CN1244769A - 抗微生物蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了抗微生物蛋白的新家族。原型蛋白可从Macadamiaintegrifolia和其它植物种分离。本发明还描述了编码这种蛋白的DNA以及可用于表达这种微生物蛋白或将抗微生物蛋白导入植物的DNA构建体。包含这种抗微生物蛋白的组合物或这种抗微生物蛋白本身可施用于植物或哺乳动物以抵抗微生物侵染。

Description

抗微生物蛋白
技术领域
本发明涉及对真菌和细菌包括植物和动物的一些微生物病原体的生长发挥抑制作用的分离蛋白。本发明还涉及包含编码这些蛋白序列的重组基因，能有助于植物细胞或其它生物细胞抵御微生物病原体侵袭的重组基因的表达产物。本发明还涉及这些蛋白和/或编码这些蛋白的基因用于控制人和兽医学临床疾病中的微生物的用途。
技术背景
对于农业和园艺工业来说，植物的微生物病是重要问题。每年植物病一般引起数百万吨农作物损失。其中真菌和细菌应负责损失的主要部分。抵抗真菌和细菌病的可行方法是提供能表达以某种方式增加植物对病原体侵袭的抗性的蛋白质的转基因植物。简单策略是，首先在体外鉴定具有抗微生物活性的蛋白，然后克隆或合成编码此蛋白的DNA序列，然后制备用于在植物体内有效表达此蛋白的嵌合基因构建体，然后将此基因转移入转基因植物中并通过与对照植物对比来评估导入基因对微生物病原体的抗性。
上述疾病控制方法的第一步和最重要的一步是识别、特征鉴定和描述具有强抗微生物活性的蛋白。近些年来，已鉴定和描述了许多具有抗微生物和/或抗真菌活性的不同蛋白。根据它们推测的作用方式和/或它们的氨基酸序列比较，将这些蛋白分成几类。这几类包括：壳多糖酶(Roberts，W.K.等[1986]生物化学与生物物理学学报880：161-170)；β-1，3-葡聚糖酶(Manners，J.D.等[1973]植物化学12：547-553)；硫素(Bolmann，H.等[1988]欧洲分子生物学组织杂志7：1559-1565和Fernadez de Caleyu，R等[1972]Appl.Microbiol.23：998-1000)；permatins(Roberts，W.K.等[1990]普通微生物学杂志136：771-1778和Vigers，A.J.等[1991]分子植物与微生物相互作用4：315-323)；核糖体失活蛋白(Roberts，W.K.等[1986]生物化学与生物物理学学报880：161-170和Leah，R等，[1991]生物化学杂志266：1564-1573)；植物防卫素(Terras，F.R.G等[1995]植物细胞7：573-588)；壳多糖结合蛋白(De Bolle，M.F.C等[1992]植物分子生物学22：1187-1190和Van Parijis，J等[1991]植物183：258-264)；奇甜蛋白样或渗透蛋白样蛋白(Woloshuk，C.P.等[1991]植物细胞3：619-628和Hejgaard，J.[1991]欧洲生物化学学会联合会快报291：127-131)；PR1型蛋白(Niderman，T.等[1995]植物生理学108：17-27)和非特异性脂转移蛋白(Terras，F.R.G等[1992]植物生理学100：1055-1058和Molina，A.等[1993]欧洲生物化学学会联合会快报，3166：119-122)。另一类来源于植物的抗微生物蛋白是knottin或knottin样抗微生物蛋白(Cammue，B.P.A.等[1992]生物化学杂志，67：2228-2233；Broekaert W.F.等(1997)植物科学鉴定性评论16(3)：297-323)。一类命名为4-半胱氨酸蛋白的抗微生物蛋白已在一篇其中分类包括玉米基本蛋白(Maize Basic Protein，MBP-1)的文献中报道(Durick，J.P.等[1992]生物化学杂志，267：18114-18120)。一种不适于前述抗微生物蛋白分类的新型抗微生物蛋白已经从命名为MiAMP1的Macadamia integrifolia种子得到分离。(Marcus，J.P.等[1997]欧洲生物化学杂志，244：743-749)。另外，植物并不是抗微生物蛋白的唯一来源，有许多关于从动物和微生物细胞分离抗微生物蛋白的报道(Gabay，J.E.[1994]科学264：373-374和“抗微生物肽”[1994]CIBA基金专题论文集186，John Wiley和Sons Publ.，Chichester，UK中的综述)。
有迹象表明编码在体外有微生物活性的蛋白的基因在转基因植物中的异位表达可导致对微生物病原体的抗性增强。基因工程抗性的例子包括表达编码下列蛋白的基因的转基因植物：植物壳多糖酶，单独(Broglie，K.等[1991]科学254：1194-1197)或与β-1，3-葡聚糖酶结合(Van den Elzen，P.J.M.等[1993]皇家学会哲学汇刊342：271-278)；植物防卫素(Terras，F.R.G等[1995]植物细胞7：573-588)；渗透蛋白样蛋白(Liu，D，等[1994]美国国家科学院院报91：1888-1892)；PR1类蛋白(Alexander，D.等[1993]美国国家科学院院报90：7327-7331)和核糖体失活蛋白(Logemann，J.等[1992]生物技术10：305-308)。
尽管抗微生物蛋白在转基因植物中用于基因工程抗病性的潜在用途已被广泛描述，但是此外还有其它值得一提的应用。首先，高效抗微生物蛋白可直接应用于控制植物病(De Bolle，M.F.C等[1993]植物防御反应机制，B.Fritig和M.Legrand编，Kluwer Acad.Publ.，Dordrecht，NL，第433-436页)。另外，抗微生物肽在人类和兽医学中有潜在治疗用途。尽管对于植物来源的肽在这方面还没有描述，但对来源于动物的肽已有积极的开发并已达到临床试用阶段。(Jacob，L.和Zasloff，M.[1994]“抗微生物肽”，CIBA基金专题论文集186，John Wiley和Sons Publ.，Chichester，UK，第197-223页)。
抗微生物蛋白表现几种三维结构，这些三维结构将很大程度上决定它们表现的活性。已测定了这些蛋白表现的一些球状结构。(Broekaert W.F.等(1997)植物科学鉴定性评论16(3)：297-323)。决定这些蛋白稳定性的主要因素是位于α-螺旋和β-折叠中的各个半胱氨酸之间二硫键的存在。众所周知，许多有毒性的肽如芋螺毒素被二硫键所稳定(见例如Hill J.M.等(1996)生物化学35(27)：8824-8835)在上面所引用的芋螺毒素的例子中，形成包括螺旋、小发夹结构、顺式羟脯氨酸和几个转角的紧密结构。分子的稳定是通过三个二硫键，两个二硫键连接α-螺旋和β-折叠形成实心的结构核心。有意思的是，此分子的八个精氨酸和赖氨酸侧链以相对分子核心的放射方向存在于溶剂中。这些阳离子侧链形成了与病原体膜上的阴离子位点相互作用的潜在位点。(Hill J.M.等，同上)。
在此描述的本发明包括以前未发现并因此是新的具有抗微生物活性的蛋白。这些蛋白可从Macadamia integrifolia(Mi)种子或从棉花或可可种子分离。另外，抗真菌蛋白片段可来源于含有与来自此处所述的Macadamia的抗微生物蛋白基本上相似的区域的更大的种子贮存蛋白。含有与已提纯的蛋白相似的区域的种子贮存蛋白的实例见图4。Macadamia integrifolia属于Proteaceae家族。M.integrifolia，也称为Bauple坚果或Queensland坚果，被某些人认为是世界上最好的可食坚果。棉花(陆地棉)属于Malvaceae家族并因其纤维而广泛种植。可可(Threobroma cacao)属于Sterculiaceae家族并由于多种可可产品而在世界上广泛应用。
由于表达这些蛋白的转基因植物没有附加的毒性，macadamia和可可抗微生物蛋白存在于这些植物可食用部分的事实使这些肽对于用于抗病基因工程很具吸引力。这些蛋白也可安全地用于人及兽医用途。
发明概述
根据本发明的第一实施方案，提供具有抗微生物活性的蛋白片段，其中所述蛋白片段选自：
(i)具有选自以下的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽：
SEQ ID NO：1的残基29-73
SEQ ID NO：1的残基74-116
SEQ ID NO：1的残基117-185
SEQ ID NO：1的残基186-248
SEQ ID NO：3的残基29-73
SEQ ID NO：3的残基74-116
SEQ ID NO：3的残基117-185
SEQ ID NO：3的残基186-248
SEQ ID NO：5的残基1-32
SEQ ID NO：5的残基33-75
SEQ ID NO：5的残基76-144
SEQ ID NO：5的残基145-210
SEQ ID NO：7的残基34-80
SEQ ID NO：7的残基81-140
SEQ ID NO：8的残基33-79
SEQ ID NO：8的残基80-119
SEQ ID NO：8的残基120-161
SEQ ID NO：21的残基32-91
SEQ ID NO：22的残基25-84
SEQ ID NO：24的残基29-94
SEQ ID NO：25的残基31-85
SEQ ID NO：26的残基1-23
SEQ ID NO：27的残基1-17
SEQ ID NO：28的残基1-28；
(ii)(i)的同系物；
(iii)含有相关胱氨酸间隔C-2X-C-3X-C-(10-12)X-C-3X-C-3X-C的多肽，其中X是任意氨基酸，C是半胱氨酸；
(iv)含有相关半胱氨酸间隔和酪氨酸/苯丙氨酸间隔Z-2X-C-3X-C-(10-12)X-C-3X-C-3X-Z的多肽，其中X是任意氨基酸，C是半胱氨酸，Z是酪氨酸或苯丙氨酸；
(v)含有的相关半胱氨酸间隔C-3X-C-(10-12)X-C-3X-C的多肽，其中X是任意氨基酸，C是半胱氨酸；
(vi)具有与(i)中半胱氨酸残基间隔基本上相同的带正电残基间隔的多肽，和
(vii)具有与(i)基本上相同的抗微生物活性的(i)至(vi)中的任意多肽片段。
根据本发明的第二实施方案，提供包含根据第一实施方案所述的至少一种多肽片段的蛋白，其中所述多肽片段具有选自包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列的序列。
根据本发明的第三实施方案，提供具有选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的序列的蛋白。
根据本发明的第四实施方案，提供编码根据第一实施方案所述的蛋白的分离或合成DNA。
根据本发明的第五实施方案，提供包含根据第四实施方案所述的与用于表达所述蛋白的元件可操作性连接的DNA的DNA构建体。
根据本发明的第六实施方案，提供带有根据第五实施方案所述的DNA构建体的转基因植物。
根据本发明的第七实施方案，提供根据第六实施方案所述的转基因植物的繁殖材料。
根据本发明的第八实施方案，提供包含根据第一实施方案所述的抗微生物蛋白以及农业上可接受的载体稀释剂或赋型剂的组合物。
根据本发明的第九实施方案，提供包括根据第一实施方案所述的抗微生物蛋白以及药学上可接受的载体稀释剂或赋型剂的组合物。
根据本发明的第十实施方案，提供控制微生物侵染植物的方法，方法包括：
i)用根据第一实施所述的抗微生物蛋白或根据第八实施方案所述的组合物处理所述植物；或
ii)将根据第五实施方案所述的DNA构建体导入该植物。
根据本发明的第十一实施方案，提供控制微生物侵染哺乳动物的方法，此方法包括用根据第一实施方案所述的抗微生物蛋白或根据第九实施方案所述的组合物治疗动物。
根据本发明的第十二实施方案，提供制备抗微生物蛋白的方法，该方法包括如下步骤：
a)获得或设计能形成螺旋-转角-螺旋结构的氨基酸序列；
b)置换个别残基以得到与图4所示的1个或多个氨基酸序列基本上相同的带正电残基和半胱氨酸残基分布。
c)化学合成或通过液体培养中的重组DNA技术合成含有所述氨基酸序列的蛋白；并且
d)如果需要，在所述半胱氨酸残基之间形成二硫键。
本发明的其它实施方案包括生产抗微生物蛋白的方法。
附图简述
图1表示Macadamia integrifolia提取物的基本蛋白组分的阳离子交换层析的结果以及MiAMP2c洗脱液区域组分抗微生物活性生物测定的结果。
图2表示阳离子交换分离组分的平行生物测定中含有1mM Ca2+时的结果。
图3表示来自图1和图2中阳离子交换分离的含有M1AMP2C的高度抑制组分的反相高压液相色谱(HPLC)特征及这些HPLC组分表现的％生长抑制率。
图4表示MiAMP2a，b，c和d以及来源于其它种子贮存蛋白含有与抗微生物蛋白MiAMP2系列同源的区域的蛋白片段的氨基酸序列。
图5表示可用于在转基因植物中表达和分泌MiAMP2c的合成核苷酸序列的实例。
图6表示来自Macadamia的含有MiAMP2a，b，c和d亚单位的克隆1-3和来自与Macadamia克隆表现明显同源性的可可和棉花豌豆球蛋白种子贮存蛋白的序列的比较。
图7表示MiAMP2c的一系列二级结构预测。
图8表示MiAMP2c蛋白的三维模型。
图9表示大肠杆菌液体培养中表达的TcAMP1(可可亚单位1)，MiAMP2a，MiAMP2b，MiAMP2c和MiAMP2d的表达和纯化过程中不同阶段蛋白组分的染色SDS-PAGE凝胶。
图10表示使用Ni-NTA介质的起始纯化步骤后的可可亚单位2(TcAMP2)的反相HPLC纯化。
图11表示使用针对MiAMP2c产生的兔抗血清进行的从不同植物种提取的粗蛋白的Western印迹杂交。
图12表示Stenocarpus sinuatus基本蛋白成分的阳离子交换分级分离以及表明一系列组分中免疫相关蛋白存在的随后的Western印迹杂交。
图13表示先前与MiAMP2c抗体反应的Stenocarpus sinuatus阳离子交换组分的反相HPLC分离(见图4)。也表示了Western印迹杂交，表明各个HPLC组分中存在推定的MiAMP2同系物。
图14是能用于在转基因植物中表达这些抗微生物蛋白的载体的实例，双元载体pPCV91-MiAMP2c的图谱。
图15表示检测转基因烟草植物中MiAMP2c的Western印迹杂交。
实施本发明的最佳方式和其它方式
后面用到以下缩写：
EDTA     乙二胺四乙酸
IPTG     异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
MeCN     甲基氰(乙腈)
Mi       Macadamia integrifolia
MiAMP2   Macadamia integrifolia抗微生物蛋白系列第2号
Ni-NTA   次氮基三乙酸镍层析介质
ND       未测定
PCR      聚合酶链反应
PMSF     苯甲基磺酰氟
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
TFA      三氟乙酸盐
此处所用的术语同系物代表任何在组成和序列上与用作参考的多肽基本上相似的多肽。参考多肽的同系物应包含主要元件如在相同间隔隔开的半胱氨酸或其它残基以使同系物采用与参考物基本上相似的三维球状结构。同系物还应表现有与参考蛋白基本上相同的抗微生物活性。
本发明人已鉴定了一类新的具有抗微生物活性的蛋白。原型蛋白可从Macadamia integrifolia种子分离。本发明因此提供抗微生物蛋白本身及编码这些抗微生物蛋白的DNA序列。
本发明还提供与来自Macadamia integrifolia的原型抗微生物蛋白同源的蛋白的氨基酸序列。因此，除了来自Macadamia的抗微生物蛋白，本发明还提供来自其他种的、到目前为止未鉴定为具有抗微生物活性的同系物的氨基酸序列。
本系列的第一种抗微生物蛋白是直接从Macadamia integrifolia分离的，其它抗微生物蛋白是通过克隆努力、同源性搜索和随后的液体培养中表达和纯化之后进行编码蛋白的抗微生物试验而得到鉴定的。在本系列的第一种蛋白从Macadamia得到纯化并命名为MiAMP2之后，就获得了编码含有MiAMP2的前原蛋白的克隆。这种由几个几乎相同的克隆来代表的大蛋白(666氨基酸)含有与本身位于克隆的核苷酸序列区域3内的纯化抗微生物蛋白片段(MiAMP2)有明显相似性的4个相邻区域，因此将这种纯化的抗微生物蛋白命名为MiAMP2c。在666个氨基酸的克隆中所含的其它片段根据它们在克隆的核苷酸序列中的位置分别命名为MiAMP2a，b和d。然后，其它几个与MiAMP2a，b，c和d蛋白片段有明显同源性的序列在Entrez数据库中得到鉴定。这些同源序列包含在来源于棉花和可可的其序列以前未被描述为含有抗微生物蛋白序列或表现为抗微生物活性的大的种子贮存蛋白之中。含有与MiAMP2c同源的序列的稍大的种子贮存蛋白片段经测试并在此证明表现抗微生物活性。因此，发明人已建立了用于从更大的种子贮存蛋白获得抗微生物蛋白片段的方法。根据这些发现，显而易见，其它含有与所述蛋白相似序列的种子贮存蛋白的片段也会表现抗微生物活性。
特别地，47个氨基酸的TcAMP1(可可抗微生物蛋白1)和60个氨基酸的TcAMP2序列来源于可可豌豆球蛋白种子贮存蛋白序列(含有525个氨基酸)(Spencer，M.E和Hodge R.[1992]植物186：567-576)。然后使这些衍生的片段在液体培养中表达。已证明如此表达和随后纯化的可可豌豆球蛋白片段(实施例10和11)抗微生物(实施例15)。这是关于可可豌豆球蛋白片段具有抗微生物活性的首次报道。已证明含有与明显由棉花豌豆球蛋白种子贮存蛋白释放的MiAMP2c同源的片段的序列库具有抗微生物活性(Chung，R.P.T.等[1997]植物科学127：1～16)。这些发现清楚地包括在本申请公开的序列中。
