工具，则它们优选在载体上是在空间上分离的。优选地，带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选地40％，50％，60％，70％或80％。测试条可以包含一个或多个对照带，用于确认其已在适当的条件下，特别是在存在人血清、抗体缀合物或两者的情况下，与样品接触足够长的时间。许多线印迹可商购获得，例如获自EUROIMMUN AG,Lübeck, Germany。

必要的是，用于实施本发明的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。通常，样品是包含受试者的全部免疫球蛋白的代表性集合的体液。然而，在提供样品后，样品可以经历进一步的处理，这可包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，优选IgE和/或IgG4，这可影响各种类型的免疫球蛋白的相对分布。样品可以选自全血、血清、脑脊液和唾液，优选血清。在最优选的实施方案中，样品包含IgE类抗体。

必要的是，诊断上有用的载体包含用于特异性捕获针对在pH 6.3 至8.7于2D SDSPAGE中电泳的53至67kDa的澳洲坚果蛋白或在 pH 6.5至7.9于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的澳洲坚果蛋白 (优选在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的澳洲坚果蛋白)的抗体的工具，所述澳洲坚果蛋白已被本发明人鉴定为澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(macadamiavicilin-like protein)(多肽的数据库登录码： Q9SPL3；编码所述蛋白质的核酸的数据库登录码：AF161885)。本申请通篇中提及的任何数据库代码是指在本申请的优先权日时可通过 NCBI数据库在线获得的多肽序列。

优选地，用于特异性捕获这样的抗体的这样的工具是一种多肽，其包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在pH 6.3至8.7于 2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质或在pH 6.5至7.9于 2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质或其变体，优选在pH6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质或其变体。

根据本发明，载体包括用于特异性捕获抗体的一种或多种工具，优选一种或多种，更优选两种或更多种，更优选三种或更多种，更优选四种或更多种这样的工具，它们中的每一种能够特异性捕获不同的抗体。除了用于捕获澳洲坚果蛋白(优选澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白 (Q9SPL3))的工具以外，所述载体还可包括用于捕获针对一种或多于一种来自包含下列蛋白质的组的蛋白质的抗体的工具：SEQ ID NO3(来自榛子的Cor a11),SEQ ID NO4(来自芝麻(Sesam)的Ses i3), SEQ ID NO5(来自花生的Ara h1),SEQ ID NO6(来自开心果的Pis v3),SEQ ID NO7(来自腰果的Ana o1),SEQ ID NO8(来自美洲山核桃的Car i2),SEQID NO9(来自核桃的Jug r2)；例如用于捕获针对 SEQ ID NO3的抗体的工具和用于捕获针对SEQ ID NO4的抗体的工具。所述工具优选固定在所述载体上。在优选的实施方案中，用于特异性捕获抗体的工具是与待捕获的抗体结合的多肽或其变体，例如根据本发明的多肽或SEQ ID NO3(来自榛子的Cor a11),SEQ ID NO4 (来自芝麻的Ses i3),SEQ ID NO5(来自花生的Ara h1),SEQ ID NO6 (来自开心果的Pis v3),SEQ ID NO7(来自腰果的Ana o1),SEQID NO8(来自美洲山核桃的Car i2),SEQ ID NO9(来自核桃的Jug r2)，例如用于捕获针对SEQ ID NO3的抗体的工具和用于捕获针对SEQ ID NO4的抗体的工具。所述工具与其附着至的不溶性载体一起可以以直接方式例如通过过滤、离心或倾析从反应混合物中分离。所述工具可以以可逆或不可逆的方式固定。例如，如果分子经由可以通过加入高浓度的盐掩蔽的离子相互作用与载体相互作用，或者如果分子通过可切割的共价键结合，则固定是可逆的。相比之下，如果分子通过不能在水溶液中裂解的共价键连接到载体上，则固定是不可逆的。所述工具(优选多肽)可以是间接固定的，例如通过固定对多肽具有亲和力的抗体或其它实体，然后加入多肽并形成多肽-抗体复合物。

然而，本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确或隐含提及 (例如通过功能、名称、序列或登录号)的精确序列的多肽或野生型序列来执行，还可以使用这样的多肽的变体来执行。

在优选的实施方案中，如本文所用的术语“变体”可以指所提及的全长序列的至少一个片段，更具体地，相对于全长序列而言在一个或两个末端上截短一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列的至少10、15、25、50、75、100、150、200、 300、400或500个连续氨基酸的肽或其变体。变体的总长度可以是25、 30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。优选的片段是SEQ ID NO：1或其变体。

变体可以与所提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、 60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中除了对生物活性必需的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和 /或一个或多个这样的必需氨基酸以保守方式被替换和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物活性至少被部分保留。现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008，第三版。在优选的实施方案中，使用ClustalW 软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm, A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007): Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，应用默认设置。

在优选的实施方案中，变体可以另外包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化，磷酸化，乙酰化，脱羧基化，瓜氨酸化，羟基化等。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。此外，还可以通过与其它已知多肽或其变体融合来产生变体。

必要的是，多肽的变体具有生物活性。在优选的实施方案中，这样的生物活性是结合来自患者，优选患有过敏，更优选对坚果的过敏，最优选对澳洲坚果的过敏的患者的过敏特异性IgE抗体的能力。在另一个优选的实施方案中，这样的生物活性是在对坚果，优选树坚果，更优选澳洲坚果过敏的受试者中引发过敏反应的能力。

本领域技术人员能够通过从原始澳洲坚果蛋白质开始，引入修饰点突变、截短等来设计变体，随后通过测试所述变体是否结合获自对澳洲坚果过敏的受试者的样品中的抗体来确认该变体仍然具有生物活性。

变体可以使用遗传工程方法或化学合成法制备。

可以通过蛋白质印迹，使用来自对澳洲坚果过敏的患者的血清(优选如实施例中所述的)作为抗体来源来确定结合活性。

根据本发明的多肽或其变体可以是融合蛋白，即任选通过接头与其它序列融合(优选在N末端或C末端上)的多肽。该其它序列可以是用于检测的标签，例如FLAG标签，或用于纯化的标签，例如选自包含GST、His或MBP标签的组。根据本发明的示例性融合多肽显示于SEQ ID NO：2中。

根据本发明的多肽可以以任何形式和以任何纯化程度提供，从以内源形式包含所述多肽的组织、果实或细胞、更优选过表达所述多肽的细胞、这样的细胞的粗制或富集的裂解物到纯化和/或分离的多肽 (其基本上是纯的)。在优选的实施方案中，多肽是天然多肽，其中本文所用的术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选从组织或细胞，更优选从哺乳动物细胞或组织，任选地从非重组组织或细胞纯化的折叠多肽。如果使用天然多肽，与其天然状态相比，优选是富集的。

根据本发明，多肽可以是重组蛋白，其中本文使用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用遗传工程方法产生的多肽，例如通过融合编码多肽的核酸至用于在细胞或组织中过表达的强启动子或通过工程改造多肽本身的序列和/或使用用于通过遗传工程修饰的细胞的表达。本领域技术人员熟悉用于工程改造核酸和编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH或BrownT.A.(1986),Gene Cloning–an introduction, Chapman&Hall中描述的)以及用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如由GE Healthcare Life Sciences出版的Handbooks“Strategies for Protein Purification”,“Antibody Purification”，以及在 Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide to Protein Purification 中描述的)。

在优选的实施方案中，术语“分离的”意指多肽相对于在整个坚果或从整个坚果获得的全坚果提取物中的全部澳洲坚果蛋白，优选澳洲坚果过敏原，已被富集。在另一个更优选的实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”意指该多肽相较于其在使用生物技术或合成方法产生后的状态已被富集并且优选是纯的，即所使用的多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳随后考马斯蓝染色和目视检查所判断的。

根据本发明的受试者是产生抗体，优选IgE类别或等同的过敏相关抗体，更优选来自哺乳动物，最优选人的抗体的动物，包括人。

根据本发明的方法考虑了在样品中检测与根据本发明的多肽结合的抗体，所述方法优选用于诊断坚果过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。本领域技术人员熟悉可用于检测样品中的抗体的各种方法，例如选自包括免疫扩散技术、通过IgE抗体的嗜碱性粒细胞活化、免疫电泳技术、光散射免疫测定、凝集技术、标记的免疫测定例如放射性标记的免疫测定、酶免疫测定例如比色测定、化学发光免疫测定和免疫荧光技术的组。

