JP2001510995A

JP2001510995A - 抗微生物性タンパク質

Info

Publication number: JP2001510995A
Application number: JP52815198A
Authority: JP
Inventors: マナーズ，ジョン・マイケル; マーカス，ジョン・ポール; グールター，ケネス・クリフォード; グリーン，ジョディ・リン; バウアー，ニール・アイバン
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2001-08-07
Also published as: BR9713772A; EP1006785B1; ATE343927T1; US20020168392A1; DE69736904T2; EP1006785A4; US7067624B2; WO1998027805A1; CA2274730A1; US20030171274A1; NZ336337A; KR20000057699A; EP1006785A1; DE69736904D1; CN1244769A; AUPO427596A0; ES2277363T3

Abstract

(57)【要約】抗微生物性タンパク質の新しい種類を開示する。マカダミアインテグリフォリアおよび他の植物から原型タンパク質が単離されうる。タンパク質をコードしているＤＮＡおよび抗微生物性タンパク質を発現するのに、または植物に抗微生物性タンパク質を誘導するのに用いられるＤＮＡ構築物もまた開示される。抗微生物性タンパク質を含む組成物または抗微生物性タンパク質自体は、微生物の感染に抵抗するために植物または哺乳動物に投与し得る。

Description

【発明の詳細な説明】抗微生物性タンパク質技術分野本発明は、真菌および細菌の成長に阻止活性を及ぼす単離されたタンパク質に関する。真菌および細菌は植物および動物のいくつかの微生物病原菌を含む。本発明はまた、該タンパク質をコードする配列を含む組換え遺伝子に関し、その組換え遺伝子の発現産物は、病原微生物の感染から植物細胞または他の生物細胞を守ることに役立ち得る。本発明はさらに、ヒトおよび家畜の診療における微生物コントロールのためのタンパク質および／またはタンパク質をコードする遺伝子の使用に関する。発明の背景植物の微生物病は農業および園芸産業にとって重要な問題である。植物の病気は一般に年間何百万トンもの作物損失を引き起こし、これら損失の大部分は真菌性および細菌性の病気が原因である。真菌性および細菌性の病気に対処する一つの可能な方法は、病原菌の感染に対する植物の抵抗力を何らかの方法で高めるタンパク質を発現し得る形質転換植物または該タンパク質を提供することである。簡単な戦略は、まずインビトロで抗微生物活性を有するタンパク質を同定し、タンパク質をコードするＤＮＡ配列をクローニング、または合成し、植物におけるタンパク質の有効な発現のためのキメラ遺伝子構築体をつくり、この遣伝子を形質転換植物に転移し、導入された遺伝子の病原微生物に対する抵抗力の効果を対照植物との比較で検査する。上記病気のコントロールのための戦略で最も重要な最初の工程は、強力な抗微生物活性を有するタンパク質を同定することである。近年、抗微生物および／または抗真菌活性を有する多くの様々な植物タンパク質が同定され、記述されてきた。これらのタンパク質は、推定活性形態および／またはアミノ酸配列相同性によっていくつかの種類に分類される。これらの種類には下記のものがある：キチナーゼ（chitinases）（ロバーツ，ダブリュ.ケイ.ら.［１９８６］バイオケム. バイオフィズ.アクタ８８０：１６１−１７０）；β−１,３−グルカナーゼ（β-1,3-glucanases）（マナーズ，ジェイ.ディー.ら.［１９７３］フィトケミストリー１２：５４７−５５３）；チオニン（thionins）（ボルマン，エイチ .ら.［１９８８］イーエムビーオージェイ.７：１５５９−１５６５アンドフェルナンドデカリヤ，アール.ら.［１９７２］アップル.マイクロバイオル.２３：９９８−１０００）；ペルマチン（permatins）（ロバーツ，ダブリュ.ケイ.ら.［１９９０］ジェイ.ジェヌ.マイクロバイオル.１３６：１７７１− １７７８アンドヴィガーズ，エイ，ジェイ.ら.［１９９１］モル.プラント− マイクローブインターアクト.