除了表明可可豌豆球蛋白衍生片段表现抗微生物活性，在此描述了其它一些表现有抗微生物活性的蛋白。例如，下面描述的来自Stenocarpus sinuatus并具有与MiAMP2亚单位相同大小的蛋白，可与MiAMP2c抗血清反应并含有与MiAMP2蛋白同源的序列(见图4)。根据此处提供的证据，与MiAMP2c亚单位(即MiAMP2a，b，d；TcAMP1；TcAMP2和棉花片段1，2和3-见图4)同源的序列组成含有抗微生物片段的蛋白。来自Macadamia的MiAMP2片段和来自可可的TcAMP1和2片段的抗微生物活性在下面举例。R.P.T Chung等(植物科学127：1-16[1997]已证明这些棉片段表现抗微生物活性。其它抗微生物蛋白也可来源于种子贮存蛋白如花生过敏原Ara h(Burks，A.W.等[1995]临床研究杂志96(4)，1715-1721)，玉米球蛋白(Belanger，F.C和Kriz，A.L.[1991]遗传学129(3)，863-872)，大麦球蛋白(Heck，G.R等[1993]分子遗传学和普通遗传学239(1-2)，209-218)和大豆总大豆球蛋白(Sebastiani，F.L等[1990]植物分子生物学15(1)，197-201)，所有这些都含有存在于此处表明表现有抗微生物活性的序列中的相同的主要元件。
这些含有与MiAMP2同源的序列区域的蛋白(如图4)可用于构建编码1)更大蛋白的活性片段或2)多个抗微生物片段的融合的核苷酸序列。这可使用标准密码子表和实验室手册如《分子生物现行实验方法》(版权1987-1995，Ausubel F.M.等编辑和John Wiley & SonsInc；出版，印刷于美国)中所述的克隆方法进行。随后，这些序列可在液体培养中表达以纯化和检测，或者可以在将这些序列放入合适表达载体之后在转基因植物中表达。
这些抗微生物蛋白本身将表现独特的可通过X线衍射晶体分析法和核磁共振技术来确定的三维结构。这种蛋白的抗微生物活性在很大程度上取决于这种三维结构。也可将蛋白序列用于结构预测程序以估计这些蛋白是否可能表现某些二级结构元件(见实施例8和图7)。然后如此预测的二级结构可用于模拟三维球状结构。尽管这种三维结构预测并不适于大多数蛋白，但由于对MiAMP2c的二级结构预测非常简单、明确，因此已得到MiAMP2c蛋白的三维模型结构。表现相同半胱氨酸间隔和其它关键元件的同系物也应采用相同的三维结构。实施例8表明MiAMP2c(和同系物)最有可能采用的结构是由至少两个连接两个反平行α-螺旋片段的二硫键来稳定的螺旋-转角-螺旋结构(见图8)。额外的二硫键(如，象MiAMP2b中)或各位于α-螺旋片段的与正常存在的参与上述两个二硫键的半胱氨酸残基的同一面的酪氨酸和/或苯丙氨酸之间的疏水环-堆积相互作用可提供附加的稳定性。MiAMP2c表现的NMR信号与上述二级结构预测产生的三维球状模型一致。
应当理解，本领域技术人员可以利用已知结构的蛋白，明显改变其序列，但保留其整体三维形状和蛋白的抗微生物活性，如果不明显影响其结构(和蛋白活性)，最不可能改变的一种结构是半胱氨酸残基的含量和间隔，因为这会破坏对于a)保持蛋白整体结构和/或b)使蛋白更耐受变性和蛋白分解(稳定蛋白结构)很关键的二硫键形成。尤其，半胱氨酸位于它们所在的螺旋的一个平面是必需的。这最好可以通过在每个螺旋内保持半胱氨酸残基之间的三残基间隔来实现，但是也可通过用三个残基隔开的另一螺旋片段上提供的半胱氨酸残基之间的二残基间隔来实现(即C-X-X-C-X-X-X-C-nX-C-X-X-X-C-X-X-X-C，在此C是半胱氨酸，X是任意氨基酸，n是在两个α-螺旋片段间形成转角的残基数)。芳香族的酪氨酸(或苯丙氨酸)残基如果象半胱氨酸侧链一样位于螺旋的同一面上，它们就具有增加蛋白结构稳定性的作用。这可通过在芳香族残基和最接近的半胱氨酸残基之间提供2或3个残基的适当间隔来实现(即Z-X-X-C-X-X-X-C-nX-C-X-X-X-C-X-X-X-Z，这里Z是酪氨酸或苯丙氨酸)。
蛋白不同表面上的正电荷(或负电荷)分布在决定蛋白结构和活动中起关键作用。尤其，蛋白α-螺旋区域中带正电残基的分布可导致正电荷分布于螺旋的一面或可导致带正电残基集中于分子的一些特定部分。带正电残基的另一种分布使它们在溶剂中时从蛋白核心呈放射状分布。预测几种MiAMP2同系物是这种分布(资料未显示)。本领域的技术人员可以容易地用带有目的序列的螺旋旋转结构确定用来定位螺旋一面的残基间隔或者用来实现从核心外放射状分布的间隔。螺旋旋转结构利用在α-螺旋中，每圈螺旋平均包括3.6个残基这一事实。每个残基绕轴旋转100℃这可以构成表明螺旋区域内侧链分布的示意图。图8显示，带带正电残基的间隔可导致大多数正电荷侧链定位于螺旋的一个面上。本领域的技术人员认可这些正电荷来自精氨酸和赖氨酸残基。
为使蛋白形成螺旋-转角-螺旋结构。还需要有有利于α-螺旋形成和有利于在氨基酸序列中间部分转折结构形成(并不需要转折区域有螺旋结构)的特定残基。这可通过一个脯氨酸残基或象所见到的许多MiAMP2同系物的转折片段中央的残基来实现。当不存在脯氨酸时，甘氨酸也可打破连续的螺旋结构并且诱导这一位置的转角的形成。在某些情况下(如TcAMP1)，丝氨酸可起到这一作用。将认识到蛋白的这一区域的残基通常有利于转折结构的形成；满足这一要求的残基包括脯氨酸，丝氨酸和天冬氨酸；但是，其它残基也可。
在此报道的DNA序列是用来获得来自基它种的同源基因的非常有力的工具。应用此DNA序列，本领域技术人员可设计和合成用来筛选来自其它种植物的以具有编码与这里所描述的同源的抗微生物蛋白基因的cDNA文库的寡核苷酸探针。这可简单地包括cDNA文库的构建和随后的应用在此报道的一个序列或一个序列的一部分作为寡核苷酸探针来筛选这一文库(如序列ID No.2或实施例9所描述的PCR片段)。其它编码与MiAMP2同源的蛋白的寡核苷酸也可用于此目的(如棉花和可可豌豆球蛋白的寡核苷酸序列)。制备和筛选cDNA文库可通过购买用于该目的的试剂盒(如来自Stratagene)或按照可得的DNA克卫手册(见《分子生物学现行实验方法》，同上)所描述的已建立的方法来进行。构建不同种的文库和应用简单的DNA杂交技术筛选这些文库专门分离与Macadamia，棉花或可可豌豆球蛋白相似的豌豆球蛋白同系物的方法相对直接。一旦克隆后，然后再检测这些豌豆球蛋白相关序列中MiAMP2样亚单位的存在。应用实施例10和11所描述的系统在大肠杆菌中可容易地表达这些亚单位。随后，这些蛋白可在转基因植物中表达。
基因或其片段在组成性或可诱导的启动子的控制下，克隆进入允许编码的蛋白表达的生物系统。已知允许蛋白在多种系统中表达的转化方法。这些蛋白因此可在合适的系统中表达以产生为进一步应用白。表达这些蛋白合适的宿主包括：大肠杆菌，真菌细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞和植物细胞。在这些宿主中表达蛋白标准方法，在许多教科书中包括《分子这现行实验方法》(同上)的第16部分(蛋白表达)中有描述。
根据多种已知的方法(农杆菌属，Ti质粒，电穿孔，微注射，微粒枪等)，植物细胞可用本发明的DNA构建体转化。编码Macadamiaintegrifolia抗微生物蛋白亚单位(如来自MiAMP2克隆的a，b，c，d片段)的DNA序列和其它同系物的DNA或编码产生成熟蛋白的前蛋白DNA序列可联合使用。这些前蛋白含有把蛋白定某一特定的细胞区室(如质外体或液泡)的目标的天然的或合成的信号肽序列。这些编码序列可以与能确保在植物细胞中强表达的植物启动子序列连接。启动子序列可确保大多数或所有植物细胞中蛋白的强组成型表达，这可能是可保证易受微生物感染的特定的组织和细胞中的表达的启动子，还可能是保证在感染过程中强烈表达诱导的启动子。基因组件盒的这些类型也包括转录终止点和抗微生物蛋白编码区的聚腺苷酸化序列3’以保证mRNA编码的抗微生物蛋白的有效的产生和稳定。有可能的是在此公开的抗微生物蛋白的有效表达可通过将它们的DNA序列插入生planta处理中分别产生的一个或更多的有活性的MiAMP2样片段的更大的蛋白而增强。
编码MiAMP2系列抗微生物蛋白的基因组件盒(如，MiAMP2a，b，c或d；或所有这些亚单位一起，完整的MiAMP2克隆)或上面描述的MiAMP2蛋白的同系物可用两种常用的方法在植物细胞中表达。首先，基因组件盒可与携带下面的双元载体连接：i)位于根瘤农杆菌Ti质粒的T-DNA两侧的左边或右边序列；ii)用于筛选抗生素抗性植物细胞的合适的可选择的标记基因；iii)在根瘤农杆菌或大肠杆菌中起作用的复制起点和iv)可筛选根瘤农杆菌和大肠杆菌的质粒携带细胞的抗生素抗性基因。这些携带嵌合编码MiAMP2的基因的双元载体可通过电穿孔或三亲交配导入携带去毒Ti质粒的根瘤农杆菌株如菌株LBA4404，GV3101，和AGL1或发根农杆菌株如A4或NCCP1885。这些农杆菌株可与合适的植物外植体或完整的植物组织共同培养，转化的植物细胞和/或新生体用抗生素抗药性来筛选。
基因转移进植物的第二种方法可以通过直接把基因插入目标植物细胞中来完成。例如，MiAMP2编码的基因组件盒可以与编码植物抗生素抗药性的嵌合基团的质粒共同沉淀在金或钨微粒上。用快速流动氦气可加速钨微粒，这些微粒可用来轰击合适的植物组织。这可以是胚胎发生的细胞培养，植物外植体，愈伤组织或细胞悬浮液或完整的分生组织。植物的重新获得可通过抗生素抗性基因选择和用来检测表达MiAMP2蛋白或相关片段的植物细胞的抗体。
转基因植物中MiAMP2蛋白的表达既可用抗体与蛋白反应，又可用抗微生物生物测定来检测。在植物中表达MiAMP2蛋白或其片段的这些或其它相关的方法的描述见于《植物分子生物学》(第二版，Gelvln，S.B和Schilperorrt R.A编辑1994，K1uwer Academic Publishers出版，Dordrecht，新西兰)。
单子叶植物和双子叶植物都能被转化和再生。遗传上被修饰的植物的实例包括玉米，香蕉，花生，田间豌豆，向日葵，西红柿，Canola，烟草，小麦，大麦，燕麦，土豆，棉花，康乃馨，玫瑰，高梁。这些以及其它农业作物可用抗微生物基因转化，于是它们就会表现出对病原体侵袭更大程度上的抵抗力。或者，这些蛋白可通过表面施药用来控制疾病。
本发明还涉及应用抗微生物蛋白来控制哺乳动物包括人的病原体。为控制微生物感染，此蛋白既可体表给药又可静脉内给药。
上面提到的实施例十的描述中，本发明包括在其范围内根据原型MiAMP2蛋白系列的抗微生物蛋白的制备。新序列可根据基本上保留象在MiAMP2蛋白中找到的与半胱氨酸有关的带正电残基分布的MiAMP2氨基酸序列来设计。新序列的合成或表达可来自在合适的宿主细胞中编码序列的基因。这些操作的合适方法在上面已有描述。遗传工程的细胞中这种新蛋白的表达通常会产生具有正确的、包括半胱氨酸之间正确形成的二硫键的二维结构产物。然而，即使蛋白是化学合成的，本领域内已知的为进一步处理这种蛋白的方法是打破不需要的二硫键和在想要的半胱氨酸残基间形成键而得到的，必需的三维结构。Macadamia integrifolia抗微生物蛋白系列第2号
如上所述，一系列新的潜在抗微生物蛋白已在Macadamiaintegrifolla种子中得到鉴定。由于发现它们都位于加工成更小都表现有抗微生物活性的亚单位的大的前原蛋白上；由于它们代表从Macadamia integrifolia分离的抗微生物蛋白的第二类，这些蛋白集合起来称为MiAMP2系列(或MiAMP2蛋白)。这一系列的每种蛋白片段都具有特征的pI值。图4所示MiAMP2a，b，c和d亚单位分别具有预测的pI值4.4，4.6，11.5和11.6(预测应用没有组氨酸标签或载体pET16b中片段表达相关的切割序列的原始序列资料)，并且含有两套通过二硫键的形成在稳定蛋白的三维结构中很重要的CXXXC基序。另外，这些蛋白含有位于象上面实施例8所描述的可赋予螺旋-转角-螺旋结构更多的稳定性的位置的一套附加的芳香族(酪氨酸/苯丙氨酸)残基，或者一套附加的半胱氨酸残基。
MiAMP2系列蛋白的氨基酸序列与用BLASTP公式(Alschnl，S.F等[1990]分子生物杂志215：403)。搜索到的序列数据库中(Swiss Prot和非多余数据库)的以前所描述的蛋白的片段具有明显同源性。尤其，MiAMP2a，b，c和d序列表现与可可豌豆球蛋白和棉花植物豌豆球蛋白区域有明显的相似性(如见图6)。来自其它如花生(Burks，A.N.等[1995]临床检查杂志96(4)，1715-1721)，玉米(Belanger，F.C.和Kriz，A.L.[1991]遗传学129(3)，863-872)，大麦(Heck，G.R等[1993]分子遗传学与普通遗传学239(1-2)，209-218)和大豆(SebastianiF.L.等[1990]植物分子生物学15(1)，197-201)。尽管在某些情况下这种同源性不是非常高(例如，MiAMP2a和棉花亚单位之间有18％的相同性，见图4(，所有的亚单位和同系物中保留了主要的4个半胱氨酸残基的间隔。另外，棉花和可可豌豆球蛋白来源亚单位保留了保守的酪氨酸或苯丙氨酸残基以作为三级结构附加的稳定物。分别含有525个或590个氨基酸的棉花和可可豌豆球蛋白比MiAMP2c(47个氨基酸)蛋白大得多(见图4和图6)。尽管MiAMP2也与来源于玉米的MBP-1抗微生物蛋白具有一些同源性(Duvick，J.P.等(1992)生物化学杂志267：18814-20)，由于本申请中所给出的间隔CXXXC基序之间的残基是13使得MBP-1不在说明书之内。总的说，MBP也是比在此公布的序列小的蛋白(33个氨基酸)，且没有现有的证据表明MBP-1来自大的种子贮存蛋白而不是与玉米球蛋白一部分具有某些相似性的蛋白。然而，MBP-1不能来源于玉米球蛋白，因为玉米球蛋白在两个CXXXC基序间含10个残基，而MBP-1含有13个。图4和图6中的排列显示了MiAMP2亚单位和可可和棉花豌豆球蛋白的来源的分子之间半胱氨酸间隔的相似性。图4和6中用粗的下划线句子突出的是半胱氨酸和芳香族酪氨酸/苯丙氨酸残基。图4还显示了可在液体培养中表达的并表现有抗微生物活性的附加的蛋白的排列。
所有经过试验的MiAMP2同系物表现有抗真菌活性。对蛋白试验的霜些病原体/微生物，MiAMP2同系物在2μg/ml的低学不有很明显的对真功生长的抑制作用。因此它们可针对几种植物疾病起到保护作用。通过作用于植物的一些部位，MiAMP2同系物可用作杀真菌剂或抗生素。这些蛋白还可通过在转基因植物中表达用于抑制病原体的生长。这些蛋白还可通过体表给药或静脉内注射用于控制人的病原体。这些蛋白的一个特征是它对一些微生物的抑制作用在Ca2+(1mM)存在时受到抑制。MiAMP2c亚单位这一效应的实例见表1。
一些MiAMP2蛋白和同系物可用作昆虫控制试剂。由于一些蛋白是强碱性(如对于MiAMP2c和d亚单位来说，pI＞11.5)，即使在昆虫消化道强碱性环境下，它们也可保持强的净正电荷。这种强的净正电荷可在消化道内与负电荷结构发生反应。这种反应可导致进食无效，生长缓慢和可能造成有害昆虫死亡。
下面是本发明的非限制性实施例。实施例1从Macadamia integrifolia种子中提取基本蛋白
25Kg的Mi坚果(购自Macadamia坚果工厂，昆士兰，澳大利亚)在食物处理机(The BigOscar，Sunbeam)中经过研磨得到的粗物在4℃，50L冰冷的含有10mM NaH2PO4，15mM Na2HPO4，100mM KCl，2mM EDTA，0.75％聚乙烯聚吡咯烷酮和0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的提取缓冲液中抽提2-4小时。得到的匀浆通过厨房滤过器以去除大的颗粒成分然后进一步在大容量的离心机中离心(4000rpm，15分钟)以澄清。在上清液中加入固体硫酸铵达到30％相对饱和，4℃搅拌过夜以形成沉淀。离心4000转/分，30分钟后，取出上清液并加入硫酸铵达到70％相对饱和。使此溶液沉淀过夜然后于4000转/分离心30分钟以收集沉淀的蛋白组分。沉淀的蛋白重悬于最低限度体积的提取缓冲液中并再次离心(13,000转/分，30分钟)以去除任何尚存的不溶物质。经过透析(10mM乙醇胺pH9.0，2mM EDTA和1mM PMSF)去除残余的硫酸铵后，此蛋白通过预先用10mM乙醇胺(pH9)，EDTAk 2mM)平衡的Q-Sepharose Fast Flow柱(5×12cm)。从该柱收集的流出物代表了种子的碱性(pI＞9)蛋白组分。这一部分蛋白按实施例3所描述的进一步纯化。实施例2抗真菌和抗细菌活性的测定
通常，估计抗真菌和抗细菌活性的生物测定在96孔微量滴定板中进行。典型地，试验的有机体悬浮于含有K2HPO4(2.5mM)，MgSO4(50μM)，CaCl2(50μM)，FeSO4(5μM，CoCl2(0.1μm)，CuSO4(0.1μM)，Na2MoO4(2μM)，H3BO3(0.5μM)，KI(0.1μM)，ZnSO4(0.5μM)，MnSO4(0.1μM)，葡萄糖(10g/L)，天冬酰胺(1g/L)，蛋氨酸(20mg/L)，生物素(0.2mg/L)，盐酸硫胺素(1mg/L)和盐酸吡哆醇(0.2mg/L)的合成培养基中。试验有机体包括细菌细胞，真菌孢子(50,000孢子/ml)或真菌菌丝体片段(通过混合来自受试的真菌培养的菌丝团，然后过滤通过细筛以去除大些的菌丝团来产生)。微孔滴定板每孔加入50微升的悬浮于培养基的试验有机体。另50μl的试验抗微生物溶液加入适当的孔中。为清除生物测定孔与孔间的变异性，每种测试溶液设4个重复。每个96孔加样板中的16个加样孔用作与测试比较的对照。