在许多情况下，检测样品中的抗体的不存在或存在(任选地意指确定抗体的浓度是否超过某些阈值，常常通过检测限度显示)足以用于诊断。如果可以检测抗体，则这将是对临床医生的诊断有用的信息，并且表明患者患有过敏的可能性增加。在优选的实施方案中，可以测定血清中的抗体相对于可能在平均健康受试者中发现的水平的相对浓度。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“检测存在或不存在”意指足以核查是否可以使用合适的复合物检测方法检测足够超过任何背景水平的信号，所述复合物检测方法指示目标抗体存在或存在比在健康受试者中所存在的更多的目标抗体。在更优选的实施方案中，这可以包括确定浓度是否超过对照中的浓度或超过阈值，优选至少0.1，优选0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100，200、500、1000、 10000或100000倍高于在平均健康受试者中发现的目标抗体的浓度。

简言之，检测抗体可以包括步骤a)在适于形成复合物的条件下，使包含抗体的样品与根据本发明的多肽或其变体接触。这可以通过使液体样品与固定化形式(例如被固定在膜上，例如在蛋白质印迹或线印迹中所使用的)的多肽接触来实现。当样品和多肽接触时，样品中存在的能够特异性结合多肽的任何抗体将进行这样的结合达到使包含多肽和抗体的复合物存在的效果。

随后，进行步骤b)，其包括分离在步骤a)中形成的所述复合物，例如通过除去样品和任选地使用洗涤缓冲液洗涤被固定的多肽来进行分离。

最后的步骤c)包括检测复合物，例如通过添加可结合来自样品的抗体的第二抗体来检测。第二抗体可以包含标记，例如酶或放射性同位素。或者，可以使用方法诸如化学交联随后SDS PAGE或使用质谱法来直接检测复合物。

针对根据本发明的多肽的抗体的检测表明，供给样品的受试者对澳洲坚果过敏。在受试者表现出过敏反应，但这样的样品不含有针对本发明受试者的抗体的情况下，受试者可能患有过敏，例如坚果过敏，但对澳洲坚果不过敏。

在本发明的范围内的是诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获针对本发明多肽的抗体的工具。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性捕获抗体”是指特异性结合目标抗体达到从样品中结合和去除其而其它抗体基本上不结合并保留在样品中的效果的能力。

根据本发明，提供了用于特异性检测捕获的抗体的工具，任选地作为试剂盒的一部分。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“特异性检测捕获的抗体”意指在捕获后检测到特异性结合至特异性捕获抗体(其结合根据本发明的多肽)的工具的抗体，而不是样品中存在的任何其它抗体。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性结合”意指该结合比其特征在于下述解离常数的结合反应更强： 1×10^-5M，更优选1×10^-7M，更优选1×10^-8M，更优选1×10^-9M，更优选1×10^-10M，更优选1×10^-11M，更优选1×10^-12M，如通过表面等振子体共振使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中测定的。

本发明的教导内容提供了试剂盒，其优选用于诊断过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。这样的试剂盒是包含实施本发明方法所需的特定试剂(特别是根据本发明的诊断上有用的载体，任选地除了实施本发明方法所需的一种或多种溶液之外，该溶液优选选自或全部选自包括样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和包含用于检测任何特异性捕获的抗体例如第二抗体的工具和任选地用于检测后者的工具的缓冲液的组)的容器。此外，其可以包括详述如何使用试剂盒和本发明的用于使本发明的多肽与来自受试者优选人受试者的体液样品接触的诊断上有用的载体(例如线印迹，其中将用于特异性捕获抗体至根据本发明的多肽的工具固定在线印迹上)的说明书。此外，试剂盒可以包含阳性对照，例如已知结合根据本发明的多肽的重组抗体，和阴性对照，例如对根据本发明的多肽没有可检测的亲和力的蛋白质。最后，这样的试剂盒可以包含含有用于制备校准曲线的抗体的标准溶液。

根据本发明，需要用于检测一种或多种捕获的抗体的工具。本领域技术人员知道可以使用的许多方法，所述方法也被描述在现有技术中，例如在Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.SaundersCompany中，特别是在第14章中描述的。在优选的实施方案中，使用结合一种或多种捕获的抗体(其是相应的第一抗体)的恒定区的第二抗体，所述第二抗体可以与直接检测例如荧光、放射性或酶活性标记(后者可以催化化学发光反应或可使用比色法或光谱或其它分析方法检测的分子的产生)的标记相关联。

或者，生物功能测定可用作检测一种或多种捕获的抗体的工具，条件是抗体是IgE类抗体，优选基于通过IgE抗体的嗜碱性粒细胞活化的测定。这样的测定法已经在现有技术中描述，例如Hausmann,O. V.,Gentinetta,T.,Bridts,C.H.,and Ebo,E.G.(2009):TheBasophil Activation Test in Immediate-Type Drug Allergy,Immunol.AllergyClin.N.Am.29,555-566。

在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得在评估患者是否患有或可能或比平均或比较受试者(后者优选地具有相似的症状)更可能在诊断时或在未来患有某种疾病或病症的过程中有用的信息以发现疾病如何进展或在未来可能进展或评估患者对于某种治疗(例如施用合适的药物，例如用于使过敏患者脱敏的药物) 的反应性的任何种类的程序。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且包括预测和/或监测疾病或病症的过程或治疗的成功。优选检测 IgG(更优选IgG4)类别的自身抗体用于监测疾病的进展和/或治疗的成功。

因此，术语“诊断”优选地不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将是结论性的并且足以基于单一测试(更不用说参数)来完成诊断，而是可以指对被称为“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑一系列可能条件的可能性的系统诊断程序)的贡献。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换句话说，所述方法或药剂可涉及选择用于受试者的治疗方案。

本发明提供了包含根据本发明的多肽的药物组合物，优选疫苗，所述组合物优选适于施用至受试者，优选哺乳动物受试者，更优选施用至人。这样的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部地、通过滴眼剂、经直肠、经鼻、经口腔、经阴道或经由植入的储库施用，其中本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。药物组合物可以以合适的剂型提供，例如胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液，优选为无菌形式。其可用于治疗疾病优选过敏的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。可以使用根据本发明的多肽的低过敏原性变体。本领域技术人员熟悉用于产生已知过敏原的低过敏原性变体的方法。

本发明提供了用于通过向受试者施用本发明的药物组合物治疗、预防或改善过敏，优选坚果过敏，更优选澳洲坚果过敏的方法。

通过以下附图和非限制性序列和实施例进一步说明本发明，从中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。

附图描述

图1显示了澳洲坚果提取物的2D凝胶电泳分离的结果。在pH 3-10非线性IPG条上在第一维中分离，随后在还原条件下通过SDS PAGE分离蛋白质，通过考马斯染色进行染色并从凝胶中切出。数字标记随后进行MALDI-TOF分析的点。箭头标记代表后续被鉴定为澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的蛋白质的条带。

图2显示了澳洲坚果提取物的蛋白质印迹分析和通过2D凝胶电泳分离的蛋白质的蛋白质印迹的结果。分子量标记与图1所示相同。

图3显示了使用涂覆有来自澳洲坚果的豌豆球蛋白样蛋白的 EUROLINE品系测定法对来自澳洲坚果致敏患者(n＝20)和健康献血者(n＝17)的人血清的分析。基于EAST参考系统进行来自人血清的结合抗体的评价。

图4a至4g显示了比较数据，其指示如使用线印迹测定的来自所述患者的血清中以EAST类别形式表达的IgE浓度。这些图显示了针对来自非澳洲坚果的树坚果的一种树坚果或核7S豌豆球蛋白样蛋白的IgE与针对来自澳洲坚果的Mac I豌豆球蛋白的IgE之间的相关性 (如果有的话)。

本申请包括多个氨基酸序列，更具体地，包括：

SEQ ID NO1(优选澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(Q9SPL3)的片段)

SEQ ID NO2(包含澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的融合蛋白)

SEQ ID NO3(来自榛子的Cor a11),

SEQ ID NO4(来自芝麻的Ses i3),

SEQ ID NO5(来自花生的Ara h1),

SEQ ID NO6(来自开心果的Pis v3)

SEQ ID NO7(来自腰果的Ana o1)

SEQ ID NO8(来自美洲山核桃的Car i2)

SEQ ID NO9(来自核桃的Jug r2)

SEQ ID NO10(来自澳洲坚果的Mac I豌豆球蛋白)

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，从中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。

实施例：

实施例1：

澳洲坚果提取物的制备

将烘焙和盐腌的市售澳洲坚果仁研磨，然后用丙酮脱脂3次。将脱脂的坚果碎片在折叠的过滤器上干燥。将干燥的材料重悬于缓冲液例如磷酸缓冲盐水(PBS，50mM磷酸钠，150mM NaCl,pH 7.4)中，在孵育振荡器中在4℃孵育3小时，随后过滤并在台式离心机中在4℃以4000rpm离心30分钟。