４：３１５−３２３）；リボソーム非活性タンパク質（ribosome-inactivating proteins）（ロバーツ，ダブリュ.ケイ.ら.［１９８６］バイオケム.バイオフィズ.アクタ８８０：１６１−１７０およびレア，アール.ら.［１９９１］ジェイ.バイオル.ケム.２６６：１５６４−１５７３）；植物デフェンシン（plant defensins）（テラス，エフ.アール.ジー.ら.［１９９５］ザプラントセル７：５７３−５８８）；キチン結合タンパク質（chitin binding proteins）（デボーレ，エム.エフ.シー.ら.［１９９２］プラントモル.バイオル.２２：１１８７−１１９０およびヴァンパリジス，ジェイ.ら.［１９９１］プランタ１８３：２５８−２６４）；タウマチン様（thau matin-like）またはオスモチン様（osmotin-like）タンパク質（ヴォロシャク，シー.ピー.ら.［１９９１］ザプラントセル３：６１９−６２８およびヘッジャード，ジェイ.［１９９１］フェブズレッツ.２９１：１２７−１３１）；ＰＲ１型タンパク質（ニダーマン，ティー.ら.［１９９５］プラントフィジオル.１０８：１７−２７）；非特異性脂質転移タンパク質（thenon-specific lip id transfer proteins）（テラス，エフ.アール.ジー.ら.［１９９２］プラントフィジオル.１００：１０５５−１０５８およびモリナ，エイ.ら.［１９９３］フェブズレッツ.３１６６：１１９−１２２）。植物由来の抗微生物性タンパク質の他のクラスはクノチン（knottin）またはクノチン様（knottin-like）タンパク質（カミュ，ビー.ピー.エイ.ら.[１９９２]ジェイ.バイオル.ケム.６７：２２２８−２２３３;ブロエカートダブリュ.エフ.ら.（１９９７）クリット.レヴ.インプラントサイ.１６（３）：２９７−３２３）である。トウモロコシ塩基性タンパク質（ＭＢＰ−１）（デュービック，ジェイ.ピー.ら［１９９２］ジェイ.バイオル.ケム.２６７：１８１１４ −１８１２０）を含むクラスで、４−システインタンパク質と呼ばれる抗微生物性タンパク質のクラスは論文に既に報告されている。これまでに記載された抗微生物性タンパク質のどのクラスにもあたらない新規抗微生物性タンパク質もＭｉＡＭＰ１と名づけられたマカダミアインテグリフォリア（Macadamia integrif olia）の種子から単離された（マルカス，ジェイ.ピー.ら.［１９９７］ユア.ジェイ.バイオケム.２４４：７４３−７４９）。さらに、植物は抗微生物性タンパク質の唯一の源でなく、動物および微生物細胞からの抗微生物性タンパク質の単離に関して多くの報告がある（ガベイ，ジェイ.イー.［１９９４］サイエンス２６４：３７３−３７４および“抗微生物性ペプチド”［１９９４］シーアイビーエイ財団シンポジウム１８６、ジョンウィレイアンドサンズパブル.、チチェスター、ＵＫに概説）。形質転換植物においてインビトロ抗微生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の異所性発現が、病原微生物に対する抵抗力を高めることができるといういくつかの証拠がある。この設計された抵抗力の例には、植物キチナーゼ単独（ブログリー，ケイ.ら.［１９９１］サイエンス２５４：１１９４−１１９７）またはβ−１,３−グルカナーゼとの併用（ファンデンエルゼン，ピー.ジェイ.エム.ら.［１９９３］フィル.トランス.ロイ.ソク.３４２：２７１−２７８）；植物デフェンシン（テラス，エフ.アール.ジー.ら.［１９９５］ザプラントセル７：５７３−５８８）；オスモチン様タンパク質（リュー，ディー.ら. ［１９９４］プロク.ナトル.アカド.サイ.ＵＳＡ９１：１８８８−１８９２）；ＰＲ１型タンパク質（アレクサンダー，ディー.ら.［１９９３］プロク.ナトル. アカド.サイ.ＵＳＡ９０：７３２７−７３３１）およびリボソーム非活性タンパク質（ロジェマン，ジェイ.ら.［１９９２］バイオ／テクノロジー１０：３０５ −３０８）をコードする遺伝子を発現する形質転換植物がある。形質転換植物における病気の抵抗力を設計するための抗微生物性タンパク質の可能と考えられる使用は広範囲に記載されてきたが、言及する価値のある他の適用がある。まず、非常に有効な抗微生物性タンパク質は、直接的適用により植物の病気のコントロールに使用され得る《デボレ，エム.エフ.シー.ら. ［１９９３］植物防御応答機構（Mechanisms of Plant Defence Responses）、ビー.