除非另有说明，孵育25℃，48小时。包括酵母菌在内的真菌在25℃生长，大肠杆菌在37℃生长，其它细菌在28℃生物测定。根据不同时间间隔生长的培养物在600nm的吸光度来测定百分生长抑制率，并规定百分生长抑制率为100倍的对照孔吸光度平均变化减去试验孔吸光度，再除以对照孔600nm吸光度的平均变化的比值(如[(对照孔平均变化-试验孔变化/对照孔平均变化)]×100)。有代表性地，24小时测定一次并且从24-48小时这段时间用来测定百分抑制率。实施例3从Macadamia integrifolia基本蛋白组分纯化抗微生物蛋白
分离Mi抗微生物蛋白的起始材料是按上面实施例1所描述的从成熟种子中提取的基本蛋白。这种蛋白用图1所示的阳离子交换层析法进一步纯化。
约4g溶于20mM琥珀酸钠(pH4)的基本蛋白组分被加到预先用琥珀酸缓冲液平衡过的S-Sepharose高效相上(5×60cm)(Pharmacia)。用20L溶于20mM琥珀酸钠(pH4)线形梯度从0-2M NaCl的洗脱液以17ml/分的洗脱速度对柱进行洗脱。联机测定280nm吸光度以监测洗脱液中的蛋白并收集成200ml一份。随后对每一份的组分测定其对浓度为010μg/ml，存在或不存在1mM Ca2+的隐地疫霉的抗真菌活性。生物测定结果见于图1a和图1b，其中实线区代表的是洗脱液梯度，阴影区代表的是百分抑制率。图1a所示的测定是在无Ca2+加入的情况下进行的，而图1b的测定含有1mM Ca2+。分次分离得到一些在0.05M和2MNaCl之间洗脱的来解决的峰。一个在约16小时洗脱分离的峰(部分90-92)表现明显的抗微生物活性。
表现明显的抗微生物活性的组分进一步用反相层析法纯化。等分部分90-92被加到Pep-S(C2/C18)，用90％ H2O/5％ MeCN/0.1TFA(＝100％A)平衡的柱(25×0.93)(Pharmacia)上。柱子用240ml线性梯度从100％A到100％B(＝5％ H2O/95％ MeCN/0.1 TFA)的洗脱液以3ml/分的洗脱速度洗脱(80分钟)。分别收集个峰，真空干燥三次以去除TFA痕迹，随后重叠于500微升的milli-Q水(Millipore公司水纯化系统)以用于如实施例2所描述的生物测定。图2所示的是，图1和图2中来自阳离子交换分离纯化的部分92和HPLC特征。在214nm监测蛋白洗脱液。直线表示乙腈梯度。生物测定个峰的抗微生物活性：图3中小柱表示的是来自每一部分的物质15μg/ml的抑制率。活性蛋白在大约27分钟时洗脱(～30％ MeCN/0.1％ TFA)并称为MiAMP2c。实施例4分离的MiAMP2c的纯度
分离的抗微生物蛋白的纯度，可用天然的SDS-PAGA及随后的考马斯蓝蛋白染液染色来检验。按照厂家的推荐(100V，1～2小时的分离时间)，电泳在10-20％ tricine梯度胶(Novex)上进行。在这些条件，了化的MiAMP2c作为单个分离的区带(大小＜10kDa)迁移。对SDS-PAGE分析中单个主要区带连同在阳离子交换和反相分离(未显示)中洗脱的单个峰的检测，强烈表明MiAMP2c制备物的纯度大于95％，因此，制备物的活性几乎肯定仅仅决定于MiAMP2c而不是少量的污染成分。质谱分析中清晰的信号(下面实施例5)同样支持这一结果。实施例5 MiAMP2c的质谱分析
纯化的MiAMP2c用于进行质谱分析，溶液中约1μg的蛋白用于试验。分析表明此蛋白分子量为6216.8Da±2Da。另外，蛋白用二硫苏糖醇还原其二硫键再用4-乙烯吡啶加以烷基化。这样还原/烷基化的产物受试于质谱分析并且表现增加了427个质量单位(即分子量增加了大约4×106Da)。增加的质量表明4个4-乙烯吡啶基团与还原的蛋白起反应，说明该蛋白一共含有4个半胱氨酸残基。半胱氨酸含量还可随后用氨基酸测序证实。实施例6 MiAMP2c蛋白的氨基酸序列
大约1g的已被还原和烷基化的纯蛋白用自动的Edman降解N-末端测序。第一次测序过程中，确定了前39个残基序列。随后，约1mg的MiAMP2c与附着于蛋白蛋氨酸-26 C-末端旁的溴化氰反应。由切割反应产生的C-末端片段由反相HPLC纯化并测序，获得MiAMP2c余下的序列(即残基27-47)。完整氨基酸序列是RQRDP QQQYE QCQER CQRHETEPRH MQTCQ QRCER RYEKE KRKQQKR并且代表来自实施例9(见图6和SEQUENCE ID NO：5)的克隆了的氨基酸118～164。图中，半胱氨酸且粗体字及下划线以有助于间隔型式的识别。根据形成的二硫键的数目，蛋白质量范围在6215.6～6219.6Da之间。这与质谱分析获得的6216.8±2Da非常一致(实施例5)。正如期待的，测量的质量与二硫键形式的MiAMP2c预测的质量非常近似。实施例7编码带有前导肽的MiAMP2c的合成的DNA序列
应用标准的密码子表可以逆向翻译蛋白序列以获得可以编码抗微生物蛋白的DNA序列。软件程序MacVector 4.5.3用于进入蛋白序列并获得降解的核苷酸序列。可参考烟草密码子惯用表来挑选能在烟草中充分表现的密码子以获得在试验植物中的高表达。设计一个30个氨基酸的前导肽来保证信号肽有效的加工和细胞外此肽的有效分泌。为达到此目的，Von Hiejne方法被用来评价一系列要在正确位置切割的可行的前导序列[Von Hiejne，G.(1986)核酸研究14(11)：4683-4690]。尤其，发现氨基酸序列MAWFHVSVCN AVFVV IIIIM LLMFV PVVRG(序列ID No.11)具有修正紧跟着此前导序列的G(甘氨酸)的信号肽的加工的最佳可能性。烟草花叶病毒5’未翻译区也被加到此合成基因中以启动更高的翻译效率(Dowson，M.J.等(1994)植物分子生物学报告12(4)：347-357)。合成的基因还在5’和3’端有限制位点及紧接着5’端的有关有效克隆和亚克隆程序的起始ATG。图5显示了适用于植物表达实验中合成的DNA序列。在此图中，箭头所指的是翻译起始的位置，三角符号代表信号肽的切割点。实施例8 MiAMP2c蛋白的结构预测
应用序列分析公式，可指定蛋白推定的二级结构基序。五个不同的公式被用来预测MiAMP2c蛋白内是否发生α-螺旋，β-折叠及转角(图4)。方法可从下面来源获得：DPM方法，Deleage，G.，和Roux，B.(1987)蛋白质工程1：289-294；SOPMA方法，Geourjon.，C.，和Deleage，G.(1994)蛋白质工程7：157-164；Gibrat方法，Gibrat，J.F.，Garnier，J.，和Robson，B.(1987)分子生物学杂志198：425-443；Levin方法，Levin，J.M.，Robson，B.，和Garnier，J。(1986)欧洲生物化学学会联合会快报205：303-308；和phD方法，Rost，B.，和Sander，C.(1994)蛋白质19：55-72。图7所示的是预测的α-螺旋，β-折叠和转角的位置。图7用了以下符号：C，卷曲(无结构的)；H，α-螺旋；E，β-折叠；和S，转角。下划线的残基是那些至少2个独立的结构预测方法预测的展示有α-螺旋结构的残基；这些在图7中表现为螺旋。
从二级结构预测很明显地看到，蛋白呈高度α-螺旋：尽管二级结构预测经常有困难和不准确，这些特殊的预测清楚地显示了蛋白质的结构。对二级结构预测的检查表明被约5-8个残基的伸出物所打断的区域有形成2个α-螺旋的明显的优势。这是螺旋-转角-螺旋基序的高度暗示。
MiAMP2c氨基酸序列的螺旋旋转分析表明有CXXXC间隔的半胱氨酸残基会排列在它们所处的螺旋的一个面上。由于半胱氨酸参与二硫键的形成，一个螺旋的半胱氨酸侧链必须与位于其它螺旋片段的半胱氨酸侧链形成共价键。图8所示的是当将这些螺旋片段按照来自每个各自的螺旋的半胱氨酸侧链和其它半胱氨酸侧链紧密靠近的方式排列时产生的三维结构。这一结构展示了含有被两个二硫键连在一起的两个螺旋蛋白的一个面上的带正电残基的值得注意的分布。图8表明了这一分子的螺旋区的带正电残基间隔如何导致这些侧链位于螺旋的一个面上。带正电残基是黑色括起来的黑色侧链。其它的黑色侧链代表酸性残基。一个脯氨酸残基(用“P”标记的灰色的)位于转角区域分子的最左端。实心黑线表示两个螺旋的二硫键。虚线表示两个芳香族疏水残基相互作用以增加螺旋-转角-螺旋结构稳定性的位置。
这种螺旋-转角-螺旋结构存在于所有的含有相同的半胱氨酸间隔和有螺旋和转角形成倾向的残基的所有MiAMP2同系物中。其它MiAMP2片段序列可被添加到图8所示的球状结构上。整体结构将保持本质上相同但是电荷分布将随所含有的序列的不同而有所不同。在MiAMP2b中，虚线代表一个附加的二硫链而不是疏水作用。实施例9对应于MiAMP2c的基因的cDNA克隆MiAMP2c基因的基因组片段的PCR扩增
使用反向翻译的核苷酸序列，设计简并引物用在带有来自Macadamia的基因组DNA的PCR反应中。引物JPM17序列是5’CAG CAGCAG TAT GAG CAG TG 3’，引物JPM20简并序列为5’TTT TTC GTA(T/T)C(T/G)(G/T)C(T/G)TTC GCA 3’(SEQ ID NOS：12和13)引物JPM17和JPM20用在PCR扩增中，按95℃30秒，50℃1分钟，72℃1分钟进行30次循环。在从琼脂糖凝胶上切割下DNA区带并用Qiagen DNA清除试剂盒纯化之一，与预期的大小接近的PCR产物直接进行测序(Perkin Elmer公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaetion试剂盒)。用此方法，可扩增接近100bp的DNA片段。对这个核苷酸片段的直接测序获得与抗微生物蛋白MiAMP2c的一部分(图4的氨基酸7-39)相对应的核苷酸序列。除外引物序列，按上述方法获得的部分核苷序列为5’TCA GAA GCG CTG CCA ACG GCG CGA GACAGA GCC ACG ACA CAT GCA AAT TTG TCA ACA ACG C 3’(相对应于SEQ IDNO：6中的碱基对264-324)。这个序列可用于多种目的，包括筛选克隆的MiAMP2同系物的cDNA和基因组文库或者设计PCR扩增反应的特定的引物。从Macadamia坚果果仁分离信使RNA
58g的Macadamia坚果果仁在液氮中用杵和臼研成粉末。研磨物中的RNA用硫氰酸胍/氯化铯技术(分子生物学现行实验方法，同上)提纯。用这种方法分离出约5mg的总RNA。用旋转柱RNA纯化试剂盒(Pharmacia)从总RNA中纯化信使RNA。CDNA文库构建
用来自Stratagene的文库试剂盒在λZAP载体中构建cDNA文库。用25mg的信使RNA进行了总共6次反应。第一和第二股cDNA链的合成分别应用MMLV送转录酶和DNA聚合酶I。用pfu DNA聚合酶补平cDNA后，Eco RI接头衔接头与DNA连接。然后用T4多核苷酸激酶激活DNA，随后用Xho I限制性内切酶消化DNA。在此点cDNA物和本试剂盒提供的sephacryl-500柱子根据其大小将其分成各个部分。然后将DNA连接进入ZAP载体。含有连接插入的载体进而包装进入入噬菌体(取自Stratagene的Gigapack且包装)。文库筛选
上面构建的文库进一步接种并且在长在琼脂顶层的XL1-Blue E.Coli菌苔上进行筛选。含有个别克隆的噬菌斑的分离包括：将之移到Hybond N+膜(Amersham Life SCIENCE)上，与放射性标记的上面扩增的基因组DNA片本相杂交，印迹显影，选择阳性克隆以进行下一轮筛选。第二轮和第三轮筛选之后，足可以分离噬菌斑以选择单个克隆。这样得到几个克隆，随后切除掉来自大的λ载体的pBK-CMV载体部分。MiAMP2c cDNA克隆的序列
含有推定的MiAMP2c克隆的载体(pBK-CMV)经过测序以获得克隆的插入物的DNA序列。对对七个克隆进行部分测序，对另外三个克隆进行完全测序(见关于Macadamia克隆DNA序列SEQ ID NOS：2，4和6)。DNA序列的翻译显示了编码高度相似的666个氨基酸的全长克隆。图6显示了与来自可可和棉花豌豆球蛋白种子贮存蛋白基本上相似的蛋白。星表示保守的相同性的位置，点表示保守的相似性的位置。这些蛋白序列的检测揭示了准确的MiAMP2c序列位于克隆了的翻译的蛋白序列的氨基酸位置118～164(见图6)；克隆1和克隆2含有在MiAMP2c序列的总共47个氨基酸中分别有2个或3个残基与MiAMP2c不同的序列。
全长克隆(即克隆1和2)的翻译产物包括从残基1～28的短信号肽，一个从残基29-246的疏水区域，和带有酸性氨基酸伸出物把它们在542-546位置隔开的，从残基246到666伸出的两个片段。
明显地，含有MiAMP2c序列的疏水区，也包含另外三个与MiAMP2(命名为MiAMP2a，b和d)非常相似的片段。这4个片段(发现位于残基28和～246之间)被约4/5的残基是酸性氨基酸(通常是谷氨酸)伸出物所分隔开。这些酸性氨基酸伸出物发生在64-68，111-115，171-174和241-246并表现是切割666残基的前原蛋白成小的功能片段的加工位点(切割位点的酸性伸出物在图6中用粗线表示)。所有这4种MiAMP2样含有半胱氨酸残基的两个双联体的蛋白片段被10-12个残基隔开，因此形成下面的C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C模式，在此X是任意氨基酸，C是半胱氨酸。象上面实施例8所描述的，所有这4个片段可形成螺旋-转角-螺旋基序。很明显，这些位置的半膛氨酸将形成通过把两个螺旋部分结合在一起而稳定蛋白结构的二硫键。
预测的螺旋-转角-螺旋基序可通过几种方式进一步稳定。片段1和3(即，分别是666-残基的Macadamia豌豆球蛋白样蛋白的残基29-63和残基118-170)示例了第一种稳定方式。这些片段通过两个芳香族残基(一个α-螺旋片段上一个)间的疏水环-堆积反应来稳定；这种情况正常是由酪氨酸残基来完成，但苯丙氨酸也可。对于带有半胱氨酸残基的，如果是用来提供螺旋-转角-螺旋结构的稳定性，在α-螺旋片段中，这些芳香族残基就是关键因素。在片段1和3中，芳香族残基是从这里所示的半胱氨酸双联体：Z-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X-X-X-Z上去除的残基2和残基3，双联体中C是半胱氨酸，Z通常是酪氨酸，但也可象片段1中由苯丙氨酸取代。
第二种稳定螺旋-转角-螺旋片段的方式是如片段2(残基71-110)中所见到的用一个附加的二硫键来完成。这可通过放置附加的如这里所示的半胱氨酸双联体：nX-C-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X-X-X-C-nX上去除的半胱氨酸残基2和残基3来完成。这是唯一的关于发明者知道抗微生物蛋白的螺旋-转角-螺旋结构域在哪个部位被三个二硫键所稳定的报道。尽管片段4(残基175-241)不含有外部的二硫键或者疏水环-堆积的稳定作用，它们稳定可能是通过弱离子键和/或氢键相互作用。实施例10 MiAMP2和同系物液体培养表达的载体
设计位于编码MiAMP2c的核苷酸区域两侧的PCR引物含有NdeI和Bam HI内切位点(分别相对应于编码区的5’端和3’端；引物JPM31序列：5’A CAC CAT ATG CGA CAA CGT GAT CC 3’；引物JPM 32序列：3’C GTT GTT TTC TCT ATT CCT AGG GTT G 5’，SEQ ID NOS：14和15)。这些引物被用来扩增MiAMP2c DNA编码区。如此扩增的PCR产物随即用Nde I和Bam HI消化并连接进入带有框架内编码区域的pEt 17b载体(Novagen/studier，F.W.等[1986]分子生物学杂志189：113)以产生载体pET 17-MiAMP2c。
一种与上面相似的方法是用来构建携带编码MiAMP2c同系物(即MiAMP2a，b和d以及TcAMP，和TcAMP2)的编码序列的载体。为构建MiAMP2克隆中的片段a，b和d的表达载体，设计有Nde I和BamHI位点的特定PCR引物以扩增感兴趣的片段。然后用合适的限制性内切酶消化产物并将连接在含有组氨酸标签和Xa因子切割位点的pET16b载体[Nowagen]的Nde I/Bam HI位点(氨基酸序列MGHAH HHHHH HHSSGHIEGR HM SEQ ID NO：16)。pET16b载体表达的蛋白产物是融合的抗微生物蛋白。来自可可的MiAMP2样亚单位的编码序列(图4，TcAMP1和TcAMP2)是从公布的可可豌豆球蛋白基因DNA序列得到的(Spencer，M.E.和Hodge R.[1992]植物186：567-576)。可可豌豆球蛋白基因中的两个MiAMP2样片段位于5’末端(对应于图4所示的残基)，并设计了与想要的编码序列相对应的两套互补的寡核苷酸。对应于每个可可亚单位的互补的寡核苷酸(90～100个碱基)含有一个20bp的重叠并还含有Nde I和BamHI限制性内切酶酶切位点。
对于TcAMP，合成了下面的核苷酸：
TcAMP1正向寡核苷酸
    5′GGGAATTCCA TATGTATGAG CGTGATCCTC
    GACAGCAATA CGAGCAATGC CAGAGGCGAT
    GCGAGTCGGA AGCGACTGAA GAAAGGGAGC 3′；
TcAMP1反向寡核苷酸
    5′GAAGCGACTG AAGAAAGGGA GCAAGAGCAG
    TGTGAACAAC GCTGTGAAAG GGAGTACAAG
    GAGCAGCAGA GACAGCAATA GGGATCCACA C 3′.