使用100％硫酸铵沉淀上清液，并将所得沉淀针对PBS透析。如生产商的说明书中所述，通过Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,USA)进行蛋白浓度的估计。

制备凝胶电泳

将粗制的澳洲坚果提取物用冷的丙酮沉淀，并且在-20℃孵育2小时且在4℃以20000xg离心30分钟后，将沉淀物重悬在样品缓冲液中用于等电聚焦(2.5％磺基甜菜碱3-10，4M尿素，2M硫脲，0.5％ (v/v)载体两性电解质(Carrier Ampholyte)pH 3-10、40mM DTT和0.003％溴酚蓝)。在室温下用样品再次水化IPG条(ReadyStrip IPG 条7cm pH 3至10(Bio-Rad)，固定的pH梯度)过夜。

随后，使用PROTEAN i12IEF系统(Bio-Rad)聚焦蛋白质，并且通过用于在凝胶上产生纯蛋白点的聚丙烯酰胺凝胶电泳(4至12％ Bis-Tris蛋白质凝胶，1.0mm x 2D孔，ThermoFisher Scientific)，基于其表观分子量在第二维进行分离。对于2D凝胶中的点的尺寸估计，如制造商的说明书中所述使用Spectra Multicolor Broad Range (Thermo FisherScientific)进行估计。

通过Blue-银染色(Candiano等人,Electrophoresis.2004May； 25(9):1327-33.Blue silver:a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining forproteome analysis)对所得2D凝胶的蛋白质进行染色。染色的凝胶如图1所示。

蛋白质印迹

如制造商的说明书中所述，将坚果提取物的2D凝胶通过TE22 Miniblotter(Hoefer Inc.，Holliston，MA，USA)转移至硝酸纤维素膜。通过用Ponceau S染色检测转移的蛋白质。将所得蛋白质印迹在洗涤缓冲液(EUROIMMUN AG,Lübeck,Germany)中孵育15分钟，随后用在洗涤缓冲液中1:10稀释的来自澳洲坚果致敏的患者的血清孵育1小时。

在用洗涤缓冲液(产品号ZD1100，由EUROIMMUN AG提供用于EUROLINE线印迹，Lübeck，Germany)洗涤3次，每次5分钟后，将膜与抗IgE-AP缀合物(EUROIMMUN AG,Lübeck,Germany) 孵育并再次用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如制造商的说明书中推荐的，通过与BCIP/NBT底物(EUROIMMUN AG,Lübeck, Germany)孵育来检测结合的抗体。

获得的印迹示于图2中。主要的目标蛋白质包括在pH 6.3至8.7 于2D SDS PAGE中电泳的53至67kDa的蛋白质和在pH 6.5至7.9 于2D SDS PAGE中电泳的20至25kDa的蛋白质。

MALDI

切下用Blue银染色染色的2D凝胶的选定点并用胰蛋白酶消化。如制造商的说明书中所述，使用MALDI-TOF/TOF Autoflex III (Bruker Corporation,Billerica,MA,USA)进行肽质量指纹分析 (PMF)和MSMS。就方便的序列筛选针对绿色植物的NCBI数据库，导致作为在pH 6.3至8.7电泳的53至67kDa的蛋白质的澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(数据库登录码：Q9SPL3)的鉴定。

澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的克隆、重组表达和纯化

通过基因合成(Eurofins Genomics GmbH)生成澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的编码区，更具体地等同于如SEQ ID NO：2所示的通过接头与His标签融合的AF161885中的核苷酸序列的编码DNA，通过聚合酶链反应扩增并使用

ThioFusion^TM表达试剂盒 (Invitrogen)亚克隆到重组载体中。如制造商所述，在大肠杆菌中表达融合蛋白，并通过在镍基质(IMAC)上的亲和层析分离。

线印迹(EUROLINE)的制备

通过使用精密分配器(可从Zeta Corporation商购获得)将融合蛋白涂覆在硝酸纤维素膜(可从Schleicher&Schüll商购获得)上来产生EUROLINE线印迹。根据制造商的说明书的推荐封闭和洗涤后，将膜切成3mm的条。

使用EUROLINE线测定法评价样品

根据制造商(EUROIMMUN AG,Lübeck,Germany)说明书的推荐孵育EUROLINE条。具体来说，在室温下，用1ml在洗涤缓冲液中1/11(v/v)稀释的患者样品(20个澳洲坚果致敏的患者和17个健康血液供体)孵育所述条16小时。弃去患者样品后，将所述条洗涤3 次，每次用每条1ml洗涤缓冲液洗涤5分钟，随后用1ml与AP缀合的抗人IgE抗体孵育1小时。然后，将所述条再次用洗涤缓冲液洗涤 5次，然后用BCIP/NBT底物孵育10分钟。

通过扫描仪和

程序(EUROIMMUN AG, Lübeck，Germany)对结果进行评价。可以通过使用WHO标准 (75/502)的IgE校准曲线实现半定量分析。IgE浓度以国际单位kU/l (千IgE单位/升)表示。结果可以例如使用Pharmacia公司(现在为 ThermoScientific)开发的RAST系统(放射-过敏-吸附剂测试)作为参考系统来解释(Volcheck,Clinical Allergy,Diagnosis and Management,2009,ISBN 978-1-59745-315-8)。

程序将EUROLINE的条带的强度自动计算进入EAST类别(酶-过敏-吸附剂测试)，其与RAST系统的浓度水平相关。EAST类别的分类显示在表1中。

表1：EAST类别

实施例2：

来自榛子(SEQ ID NO 3)、芝麻(SEQ ID NO 4)、花生(SEQ ID NO 5)、开心果(SEQID NO 6)、腰果(SEQ ID NO 7)、美洲山核桃(SEQ ID NO8)、核桃(SEQ ID NO9)和澳大利亚坚果(SEQ ID NO10)的豌豆球蛋白样蛋白根据标准方法表达为His标签融合蛋白，并如实施例1所述纯化。

制备线印迹，将其与患者样品接触，并如EP15001277的实施例2 和3中所述进行评价。测试了来自对树坚果过敏的29个患者和9个健康献血者的血清。

测试来自健康献血者的对照血清，并且发现其均为阴性(EAST 类别0)。

例如，图4g显示，对于Mac I豌豆球蛋白，一个患者显示出EAST 类别1IgE反应，几个患者显示EAST类别2IgE反应，并且一个患者显示EAST类别5IgE反应，但是对于Ana o1(腰果)没有反应，如通过他们在对应于Ana o1的0EAST类别的那一排中所显示的情况所指示的。

这些结果显示，在每个比较实验中，显著数量的过敏性患者(图4a至4g中的暗视野)对Mac I豌豆球蛋白反应，但不对来自另一树坚果的相应豌豆球蛋白样蛋白反应，更具体地，该数量为29个患者中的13个(Cor a11相比于Mac I)，29个患者中的9个(Ses i3)， 29个患者中的10个(Jug r2)，29个患者中的9个(Pis v3)，29 个患者中的8个(Car i2)，29个患者中的4个(Ara h1)和29个患者中的4个(Ana o1)。这些患者之一不能通过检测针对来自其它树坚果的豌豆球蛋白而非Mac I豌豆球蛋白的IgE类别抗体来诊断，因为其血清中的IgE抗体仅对Mac I豌豆球蛋白反应。

Mac I豌豆球蛋白与来自其它坚果和核的7S豌豆球蛋白样蛋白没有EAST类别相关性。一些患者对Mac I豌豆球蛋白的反应比对各自的其它树坚果过敏原的反应强得多，表明各患者主要对澳洲坚果过敏而不是对另一种树坚果过敏。例如，图4a显示4名患者具有对Mac I 豌豆球蛋白的6(强反应)的EAST类别，但对于Cor a11没有或仅有轻微反应(EAST类别0或1)。这表明，Mac I豌豆球蛋白具有不与任何其它豌豆球蛋白共有的独特的IgE表位。

序列表

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG

<120> 新型澳洲坚果过敏原

<130> 15PP017EP2

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr Ser Gly Gln Met Arg Arg Cys Val Ser

1 5 10 15

Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys Tyr Asp

20 25 30

Asn Gln Glu Asp Pro Gln Thr Glu Cys Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys

35 40 45

Arg Gln Gln Glu Ser Asp Pro Arg Gln Gln Gln Tyr Cys Gln Arg Arg

50 55 60

Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Gln Arg Asp

65 70 75 80

Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln Cys Gln Lys Arg Cys Gln Arg Arg Glu

85 90 95

Thr Glu Pro Arg His Met Gln Ile Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Arg

100 105 110

Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys Gln Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Gln Gln