フリティグおよびエム.レグランドエッヅ.、クルーワーアカド.パブル .、ドルドレヒト、エヌエル、ｐｐ.４３３−４３６》。さらに、抗微生物性ペプチドは、ヒトおよび家畜の医薬に潜在的な治療効果を有する。これは植物起源のペプチドに関して記載されていないが、動物からのペプチドで活発に調査されていて、臨床試験まで行った（ジャコブ，エル.およびザスロフ，エム.［１９９４］“抗微生物性ペプチド”、シーアイビーエイ財団シンポジウム１８６、ジョンウィレイアンドサンズパブル.、チチェスター、ＵＫ、ｐｐ１９７−２２３）。抗微生物性タンパク質は、その現す活性の大部分を決定する様々な三次元構造を呈する。これらのタンパク質により呈される球状構造の多くは既に決定されている（ブロエカートダブリュ.エフ.ら.（１９９７）クリット.レヴ.インプラントサイ.１６（３）：２９７−３２３）。これらのタンパク質の安定性を決定する大きな要素はα−ヘリックスおよびβ−シート領域に位置する多くのシステイン間のジスルフィド結合の存在である。コノトキシン（conotoxin）のごとき毒性活性を持つ多くのペプチドはジスルフィド結合により安定化されていることがよく知られる（例えばヒル参照、ジェイ.エム.ら.（１９９６）バイオケミストリー３５（２７）：８８２４−８８３５）。上述のコノトキシンの場合、ヘリックスの小さなヘアピン、シス−ヒドロキシプロリンおよびいくらかのターンから成るコンパクトな構造が形成される。分子は三つのジスルフィド結合により安定化されるが、そのうちの二つはα−ヘリックスおよびβ−シートにつながり、固体構造の核を形成している。興味深いことに、この分子内の８つのアルギニンおよびリジン側鎖は、分子の核に対して放射状方向に溶剤中に突き出している。これらのカチオン側鎖は、病原体の膜上の陰イオン部位との相互作用の電位部位を形成する（ヒル，ジェイ.エム.ら.既出）。本明細書に記載の発明は、以前に発見されなかった新規の抗微生物活性を有するタンパク質を構成する。このタンパク質はマカダミアインテグリフォリア（Ｍｉ）種子またはコットンあるいはココア種子から単離することができる。さらに、抗真菌性のタンパク質断片は、ここで記載されるマカダミア由来の抗微生物性タンパク質と実質上相同の領域を含む巨大種子貯蔵タンパク質から誘導され得る。精製されたタンパク質と似た領域を含む種子貯蔵タンパク質の例は図４参照。マカダミアインテグリフォリアはプロテアケア（Proteaceae）科に属する。マカダミアインテグリフォリアはまた、バウプルナッツ（Bauple Nut）またはクイーンズランドナッツ（Queensland Nut）としても知られ、世界で最高の食用ナッツと考えられている。コットン《ゴシピウムヒアサタム（Gossypium hirsutum）》はマルバケア（Malvaceae）科に属し、その繊維のために大量に耕作されている。ココア《テオブローマカカオ（Threobroma cacao）》はステルクリアカエ（Sterculiaceae）科に属し、様々なココア産物として世界中で用いられている。マカダミアおよびココアの抗微生物性タンパク質が共に、これらの植物の食用部分に見出されるという事実は、これらのタンパク質を発現している形質転換植物が付加的な毒性を示しそうにないがゆえに、病気抵抗のための遺伝子工学上の使用に関してこれらのペプチドを魅力的にする。タンパク質はヒトにとってもおそらく安全であり、獣医学的にも用いられる。発明の概要本発明の第一の態様により、以下のタンパク質断片：（ｉ）配列番号１の２９から７３までの残基配列番号１の７４から１１６までの残基配列番号１の１１７から１８５までの残基配列番号１の１８６から２４８までの残基配列番号３の２９から７３までの残基配列番号３の７４から１１６までの残基配列番号３の１１７から１８５までの残基配列番号３の１８６から２４８までの残基配列番号５の１から３２までの残基配列番号５の３３から７５までの残基配列番号５の７６から１４４までの残基配列番号５の１４５から２１０までの残基配列番号７の３４から８０までの残基配列番号７の８１から１４０までの残基配列番号８の３３から７９までの残基配列番号８の８０から１１９までの残基配列番号８の１２０から１６１までの残基配列番号２１の３２から９１までの残基配列番号２２の２５から８４までの残基配列番号２４の２９から９４までの残基配列番号２５の３１から８５までの残基配列番号２６の１から２３までの残基配列番号