对于TcAMP2，使用下列寡核苷酸：
TcAMP2正向寡核苷酸
    5’GGGAATTCCA TATGCTTCAA AGGCAATACC
    AGCAATGTCA AGGGCGTTGT CAAGAGCAAC
    AACAGGGGCA GAGAGAGCAG CAGCAGTGCC
    AGAGAAAATG C 3’；
TcAMP2反向寡核苷酸
    5’GTGTGGATCC CTAGCTCCTA TTTTTTTTGT
    GATTATGGTA ATTCTCGTGC TCGCCTCTCT
    CTTGTTCCTT ATATTGCTCC CAGCATTTTC
    TCTGGCACTG CT 3’.
这些寡核苷酸组合被加到各自的PCR扩增反应中以合成各自的含有想要的编码区的PCR片段。由于起始的PCR扩增产生模糊的区带，原始产物的再扩增采用设计用于扩增可可亚单位整个编码区的新的20mer引物(与以上所示的正向和反向寡核苷酸5’端互补)进行。一旦扩增后，PCR产物就被合适的酶限制性消化并连接入上面提到的载体pET16b中。这一过程同样可用于与MiAMP2c相似的可可片段(图4所示)。实施例11 MiAMP2c和同系物在大肠杆菌中的表达及纯化
用合适的pET构建体(实施例10)转化的大肠杆菌菌株BL21(Groberg，J.[1998]细菌学杂志170：1245)的起始培养物(50ml)被加到500ml的NZCYM培养基中(分子生物学现行实验方法，同上)并培养达到光密度为0.6(600nm)并视所用的载体是pET17b(含有T7启动子)还是pET16b(含有一个组氨酸标签融合和T7启动子/乳糖操纵基因)而添加0.1mM或1.0mM的IPTG加以诱导。细胞在诱导之后，培养物在收集前再培养4小时。在一定的时间间隔取出等份的生长培养物，蛋白提取物在SDS-PAGE凝胶上按照培养中MiAMP2和同系物的表达水平电泳。用组氨酸标签表达的片段(即在pET16b载体中)，通过以5000g，10分钟离心诱导的细胞培养物来收集，细胞沉淀物重新浮并用100mM磷酸钠和10mM Tris，pH 8.0缓冲的6M盐酸胍搅拌1小时以打碎细胞。打碎的细胞悬浮液以10,000g离心20-30分钟来沉淀细胞碎片。将上清液移至干净试管中，并在每一份上清液中加入500mg的Ni-NTA快速流动树脂(Qiagen)。4℃，温和地混合30-60分钟之后，悬浮液被加进小柱，用8M Urea(pH8.0然后pH6.3)冲洗两遍，随后，用8M Urea pH4.5洗脱蛋白。这样得到的蛋白组分基本上是纯的，但进一步用9.3×250mm C2/C18反相柱(Pharmacia)纯化，用梯度为从5％到50％的乙腈(0.1％TFA)以3ml/分的流量(未显示资料)洗脱75分钟。
所有这些MiAMP2c同系物(除外在pET17b中表达的MiAMP2c)在含有组氨酸标签的pET16b载体中表达。尽管MiAMP2c培养物的诱导按上面所提到的方法进行，其余的纯化过程在某种程度上有所不同。在本例中，MiAMP2c表达细胞用离心法收集，但，随后重悬于磷酸缓冲液(100mM，pH7.0，含有10mM EDTA和1mM PMSF)并用French压榨机器打碎。含有MiAMP2c包含体的细胞碎片溶解于6M盐酸胍，10mm MESpH6.0的缓冲液中。在离子去除溶解过程后残留的不溶性碎片之后，获得可溶性成分。然后用含有PMSF(1mM)和EDTA(10mM)的10mM MESph6.0对盐酸胍可溶性物质进行透析。除了在透析后小规模进行之外，按实施例3描述的方法进行了阳离子交换分级分离。随后，从阳离子交换柱洗脱的主要蛋白，即MiAMP2c，进一步按实施例3所描述的进行了反相HPLC纯化。
图9显示了按照用IPTG诱导和随后的表达蛋白的纯化的方法获得的不同纯化阶段的SDS-PAGE凝胶分析。TcAMP1纯化过程中分析的样品如下；泳道1，分子量标记；泳道2，Ni-NTA未结合部分；泳道3，用pH8尿素冲洗Ni-NTA树脂的冲洗液；泳道4，用pH6.3尿素冲洗Ni-NTA树脂的冲洗液；泳道5，用pH4.5尿素的TcAMP1洗脱液；泳道6，用pH4.5尿素的TcAMP1第二次洗脱液，TcAMP2用同样方式进行纯化，并也用反相HPLC对从Ni-NTA树脂洗脱的部分进行进一步纯化。图10所示的是可可亚单位第2号(TcAMP2)的反相纯化。
MiAMP2a，b和d片段纯化的SDS-PAGE凝胶分析见图9的第二部分。泳道中的成分如下：泳道1，分子量标记；泳道2，MiAMP2a预先诱导的细胞提取物；泳道3，MiAMP2a IPIG诱导的细胞提取物；泳道4，MiAMP2a Ni-NTA未结合部分；泳道5，自Ni-NTA洗脱的MiAMP2a；泳道6，MiAMP2b预先诱导的细胞提取物；泳道7，MiAMP2b IPIG诱导的细胞提取物；泳道8，MiAMP2b Ni-NTA未结合部分；泳道9，来自Ni-NTA的MiAMP2b洗脱物；泳道10，MiAMP2d预先诱导的细胞提取液；泳道11，MiAMP2d IPTG诱导的细胞提取物；泳道12，MiAMP2d Ni-NTA未结合部分；泳道13，来自Ni-NTA的MiAMP2d洗脱物。
应用实施例10所描述的载体，MiAMP2c和5个同系物(即，MiAMP2a，MiAMP2b，MiAMP2d，TcAMP1和TcAMP2)都可被表达，纯化及检验其抗微生物活性。上面所采用的方法可用于所有的图4所描述的抗微生物片段。然后可检测纯化的片段对感兴趣的微生物病原体的特定的抑制作用。实施例12用抗MiAMP2c抗体检测其它种中的MiAMP2同系物
根据标准的方法，用与悬浮于弗氏不完全佐剂的白喉类毒素相结合的MiAMP2对家兔进行肌肉内免疫。在给动物增加剂量的MiAMP2佐剂以加强免疫反应之后，定时从动物身上收集血清。大约收集到100ml的血清并将之用于筛选从几种植物种子中获得粗提物。按实施例1的方法研磨100g种子并粗提物。等分的蛋白在DS-PAGE凝胶上分离并将此胶印到硝化纤维素膜上以随后检测与蛋白反应的抗体。此硝化纤维素膜与MiAMP2c家兔第一抗体共同孵育，冲洗，然后再与结合有碱性磷酸酶的羊抗兔IgG共同孵育，以便用化学的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/氮蓝四唑底物系统(Schleicher和Schuell)显色检测抗原区带。图11显示了不同的其它几种与MiAMP2c相似大小的免疫相关蛋白。泳道1～15含有来自如下各种植物的提取物：
1)Stenocarpus sinuatus，2)Stenocarpus sinuatus(1/10loading)，3)Restio tremulus，4)Mesomalaena tetragona，5)Nitraria billardieri，6)Petrophile canescens，7)Synaphaeacutiloba，8)Dryandra formosa 9)Lambertia inernis，10)Stirlingia latifolia，11)Xylomelum anyustifolium，12)Conospermum bracteosum 13)Conospermum triplinernium，14)分子量标记，15)Macacamia integrifolia纯MiAMP2c泳道1～13含有不同的几种，其中有些显示存在与MiAMP2c大小相似的抗原性相关蛋白。其它表现高的分子量的条带代表抗微生物蛋白来源的、大的前体种子贮存蛋白。抗原相关性蛋白可见于泳道1，2，4，6，7，8，9和11-13。
生物测定还可用来自不同的山龙眼科种的粗提物进行。特别地，来自Banksia sobur，Banksia canei，Hakea gibbosa，Stenocarpussinuatus和Stirlingia latifolia的提取物都表现具有抗微生物活性。这种活性可能是来自MiAMP2c同系物，因为这些种与Macadamia相关。实施例13用抗MiAMP2c抗体纯化其它种的MiAMP2c同系物
根据山龙眼科家族的其它种的免疫相关蛋白的检测和粗提物中抗微生物活性的存在，为分离MiAMP2c同系物，选择Stenocarpus sinuatus进行大规模分级分离实验。5Kg S.Sinuatus种子冷冻于液氮并用食物加工机(Big Oscaar Sunbeam)磨碎。磨碎的种子立即置于15L的50mMrH2SO4提取缓中液并在4℃下搅抖提取1小时。然后，将此研浆在10,000g，离心20分钟以去除颗粒物质。用50mM氨水调上清液pH至pH为9。加入PMSF和EDTA，分别使其终浓度为1和10mM。
粗蛋白提取物应用50mM NH4Ac pH9.0平衡的阴离子交换柱(Amberlite IRA-938，Rohm和Hass)(3cm×90cm)，以40ml/分的流连洗脱。收集含有基本蛋白组分的未结合蛋白，用于随后的纯化过程。
用乙酸将基本蛋白组分的pH调至pH为5.5并用预先用25mM醋酸铵平衡过的sp-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱(5cm×60cm)以10ml/分的流速洗脱12小时。然后用pH5.5的25mM乙酸洗柱3.5小时。结合蛋白用线性梯度为25mM到2.0M(pH5.5)的NH4Ac以10ml/分的流速洗脱10小时获得。采用280nm观察洗脱液的吸收率并收集100ml的各个部分(见图12)。
与抗血清起交叉反应的阳离子交换组分(图12，组分14-28)进一步用反相层析法纯经。交叉反应部分加到用90％H2O，10％乙腈和0.1％三氟乙酸(TFA)(＝100％A)平衡的7μm C18反相柱(Brownlee)上。结合蛋白用100％A·到100％B(5％H2O，95％乙腈，0.08％TFA)的线性梯度洗脱、在214nm和280nm监测洗脱蛋白的吸收率。洗脱的蛋白真空干燥后，用水重悬三次以去除样品中残留的TFA。反相蛋白洗脱组分20到61通过混合两个相邻的组分进行分析并进行了Wstern印迹杂交分析(见图13)。洗脱组分22-41显示与抗MiAMP2c抗血清弱阳性反应，洗脱组分42-57显示强阳性反应。层析谱上箭头所指的是对50μg/ml和10μg/ml的核盘菌有抗真菌活性的组分。
应用上面所述的方法，可获得对核真菌、芸苔链格孢、小球腔菌、大丽花轮枝孢、尖镰孢具有抗真菌活性的一种活性组分(命名为SsAMP1和SsAMP2)。生物测定按实施例2所描述的进行，测定结果见实施例15。另外一个与MiAMP2抗血清起反应的片段经纯化并进了测序(SsAMP3)但没有足够的蛋白来表明其具有抗微生物活性的特征。从这些蛋白获得的部分序列见于(SEQ ID NOS：26，27和28)。这些肽的完全测序或克隆编码来自该种的种子贮存蛋白的cDNA将揭示这些肽与MiAMP2一系列同系物之间同源性的程度。实施例14 MiAMP2c小片段的合成
为确定蛋白表现抗微生物活性是否绝对需要全部MiAMP2c分子，Auspep Pty.Ltd.(澳大利亚)化学合成了两个单独的肽。对于每个肽而言，半胱氨酸残基改为苯丙氨酸残在以使两个单独的蛋白链间不再形成二硫键。由于预测到酪氨酸也参与螺旋-转角-螺旋结构的稳定作用并且这在合成的缺少其中一个螺旋的肽中并不需要，因此亦将酪氨酸残基换成丙氨酸。丙氨酸也有利于α-螺旋的形成，因此它不会在很大程度上破坏天然的螺旋结构。肽1包括克隆了的氨基酸序列中从118至139的22个氨基酸(序列：RQRDP QQQAE QAQKP AQRRE TE，SEQUENCE ID NO：9)。肽2是克隆3上从140到164的25个氨基酸(序列：PRHMQ IAQQR AERRA EKEKR KQQKR，SEQ ID NO：10)。肽1和肽2分别称为MiAMP2c pep1和MiAMP2c pep2。这些肽重新悬浮于Milli-Q水并生物测定其对抗一些真菌的活性。如表2所见，肽2对几种真菌有抑制活性而肽1表现一点点或无活性、肽1和肽2的混合物表现与单独用肽2相似的活性水平表明只有肽2有活性。肽2在缺少MiAMP2的螺旋-转角-螺旋结构时表现出抗微生物活性的这一事实揭示：肽保留这种活性并非绝对必需螺旋-转角-螺旋结构。然而，在克分子基础上，肽2并不表现与MiAMP2c(整个片段)相同的活性程度，这表明螺旋-转角-螺旋结构对于参与的片段最大限度地表达抗微生物活性非常重要。还预测到这种螺旋-转角-螺旋结构赋予MiAMP2同系物更大的稳定性，这使得这些蛋白更能耐受蛋白酶剪切和其它形式的降解。稳定性更强可更长时间地保持抗微生物活性。实施例15 MiAMP2c同系物和片段的抗真菌活性
本实施例检测浓度范围在从2到50μg/ml的MiAMP2c和每个不同的MiAMP2同系物抗几种真菌的活性。表1显示了纯MiAMP2c对不同的真菌和细菌的IC50值。表中，“＞”表明最高试验试50μg/ml不能达到50％的真菌抑制率。缩写“ND”表明未进行试验或试验结果无法解释。还在存在1mM Ca2+的试验培养基中检验了MiAMP2c的抗微生物活性，这些试验的IC50值见于表右端的栏内。正如可在图中看到，MiAMP2c的抑制活性在有Ca2+存在时大大降低(尽管未消除)。
 表1观察到50％生长抑制率时MiAMP2c的浓度
             生物     IC50(μg/ml)    IC50+Ca2+(μg/ml)
          向日葵格孢     5-10    未测定
          白假丝酵母     ＞50    ＞50
          奇异长喙壳     20-50    ＞50
           烟草尾孢     5-10    5-10
        密执安棍状杆菌     50    ＞50
         Chalara elegans     2-5    10-20
            尖镰孢     10    20-50
            核盘菌     20-50    ＞50
           隐地疫霉     5-10    10-25
     Phytophthora parasiticanicotiana     10-20    ＞50
         大丽花轮枝孢     5-10    ＞50
     Ralstonia solanacearum     ＞50    ＞50
    丁香假单孢菌烟草致病变种     ＞50    ＞50
           酿酒酵母     20-50    ＞50
         大肠埃希氏菌     ＞50    ＞50
表2所示的是不同的MiAMP2c同系物和片段的抗微生物活性。表中，用了下面的缩写：Ab，brassicola格孢；Cp：奇异长喙壳；Foc：尖镰孢；Lm：maculans小球腔菌；Ss：核盘菌；Vd：大丽花轮枝孢。“＞50”表明未试验高于50μg/ml的浓度，因此未得出IC50值。空格表明未进行试验或其结果无法解释。
用于表2显示的结果的TcAMP1和TcAMP2来源于可可豌豆球蛋白(实施例10和11)。SsAMP1和2表现出与MiAMP2c抗体具有反应性，并且还表现如下表中所见的抗微生物活性。MiAMP2a，b和d的版本及生物测定试验的TcAMP1和TcAMP2都含有载体pET16b中表达产生的组氨酸标签融合。MiAMP2c肽1和2分别是上面实施例14所规定的MiAMP2c抗微生物肽的N末端和C末端区域。为‘MiAMP2c pep1+2’所列浓度值是混合物中每个个别的肽的浓度。应记住的是MiAMP2c pep1和pep2都约是MiAMP2c大小的1/2；因此，这些肽与MiAMP2c蛋白活性的比较应在摩尔基础上而不是严格的μg/ml浓度基础。肽仅仅在不含添加的Ca2+的培养基A中进行试验。
表2抵抗不同真菌的MiAMP2相关蛋白的IC50值(μg/ml)
测试的多肽                     用于生物测定的真菌
   Ab   Cp    Foc     Lm     Ss     Vd
MiAMP2a    5-10     2.5-5     5-10
MiAMP2b    2.5     2.5     5-10
MiAMP2c   20-50    10     20-50   5-10
MiAMP2d    5     2.5     5-10
MiAMP2c pep1    100     ＞50
MiAMP2c pep2    10-20     10-20     50   10-20
MiAMP2cpep1+2    10-25     50
TcAMP1     10    5-10     2-5     10   5-20
TcAMP2   5-10    5-10     2-5     5   5-20
SsAMP1    20-50     20-50     20-50   10-20
SsAMP2  20-50    ＞50     ＞50     ＞50   ＞50
值得注意的是尽管TcAMP1和TcAMP2序列可容易地在公开的数据库中获得，但它们没有抗微生物活性，这些序列来源于参与种子贮存功能的更大的蛋白。发明者因此已描述了关于整保可可豌豆球蛋白分子的一小部分的完全新的活性。其它作者例示了棉花片段1，2和3的活性(chung，R.P.T等[1997]植物科学127：1-16)。实施例16植物转化载体PCV91-MiAMP2c的构建
表达载体pPCV91-MiAMP2c(图14)含有5’端一侧有来自带有四倍重复增强子元件(e-35S)以达到高转录活性(Kay等[1987]科学236：1299-1302)的花椰菜花叶病毒(pCaMV35S)(Odel等[1985]自然313：810-812)的35S RNA的强组成性启动子的MiAMP2c(实施例7)DNA的整个编码区。MiAMP2c DNA编码区的3’端一侧有花椰菜花叶病毒的35SRNA的多聚腺苷酸序列(pA35S)。这个载体的质粒主链是质粒pPCV91(Walden，R.等[1990]分子细胞生物学方法1：175-194)。质粒还含有其它对植物转化有用的元件如nos启动子(pnos驱动的一个氨苄青霉素抗性基因(bla)和一个潮霉素抗性基因(hph)。这些或其它特征可考虑在不同的克隆和转化过程中选择。质粒pPCV91-MiAMP2c构建如下；编码MiAMP2c的克隆片段(实施例7)用限制性内切酶消化以释放含有合成的前导序列的MiAMP2c基因片段。用限制性内切酶Bam HI消化双元载体。所含的MiAMP2c DNA片段和双元载体都用T4 DNA连接酶连接以产生用于植物转化的pPCV91-MiAMP2c双元载体(图12)。
应用这种方法，可在植物中表达MiAMP2c的其它同系物。同系物不仅可以个别地表达，还可以与其它蛋白结合作为融合蛋白或大的前体蛋白的部分而表达。例如，表达含有一个信号肽和带有4个抗微生物片段的疏水区的MiAMP2克隆1的N-末端区域(氨基酸1到～246)是可能的。转基因植物于是被用来检查个别的片段是否由植物细胞中已经丰承的加工机器加工成期望的片段。完整的MiAMP2克隆1(氨基酸1到666)和检查转基因植物中表达的完整的蛋白的加工是可能的。其它序列的同源也可用于与，例如，10个或更多的表达为带有位于每个片段间合适的位置的酸性切割位点的大的融合蛋白的MiAMP2样片段多样结合。象把MiAMP2片段连接在一起一样，将MiAMP2片段与其它有用的蛋白连接以在植物中表达也是可能的。实施例17表达MiAMP2c(或相关片段)的转基因植物
采用选自Van Haute等(欧洲分子生物学组织杂志2：411-417(1983)的Walkerpeach等的方法(植物分子生物学手册B1：1-19[1994]用载体pPCV91-MiAMP2c(实施例16)转化去毒的根瘤农杆菌株GV3101(pMP90RK)(Koncz，Cs.[1986]分子遗传学和普通遗传学204：383-396)。
根据Horsch等的方法(科学227：1229-1231[1985]和含有pPCV91-MiAMP2c的共同培养的菌株用烟草中盘进行烟草转化。在根瘤农杆菌和烟草叶盘共同培养之后，转基因植物(用pPCV91-MiAMP2c转化的)在含有50μg/ml潮霉素和500μg/ml头孢噻肟的培养基中重新生长。用标准的Western印迹杂交技术分析这些转基因植物中新导入基因的表达(图15)。图15所示的是，来自带有实施例16中MiAMP2c构建体的转基因烟草的提取物的Western印迹杂交。泳道1含有作为标准的纯MiAMP2c，泳道2和3含有携带p PCV91-MiAMP2c构建体的转基因植物的提取物。如图中所看到的，在接近正确的分子量的位置可见微弱的条带，这表明转基因植物可表达MiAMP2c蛋白。可选择能够组成性表达引入基因的植物并自身传粉以得到种子。可进一步分析转基因植物的F1代幼苗。实施例18 MiAMP2c同系物
已被试验的MiAMP2c的每个同系物已表现具有一些抗微生物活性。这个证据表明其它同系物也表现有抗微生物活性。这些同系物包括来自1)花生(Burks，A.W.等[1995]临床检查杂志96(4)，1715-1721)，2)玉米(Belanger，F.C.和Kriz，A.L.[1991]遗传学129(3)，863-872)，3)大麦(Heck，G.R.等[1993]分子遗传学和普通遗传学239(1-2)，209-218)，和4)大豆(Sebastiani，F.L.等[1990]植物分子生物学15(1)，197-201)(见SEQ ID NOS：21，22，24和25)。其它来自7S类种子贮存蛋白的序列也可望获得MiAMP2蛋白的同系物。
                  序列表(1)基本信息(i)申请人：
(A)名称：COOPERATIVE RESEARCH CENTRE FORTROPICAL PLANT
(B)街道：The University of Queensland
(C)城市：St Lucia
(E)国家：Australia
(F)邮政编号(Zip)：4067(ii)发明名称：抗微生物蛋白(iii)序列数：28(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征
(A)长度：666个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Ala Ile Asn Thr Ser Asn Leu Cys Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ser1               5                   10                  15Leu Phe Leu Leu Ser Thr Thr Val Ser Leu Ala Glu Ser Glu Phe Asp
        20                  25                  30Arg Gln Glu Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr
    35                  40                  45Ser Gly Gln Met Arg Arg Cys Val Ser Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu
50                  55                  60Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys Tyr Asp Asn Gln Glu Asp Pro Gln Thr65                  70                  75                  80Glu Cys Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys Arg Gln Gln Glu Ser Gly Pro
            85                  90                  95Arg Gln Gln Gln Tyr Cys Gln Arg Arg Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu
        100                 105                 110Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Gln Arg Asp Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln
    115                 120                 125Cys Gln Lys His Cys Gln Arg Arg Glu Thr Glu Pro Arg His Met Gln
130                 135                 140Thr Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Arg Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys145                 150                 155                 160Gln Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Gln Gln Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr
            165                 170                 175Glu Glu Arg Met Lys Glu Glu Asp Asn Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg
        180                 185                 190Glu Tyr Glu Asp Cys Arg Arg Arg Cys Glu Gln Gln Glu Pro Arg Gln
    195                 200                 205Gln His Gln Cys Gln Leu Arg Cys Arg Glu Gln Gln Arg Gln His Gly
210                 215                 220Arg Gly Gly Asp Met Met Asn Pro Gln Arg Gly Gly Ser Gly Arg Tyr225                 230                 235                 240Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gln Ser Asp Asn Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu
           245                  250                 255Arg Ser Leu Ser Thr Arg Phe Arg Thr Glu Glu Gly His Ile Ser Val
        260                 265                 270Leu Glu Asn Phe Tyr Gly Arg Ser Lys Leu Leu Arg Ala Leu Lys Asn
    275                 280                 285Tyr Arg Leu Val Leu Leu Glu Ala Asn Pro Asn Ala Phe Val Leu Pro
290                 295                 300Thr His Leu Asp Ala Asp Ala Ile Leu Leu Val Ile Gly Gly Arg Gly305                 310                 315                 320Ala Leu Lys Met Ile His His Asp Asn Arg Glu Ser Tyr Asn Leu Glu
            325                 330                 335Cys Gly Asp Val Ile Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Phe Tyr Leu Ile
        340                 345                 350Asn Arg Asp Asn Asn Glu Arg Leu His Ile Ala Lys Phe Leu Gln Thr
    355                 360                 365Ile Ser Thr Pro Gly Gln Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Ala Gly Gly Gln
370                 375                 380Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Phe Ser Lys Glu Ile Leu Glu Ala385                 390                 395                 400Ala Leu Asn Thr Gln Thr Glu Lys Leu Arg Gly Val Phe Gly Gln Gln
            405                 410                 415Arg Glu Gly Val Ile Ile Arg Ala Ser Gln Glu Gln Ile Arg Glu Leu
        420                 425                 430Thr Arg Asp Asp Ser Glu Ser Arg His Trp His Ile Arg Arg Gly Gly
    435                 440                 445Glu Ser Ser Arg Gly Pro Tyr Asn Leu Phe Asn Lys Arg Pro Leu Tyr
450                 455                 460Ser Asn Lys Tyr Gly Gln Ala Tyr Glu Val Lys Pro Glu Asp Tyr Arg465                 470                 475                 480Gln Leu Gln Asp Met Asp Leu Ser Val Phe Ile Ala Asn Val Thr Gln