115 120 125

Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr Glu Glu Arg Met Lys Glu Gly Asp Asn

130 135 140

Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg Glu Tyr Glu Asp Cys Arg Arg His Cys

145 150 155 160

Glu Gln Gln Glu Pro Arg Leu Gln Tyr Gln Cys Gln Arg Arg Cys Gln

165 170 175

Glu

<210> 2

<211> 645

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Ser His His His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ser Met Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr Ser Gly Gln Met Arg

20 25 30

Arg Cys Val Ser Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu Glu Asp Ile Asp Trp

35 40 45

Ser Lys Tyr Asp Asn Gln Glu Asp Pro Gln Thr Glu Cys Gln Gln Cys

50 55 60

Gln Arg Arg Cys Arg Gln Gln Glu Ser Asp Pro Arg Gln Gln Gln Tyr

65 70 75 80

Cys Gln Arg Arg Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Asn

85 90 95

Arg Gln Arg Asp Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln Cys Gln Lys Arg Cys

100 105 110

Gln Arg Arg Glu Thr Glu Pro Arg His Met Gln Ile Cys Gln Gln Arg

115 120 125

Cys Glu Arg Arg Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys Gln Gln Lys Arg Tyr

130 135 140

Glu Glu Gln Gln Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr Glu Glu Arg Met Lys

145 150 155 160

Glu Gly Asp Asn Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg Glu Tyr Glu Asp Cys

165 170 175

Arg Arg His Cys Glu Gln Gln Glu Pro Arg Leu Gln Tyr Gln Cys Gln

180 185 190

Arg Arg Cys Gln Glu Gln Gln Arg Gln His Gly Arg Gly Gly Asp Leu

195 200 205

Met Asn Pro Gln Arg Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Glu Glu Gly Glu Glu

210 215 220

Lys Gln Ser Asp Asn Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu Arg Ser Leu Ser Thr

225 230 235 240

Arg Phe Arg Thr Glu Glu Gly His Ile Ser Val Leu Glu Asn Phe Tyr

245 250 255

Gly Arg Ser Lys Leu Leu Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Arg Leu Val Leu

260 265 270

Leu Glu Ala Asn Pro Asn Ala Phe Val Leu Pro Thr His Leu Asp Ala

275 280 285

Asp Ala Ile Leu Leu Val Ile Gly Gly Arg Gly Ala Leu Lys Met Ile

290 295 300

His Arg Asp Asn Arg Glu Ser Tyr Asn Leu Glu Cys Gly Asp Val Ile

305 310 315 320

Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Phe Tyr Leu Ile Asn Arg Asp Asn Asn

325 330 335

Glu Arg Leu His Ile Ala Lys Phe Leu Gln Thr Ile Ser Thr Pro Gly

340 345 350

Gln Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Ala Gly Gly Gln Asn Pro Glu Pro Tyr

355 360 365

Leu Ser Thr Phe Ser Lys Glu Ile Leu Glu Ala Ala Leu Asn Thr Gln

370 375 380

Thr Glu Arg Leu Arg Gly Val Leu Gly Gln Gln Arg Glu Gly Val Ile

385 390 395 400

Ile Arg Ala Ser Gln Glu Gln Ile Arg Glu Leu Thr Arg Asp Asp Ser

405 410 415

Glu Ser Arg Arg Trp His Ile Arg Arg Gly Gly Glu Ser Ser Arg Gly

420 425 430

Pro Tyr Asn Leu Phe Asn Lys Arg Pro Leu Tyr Ser Asn Lys Tyr Gly

435 440 445

Gln Ala Tyr Glu Val Lys Pro Glu Asp Tyr Arg Gln Leu Gln Asp Met

450 455 460

Asp Val Ser Val Phe Ile Ala Asn Ile Thr Gln Gly Ser Met Met Gly

465 470 475 480

Pro Phe Phe Asn Thr Arg Ser Thr Lys Val Val Val Val Ala Ser Gly

485 490 495

Glu Ala Asp Val Glu Met Ala Cys Pro His Leu Ser Gly Arg His Gly

500 505 510

Gly Arg Gly Gly Gly Lys Arg His Glu Glu Glu Glu Glu Val His Tyr

515 520 525

Glu Gln Val Arg Ala Arg Leu Ser Lys Arg Glu Ala Ile Val Val Leu

530 535 540

Ala Gly His Pro Val Val Phe Val Ser Ser Gly Asn Glu Asn Leu Leu

545 550 555 560

Leu Phe Ala Phe Gly Ile Asn Ala Gln Asn Asn His Glu Asn Phe Leu

565 570 575

Ala Gly Arg Glu Arg Asn Val Leu Gln Gln Ile Glu Pro Gln Ala Met

580 585 590

Glu Leu Ala Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Val Glu Glu Leu Phe Asn

595 600 605

Ser Gln Asp Glu Ser Ile Phe Phe Pro Gly Pro Arg Gln His Gln Gln

610 615 620

Gln Ser Pro Arg Ser Thr Lys Gln Gln Gln Pro Leu Val Ser Ile Leu

625 630 635 640

Asp Phe Val Gly Phe

645

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> 榛子

<400> 3

Met Leu Pro Lys Glu Asp Pro Glu Leu Lys Lys Cys Lys His Lys Cys

1 5 10 15

Arg Asp Glu Arg Gln Phe Asp Glu Gln Gln Arg Arg Asp Gly Lys Gln

20 25 30

Ile Cys Glu Glu Lys Ala Arg Glu Arg Gln Gln Glu Glu Gly Asn Ser

35 40 45

Ser Glu Glu Ser Tyr Gly Lys Glu Gln Glu Glu Asn Pro Tyr Val Phe

50 55 60

Gln Asp Glu His Phe Glu Ser Arg Val Lys Thr Glu Glu Gly Arg Val

65 70 75 80

Gln Val Leu Glu Asn Phe Thr Lys Arg Ser Arg Leu Leu Ser Gly Ile

85 90 95

Glu Asn Phe Arg Leu Ala Ile Leu Glu Ala Asn Pro His Thr Phe Ile

100 105 110

Ser Pro Ala His Phe Asp Ala Glu Leu Val Leu Phe Val Ala Lys Gly

115 120 125

Arg Ala Thr Ile Thr Met Val Arg Glu Glu Lys Arg Glu Ser Phe Asn

130 135 140

Val Glu His Gly Asp Ile Ile Arg Ile Pro Ala Gly Thr Pro Val Tyr

145 150 155 160

Met Ile Asn Arg Asp Glu Asn Glu Lys Leu Phe Ile Val Lys Ile Leu

165 170 175

Gln Pro Val Ser Ala Pro Gly His Phe Glu Ala Phe Tyr Gly Ala Gly

180 185 190

Gly Glu Asp Pro Glu Ser Phe Tyr Arg Ala Phe Ser Trp Glu Val Leu

195 200 205

Glu Ala Ala Leu Lys Val Arg Arg Glu Gln Leu Glu Lys Val Phe Gly

210 215 220

Glu Gln Ser Lys Gly Ser Ile Val Lys Ala Ser Arg Glu Lys Ile Arg

225 230 235 240

Ala Leu Ser Gln His Glu Glu Gly Pro Pro Arg Ile Trp Pro Phe Gly

245 250 255

Gly Glu Ser Ser Gly Pro Ile Asn Leu Leu His Lys His Pro Ser Gln

260 265 270

Ser Asn Gln Phe Gly Arg Leu Tyr Glu Ala His Pro Asp Asp His Lys

275 280 285

Gln Leu Gln Asp Leu Asp Leu Met Val Ser Phe Ala Asn Ile Thr Lys

290 295 300

Gly Ser Met Ala Gly Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Ala Thr Lys Ile Ser

305 310 315 320

Val Val Val Glu Gly Glu Gly Phe Phe Glu Met Ala Cys Pro His Leu

325 330 335

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Lys Ile Ser Ala Arg Leu Arg Arg

340 345 350

Gly Val Val Phe Val Ala Pro Ala Gly His Pro Val Ala Val Ile Ala

355 360 365

Ser Gln Asn Asn Asn Leu Gln Val Leu Cys Phe Glu Val Asn Ala His

370 375 380

Gly Asn Ser Arg Phe Pro Leu Ala Gly Lys Gly Asn Ile Val Asn Glu

385 390 395 400

Phe Glu Arg Asp Ala Lys Glu Leu Ala Phe Asn Leu Pro Ser Arg Glu

405 410 415

Val Glu Arg Ile Phe Lys Asn Gln Asp Gln Ala Phe Phe Phe Pro Gly

420 425 430

Pro Asn Lys Gln Gln Glu Glu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ala Phe Glu