２７の１から１７までの残基配列番号２８の１から２８までの残基から選択されるアミノ酸配列を持つポリペプチド；（ｉｉ）（ｉ）の相同物；（ｉｉｉ）Ｃ−２Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−３Ｘ− Ｃ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインである）の相対システイン間隔を含むポリペプチド；（ｉｖ）Ｚ−２Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｚ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインであり、Ｚはチロシンおよびフェニルアラニンである）の相対システインおよびチロシン／フェニルアラニン間隔を含むポリペプチド；（ｖ）Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインである）の相対システイン間隔を含むポリペプチド；（ｖｉ）実質上（ｉ）のシステイン残基の間隔と同一の、正荷電残基の間隔を持つポリペプチド；および（ｖｉｉ）実質上（ｉ）と同一の抗微生物活性を持つ、（ｉ）から（ｖｉ）のうちのいずれか一つであるポリペプチドの断片；から選択される、抗微生物性活性を持つタンパク質断片を提供する。本発明の第二の態様により、該ポリペプチド断片が配列番号１、配列番号３、または配列番号５を含む配列の中から選ばれた配列を持つ第一の態様による、ポリペプチド断片を少なくとも一つ含むタンパク質が提供される。本発明の第三の態様により、配列番号１、配列番号３または配列番号５から選ばれた配列を持つタンパク質が提供される。本発明の第四の態様により、第一の態様によるタンパク質をコードする単離あるいは合成されたＤＮＡが提供される。本発明の第五の態様により、該コードタンパク質の発現のためにエレメントに作用的に結合した、第四態様によるＤＮＡを含むＤＮＡ構築体が提供される。本発明の第六の態様により、第五態様によるＤＮＡ構築体を宿す形質転換植物が提供される。本発明の第七の態様により、第六態様による形質転換植物の再生物が提供される。本発明の第八の態様により、第一態様による抗微生物性タンパク質を農業的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する組成物が提供される。本発明の第九の態様により、第一態様による抗微生物性タンパク質を製薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する組成物が提供される。本発明の第十の実施態様により、（ｉ）第一態様による抗微生物性タンパク質または第八態様の組成物で植物を処置すること、または（ii）第五態様によるＤＮＡ構築体を植物に導入すること、を含む、植物の微生物侵襲をコントロールする方法が提供される。本発明の第十一実施態様により、第一態様による抗微生物性タンパク質または第九態様による組成物で動物を処理することを含む、哺乳動物の微生物侵襲をコントロールする方法が提供される。本発明の第十二の態様により、（ａ）ヘリックス−ターン−ヘリックス構造を形成するアミノ酸配列を得ること、あるいは設計すること；（ｂ）個々の残基を置き換えて、図４に示される１または複数のアミノ酸配列内と実質上同一の、正荷電残基とシステイン残基の分布を得ること；（ｃ）該アミノ酸を含むタンパク質を化学的に、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、液体培地中で合成すること；および、（ｄ）所望により、該システイン残基間のジスルフィド結合を形成すること；の段階を含む、抗微生物性タンパク質の調製法が提供される。本発明の他の態様は、抗微生物性タンパク質をつくる方法を含む。図面の簡単な説明図１は、マカダミアインテグリフォリアから抽出された塩基性タンパク質フラクションのカチオン交換クロマトグラフィーを、ＭｉＡＭＰ２ｃ溶出の範囲のフラクションに見られる抗微生物性活性についてのバイオアッセイの結果とともに示す。図２はカチオン交換分離からのフラクションの並列バイオアッセイでの１ｍＭＣａ²⁺を含む結果を示す。図３は図１および図２のカチオン交換分離からのＭｉＡＭＰ２ｃを含む高い阻止フラクションの逆相のＨＰＬＣグラフをＨＰＬＣフラクションにより呈される％成長阻止と共に示す。