            485                 490                 495Gly Ser Met Met Gly Pro Phe Phe Asn Thr Arg Ser Thr Lys Val Val
        500                 505                 510Val Val Ala Ser Gly Glu Ala Asp Val Glu Met Ala Cys Pro His Leu
    515                 520                 525Ser Gly Arg His Gly Gly Arg Gly Gly Gly Lys Arg His Glu Glu Glu
530                 535                 540Glu Asp Val His Tyr Glu Gln Val Arg Ala Arg Leu Ser Lys Arg Glu545                 550                 555                 560Ala Ile Val Val Leu Ala Gly His Pro Val Val Phe Val Ser Ser Gly
            565                 570                 575Asn Glu Asn Leu Leu Leu Phe Ala Phe Gly Ile Asn Ala Gln Asn Asn
        580                 585                 590His Glu Asn Phe Leu Ala Gly Arg Glu Arg Asn Val Leu Gln Gln Ile
    595                 600                 605Glu Pro Gln Ala Met Glu Leu Ala Phe Ala Ala Pro Arg Lys Glu Val
610                 615                 620Glu Glu Ser Phe Asn Ser Gln Asp Gln Ser Ile Phe Phe Pro Gly Pro625                 630                 635                 640Arg Gln His Gln Gln Gln Ser Pro Arg Ser Thr Lys Gln Gln Gln Pro
            645                 650                 655Leu Val Ser Ile Leu Asp Phe Val Gly Phe
        660                 665(2)关于SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征
(A)长度：2171个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(ix)特征：
(A)名称/关键：sig-肽
(B)位置：1..85(ix)特征：
(A)名称/关键：mat-肽
(B)位置：86..1999(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：ATGGCGATCA ATACATCAAA TTTATGTTCT CTTCTCTTTC TCCTTTCACT CTTCCTTCTG        60TCTACGACAG TGTCTCTTGC TGAAAGTGAA TTTGACAGGC AGGAATATGA GGAGTGCAAA       120CGGCAATGCA TGCAGTTGGA GACATCAGGC CAGATGCGTC GGTGTGTGAG TCAGTGCGAT       180AAGAGATTTG AAGAGGATAT AGATTGGTCT AAGTATGATA ACCAAGAGGA TCCTCAGACG       240GAATGCCAAC AATGCCAGAG GCGATGCAGG CAGCAGGAGA GTGGCCCACG TCAGCAACAA       300TACTGCCAAC GACGCTGCAA GGAAATATGT GAAGAAGAAG AAGAATATAA CCGACAACGT       360GATCCACAGC AGCAATACGA GCAATGTCAG AAGCACTGCC AACGGCGCGA GACAGAGCCA       420CGTCACATGC AAACATGTCA ACAACGCTGC GAGAGGAGAT ATGAAAAGGA GAAACGTAAG       480CAACAAAAGA GATATGAAGA GCAACAACGT GAAGACGAAG AGAAATATGA AGAGCGAATG       540AAGGAAGAAG ATAACAAACG CGATCCACAA CAAAGAGAGT ACGAAGACTG CCGGAGGCGC       600TGCGAACAAC AGGAGCCACG TCAGCAGCAC CAGTGCCAGC TAAGATGCCG AGAGCAGCAG       660AGGCAACACG GCCGAGGTGG CGATATGATG AACCCTCAGA GGGGAGGCAG CGGCAGATAC       720GAGGAGGGAG AAGAGGAGCA AAGCGACAAC CCCTACTACT TCGACGAACG AAGCTTAAGT       780ACAAGGTTCA GGACCGAGGA AGGCCACATC TCAGTTCTGG AGAACTTCTA TGGTAGATCC       840AAGCTTCTAC GCGCACTAAA AAACTATCGC TTGGTGCTCC TCGAGGCTAA CCCCAACGCC       900TTCGTGCTCC CTACCCACTT GGATGCAGAT GCCATTCTCT TGGTCATAGG AGGGAGAGGA       960GCCCTCAAAA TGATCCACCA CGACAACAGA GAATCCTACA ACCTCGAGTG TGGAGACGTA      1020ATCAGAATCC CAGCTGGAAC CACATTCTAC TTAATCAACC GAGACAACAA CGAGAGGCTC      1080CACATAGCCA AGTTCTTACA GACCATATCC ACTCCTGGCC AATACAAGGA ATTCTTCCCA      1140GCTGGAGGCC AAAACCCAGA GCCGTACCTC AGTACCTTCA GCAAAGAGAT TCTCGAGGCT      1200GCGCTCAACA CACAAACAGA GAAGCTGCGT GGGGTGTTTG GACAGCAAAG GGAGGGAGTG      1260ATAATTAGGG CGTCACAGGA GCAGATCAGG GAGTTGACTC GAGATGACTC AGAGTCACGA      1320CACTGGCATA TAAGGAGAGG TGGTGAATCA AGCAGGGGAC CTTACAATCT GTTCAACAAA      1380AGGCCACTGT ACTCCAACAA ATACGGTCAA GCCTACGAAG TCAAACCTGA GGACTACAGG      1440CAACTCCAAG ACATGGACTT ATCGGTTTTC ATAGCCAACG TCACCCAGGG ATCCATGATG      1500GGTCCCTTCT TCAACACTAG GTCTACAAAG GTGGTAGTGG TGGCTAGTGG AGAGGCAGAT      1560GTGGAAATGG CATGCCCTCA CTTGTCGGGA AGACACGGCG GCCGCGGTGG AGGAAAAAGG      1620CATGAGGAGG AAGAGGATGT GCACTATGAG CAGGTTAGAG CACGTTTGTC GAAGAGAGAG      1680GCCATTGTTG TTCTGGCAGG TCATCCCGTC GTCTTCGTTT CATCCGGAAA CGAGAACCTG      1740CTGCTTTTTG CATTTGGAAT CAATGCCCAA AACAACCACG AGAACTTCCT CGCGGGGAGA      1800GAGAGGAACG TGCTGCAGCA GATAGAGCCA CAGGCAATGG AGCTAGCGTT TGCCGCTCCA      1860AGGAAAGAGG TAGAAGAGTC ATTTAACAGC CAGGACCAGT CTATCTTCTT TCCTGGGCCC      1920AGGCAGCACC AGCAACAGTC GCCCCGCTCC ACCAAGCAAC AACAGCCTCT CGTCTCCATT      1980CTGGACTTCG TTGGCTTCTA AAGTTCCACA AAAAAGAGTG TGTTATGTAG TATAGGTTAG      2040TAGCTCCTAG CTCGGTGTAT GAGAGTGGTA AGAGACTAAG ACGCTAAATC CCTAAGTAAC      2100TAACCTGGCG AGCTTGCGTG TATGCAAATA AAGAGGAACA GCTTTCCAAC TTTAAAAAAA      2160AAAAAAAAAA A                                                           2171(2)关于SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征
(A)长度：666个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(ix)特征：
(A)名称/关键：sig-肽
(B)位置：1..28(ix)特征：
(A)名称/关键：mat-肽
(B)位置：29..666(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ala Ile Asn Thr Ser Asn Leu Cys Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ser1               5                   10                  15Leu Phe Leu Leu Ser Thr Thr Val Ser Leu Ala Glu Ser Glu Phe Asp
        20                  25                   30Arg Gln Glu Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr
    35                  40                  45Ser Gly Gln Met Arg Arg Cys Val Ser Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu
50                  55                  60Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys Tyr Asp Asn Gln Asp Asp Pro Gln Thr65                  70                  75                  80Asp Cys Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys Arg Gln Gln Glu Ser Gly Pro
            85                  90                  95Arg Gln Gln Gln Tyr Cys Gln Arg Arg Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu
        100                 105                 110Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Gln Arg Asp Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln
    115                 120                 125Cys Gln Glu Arg Cys Gln Arg His Glu Thr Glu Pro Arg His Met Gln
130                 135                 140Thr Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Arg Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys145                 150                 155                 160Gln Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Gln Gln Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr
            165                 170                 175Glu Glu Arg Met Lys Glu Glu Asp Asn Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg
        180                 185                 190Glu Tyr Glu Asp Cys Arg Arg Arg Cys Glu Gln Gln Glu Pro Arg Gln
    195                 200                 205Gln Tyr Gln Cys Gln Arg Arg Cys Arg Glu Gln Gln Arg Gln His Gly
210                 215                 220Arg Gly Gly Asp Leu Ile Asn Pro Gln Arg Gly Gly Ser Gly Arg Tyr225                 230                 235                 240Glu Glu Gly Glu Glu Lys Gln Ser Asp Asn Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu
            245                 250                 255Arg Ser Leu Ser Thr Arg Phe Arg Thr Glu Glu Gly His Ile Ser Val
        260                 265                 270Leu Glu Asn Phe Tyr Gly Arg Ser Lys Leu Leu Arg Ala Leu Lys Asn
    275                 280                 285Tyr Arg Leu Val Leu Leu Glu Ala Asn Pro Asn Ala Phe Val Leu Pro
290                 295                 300Thr His Leu Asp Ala Asp Ala Ile Leu Leu Val Thr Gly Gly Arg Gly305                 310                 315                 320Ala Leu Lys Met Ile His Arg Asp Asn Arg Glu Ser Tyr Asn Leu Glu
            325                 330                 335Cys Gly Asp Val Ile Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Phe Tyr Leu Ile
        340                 345                 350Asn Arg Asp Asn Asn Glu Arg Leu His Ile Ala Lys Phe Leu Gln Thr
    355                 360                 365Ile Ser Thr Pro Gly Gln Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Ala Gly Gly Gln
370                 375                 380Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Phe Ser Lys Glu Ile Leu Glu Ala385                 390                 395                 400Ala Leu Asn Thr Gln Ala Glu Arg Leu Arg Gly Val Leu Gly Gln Gln
            405                 410                 415Arg Glu Gly Val Ile Ile Ser Ala Ser Gln Glu Gln Ile Arg Glu Leu
        420                 425                 430Thr Arg Asp Asp Ser Glu Ser Arg Arg Trp His Ile Arg Arg Gly Gly
    435                 440                 445Glu Ser Ser Arg Gly Pro Tyr Asn Leu Phe Asn Lys Arg Pro Leu Tyr
450                 455                 460Ser Asn Lys Tyr Gly Gln Ala Tyr Glu Val Lys Pro Glu Asp Tyr Arg465                 470                 475                 480Gln Leu Gln Asp Met Asp Val Ser Val Phe Ile Ala Asn Ile Thr Gln
            485                 490                 495Gly Ser Met Met Gly Pro Phe Phe Asn Thr Arg Ser Thr Lys Val Val
        500                 505                 510Val Val Ala Ser Gly Glu Ala Asp Val Glu Met Ala Cys Pro His Leu
    515                 520                 525Ser Gly Arg His Gly Gly Arg Arg Gly Gly Lys Arg His Glu Glu Glu
530                 535                 540Glu Asp Val His Tyr Glu Gln Val Lys Ala Arg Leu Ser Lys Arg Glu545                 550                 555                 560Ala Ile Val Val Pro Val Gly His Pro Val Val Phe Val Ser Ser Gly
            565                 570                 575Asn Glu Asn Leu Leu Leu Phe Ala Phe Gly Ile Asn Ala Gln Asn Asn
        580                 585                 590His Glu Asn Phe Leu Ala Gly Arg Glu Arg Asn Val Leu Gln Gln Ile
    595                 600                 605Glu Pro Gln Ala Met Glu Leu Ala Phe Ala Ala Pro Arg Lys Glu Val
610                 615                 620Glu Glu Leu Phe Asn Ser Gln Asp Glu Ser Ile Phe Phe Pro Gly Pro625                 630                 635                 640Arg Gln His Gln Gln Gln Ser Ser Arg Ser Thr Lys Gln Gln Gln Pro
            645                 650                 655Leu Val Ser Ile Leu Asp Phe Val Gly Phe
        660                 665(2)关于SEQ ID NO：4的信息：  (i)序列特征
(A)长度：2171个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(ix)特征：
(A)名称/关键：sig-肽
(B)位置：1..86(ix)特征：
(A)名称/关键：mat-肽
(B)位置：87..1999(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATGGCGATCA ATACATCAAA TTTATGTTCT CTTCTCTTTC TCCTTTCCCT CTTCCTTCTG        60TCAACGACAG TGTCTCTTGC TGAAAGTGAA TTTGACAGGC AGGAATATGA GGAGTGCAAA       120CGGCAATGCA TGCAGTTGGA GACATCAGGC CAGATGCGTC GGTGTGTGAG TCAGTGCGAT       180AAGAGATTTG AAGAGGATAT AGATTGGTCT AAGTATGATA ACCAAGACGA TCCTCAGACG       240GATTGCCAAC AATGCCAGAG GCGATGCAGG CAGCAGGAGA GTGGCCCACG TCAGCAACAA       300TACTGCCAAC GACGCTGCAA GGAAATATGT GAAGAAGAAG AAGAATATAA CCGACAACGT       360GATCCACAGC AGCAATACGA GCAATGTCAG GAGCGCTGCC AACGGCACGA GACAGAGCCA       420CGTCACATGC AAACATGTCA ACAACGCTGC GAGAGGAGAT ATGAAAAGGA GAAACGTAAG       480CAACAAAAGA GATATGAAGA GCAACAACGT GAAGACGAAG AGAAATATGA AGAGCGAATG       540AAGGAAGAAG ATAACAAACG CGATCCACAA CAAAGAGAGT ACGAAGACTG CCGGAGGCGC       600TGCGAACAAC AGGAGCCACG TCAGCAGTAC CAGTGCCAGC GAAGATGCCG AGAGCAGCAG       660AGGCAACACG GCCGAGGTGG TGATTTGATT AACCCTCAGA GGGGAGGCAG CGGCAGATAC       720GAGGAGGGAG AAGAGAAGCA AAGCGACAAC CCCTACTACT TCGACGAACG AAGCTTAAGT       780ACAAGGTTCA GGACCGAGGA AGGCCACATC TCAGTTCTGG AGAACTTCTA TGGTAGATCC       840AAGCTTCTAC GCGCACTAAA AAACTATCGC TTGGTGCTCC TCGAGGCTAA CCCCAACGCC       900TTCGTGCTCC CTACCCACTT GGACGCAGAT GCCATTCTCT TGGTCACCGG AGGGAGAGGA       960GCCCTCAAAA TGATCCACCG TGACAACAGA GAATCCTACA ACCTCGAGTG TGGAGACGTA      1020ATCAGAATCC CAGCTGGAAC CACATTCTAC TTAATCAACC GAGACAACAA CGAGAGGCTC      1080CACATAGCCA AGTTCTTACA GACCATATCC ACTCCTGGCC AATACAAGGA ATTCTTCCCA      1140GCTGGAGGCC AAAACCCAGA GCCGTACCTC AGTACCTTCA GCAAAGAGAT TCTCGAGGCT      1200GCGCTCAACA CACAAGCAGA GAGGCTGCGT GGGGTGCTTG GACAGCAAAG GGAGGGAGTG      1260ATAATTAGTG CGTCACAGGA GCAGATCAGG GAGTTGACTC GAGATGACTC AGAGTCACGA      1320CGCTGGCATA TAAGGAGAGG TGGTGAATCA AGCAGGGGAC CTTACAATCT GTTCAACAAA      1380AGGCCACTGT ACTCCAACAA ATACGGTCAA GCCTACGAAG TCAAACCTGA GGACTACAGG      1440CAACTCCAAG ACATGGACGT ATCGGTTTTC ATAGCCAACA TCACCCAGGG ATCCATGATG      1500GGTCCCTTCT TCAACACTAG GTCTACAAAG GTGGTAGTGG TGGCTAGTGG AGAGGCAGAT      1560GTGGAAATGG CATGCCCTCA CTTGTCGGGA AGACACGGCG GCCGCCGTGG AGGGAAAAGG      1620CATGAGGAGG AAGAGGATGT GCACTATGAG CAGGTTAAAG CACGTTTGTC GAAGAGAGAG      1680GCCATTGTTG TTCCGGTAGG TCATCCCGTC GTCTTCGTTT CATCCGGAAA CGAGAACCTG      1740CTGCTTTTTG CATTTGGAAT CAATGCCCAA AACAACCACG AGAACTTCCT CGCGGGGAGA      1800GAGAGGAACG TGCTGCAGCA GATAGAGCCA CAGGCAATGG AGCTAGCGTT TGCCGCTCCA      1860AGGAAAGAGG TAGAAGAGTT ATTTAACAGC CAGGACGAGT CTATCTTCTT TCCTGGGCCC      1920AGGCAGCACC AGCAACAGTC TTCCCGCTCC ACCAAGCAAC AACAGCCTCT CGTCTCCATT      1980CTGGACTTCG TTGGCTTCTA AAGTTCTACA AAAAAGAGTG TGTTATGTAG TATAGGTTAG      2040TAGCTCCTAG CTCGGTGTAT GCGAGTGGTA AGAGACCAAG ACGCTAAATC CCTAAGTAAC      2100TAACCTGGCG AGCTTGCGTG TATGCAAATA AAGAGGAACA GCTTTCCAAC TTTAAAAAAA      2160AAAAAAAAAA A                                                           2171(2)关于SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征
(A)长度：625个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(ix)特征：
(A)名称/关键：部分mat-肽
(B)位置：1..625(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Gln Cys Met Gln Leu Glu Thr Ser Gly Gln Met Arg Arg Cys Val Ser1               5                   10                  15Gln Cys Asp Lys Arg Phe Glu Glu Asp Ile Asp Trp Ser Lys Tyr Asp
        20                  25                  30Asn Gln Glu Asp Pro Gln Thr Glu Cys Gln Gln Cys Gln Arg Arg Cys
    35                  40                  45Arg Gln Gln Glu Ser Asp Pro Arg Gln Gln Gln Tyr Cys Gln Arg Arg
50                  55                  60Cys Lys Glu Ile Cys Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Gln Arg Asp65                  70                  75                  80Pro Gln Gln Gln Tyr Glu Gln Cys Gln Lys Arg Cys Gln Arg Arg Glu