435 440 445

<210> 4

<211> 562

<212> PRT

<213> 芝麻

<400> 4

Glu Ser Lys Asp Pro Glu Leu Lys Gln Cys Lys His Gln Cys Lys Ala

1 5 10 15

Gln Gln Gln Ile Ser Lys Glu Gln Lys Glu Ala Cys Ile Gln Ala Cys

20 25 30

Lys Glu Tyr Ile Arg Gln Lys His Gln Gly Glu His Gly Arg Gly Gly

35 40 45

Gly Asp Ile Leu Glu Glu Glu Val Trp Asn Arg Lys Ser Pro Ile Glu

50 55 60

Arg Leu Arg Glu Cys Ser Arg Gly Cys Glu Gln Gln His Gly Glu Gln

65 70 75 80

Arg Glu Glu Cys Leu Arg Arg Cys Gln Glu Glu Tyr Gln Arg Glu Lys

85 90 95

Gly Arg Gln Asp Asp Asp Asn Pro Thr Asp Pro Glu Lys Gln Tyr Gln

100 105 110

Gln Cys Arg Leu Gln Cys Arg Arg Gln Gly Glu Gly Gly Gly Phe Ser

115 120 125

Arg Glu His Cys Glu Arg Arg Arg Glu Glu Lys Tyr Arg Glu Gln Gln

130 135 140

Gly Arg Glu Gly Gly Arg Gly Glu Met Tyr Glu Gly Arg Glu Arg Glu

145 150 155 160

Glu Glu Gln Glu Glu Gln Gly Arg Gly Arg Ile Pro Tyr Val Phe Glu

165 170 175

Asp Gln His Phe Ile Thr Gly Phe Arg Thr Gln His Gly Arg Met Arg

180 185 190

Val Leu Gln Lys Phe Thr Asp Arg Ser Glu Leu Leu Arg Gly Ile Glu

195 200 205

Asn Tyr Arg Val Ala Ile Leu Glu Ala Glu Pro Gln Thr Phe Ile Val

210 215 220

Pro Asn His Trp Asp Ala Glu Ser Val Val Phe Val Ala Lys Gly Arg

225 230 235 240

Gly Thr Ile Ser Leu Val Arg Gln Asp Arg Arg Glu Ser Leu Asn Ile

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ile Leu Lys Ile Asn Ala Gly Thr Thr Ala Tyr Leu

260 265 270

Ile Asn Arg Asp Asn Asn Glu Arg Leu Val Leu Ala Lys Leu Leu Gln

275 280 285

Pro Val Ser Thr Pro Gly Glu Phe Glu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Gly

290 295 300

Glu Asn Pro Glu Ser Phe Phe Lys Ser Phe Ser Asp Glu Ile Leu Glu

305 310 315 320

Ala Ala Phe Asn Thr Arg Arg Asp Arg Leu Gln Arg Ile Phe Gly Gln

325 330 335

Gln Arg Gln Gly Val Ile Val Lys Ala Ser Glu Glu Gln Val Arg Ala

340 345 350

Met Ser Arg His Glu Glu Gly Gly Ile Trp Pro Phe Gly Gly Glu Ser

355 360 365

Lys Gly Thr Ile Asn Ile Tyr Gln Gln Arg Pro Thr His Ser Asn Gln

370 375 380

Tyr Gly Gln Leu His Glu Val Asp Ala Ser Gln Tyr Arg Gln Leu Arg

385 390 395 400

Asp Leu Asp Leu Thr Val Ser Leu Ala Asn Ile Thr Gln Gly Ala Met

405 410 415

Thr Ala Pro His Tyr Asn Ser Lys Ala Thr Lys Ile Ala Leu Val Val

420 425 430

Asp Gly Glu Gly Tyr Phe Glu Met Ala Cys Pro His Met Ser Arg Ser

435 440 445

Arg Gly Ser Tyr Gln Gly Glu Thr Arg Gly Arg Pro Ser Tyr Gln Arg

450 455 460

Val Ala Ser Arg Leu Thr Arg Gly Thr Val Val Ile Ile Pro Ala Gly

465 470 475 480

His Pro Phe Val Ala Val Ala Ser Ser Asn Gln Asn Leu Gln Val Leu

485 490 495

Cys Phe Glu Val Asn Ala Asn Asn Asn Glu Lys Phe Pro Leu Ala Gly

500 505 510

Arg Arg Asn Val Met Asn Gln Leu Glu Arg Glu Ala Lys Glu Leu Ala

515 520 525

Phe Gly Met Pro Ala Arg Glu Val Glu Glu Val Ser Arg Ser Gln Gln

530 535 540

Glu Glu Phe Phe Phe Lys Gly Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gly Arg Ala

545 550 555 560

Asp Ala

<210> 5

<211> 626

<212> PRT

<213> 花生

<400> 5

Met Arg Gly Arg Val Ser Pro Leu Met Leu Leu Leu Gly Ile Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Ser Val Ser Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr Gln Lys

20 25 30

Lys Thr Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln

35 40 45

Glu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys

50 55 60

Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro Arg Gly His Thr Gly

65 70 75 80

Thr Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln

85 90 95

Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly

100 105 110

Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp

115 120 125

Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro

130 135 140

Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr

145 150 155 160

Pro Gly Ser His Val Arg Glu Glu Thr Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr

165 170 175

Phe Pro Ser Arg Arg Phe Ser Thr Arg Tyr Gly Asn Gln Asn Gly Arg

180 185 190

Ile Arg Val Leu Gln Arg Phe Asp Gln Arg Ser Arg Gln Phe Gln Asn

195 200 205

Leu Gln Asn His Arg Ile Val Gln Ile Glu Ala Lys Pro Asn Thr Leu

210 215 220

Val Leu Pro Lys His Ala Asp Ala Asp Asn Ile Leu Val Ile Gln Gln

225 230 235 240

Gly Gln Ala Thr Val Thr Val Ala Asn Gly Asn Asn Arg Lys Ser Phe

245 250 255

Asn Leu Asp Glu Gly His Ala Leu Arg Ile Pro Ser Gly Phe Ile Ser

260 265 270

Tyr Ile Leu Asn Arg His Asp Asn Gln Asn Leu Arg Val Ala Lys Ile

275 280 285

Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe Pro Ala

290 295 300

Ser Ser Arg Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr

305 310 315 320

Leu Glu Ala Ala Phe Asn Ala Glu Phe Asn Glu Ile Arg Arg Val Leu

325 330 335

Leu Glu Glu Asn Ala Gly Gly Glu Gln Glu Glu Arg Gly Gln Arg Arg

340 345 350

Trp Ser Thr Arg Ser Ser Glu Asn Asn Glu Gly Val Ile Val Lys Val

355 360 365

Ser Lys Glu His Val Glu Glu Leu Thr Lys His Ala Lys Ser Val Ser

370 375 380

Lys Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gly Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu

385 390 395 400

Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu

405 410 415

Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn Pro Gln Leu Gln Asp Leu Asp Met Met

420 425 430

Leu Thr Cys Val Glu Ile Lys Glu Gly Ala Leu Met Leu Pro His Phe

435 440 445

Asn Ser Lys Ala Met Val Ile Val Val Val Asn Lys Gly Thr Gly Asn

450 455 460

Leu Glu Leu Val Ala Val Arg Lys Glu Gln Gln Gln Arg Gly Arg Arg

465 470 475 480

Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Ser Asn Arg Glu

485 490 495

Val Arg Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly Asp Val Phe Ile Met

500 505 510

Pro Ala Ala His Pro Val Ala Ile Asn Ala Ser Ser Glu Leu His Leu

515 520 525

Leu Gly Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn His Arg Ile Phe Leu Ala

530 535 540

Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp

545 550 555 560

Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Leu Ile Lys Asn

565 570 575

Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser Gln

580 585 590

Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys Glu Ser Pro Glu Lys Glu Asp Gln Glu

595 600 605

Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu Leu Ser Ile Leu Lys Ala

610 615 620

Phe Asn

625

<210> 6

<211> 519

<212> PRT

<213> 开心果

<400> 6

Lys Thr Asp Pro Glu Leu Lys Gln Cys Lys His Gln Cys Lys Val Gln

1 5 10 15

Arg Gln Tyr Asp Glu Glu Gln Lys Glu Gln Cys Ala Lys Gly Cys Glu

20 25 30

Lys Tyr Tyr Lys Glu Lys Lys Gly Arg Glu Gln Glu Glu Glu Glu Glu

35 40 45

Glu Glu Trp Gly Ser Gly Arg Gly Arg Gly Asp Glu Phe Ser Thr His

50 55 60

Glu Pro Gly Glu Lys Arg Leu Ser Gln Cys Met Lys Gln Cys Glu Arg

65 70 75 80

Gln Asp Gly Gly Gln Gln Lys Gln Leu Cys Arg Phe Arg Cys Gln Glu

85 90 95

Lys Tyr Lys Lys Glu Arg Arg Glu His Ser Tyr Ser Arg Asp Glu Glu

100 105 110

Glu Glu Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gln Glu Glu Glu Asp Glu Asn Pro