図４はＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃ、およびｄと抗微生物性タンパク質のＭｉＡＭＰ２シリーズと相同の領域を含む、他の種子貯蔵タンパク質由来のタンパク質断片のアミノ酸配列を示す。図５は形質転換植物内でのＭｉＡＭＰ２ｃの発現および分泌に用いられる、合成ヌクレオチド配列の例を示す。図６はマカダミアクローンと有意の相同性を呈するココアおよびコットンヴィシリン種子貯蔵タンパク質由来の配列と共にＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃおよびｄを含むマカダミア由来のクローン１−３の配列を示す。図７はＭｉＡＭＰ２ｃの二次構造の一連の予測を表示する。図８はＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質の三次元構造を示す。図９は大腸菌液体培養物内に発現された、ＴｃＡＭＰ１（テオブローマカカオサブユニット１）、ＭｉＡＭＰ２ａ、ＭｉＡＭＰ２ｂ、ＭｉＡＭＰ２ｃおよびＭｉＡＭＰ２ｄの発現と精製の様々な段階でのタンパク質フラクションの、染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１０はＮｉ−ＮＴＡ媒体を用いた初期精製段階後のココアサブユニット２（ＴｃＡＭＰ２）の逆相ＨＰＬＣ精製を示す。図１１はＭｉＡＭＰ２ｃに対するウサギ抗血清をもちいて様々な植物種からの粗タンパク質抽出物のウエスタンブロットを示す。図１２は、ステノカルパスシヌエイタス（Stenocarpus sinuatus）塩基タンパク質フラクションのカチオン交換分別を、一部範囲のフラクションに免疫学的に関係するタンパク質が存在することを示すウエスタンブロットと共に示す。図１３はＭｉＡＭＰ２ｃ抗体と予め反応させたステノカルパスカチオン交換フラクションの逆相ＨＰＬＣ分離を示す（図１４参照）。個々のＨＰＬＣフラクション内で推定のＭｉＡＭＰ２ｃ相同物の存在を明らかにするウエスタンブロットも示されている。図１４は形質転換植物中へこれら抗微生物性タンパク質を発現させるのに用いられうるベクターの例としてのバイナリーベクターｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃの地図である。図１５は形質転換タバコ植物で発現されているＭｉＡＭＰ２ｃを同定するためのウエスタンブロットを示す。発明を実施するための最良の形態および他の態様下記の略号を本明細書で使用する。 EDTA エチレンジアミン四酢酸 IPTG イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド MeCN メチルシアニド（アセトニトリル） Mi マカダミアインテグリフォリア（Macadamia integrifolia）ＭｉＡＭＰ２マカダミアインテグリフォリア抗微生物性タンパク質シリーズ２ Ni-NTA ニッケル−ニトリロ三酢酸クロマトグラフィー媒体 ND 未測定（not determined） PCR ポリメラーゼ連鎖反応 PMSF フェニルメタンスルホニルフルオリド SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 TFA トリフルオロ酢酸相同物という語はここでは組成や配列について、参照として用いられているポリペプチドと実質的な類似性を持つ全ポリペプチドを表すのに用いられる。参照ポリペプチドの相同物は、同一の間隔を持つシステインまたはその他の残基のようなキー要素を含み、そのため、参照と比較して、実質上同様の三次元球状構造をとる。相同物は参照のタンパク質と同じ抗微生物性活性をも呈する。本発明は抗微生物活性を持つ新しいクラスのタンパク質を同定する。プロトタイプとなるタンパク質はマカダミアインテグリフォリアの種子から単離される。そして本発明は、抗微生物性タンパク質自体およびこれらの抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡ配列をも提供する。本発明はマカダミアインテグリフォリア由来の原抗微生物性タンパク質と相同であるタンパク質のアミノ酸配列をも提供する。さらに、マカダミア由来の抗微生物性タンパク質に加えて、本発明は、抗微生物活性を持つと従来考えられていなかった他の種由来の相同物のアミノ酸配列をも提供する。