            85                  90                  95Thr Glu Pro Arg His Met Gln Ile Cys Gln Gln Arg Cys Glu Arg Arg
        100                 105                 110Tyr Glu Lys Glu Lys Arg Lys Gln Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Gln Gln
    115                 120                 125Arg Glu Asp Glu Glu Lys Tyr Glu Glu Arg Met Lys Glu Gly Asp Asn
130                 135                 140Lys Arg Asp Pro Gln Gln Arg Glu Tyr Glu Asp Cys Arg Arg His Cys145                 150                 155                 160Glu Gln Gln Glu Pro Arg Leu Gln Tyr Gln Cys Gln Arg Arg Cys Gln165             170                 175                 180Glu Gln Gln Arg Gln His Gly Arg Gly Gly Asp Leu Met Asn Pro Gln
        185                 190                 195Arg Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Glu Glu Gly Glu Glu Lys Gln Ser Asp
    200                 205                 210Asn Pro Tyr Tyr Phe Asp Glu Arg Ser Leu Ser Thr Arg Phe Arg Thr
215                 220                 225Glu Glu Gly His Ile Ser Val Leu Glu Asn Phe Tyr Gly Arg Ser Lys230                 235                 240                 245Leu Leu Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Arg Leu Val Leu Leu Glu Ala Asn
            250                 255                 260Pro Asn Ala Phe Val Leu Pro Thr His Leu Asp Ala Asp Ala Ile Leu
        265                 270                 275Leu Val Ile Gly Gly Arg Gly Ala Leu Lys Met Ile His Arg Asp Asn
    280                 285                 290Arg Glu Ser Tyr Asn Leu Glu Cys Gly Asp Val Ile Arg Ile Pro Ala
295                 300                 305Gly Thr Thr Phe Tyr Leu Ile Asn Arg Asp Asn Asn Glu Arg Leu His310                 315                 320                 325Ile Ala Lys Phe Leu Gln Thr Ile Ser Thr Pro Gly Gln Tyr Lys Glu
            330                 335                 340Phe Phe Pro Ala Gly Gly Gln Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Phe
        345                 350                 355Ser Lys Glu Ile Leu Glu Ala Ala Leu Asn Thr Gln Thr Glu Arg Leu
    360                 365                 370Arg Gly Val Leu Gly Gln Gln Arg Glu Gly Val Ile Ile Arg Ala Ser
375                 380                 385Gln Glu Gln Ile Arg Glu Leu Thr Arg Asp Asp Ser Glu Ser Arg Arg390                 395                 400                 405Trp His Ile Arg Arg Gly Gly Glu Ser Ser Arg Gly Pro Tyr Asn Leu
            410                 415                 420Phe Asn Lys Arg Pro Leu Tyr Ser Asn Lys Tyr Gly Gln Ala Tyr Glu
        425                 430                 435Val Lys Pro Glu Asp Tyr Arg Gln Leu Gln Asp Met Asp Val Ser Val
    440                 445                 450Phe Ile Ala Asn Ile Thr Gln Gly Ser Met Met Gly Pro Phe Phe Asn
455                 460                 470Thr Arg Ser Thr Lys Val Val Val Val Ala Ser Gly Glu Ala Asp Val480                 485                 490                 500Glu Met Ala Cys Pro His Leu Ser Gly Arg His Gly Gly Arg Gly Gly
            505                 510                 515Gly Lys Arg His Glu Glu Glu Glu Glu Val His Tyr Glu Gln Val Arg
        520                 525                 530Ala Arg Leu Ser Lys Arg Glu Ala Ile Val Val Leu Ala Gly His Pro
    535                 540                 545Val Val Phe Val Ser Ser Gly Asn Glu Asn Leu Leu Leu Phe Ala Phe
550                 555                 560Gly Ile Asn Ala Gln Asn Asn His Glu Asn Phe Leu Ala Gly Arg Glu565                 570                 575                 580Arg Asn Val Leu Gln Gln Ile Glu Pro Gln Ala Met Glu Leu Ala Phe
            585                 590                 595Ala Ala Ser Arg Lys Glu Val Glu Glu Leu Phe Asn Ser Gln Asp Glu
        600                 605                 610Ser Ile Phe Phe Pro Gly Pro Arg Gln His Gln Gln Gln Ser Pro Arg
    615                 620                 625Ser Thr Lys Gln Gln Gln Pro Leu Val Ser Ile Leu Asp Phe Val Gly
630                 635                 640Phe(2)关于SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征
(A)长度：2140个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(vi)原始来源：
(A)生物：Macadamia integrifolia
(B)组织类型：种子(ix)特征：
(A)名称/关键：部分mat-肽
(B)位置：1..1875(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CAATGCATGC AGTTAGAGAC ATCAGGCCAG ATGCGTCGGT GTGTGAGTCA GTGCGATAAG        60AGATTTGAAG AGGATATAGA TTGGTCTAAG TATGATAACC AAGAGGATCC TCAGACGGAA       120TGCCAACAAT GCCAGAGGCG ATGCAGGCAG CAGGAGAGTG ACCCACGTCA GCAACAATAC       180TGCCAACGAC GCTGCAAGGA AATATGTGAA GAAGAAGAAG AATATAACCG ACAACGTGAT       240CCACAGCAGC AATACGAGCA ATGTCAGAAG CGCTGCCAAC GGCGCGAGAC AGAGCCACGT       300CACATGCAAA TATGTCAACA ACGCTGCGAG AGGAGATATG AAAAGGAGAA ACGTAAGCAA       360CAAAAGAGAT ATGAAGAGCA ACAACGTGAA GACGAAGAGA AATATGAAGA GCGAATGAAG       420GAAGGAGATA ACAAACGCGA TCCACAACAA AGAGAGTACG AAGACTGCCG GCGGCACTGC       480GAACAACAGG AGCCACGTCT GCAGTACCAG TGCCAGCGAA GATGCCAAGA GCAGCAGAGG       540CAACACGGCC GAGGTGGCGA TTTGATGAAC CCTCAGAGGG GAGGCAGCGG CAGATACGAG       600GAGGGAGAAG AGAAGCAAAG CGACAACCCC TACTACTTCG ACGAACGAAG CTTAAGTACA       660AGGTTCAGGA CCGAGGAAGG CCACATCTCA GTTCTGGAGA ACTTCTATGG TAGATCCAAG       720CTTCTACGCG CACTAAAAAA CTATCGCTTG GTGCTCCTCG AGGCTAACCC CAACGCCTTC       780GTGCTCCCTA CCCACTTGGA TGCAGATGCC ATTCTCTTGG TCATCGGAGG GAGAGGAGCC       840CTCAAAATGA TCCACCGTGA CAACAGAGAA TCCTACAACC TCGAGTGTGG AGACGTAATC       900AGAATCCCAG CTGGAACCAC ATTCTACTTA ATCAACCGAG ACAACAACGA GAGGCTCCAC       960ATAGCCAAGT TCTTACAGAC CATATCCACT CCTGGCCAAT ACAAGGAATT CTTCCCAGCT      1020GGAGGCCAAA ACCCAGAGCC GTACCTCAGT ACCTTCAGCA AAGAGATTCT CGAGGCTGCG      1080CTCAACACAC AAACAGAGAG GCTGCGTGGG GTGCTTGGAC AGCAAAGGGA GGGAGTGATA      1140ATTAGGGCGT CACAGGAGCA GATCAGGGAG TTGACTCGAG ATGACTCAGA GTCACGACGC      1200TGGCATATAA GGAGAGGTGG TGAATCAAGC AGGGGACCTT ACAATCTGTT CAACAAAAGG      1260CCACTGTACT CCAACAAATA CGGTCAAGCC TACGAAGTCA AACCTGAGGA CTACAGGCAA      1320CTCCAAGACA TGGACGTATC AGTTTTCATA GCCAACATCA CCCAGGGATC CATGATGGGT      1380CCCTTCTTCA ACACTAGGTC TACAAAGGTG GTAGTGGTGG CTAGTGGAGA GGCAGATGTG      1440GAAATGGCAT GCCCTCACTT GTCGGGAAGA CACGGCGGCC GCGGTGGAGG GAAAAGGCAT      1500GAGGAGGAAG AGGAGGTGCA CTATGAGCAG GTTAGAGCAC GTTTGTCGAA GAGAGAGGCC      1560ATTGTTGTTC TGGCAGGTCA TCCCGTCGTC TTCGTTTCAT CCGGAAACGA AAACCTGCTG      1620CTTTTTGCAT TTGGAATCAA TGCCCAAAAC AACCACGAGA ACTTCCTCGC GGGGAGAGAG      1680AGGAACGTGC TGCAGCAGAT AGAGCCACAG GCAATGGAGC TAGCGTTTGC CGCTTCAAGG      1740AAAGAGGTAG AAGAGTTATT TAACAGCCAG GACGAGTCTA TCTTCTTTCC TGGGCCCAGG      1800CAGCACCAGC AACAGTCGCC CCGCTCCACC AAGCAACAAC AGCCTCTCGT CTCCATTCTG      1860GACTTCGTTG GCTTCTAAAG TTCTACAAAA AAGAGTGTGT TATGTAGTAT AGGTTAGTAG      1920CTCCTAGCTC GGTGTATGAG AGTGGTAAGA GACTAAGACG CTAAATCCCT AAGTAACTAA      1980CCTGGCGAGC TTGCGTGTAT GCAAATAAAG AGGAACAGCT TTCCAACTTT AGAAAGCTCT      2040TTTTTTTTTT TTTTTTCTTT CTTTTTCTTA AGAAATAAAC GAACGTAGAT TGCGGCTCAA      2100AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA                            2140(2)关于SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征
(A)长度：525个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：可可
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Met Val Ile Ser Lys Ser Pro Phe Ile Val Leu Ile Phe Ser Leu Leu1               5                   10                  15Leu Ser Phe Ala Leu Leu Cys Ser Gly Val Ser Ala Tyr Gly Arg Lys
        20                  25                  30Gln Tyr Glu Arg Asp Pro Arg Gln Gln Tyr Glu Gln Cys Gln Arg Arg
    35                  40                  45Cys Glu Ser Glu Ala Thr Glu Glu Arg Glu Gln Glu Gln Cys Glu Gln
50                  55                  60Arg Cys Glu Arg Glu Tyr Lys Glu Gln Gln Arg Gln Gln Glu Glu Glu65                  70                  75                  80Leu Gln Arg Gln Tyr Gln Gln Cys Gln Gly Arg Cys Gln Glu Gln Gln
            85                  90                  95Gln Gly Gln Arg Glu Gln Gln Gln Cys Gln Arg Lys Cys Trp Glu Gln
        100                 105                 110Tyr Lys Glu Gln Glu Arg Gly Glu His Glu Asn Tyr His Asn His Lys
    115                 120                 125Lys Asn Arg Ser Glu Glu Glu Glu Gly Gln Gln Arg Asn Asn Pro Tyr
130                 135                 140Tyr Phe Pro Lys Arg Arg Ser Phe Gln Thr Arg Phe Arg Asp Glu Glu145                 150                 155                 160Gly Asn Phe Lys Ile Leu Gln Arg Phe Ala Glu Asn Ser Pro Pro Leu
            165                 170                 175Lys Gly Ile Asn Asp Tyr Arg Leu Ala Met Phe Glu Ala Asn Pro Asn
        180                 185                 190Thr Phe Ile Leu Pro His His Cys Asp Ala Glu Ala Ile Tyr Phe Val
    195                 200                 205Thr Asn Gly Lys Gly Thr Ile Thr Phe Val Thr His Glu Asn Lys Glu
210                 215                 220Ser Tyr Asn Val Gln Arg Gly Thr Val Val Ser Val Pro Ala Gly Ser225                 230                 235                 240Thr Val Tyr Val Val Ser Gln Asp Asn Gln Glu Lys Leu Thr Ile Ala
            245                 250                 255Val Leu Ala Leu Pro Val Asn Ser Pro Gly Lys Tyr Glu Leu Phe Phe
        260                 265                 270Pro Ala Gly Asn Asn Lys Pro Glu Ser Tyr Tyr Gly Ala Phe Ser Tyr
    275                 280                 285Glu Val Leu Glu Thr Val Phe Asn Thr Gln Arg Glu Lys Leu Glu Glu
290                 295                 300Ile Leu Glu Glu Gln Arg Gly Gln Lys Arg Gln Gln Gly Gln Gln Gly305                 310                 315                 320Met Phe Arg Lys Ala Lys Pro Glu Gln Ile Arg Ala Ile Ser Gln Gln
            325                 330                 335Ala Thr Ser Pro Arg His Arg Gly Gly Glu Arg Leu Ala Ile Asn Leu
        340                 345                 350Leu Ser Gln Ser Pro Val Tyr Ser Asn Gln Asn Gly Arg Phe Phe Glu
    355                 360                 365Ala Cys Pro Glu Asp Phe Ser Gln Phe Gln Asn Met Asp Val Ala Val
370                 375                 380Ser Ala Phe Lys Leu Asn Gln Gly Ala Ile Phe Val Pro His Tyr Asn385                 390                 395                 400Ser Lys Ala Thr Phe Val Val Phe Val Thr Asp Gly Tyr Gly Tyr Ala
            405                 410                 415Gln Met Ala Cys Pro His Leu Ser Arg Gln Ser Gln Gly Ser Gln Ser
        420                 425                 430Gly Arg Gln Asp Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Ser Glu Glu Glu Thr
    435                 440                 445Phe Gly Glu Phe Gln Gln Val Lys Ala Pro Leu Ser Pro Gly Asp Val
450                 455                 460Phe Val Ala Pro Ala Gly His Ala Val Thr Phe Phe Ala Ser Lys Asp465                 470                 475                 480Gln Pro Leu Asn Ala Val Ala Phe Gly Leu Asn Ala Gln Asn Asn Gln
            485                 490                 495Arg Ile Phe Leu Ala Gly Arg Pro Phe Phe Leu Asn His Lys Gln Asn
        500                 505                 510Thr Asn Val Ile Lys Phe Thr Val Lys Ala Ser Ala Tyr
    515                 520                 525(2)关于SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征
(A)长度：590个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：可可
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Val Arg Asn Lys Ser Ala Cys Val Val Leu Leu Phe Ser Leu Phe1               5                   10                  15Leu Ser Phe Gly Leu Leu Cys Ser Ala Lys Asp Phe Pro Gly Arg Arg
        20                  25                  30Gly Asp Asp Asp Pro Pro Lys Arg Tyr Glu Asp Cys Arg Arg Arg Cys
    35                  40                  45Glu Trp Asp Thr Arg Gly Gln Lys Glu Gln Gln Gln Cys Glu Glu Ser
50                  55                  60Cys Lys Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Asp Gln Gln Gln Arg His Arg Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Pro Gln Arg Arg Tyr Glu Glu Cys Gln Gln Glu Cys Arg Gln
            85                  90                  95Gln Glu Glu Arg Gln Gln Pro Gln Cys Gln Gln Arg Cys Leu Lys Arg
        100                 105                 110Phe Glu Gln Glu Gln Gln Gln Ser Gln Arg Gln Phe Gln Glu Cys Gln
    115                 120                 125Gln His Cys His Gln Gln Glu Gln Arg Pro Glu Lys Lys Gln Gln Cys
130                 135                 140Val Arg Glu Cys Arg Glu Lys Tyr Gln Glu Asn Pro Trp Arg Gly Glu145                 150                 155                 160Arg Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Thr Glu Glu Gly Glu Gln Glu
            165                 170                 175Gln Ser His Asn Pro Phe His Phe His Arg Arg Ser Phe Gln Ser Arg
        180                 185                 190Phe Arg Glu Glu His Gly Asn Phe Arg Val Leu Gln Arg Phe Ala Ser
    195                 200                 205Arg His Pro Ile Leu Arg Gly Ile Asn Glu Phe Arg Leu Ser Ile Leu
210                 215                 220Glu Ala Asn Pro Asn Thr Phe Val Leu Pro His His Cys Asp Ala Glu225                 230                 235                 240Lys Ile Tyr Leu Val Thr Asn Gly Arg Gly Thr Leu Thr Phe Leu Thr
            245                 250                 255His Glu Asn Lys Glu Ser Tyr Asn Ile Val Pro Gly Val Val Val Lys
        260                 265                 270Val Pro Ala Gly Ser Thr Val Tyr Leu Ala Asn Gln Asp Asn Lys Glu
    275                 280                 285Lys Leu Ile Ile Ala Val Leu His Arg Pro Val Asn Asn Pro Gly Gln
290                 295                 300Phe Glu Glu Phe Phe Pro Ala Gly Ser Gln Arg Pro Gln Ser Tyr Leu305                 310                 315                 320Arg Ala Phe Ser Arg Glu Ile Leu Glu Pro Ala Phe Asn Thr Arg Ser