115 120 125

Tyr Val Phe Glu Asp Glu His Phe Thr Thr Arg Val Lys Thr Glu Gln

130 135 140

Gly Lys Val Val Val Leu Pro Lys Phe Thr Lys Arg Ser Lys Leu Leu

145 150 155 160

Arg Gly Leu Glu Lys Tyr Arg Leu Ala Phe Leu Val Ala Asn Pro Gln

165 170 175

Ala Phe Val Val Pro Asn His Met Asp Ala Asp Ser Ile Phe Phe Val

180 185 190

Ser Trp Gly Arg Gly Thr Ile Thr Lys Ile Arg Glu Asn Lys Arg Glu

195 200 205

Ser Met Asn Val Lys Gln Gly Asp Ile Ile Arg Ile Arg Ala Gly Thr

210 215 220

Pro Phe Tyr Ile Val Asn Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu Tyr Ile Val

225 230 235 240

Lys Leu Leu Gln Pro Val Asn Leu Pro Gly His Tyr Glu Val Phe His

245 250 255

Gly Pro Gly Gly Glu Asn Pro Glu Ser Phe Tyr Arg Ala Phe Ser Arg

260 265 270

Glu Val Leu Glu Ala Ala Leu Lys Thr Pro Arg Asp Lys Leu Glu Lys

275 280 285

Leu Phe Glu Lys Gln Asp Glu Gly Ala Ile Val Lys Ala Ser Lys Glu

290 295 300

Gln Ile Arg Ala Met Ser Arg Arg Gly Glu Gly Pro Ser Ile Trp Pro

305 310 315 320

Phe Thr Gly Lys Ser Thr Gly Thr Phe Asn Leu Phe Lys Lys Asp Pro

325 330 335

Ser Gln Ser Asn Asn Tyr Gly Gln Leu Phe Glu Ser Glu Phe Lys Asp

340 345 350

Tyr Pro Pro Leu Gln Glu Leu Asp Ile Met Val Ser Tyr Val Asn Ile

355 360 365

Thr Lys Gly Gly Met Ser Gly Pro Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Thr Lys

370 375 380

Ile Ala Ile Val Val Ser Gly Glu Gly Arg Leu Glu Ile Ala Cys Pro

385 390 395 400

His Leu Ser Ser Ser Lys Asn Ser Gly Gln Glu Lys Ser Gly Pro Ser

405 410 415

Tyr Lys Lys Leu Ser Ser Ser Ile Arg Thr Asp Ser Val Phe Val Val

420 425 430

Pro Ala Gly His Pro Phe Val Thr Val Ala Ser Gly Asn Gln Asn Leu

435 440 445

Glu Ile Leu Cys Phe Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Ile Arg Tyr Thr

450 455 460

Leu Ala Gly Lys Lys Asn Ile Ile Glu Val Met Glu Lys Glu Ala Lys

465 470 475 480

Glu Leu Ala Phe Lys Thr Lys Gly Glu Glu Val Asp Lys Val Phe Gly

485 490 495

Lys Gln Asp Glu Glu Phe Phe Phe Gln Gly Pro Lys Trp Arg Gln His

500 505 510

Gln Gln Gly Arg Ala Asp Glu

515

<210> 7

<211> 512

<212> PRT

<213> 腰果

<400> 7

Lys Ile Asp Pro Glu Leu Lys Gln Cys Lys His Gln Cys Lys Val Gln

1 5 10 15

Arg Gln Tyr Asp Glu Gln Gln Lys Glu Gln Cys Val Lys Glu Cys Glu

20 25 30

Lys Tyr Tyr Lys Glu Lys Lys Gly Arg Glu Arg Glu His Glu Glu Glu

35 40 45

Glu Glu Glu Trp Gly Thr Gly Gly Val Asp Glu Pro Ser Thr His Glu

50 55 60

Pro Ala Glu Lys His Leu Ser Gln Cys Met Arg Gln Cys Glu Arg Gln

65 70 75 80

Glu Gly Gly Gln Gln Lys Gln Leu Cys Arg Phe Arg Cys Gln Glu Arg

85 90 95

Tyr Lys Lys Glu Arg Gly Gln His Asn Tyr Lys Arg Glu Asp Asp Glu

100 105 110

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Asp Glu Asn Pro Tyr Val

115 120 125

Phe Glu Asp Glu Asp Phe Thr Thr Lys Val Lys Thr Glu Gln Gly Lys

130 135 140

Val Val Leu Leu Pro Lys Phe Thr Gln Lys Ser Lys Leu Leu His Ala

145 150 155 160

Leu Glu Lys Tyr Arg Leu Ala Val Leu Val Ala Asn Pro Gln Ala Phe

165 170 175

Val Val Pro Ser His Met Asp Ala Asp Ser Ile Phe Phe Val Ser Trp

180 185 190

Gly Arg Gly Thr Ile Thr Lys Ile Leu Glu Asn Lys Arg Glu Ser Ile

195 200 205

Asn Val Arg Gln Gly Asp Ile Val Ser Ile Ser Ser Gly Thr Pro Phe

210 215 220

Tyr Ile Ala Asn Asn Asp Glu Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Val Gln Phe

225 230 235 240

Leu Arg Pro Val Asn Leu Pro Gly His Phe Glu Val Phe His Gly Pro

245 250 255

Gly Gly Glu Asn Pro Glu Ser Phe Tyr Arg Ala Phe Ser Trp Glu Ile

260 265 270

Leu Glu Ala Ala Leu Lys Thr Ser Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Phe

275 280 285

Glu Lys Gln Asp Gln Gly Thr Ile Met Lys Ala Ser Lys Glu Gln Ile

290 295 300

Arg Ala Met Ser Arg Arg Gly Glu Gly Pro Lys Ile Trp Pro Phe Thr

305 310 315 320

Glu Glu Ser Thr Gly Ser Phe Lys Leu Phe Lys Lys Asp Pro Ser Gln

325 330 335

Ser Asn Lys Tyr Gly Gln Leu Phe Glu Ala Glu Arg Ile Asp Tyr Pro

340 345 350

Pro Leu Glu Lys Leu Asp Met Val Val Ser Tyr Ala Asn Ile Thr Lys

355 360 365

Gly Gly Met Ser Val Pro Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Thr Lys Ile Ala

370 375 380

Ile Val Val Ser Gly Glu Gly Cys Val Glu Ile Ala Cys Pro His Leu

385 390 395 400

Ser Ser Ser Lys Ser Ser His Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Arg Ala Arg

405 410 415

Ile Arg Lys Asp Thr Val Phe Ile Val Pro Ala Gly His Pro Phe Ala

420 425 430

Thr Val Ala Ser Gly Asn Glu Asn Leu Glu Ile Val Cys Phe Glu Val

435 440 445

Asn Ala Glu Gly Asn Ile Arg Tyr Thr Leu Ala Gly Lys Lys Asn Ile

450 455 460

Ile Lys Val Met Glu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Ala Phe Lys Met Glu

465 470 475 480

Gly Glu Glu Val Asp Lys Val Phe Gly Lys Gln Asp Glu Glu Phe Phe

485 490 495

Phe Gln Gly Pro Glu Trp Arg Lys Glu Lys Glu Gly Arg Ala Asp Glu

500 505 510

<210> 8

<211> 766

<212> PRT

<213> 美洲山核桃

<400> 8

Leu Glu Thr Glu Asp Leu Ser Asn Glu Leu Asn Pro His His Asp Pro

1 5 10 15

Glu Ser His Arg Trp Glu Phe Gln Gln Cys Gln Glu Arg Cys Gln His

20 25 30

Glu Glu Arg Gly Gln Arg Gln Ala Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys Glu

35 40 45

Glu Gln Leu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Ile Val

50 55 60

Asp Pro Arg Glu Pro Arg Lys Gln Tyr Glu Gln Cys Arg Glu Thr Cys

65 70 75 80

Glu Lys Gln Asp Pro Arg Gln Gln Pro Gln Cys Glu Arg Arg Cys Glu

85 90 95

Arg Gln Phe Gln Glu Gln Gln Glu Arg Glu Arg Arg Glu Arg Arg Arg

100 105 110

Gly Arg Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asn Pro Arg Asp Pro Arg Glu Gln

115 120 125

Tyr Arg Gln Cys Glu Glu His Cys Arg Arg Gln Gly Gln Gly Gln Arg

130 135 140

Gln Gln Gln Gln Cys Gln Ser Arg Cys Glu Glu Arg Phe Glu Glu Glu

145 150 155 160

Gln Arg Arg Gln Glu Glu Arg Glu Arg Arg Arg Gly Arg Asp Asn Asp

165 170 175

Asp Glu Glu Asn Pro Arg Asp Pro Arg Glu Gln Tyr Arg Gln Cys Gln

180 185 190

Glu His Cys Arg Arg Gln Gly Gln Gly Gln Arg Gln Gln Gln Gln Cys

195 200 205

Gln Ser Arg Cys Glu Glu Arg Leu Glu Glu Glu Gln Arg Lys Gln Glu

210 215 220

Glu Arg Glu Arg Arg Arg Gly Arg Asp Glu Asp Asp Gln Asn Pro Arg

225 230 235 240

Asp Pro Glu Gln Arg Tyr Glu Gln Cys Gln Gln Gln Cys Glu Arg Gln

245 250 255

Arg Arg Gly Gln Glu Gln Gln Leu Cys Arg Arg Arg Cys Glu Gln Gln

260 265 270

Arg Gln Gln Glu Glu Arg Glu Arg Gln Arg Gly Arg Asp Arg Gln Asp

275 280 285

Pro Gln Gln Gln Tyr His Arg Cys Gln Arg Arg Cys Gln Thr Gln Glu

290 295 300

Gln Ser Pro Glu Arg Gln Arg Gln Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Gln

305 310 315 320

Tyr Lys Glu Gln Gln Gly Arg Glu Trp Gly Pro Asp Gln Ala Ser Pro

325 330 335

Arg Arg Glu Ser Arg Gly Arg Glu Glu Glu Gln Gln Arg His Asn Pro

340 345 350

Tyr Tyr Phe His Ser Gln Gly Leu Arg Ser Arg His Glu Ser Gly Glu

355 360 365

Gly Glu Val Lys Tyr Leu Glu Arg Phe Thr Glu Arg Thr Glu Leu Leu

370 375 380

Arg Gly Ile Glu Asn Tyr Arg Val Val Ile Leu Glu Ala Asn Pro Asn

385 390 395 400

Thr Phe Val Leu Pro Tyr His Lys Asp Ala Glu Ser Val Ile Val Val

405 410 415

Thr Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Phe Val Ser Gln Glu Arg Arg Glu

420 425 430

Ser Phe Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Val Ile Arg Val Pro Ala Gly Ala

435 440 445

Thr Glu Tyr Val Ile Asn Gln Asp Ser Asn Glu Arg Leu Glu Met Val

450 455 460

Lys Leu Leu Gln Pro Val Asn Asn Pro Gly Gln Phe Arg Glu Tyr Tyr

465 470 475 480

Ala Ala Gly Ala Gln Ser Thr Glu Ser Tyr Leu Arg Val Phe Ser Asn

485 490 495

Asp Ile Leu Val Ala Ala Leu Asn Thr Pro Arg Asp Arg Leu Glu Arg

500 505 510

Phe Phe Asp Gln Gln Glu Gln Arg Glu Gly Val Ile Ile Arg Ala Ser

515 520 525

Gln Glu Lys Leu Arg Ala Leu Ser Gln His Ala Met Ser Ala Gly Gln

530 535 540

Arg Pro Trp Gly Arg Arg Ser Ser Gly Gly Pro Ile Ser Leu Lys Ser

545 550 555 560

Gln Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Gln Phe Gly Gln Phe Phe Glu Ala Cys

565 570 575

Pro Glu Glu His Arg Gln Leu Gln Glu Met Asp Val Leu Val Asn Tyr

580 585 590

Ala Glu Ile Lys Arg Gly Ala Met Met Val Pro His Tyr Asn Ser Lys

595 600 605

Ala Thr Val Val Val Tyr Val Val Glu Gly Thr Gly Arg Phe Glu Met

610 615 620

Ala Cys Pro His Asp Val Ser Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Lys Gly Arg

625 630 635 640

Arg Glu Gln Glu Glu Glu Glu Ser Ser Thr Gly Gln Phe Gln Lys Val

645 650 655

Thr Ala Arg Leu Ala Arg Gly Asp Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly His

660 665 670

Pro Ile Ala Ile Thr Ala Ser Gln Asn Glu Asn Leu Arg Leu Val Gly

675 680 685

Phe Gly Ile Asn Gly Lys Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Gln

690 695 700

Asn Asn Ile Ile Asn Gln Leu Glu Arg Glu Ala Lys Glu Leu Ser Phe

705 710 715 720

Asn Met Pro Arg Glu Glu Ile Glu Glu Ile Phe Glu Arg Gln Val Glu

725 730 735

Ser Tyr Phe Val Pro Met Glu Arg Gln Ser Arg Arg Gly Gln Gly Arg

740 745 750

Asp His Pro Leu Ala Ser Ile Leu Asp Phe Ala Gly Phe Phe

755 760 765

<210> 9

<211> 593

<212> PRT

<213> 核桃

<400> 9

Arg Gly Arg Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asn Pro Arg Asp Pro Arg Glu

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Gln Cys Gln Glu Tyr Cys Arg Arg Gln Gly Gln Gly Gln

20 25 30

Arg Gln Gln Gln Gln Cys Gln Ile Arg Cys Glu Glu Arg Leu Glu Glu

35 40 45

Asp Gln Arg Ser Gln Glu Glu Arg Glu Arg Arg Arg Gly Arg Asp Val

50 55 60

Asp Asp Gln Asn Pro Arg Asp Pro Glu Gln Arg Tyr Glu Gln Cys Gln

65 70 75 80

Gln Gln Cys Glu Arg Gln Arg Arg Gly Gln Glu Gln Thr Leu Cys Arg

85 90 95

Arg Arg Cys Glu Gln Arg Arg Gln Gln Glu Glu Arg Glu Arg Gln Arg

100 105 110

Gly Arg Asp Arg Gln Asp Pro Gln Gln Gln Tyr His Arg Cys Gln Arg

115 120 125

Arg Cys Gln Ile Gln Glu Gln Ser Pro Glu Arg Gln Arg Gln Cys Gln

130 135 140

Gln Arg Cys Glu Arg Gln Tyr Lys Glu Gln Gln Gly Arg Glu Arg Gly

145 150 155 160

Pro Glu Ala Ser Pro Arg Arg Glu Ser Arg Gly Arg Glu Glu Glu Gln

165 170 175

Gln Arg His Asn Pro Tyr Tyr Phe His Ser Gln Ser Ile Arg Ser Arg

180 185 190

His Glu Ser Glu Glu Gly Glu Val Lys Tyr Leu Glu Arg Phe Thr Glu

195 200 205

Arg Thr Glu Leu Leu Arg Gly Ile Glu Asn Tyr Arg Val Val Ile Leu

210 215 220

Asp Ala Asn Pro Asn Thr Ser Met Leu Pro His His Lys Asp Ala Glu

225 230 235 240

Ser Val Ala Val Val Thr Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Leu Val Ser

245 250 255

Gln Glu Thr Arg Glu Ser Phe Asn Leu Glu Cys Gly Asp Val Ile Arg

260 265 270

Val Pro Ala Gly Ala Thr Val Tyr Val Ile Asn Gln Asp Ser Asn Glu

275 280 285

Arg Leu Glu Met Val Lys Leu Leu Gln Pro Val Asn Asn Pro Gly Gln

290 295 300

Phe Arg Glu Tyr Tyr Ala Ala Gly Ala Lys Ser Pro Asp Gln Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Arg Val Phe Ser Asn Asp Ile Leu Val Ala Ala Leu Asn Thr Pro

325 330 335

Arg Asp Arg Leu Glu Arg Phe Phe Asp Gln Gln Glu Gln Arg Glu Gly

340 345 350

Val Ile Ile Arg Ala Ser Gln Glu Lys Leu Arg Ala Leu Ser Gln His

355 360 365

Ala Met Ser Ala Gly Gln Arg Pro Trp Gly Arg Arg Ser Ser Gly Gly

370 375 380

Pro Ile Ser Leu Lys Ser Glu Ser Pro Ser Tyr Ser Asn Gln Phe Gly

385 390 395 400

Gln Phe Phe Glu Ala Cys Pro Glu Glu His Arg Gln Leu Gln Glu Met

405 410 415

Asp Val Leu Val Asn Tyr Ala Glu Ile Lys Arg Gly Ala Met Met Val

420 425 430

Pro His Tyr Asn Ser Lys Ala Thr Val Val Val Tyr Val Val Glu Gly

435 440 445

Thr Gly Arg Tyr Glu Met Ala Cys Pro His Val Ser Ser Gln Ser Tyr

450 455 460

Glu Gly Gln Gly Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Glu Ser Thr Gly Arg