            325                 330                 335Glu Gln Leu Asp Glu Leu Phe Gly Gly Arg Gln Ser Arg Arg Arg Gln
        340                 345                 350Gln Gly Gln Gly Met Phe Arg Lys Ala Ser Gln Glu Gln Ile Arg Ala
    355                 360                 365Leu Ser Gln Glu Ala Thr Ser Pro Arg Glu Lys Ser Gly Glu Arg Phe
370                 375                 380Ala Phe Asn Leu Leu Ser Gln Thr Pro Arg Tyr Ser Asn Gln Asn Gly385                 390                 395                 400Arg Phe Phe Glu Ala Cys Pro Pro Glu Phe Arg Gln Leu Arg Asp Ile
            405                 410                 415Asn Val Thr Val Ser Ala Leu Gln Leu Asn Gln Gly Ser Ile Phe Val
        420                 425                 430Pro His Tyr Asn Ser Lys Ala Thr Phe Val Ile Leu Val Thr Glu Gly
    435                 440                 445Asn Gly Tyr Ala Glu Met Val Ser Pro His Leu Pro Arg Gln Ser Ser
450                 455                 460Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gln Glu Gln Glu465                 470                 475                 480Glu Glu Arg Arg Ser Gly Gln Tyr Arg Lys Ile Arg Ser Arg Leu Ser
            485                 490                 495Arg Gly Asp Ile Phe Val Val Pro Ala Asn Phe Pro Val Thr Phe Val
        500                 505                 510Ala Ser Gln Asn Gln Asn Leu Arg Met Thr Gly Phe Gly Leu Tyr Asn
    515                 520                 525Gln Asn Ile Asn Pro Asp His Asn Gln Arg Ile Phe Val Ala Gly Lys
530                 535                 540Ile Asn His Val Arg Gln Trp Asp Ser Gln Ala Lys Glu Leu Ala Phe545                 550                 555                 560Gly Val Ser Ser Arg Leu Val Asp Glu Ile Phe Asn Ser Asn Pro Gln
            565                 570                 575Glu Ser Tyr Phe Val Sar Arg Gln Arg Gln Arg Ala Ser Glu
        580                 585                 590(2)关于SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Arg Gln Arg Asp Pro Gln Gln Gln Ala Glu Gln Ala Gln Lys Arg Ala1               5                   10                  15Gln Arg Arg Glu Thr Glu
          20(2)关于SEQ ID NO：10的信息：  (i)序列特征
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Pro Arg His Met Gln Ile Ala Gln Gln Arg Ala Glu Arg Arg Ala Glu1               5                   10                  15Lys Glu Lys Arg Lys Gln Gln Lys Arg
           20                  25(2)关于SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Met Ala Trp Phe His Val Ser Val Cys Asn Ala Val Phe Val Val Ile1               5                   10                  15Ile Ile Ile Met Leu Leu Met Phe Val Pro Val Val Arg Gly
          20                  25                  30(2)关于SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：  CAGCAGCAGT ATGAGCAGTG                                              20(2)关于SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TTTTTCGTAK CKKCKTTCGC A                                           21(2)关于SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：ACACCATATG CGACAACGTG ATCC                                       24(2)关于SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型  (ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGTTGTTTTC TCTATTCCTA GGGTTG                                       26(2)关于SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His1               5                   10                  15Ile Glu Gly Arg His Met
          20(2)关于SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征
(A)长度：90个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GGGAATTCCA TATGTATGAG CGTGATCCTC GACAGCAATA CGAGCAATGC CAGAGGCGAT   60GCGAGTCGGA AGCGACTGAA GAAAGGGAGC                                    90(2)关于SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征
(A)长度：91个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：  DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GAAGCGACTG AAGAAAGGGA GCAAGAGCAG TGTGAACAAC GCTGTGAAAG GGAGTACAAG   60  GAGCAGCAGA GACAGCAATA GGGATCCACA C                                  91(2)关于SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征
(A)长度：101个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GGGAATTCCA TATGCTTCAA AGGCAATACC AGCAATGTCA AGGGCGTTGT CAAGAGCAAC   60AACAGGGGCA GAGAGAGCAG CAGCAGTGCC AGAGAAAATG C                      101(2)关于SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征
(A)长度：102个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：GTGTGGATCC CTAGCTCCTA TTTTTTTTGT GATTATGGTA ATTCTCGTGC TCGCCTCTCT  60CTTGTTCCTT ATATTGCTCC CAGCATTTTC TCTGGCACTG CT                    102(2)关于SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征
(A)长度：634个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：花生
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Met Arg Gly Arg Val Ser Pro Leu Met Leu Leu Leu Gly Ile Leu Val1               5                   10                  15Leu Ala Ser Val Ser Ala Thr Gln Ala Lys Ser Pro Tyr Arg Lys Thr
        20                  25                  30Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro
    35                  40                  45Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu
50                  55                  60Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Thr Gly Ala Thr Asn Gln Arg His65                  70                  75                  80Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp
            85                  90                  95Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala
        100                 105                 110Glu Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu
    115                 120                 125Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu
130                 135                 140Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser Glu Val Arg145                 150                 155                 160Glu Glu Thr Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Set Arg Arg Phe165             170                 175                 180Ser Thr Arg Tyr Gly Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Val Leu Gln Arg
        185                 190                 195Phe Asp Gln Arg Ser Lys Gln Phe Gln Asn Leu Gln Asn His Arg Ile
    200                 205                 210Val Gln Ile Glu Ala Arg Pro Asn Thr Leu Val Leu Pro Lys His Ala
215                 220                 225Asp Ala Asp Asn Ile Leu Val Ile Gln Gln Gly Gln Ala Thr Val Thr230                 235                 240                 245Val Ala Asn Gly Asn Asn Arg Lys Ser Phe Asn Leu Asp Glu Gly His
            250                 255                 260Ala Leu Arg Ile Pro Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg His
        265                 270                 275Asp Asn Gln Asn Leu Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr
    280                 285                 290Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe Pro Ala Ser Ser Arg Asp Gln Ser
295                 300                 305Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala Phe Asn310                 315                 320                 325Ala Glu Phe Asn Glu Ile Arg Arg Val Leu Leu Glu Glu Asn Ala Gly
            330                 335                 340Gly Glu Gln Glu Glu Arg Gly Gln Arg Arg Arg Ser Thr Arg Ser Ser
        345                 350                 355Asp Asn Glu Gly Val Ile Val Lys Val Ser Lys Glu His Val Gln Glu
    360                 365                 370Leu Thr Lys His Ala Lys Ser Val Ser Lys Lys Gly Ser Glu Glu Glu
375                 380                 385Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Asp Gly Glu Pro Asp Leu Ser390                 395                 400                 405Asn Asn Phe Gly Arg Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn Pro
            410                 415                 420Gln Leu Gln Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys Val Glu Ile Lys Glu
        425                 430                 435Gly Ala Leu Met Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Met Val Ile Val
    440                 445                 450Val Val Asn Lys Gly Thr Gly Asn Leu Glu Leu Val Ala Val Arg Lys
455                 460                 470Glu Gln Gln Gln Arg Gly Arg Arg Glu Gln Glu Trp Glu Glu Glu Glu480                 485                 490                 500Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Ser Asn Arg Glu Val Arg Arg Tyr Thr
            505                 510                 515Ala Arg Leu Lys Glu Gly Asp Val Phe Ile Met Pro Ala Ala His Pro
        520                 525                 530Val Ala Ile Asn Ala Ser Ser Glu Leu His Leu Leu Gly Phe Gly Ile
    535                 540                 545Asn Ala Glu Asn Asn His Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn
550                 555                 560Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly565                 570                 575                 580Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Leu Ile Lys Asn Gln Arg Glu Ser His
            585                 590                 595Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys
        600                 605                 610Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu Leu Ser
    615                 620                 625Ile Leu Lys Ala Phe Asn
630(2)关于SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征
(A)长度：602个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：玉米
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Met Val Ser Ala Arg Ile Val Val Leu Leu Ala Thr Leu Leu Cys Ala1               5                   10                  15Ala Ala Ala Val Ala Ser Ser Trp Glu Asp Asp Asn His His His His
        20                  25                  30Gly Gly His Lys Ser Gly Gln Cys Val Arg Arg Cys Glu Asp Arg Pro
    35                  40                  45Trp His Gln Arg Pro Arg Cys Leu Glu Gln Cys Arg Glu Glu Glu Arg
50                  55                  60Glu Lys Arg Gln Glu Arg Ser Arg His Glu Ala Asp Asp Arg Ser Gly65                  70                  75                  80Glu Gly Ser Ser Glu Asp Glu Arg Glu Gln Glu Lys Glu Lys Gln Lys
            85                  90                  95Asp Arg Arg Pro Tyr Val Phe Asp Arg Arg Ser Phe Arg Arg Val Val
        100                 105                 110Arg Ser Glu Gln Gly Ser Leu Arg Val Leu Arg Pro Phe Asp Glu Val
    115                 120                 125Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Arg Asp Tyr Arg Val Ala Val Leu Glu
130                 135                 140Ala Asn Pro Arg Ser Phe Val Val Pro Ser His Thr Asp Ala His Cys145                 150                 155                 160Ile Cys Tyr Val Ala Glu Gly Glu Gly Val Val Thr Thr Ile Glu Asn165             170                 175                 180Gly Glu Arg Arg Ser Tyr Thr Ile Lys Gln Gly His Val Phe Val Ala
        185                 190                 195Pro Ala Gly Ala Val Thr Tyr Leu Ala Asn Thr Asp Gly Arg Lys Lys
    200                 205                 210Leu Val Ile Thr Lys Ile Leu His Thr Ile Ser Val Pro Gly Glu Phe
215                 220                 225Gln Phe Phe Phe Gly Pro Gly Gly Arg Asn Pro Glu Ser Phe Leu Ser230                 235                 240                 245Ser Phe Ser Lys Ser Ile Gln Arg Ala Ala Tyr Lys Thr Ser Ser Asp
            250                 255                 260Arg Leu Glu Arg Leu Phe Gly Arg His Gly Gln Asp Lys Gly Ile Ile
        265                 270                 275Val Arg Ala Thr Glu Glu Gln Thr Arg Glu Leu Arg Arg His Ala Ser
    280                 285                 290Glu Gly Gly His Gly Pro His Trp Pro Leu Pro Pro Phe Gly Glu Ser
295                 300                 305Arg Gly Pro Tyr Ser Leu Leu Asp Gln Arg Pro Ser Ile Ala Asn Gln310                 315                 320                 325His Gly Gln Leu Tyr Glu Ala Asp Ala Arg Ser Phe His Asp Leu Ala
            330                 335                 340Glu His Asp Val Ser Val Ser Phe Ala Asn Ile Thr Ala Gly Ser Met
        345                 350                  355Ser Ala Pro Leu Phe Asn Thr Arg Ser Phe Lys Ile Ala Tyr Val Pro
    360                 365                 370Asn Gly Lys Gly Tyr Ala Glu Ile Val Cys Pro His Arg Gln Ser Gln
375                 380                 385Gly Gly Glu Ser Glu Arg Glu Arg Asp Lys Gly Arg Arg Ser Glu Glu390                 395                 400                 405Glu Glu Glu Glu Ser Ser Glu Glu Gln Glu Glu Ala Gly Gln Gly Tyr
            410                 415                 420His Thr Ile Arg Ala Arg Leu Ser Pro Gly Thr Ala Phe Val Val Pro
        425                 430                 435Ala Gly His Pro Phe Val Ala Val Ala Ser Arg Asp Ser Asn Leu Gln
    440                 445                 450Ile Val Cys Phe Glu Val His Ala Asp Arg Asn Glu Lys Val Phe Leu
455                 460                 470Ala Gly Ala Asp Asn Val Leu Gln Lys Leu Asp Arg Val Ala Lys Ala480                 485                 490                 500Leu Ser Phe Ala Ser Lys Ala Glu Glu Val Asp Glu Val Leu Gly Ser
            505                 510                 515Arg Arg Glu Lys Gly Phe Leu Pro Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly His
        520                 525                 530Glu Glu Arg Glu Gln Glu Glu Glu Glu Arg Glu Glu Arg His Gly Gly
    535                 540                 545Arg Gly Glu Arg Glu Arg His Gly Arg Glu Glu Arg Glu Lys Glu Glu
550                 555                 560Glu Arg Glu Gly Arg His Gly Gly Arg Glu Glu Arg Glu Glu Glu Glu565                 570                 575                 580Arg His Gly Arg Gly Arg Arg Glu Glu Val Ala Glu Thr Leu Met Arg
            585                 590                 595Met Val Thr Ala Arg Met
        600(2)关于SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征
(A)长度：33个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：玉米
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Arg Ser Gly Arg Gly Glu Cys Arg Arg Gln Cys Leu Arg Arg His Glu1               5                   10                  15Gly Gln Pro Trp Glu Thr Gln Glu Cys Met Arg Arg Cys Arg Arg Arg
        20                  25                  30Gly(2)关于SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征
(A)长度：657个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：大麦
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Met Ala Thr Arg Ala Lys Ala Thr Ile Pro Leu Leu Phe Leu Leu Gly1               5                   10                  15Thr Ser Leu Leu Phe Ala Ala Ala Val Ser Ala Ser His Asp Asp Glu
        20                  25                  30Asp Asp Arg Arg Gly Gly His Ser Leu Gln Gln Cys Val Gln Arg Cys
    35                  40                  45Arg Gln Glu Arg Pro Arg Tyr Ser His Ala Arg Cys Val Gln Glu Cys
50                  55                  60Arg Asp Asp Gln Gln Gln His Gly Arg His Glu Gln Glu Glu Glu Gln65                  70                  75                  80Gly Arg Gly Arg Gly Trp His Gly Glu Gly Glu Arg Glu Glu Glu His
            85                  90                  95Gly Arg Gly Arg Gly Arg His Gly Glu Gly Glu Arg Glu Glu Glu His
        100                 105                 110Gly Arg Gly Arg Gly Arg His Gly Glu Gly Glu Arg Glu Glu Glu Arg
    115                 120                 125Gly Arg Gly His Gly Arg His Gly Glu Gly Glu Arg Glu Glu Glu Arg
130                 135                 140Gly Arg Gly Arg Gly Arg His Gly Glu Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu145                 150                 155                 160Gly Arg Gly Arg Gly Arg Arg Gly Glu Gly Glu Arg Asp Glu Glu Gln165             170                 175                 180Gly Asp Ser Arg Arg Pro Tyr Val Phe Gly Pro Arg Ser Phe Arg Arg
        185                 190                 195Ile Ile Gln Ser Asp His Gly Phe Val Arg Ala Leu Arg Pro Phe Asp
    200                 205                 210Gln Val Ser Arg Leu Leu Arg Gly Ile Arg Asp Tyr Arg Val Ala Ile
215                 220                 225Met Glu Val Asn Pro Arg Ala Phe Val Val Pro Gly Phe Thr Asp Ala230                 235                 240                 245Asp Gly Val Gly Tyr Val Ala Gln Gly Glu Gly Val Leu Thr Val Ile
            250                 255                 260Glu Asn Gly Glu Lys Arg Ser Tyr Thr Val Lys Glu Gly Asp Val Ile
        265                 270                 275Val Ala Pro Ala Gly Ser Ile Met His Leu Ala Asn Thr Asp Gly Arg
    280                 285                 290Arg Lys Leu Val Ile Ala Lys Ile Leu His Thr Ile Ser Val Pro Gly
295                 300                 305Lys Phe Gln Phe Leu Ser Val Lys Pro Leu Leu Ala Ser Leu Ser Lys310                 315                 320                 325Arg Val Leu Arg Ala Ala Phe Lys Thr Ser Asp Glu Arg Leu Glu Arg
            330                 335                 340Leu Phe Asn Gln Arg Gln Gly Gln Glu Lys Thr Arg Ser Val Ser Ile
        345                 350                 355Val Arg Ala Ser Glu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Arg Arg Glu Ala Ala
    360                 365                 370Glu Gly Gly Gln Gly His Arg Trp Pro Leu Pro Pro Phe Arg Gly Asp
375                 380                 385Ser Arg Asp Thr Phe Asn Leu Leu Glu Gln Arg Pro Lys Ile Ala Asn390                 395                 400                 405Arg His Gly Arg Leu Tyr Glu Ala Asp Ala Arg Ser Phe His Ala Leu
            410                 415                 420Ala Asn Gln Asp Val Arg Val Ala Val Ala Asn Ile Thr Pro Gly Ser
        425                 430                 435Met Thr Ala Pro Tyr Leu Asn Thr Gln Ser Phe Lys Leu Ala Val Val
    440                 445                 450Leu Glu Gly Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Cys Pro His Leu Gly Arg
455                 460                 470Glu Ser Glu Ser Glu Arg Glu His Gly Lys Gly Arg Arg Arg Glu Glu480                 485                 490                 500Glu Glu Asp Asp Gln Arg Gln Gln Arg Arg Arg Gly Ser Glu Ser Glu
            505                 510                 515Ser Glu Glu Glu Glu Glu Gln Gln Arg Tyr Glu Thr Val Arg Ala Arg
        520                 525                 530Val Ser Arg Gly Ser Ala Phe Val Val Pro Pro Gly His Pro Val Val
    535                 540                 545Glu Ile Ser Ser Ser Gln Gly Ser Ser Asn Leu Gln Val Val Cys Phe
550                 555                 560Glu Ile Asn Ala Glu Arg Asn Glu Arg Val Trp Leu Ala Gly Arg Asn565                 570                 575                 580Asn Val Ile Gly Lys Leu Gly Ser Pro Ala Gln Glu Leu Thr Phe Gly
            585                 590                 595Arg Pro Ala Arg Glu Val Gln Glu Val Phe Arg Ala Gln Asp Gln Asp
        600                 605                 610Glu Gly Phe Val Ala Gly Pro Glu Gln Gln Ser Arg Glu Gln Glu Gln
    615                 620                 625Glu Gln Glu Arg His Arg Arg Arg Gly Asp Arg Gly Arg Gly Asp Glu
630                 635                 640Ala Val Glu Thr Phe Leu Arg Met Ala Thr Gly Ala Ile645                 650                 655(2)关于SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征
(A)长度：625个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：大豆(Glycine max)
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Met Met Arg Ala Arg Phe Pro Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Phe Leu1               5                       10              15Ala Ser Val Ser Val Ser Phe Gly Ile Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Asn
        20                      25              30Pro Lys His Asn Lys Cys Leu Gln Ser Cys Asn Ser Glu Arg Asp Ser
    35                      40              45Tyr Arg Asn Gln Ala Cys His Ala Arg Cys Asn Leu Leu Lys Val Glu
50                      55              60Lys Glu Glu Cys Glu Glu Gly Glu Ile Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro65                  70                  75                  80Gln His Pro Glu Arg Glu Pro Gln Gln Pro Gly Glu Lys Glu Glu Asp
            85                  90                  95Glu Asp Glu Gln Pro Arg Pro Ile Pro Phe Pro Arg Pro Gln Pro Arg
        100                 105                 110Gln Glu Glu Glu His Glu Gln Arg Glu Glu Gln Glu Trp Pro Arg Lys
    115                 120                 125Glu Glu Lys Arg Gly Glu Lys Gly Ser Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
130                 135                 140Asp Glu Glu Gln Asp Glu Arg Gln Phe Pro Phe Pro Arg Pro Pro His145                 150                 155                 160Gln Lys Glu Glu Arg Asn Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Gln Gln165             170                 175                 180Arg Glu Ser Glu Glu Ser Glu Asp Ser Glu Leu Arg Arg His Lys Asn
        185                 190                 195Lys Asn Pro Phe Leu Phe Gly Ser Asn Arg Phe Glu Thr Leu Phe Lys
    200                 205                 210Asn Gln Tyr Gly Arg Ile Arg Val Leu Gln Arg Phe Asn Gln Arg Ser
215                 220                 225Pro Gln Leu Gln Asn Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Leu Glu Phe Asn Ser230                 235                 240                 245Lys Pro Asn Thr Leu Leu Leu Pro Asn His Ala Asp Ala Asp Tyr Leu
            250                 255                 260Ile Val Ile Leu Asn Gly Thr Ala Ile Leu Ser Leu Val Asn Asn Asp
        265                 270                 275Asp Arg Asp Ser Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Asp Ala Leu Arg Val Pro
    280                 285                 290Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Val Val Asn Pro Asp Asn Asn Glu Asn Leu
295                 300                 305Arg Leu Ile Thr Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Phe Glu310                 315                 320                 325Ser Phe Phe Leu Ser Ser Thr Glu Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly
            330                 335                 340Phe Ser Arg Asn Ile Leu Glu Ala Ser Tyr Asp Thr Lys Phe Glu Glu
        345                 350                 355Ile Asn Lys Val Leu Phe Ser Arg Glu Glu Gly Gln Gln Gln Gly Glu
    360                 365                 370Gln Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val Glu Ile Ser Lys Glu Gln Ile
375                 380                 385Arg Ala Leu Ser Lys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser390                 395                 400                 405Ser Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asp Pro Ile Tyr Ser
            410                 415                 420Asn Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln
        425                 430                 435Leu Arg Asp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Ile Val Asp Met Asn Glu Gly
    440                 445                 450Ala Leu Leu Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile Leu Val
455                 460                 470Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Leu Lys Glu Gln480                 485                 490                 500Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Glu Gln Pro Leu Glu Val Arg Lys Tyr
            505                 510                 515Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gln Asp Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr
        520                 525                 530Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Phe Ala Ile Gly
    535                 540                 545Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Ser Gln Asp
550                 555                 560Asn Val Ile Ser Gln Ile Pro Ser Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe Pro565                 570                 575                 580Gly Ser Ala Gln Ala Val Glu Lys Leu Leu Lys Asn Gln Arg Glu Ser
            585                 590                 595Tyr Phe Val Asp Ala Gln Pro Lys Lys Lys Glu Glu Gly Asn Lys Gly
        600                 605                 610Arg Lys Gly Pro Leu Ser Ser Ile Leu Arg Ala Phe Tyr
    615                 620                 625(2)关于SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征
(A)长度：23个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Stenocarpus sinuatus
(B)组织类型：种子  (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Val Lys Glu Asp His Gln Phe Glu Thr Arg Gly Glu Ile Leu Glu Cys1               5                   10                  15Tyr Arg Leu Cys Gln Gln Gln
          20(2)关于SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Stenocarpus sinuatus
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Gln Lys His Arg Ser Gln Ile Leu Gly Cys Tyr Leu Xxx cys Gln Gln1               5                   10                  15Leu(2)关于SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征
(A)长度：28个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
(A)生物：Stenocarpus sinuatus
(B)组织类型：种子(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Leu Asp Pro Ile Arg Gln Gln Gln Leu Cys Gln Met Arg Cys Gln Gln1               5                   10                  15Gln Glu Lys Asp Pro Arg Gln Gln Gln Gln Cys Lys
        20                  25

Claims (16)

1.一种具有抗微生物活性的蛋白片段，其中所述蛋白片段选自：
(ii)具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列的多肽：
SEQ ID NO：1的残基29-73
SEQ ID NO：1的残基74-116
SEQ ID NO：1的残基117-185
SEQ ID NO：1的残基186-248
SEQ ID NO：3的残基29-73
SEQ ID NO：3的残基74-116
SEQ ID NO：3的残基117-185
SEQ ID NO：3的残基186-248
SEQ ID NO：5的残基1-32
SEQ ID NO：5的残基33-75
SEQ ID NO：5的残基76-144
SEQ ID NO：5的残基145-210
SEQ ID NO：7的残基34-80
SEQ ID NO：7的残基81-140
SEQ ID NO：8的残基33-79
SEQ ID NO：8的残基80-119
SEQ ID NO：8的残基120-161
SEQ ID NO：21的残基32-91
SEQ ID NO：22的残基25-84
SEQ ID NO：24的残基29-94
SEQ ID NO：25的残基31-85
SEQ ID NO：26的残基1-23
SEQ ID NO：27的残基1-17
SEQ ID NO：28的残基1-28；
(ii)(i)的同系物；
(iii)含有相关半胱氨酸间隔C-2X-C-3X-C-(10-12)X-C-3X-C-3X-C的多肽，其中X是任意氨基酸残基，C是半胱氨酸；
(iv)含有相关半胱氨酸和酪氨酸/苯丙氨酸间隔Z-2X-C-3X-C-(10-12)2X-C-3X-C-3X-Z的多肽，其中X是任意氨基酸残基，C是半胱氨酸，Z是酪氨酸或苯丙氨酸；
(v)含有相关半胱氨酸间隔C-3X-C-(10-12)X-C-3X-C的多肽，其中X是任意氨基酸，C是半胱氨酸；
(vi)具有与(i)中半胱氨酸残基间隔基本上相同的带正电残基的多肽；和
(vii)具有与(i)基本上相同的抗微生物活性的(i)至(vi)中的任意多肽片段。
2.包含根据权利要求1所述的至少一种多肽片段的蛋白，其中所述多肽片段具有选自包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列的序列。
3.具有选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列的蛋白。
4.编码根据权利要求1所述的多肽片段的分离或合成DNA。
5.根据权利要求4所述的DNA，其中所述DNA具有选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列。
6.包含根据权利要求4所述的与用于表达所述编码蛋白的元件可操作性连接的DNA的DNA构建体。
7.带有根据权利要求6所述的DNA构建体的转基因植物。
8.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
9.根据权利要求7所述的转基因植物，所述植物选自玉米、香蕉、花生、紫花豌豆、向日葵、西红柿、canola、烟草、小麦、大麦、燕麦、土豆、大豆、棉花、康乃馨、玫瑰或高梁。
10.根据权利要求7所述的转基因植物的繁殖材料。
11.包含根据权利要求1所述的抗微生物蛋白和农业上可接受的载体稀释剂或赋形剂的组合物。
12.包含根据权利要求1所述的抗微生物蛋白和药学上可接受的载体稀释剂或赋形剂的组合物。
13.控制植物微生物侵染的方法，方法包括：
i)用根据权利要求1所述的抗微生物蛋白或根据权利要求11所述的组合物处理所述植物；或
ii)将根据权利要求6所述的DNA构建体导入所述植物。
14.控制哺乳动物微生物感染的方法，此方法包括用根据权利要求所述的抗微生物蛋白或根据权利要求12所述的组合物治疗所述动物。
15.权利要求14的方法，所述哺乳动物是人。
16.制备抗微生物蛋白的方法，该方法包括如下步骤：
a)获得或设计形成螺旋-转角-螺旋结构的氨基酸序列；
b)置换个别残基以得到与图4所示的1个或多个氨基酸列基本上相同的带正电残基和半胱氨基残基分布。
c)化学合成或通过液体培养中的重组DNA技术合成含有所述氨基酸序列的蛋白；并且
d)如果需要，在所述半胱氨酸残基间形成二硫键。
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