465 470 475 480

Phe Gln Lys Val Thr Ala Arg Leu Ala Arg Gly Asp Ile Phe Val Ile

485 490 495

Pro Ala Gly His Pro Ile Ala Ile Thr Ala Ser Gln Asn Glu Asn Leu

500 505 510

Arg Leu Leu Gly Phe Asp Ile Asn Gly Glu Asn Asn Gln Arg Asp Phe

515 520 525

Leu Ala Gly Gln Asn Asn Ile Ile Asn Gln Leu Glu Arg Glu Ala Lys

530 535 540

Glu Leu Ser Phe Asn Met Pro Arg Glu Glu Ile Glu Glu Ile Phe Glu

545 550 555 560

Ser Gln Met Glu Ser Tyr Phe Val Pro Thr Glu Arg Gln Ser Arg Arg

565 570 575

Gly Gln Gly Arg Asp His Pro Leu Ala Ser Ile Leu Asp Phe Ala Phe

580 585 590

Phe

<210> 10

<211> 625

<212> PRT

<213> 澳洲坚果

<400> 10

Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr Ser Gly Gln Met Arg Arg Cys Val Ser

1 5 10 15

Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys Tyr Asp

20 25 30

Asn Gln Glu Asp Pro Gln Thr Glu Cys Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys

35 40 45

Arg Gln Gln Glu Ser Asp Pro Arg Gln Gln Gln Tyr Cys Gln Arg Arg

50 55 60

Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Gln Arg Asp

65 70 75 80

Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln Cys Gln Lys Arg Cys Gln Arg Arg Glu

85 90 95

Thr Glu Pro Arg His Met Gln Ile Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Arg

100 105 110

Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys Gln Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Gln Gln

115 120 125

Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr Glu Glu Arg Met Lys Glu Gly Asp Asn

130 135 140

Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg Glu Tyr Glu Asp Cys Arg Arg His Cys

145 150 155 160

Glu Gln Gln Glu Pro Arg Leu Gln Tyr Gln Cys Gln Arg Arg Cys Gln

165 170 175

Glu Gln Gln Arg Gln His Gly Arg Gly Gly Asp Leu Met Asn Pro Gln

180 185 190

Arg Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Glu Glu Gly Glu Glu Lys Gln Ser Asp

195 200 205

Asn Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu Arg Ser Leu Ser Thr Arg Phe Arg Thr

210 215 220

Glu Glu Gly His Ile Ser Val Leu Glu Asn Phe Tyr Gly Arg Ser Lys

225 230 235 240

Leu Leu Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Arg Leu Val Leu Leu Glu Ala Asn

245 250 255

Pro Asn Ala Phe Val Leu Pro Thr His Leu Asp Ala Asp Ala Ile Leu

260 265 270

Leu Val Ile Gly Gly Arg Gly Ala Leu Lys Met Ile His Arg Asp Asn

275 280 285

Arg Glu Ser Tyr Asn Leu Glu Cys Gly Asp Val Ile Arg Ile Pro Ala

290 295 300

Gly Thr Thr Phe Tyr Leu Ile Asn Arg Asp Asn Asn Glu Arg Leu His

305 310 315 320

Ile Ala Lys Phe Leu Gln Thr Ile Ser Thr Pro Gly Gln Tyr Lys Glu

325 330 335

Phe Phe Pro Ala Gly Gly Gln Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Phe

340 345 350

Ser Lys Glu Ile Leu Glu Ala Ala Leu Asn Thr Gln Thr Glu Arg Leu

355 360 365

Arg Gly Val Leu Gly Gln Gln Arg Glu Gly Val Ile Ile Arg Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Gln Ile Arg Glu Leu Thr Arg Asp Asp Ser Glu Ser Arg Arg

385 390 395 400

Trp His Ile Arg Arg Gly Gly Glu Ser Ser Arg Gly Pro Tyr Asn Leu

405 410 415

Phe Asn Lys Arg Pro Leu Tyr Ser Asn Lys Tyr Gly Gln Ala Tyr Glu

420 425 430

Val Lys Pro Glu Asp Tyr Arg Gln Leu Gln Asp Met Asp Val Ser Val

435 440 445

Phe Ile Ala Asn Ile Thr Gln Gly Ser Met Met Gly Pro Phe Phe Asn

450 455 460

Thr Arg Ser Thr Lys Val Val Val Val Ala Ser Gly Glu Ala Asp Val

465 470 475 480

Glu Met Ala Cys Pro His Leu Ser Gly Arg His Gly Gly Arg Gly Gly

485 490 495

Gly Lys Arg His Glu Glu Glu Glu Glu Val His Tyr Glu Gln Val Arg

500 505 510

Ala Arg Leu Ser Lys Arg Glu Ala Ile Val Val Leu Ala Gly His Pro

515 520 525

Val Val Phe Val Ser Ser Gly Asn Glu Asn Leu Leu Leu Phe Ala Phe

530 535 540

Gly Ile Asn Ala Gln Asn Asn His Glu Asn Phe Leu Ala Gly Arg Glu

545 550 555 560

Arg Asn Val Leu Gln Gln Ile Glu Pro Gln Ala Met Glu Leu Ala Phe

565 570 575

Ala Ala Ser Arg Lys Glu Val Glu Glu Leu Phe Asn Ser Gln Asp Glu

580 585 590

Ser Ile Phe Phe Pro Gly Pro Arg Gln His Gln Gln Gln Ser Pro Arg

595 600 605

Ser Thr Lys Gln Gln Gln Pro Leu Val Ser Ile Leu Asp Phe Val Gly

610 615 620

Phe

625

Claims

1.用于诊断澳洲坚果过敏的医疗器械，其包含多肽，所述多肽是：

(a)由SEQ ID NO:2的氨基酸残基21-645组成的澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白；或

(b)由SEQ ID NO:2的氨基酸残基21-645组成的澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白与用于检测的标签或用于纯化的标签形成的融合多肽。

2.根据权利要求1所述的医疗器械，其中所述医疗器械是诊断上有用的载体，其中所述诊断上有用的载体选自包含珠子、测试条和微量滴定板的组。

3.根据权利要求2所述的医疗器械，其中所述诊断上有用的载体选自包含玻璃表面、生物芯片、膜、电泳凝胶和微量滴定板的组。

4.根据权利要求3所述的医疗器械，其中所述诊断上有用的载体是载玻片。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的医疗器械，其中所述多肽如SEQ ID NO:2所示。

6.多肽在制备用于诊断澳洲坚果过敏的测试试剂盒中的用途，其中所述多肽是：

(b)由SEQ ID NO:2的氨基酸残基21-645组成的澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白与用于检测的标签或用于纯化的标签形成的融合多肽；

其中所述诊断包括下列步骤：在样品中检测与所述多肽结合的抗体。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述样品是包含抗体的体液。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述样品选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品是全血。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的用途，其中所述抗体是IgE抗体。

11.根据权利要求6至9中任一项所述的用途，其中所述多肽如SEQ ID NO:2所示。

12.用于诊断澳洲坚果过敏的测试试剂盒，其包含多肽和用于检测包含所述多肽和与所述多肽结合的抗体的复合物的工具，其中所述多肽是：

13.根据权利要求12所述的测试试剂盒，其中所述抗体是IgE抗体。

14.根据权利要求12所述的测试试剂盒，其中所述多肽如SEQ ID NO:2所示。

15.多肽在制备用于预防、治疗或改善人受试者中的澳洲坚果过敏的药物组合物中的用途，其中所述多肽是：

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述多肽如SEQ ID NO:2所示。

17.诊断上有用的载体，其包含特异性捕获来自受试者的样品中针对澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的抗体的工具，所述澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸残基21-645组成，其中所述诊断上有用的载体选自包含珠子、测试条和微量滴定板的组。

18.根据权利要求17所述的诊断上有用的载体，其中所述诊断上有用的载体是玻璃表面、生物芯片、膜、电泳凝胶或微量滴定板。

19.根据权利要求18所述的诊断上有用的载体，其中所述诊断上有用的载体是载玻片。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的诊断上有用的载体，其中所述诊断上有用的载体还包含特异性捕获针对一种或多种来自下列的其他抗原的抗体的工具：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

21.试剂盒，其包含根据权利要求17至20中任一项所述的诊断上有用的载体。

22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于特异性检测捕获的抗体的工具。

23.根据权利要求17至20中任一项所述的诊断上有用的载体在制备用于诊断澳洲坚果过敏的试剂盒中的用途。