本シリーズの第一の抗微生物性タンパク質はマカダミアインテグリフォリアから直接単離したが、他の抗微生物性タンパク質は、クローニング操作、相同性検索、ついでコードされたタンパク質を液体培地中で発現させ、液体培地から精製した後、抗微生物性検査を経て同定された。このシリーズ由来の第一のタンパク質がマカダミアから精製され、ＭｉＡＭＰ２と名づけられた後、ＭｉＡＭＰを含むプレプロタンパク質をコードするクローンが得られた。いくらかのほとんど同一のクローンにより表されるこの巨大タンパク質（６６６アミノ酸）は、精製された抗微生物性タンパク質断片（ＭｉＡＭＰ２）と明らかな類似性を持つ４つの隣接部を有しており、ＭｉＡＭＰ２自体は、クローン化されたヌクレオチド配列の領域３に存在する；従って、精製された抗微生物性タンパク質はＭｉＡＭＰ２ｃと名づけられる。６６６アミノ酸クローン中に含まれる他の断片は、クローン化されたヌクレオチド配列中のそれらの位置によりＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、およびｄと名づけられる。ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃ、およびｄタンパク質断片と明らかな相同性を持ついくらかの他の配列はエントレッツデータベース（Entrez dat a base）で同定した。コットンやココア由来の、その配列が抗微生物性タンパク質配列含むあるいは抗微生物性活性を示すとは以前には記されなかった、巨大種子保存タンパク質中にこれらの相同配列は含まれていた。ここで、ＭｉＡＭＰ２ｃと相同の配列を含む巨大種子貯蔵タンパク質の断片を検査し、抗微生物活性を示すと示された。こうして発明者らは、巨大種子貯蔵タンパク質から抗微生物性タンパク質断片を得る方法を確立した。これらの発見から、記述されたタンパク質と類似の配列を含む他の種子貯蔵タンパク質の断片も抗微生物性活性を示すであろうことは明らかである。特に、４７アミノ酸ＴｃＡＭＰ１（テオブローマカカオ抗微生物性タンパク質１）および６０アミノ酸ＴｃＡＭＰ２配列はココアヴィシリン（vicilin）種子貯蔵タンパク質遺伝子配列（５２５アミノ酸を含む）から誘導された（スペンサー、エム．イー．とホッジアール．［１９９２］プランタ１８６：５６７ −５７６）。これらの誘導された断片はそれから液体培養物内に発現した。こうして発現され、また続いて精製された（実施例１０および１１）ココアヴィシリン断片は抗微生物性であることが示された（実施例１５）。これはココアヴィシリンタンパク質の断片が抗微生物性活性を有することの最初の報告である。ＭｉＡＭＰ２ｃと相同な断片を含む、コットンヴィシリン種子貯蔵タンパク質から明らかに得られた配列のプールは抗微生物性活性を有することが示されている（チャン、アール．ピー．ティー．ら．［１９９７］プラントサイエンス１２７：１−１６）。この発見はこの出願で明らかにされている配列中に明らかに具体化されている。ココア−ヴィシリン誘導断片が抗微生物性活性を示すことの明示に加えて、ここでは抗微生物性活性を示すさらなるタンパク質が記述される。例えば、ステノカルパスシヌエイタス（Stenocarpus sinuatus）由来の、ＭｉＡＭＰ２サブユニットと同じ大きさでＭｉＡＭＰ２ｃ抗血清と反応し、ＭｉＡＭＰ２タンパク質と相同の配列を含むタンパク質を以下に記述する（図４参照）。ここに示した証拠事実に基づいて、ＭｉＡＭＰ２ｃサブユニット（即ち、ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｄ：ＴｃＡＭＰ１；ＴｃＡＭＰ２；およびコットン断片１，２および３−図４参照）と相同の配列は抗微生物性活性を持つ断片を含むタンパク質を構成する。マカダミア由来のＭｉＡＭＰ２断片および、ココア由来のＴｃＡＭＰ１および２断片の抗微生物性活性は以下に例証されている。アール．ピー．ティー．チャンら．（プラントサイエンス１２７：１−１６［１９９７］）はコットン断片が抗微生物性活性を示すことを表らかにした。他の抗微生物性タンパク質はピーナッツアレルゲン（peanut allergen）Ａｒａｈ（バークス，エー．ダブリュら．［１９９５］ジー，クリン．インベスト．９６（４），１７１５−１７２１）、トウモロコシのグロブリン（maize globulin）（ベランガー，エフ．シー．とクリズ，エイ．エル．［1９９１］ジェネティクス１２９（３）８６３−８７２）、ダイズのグロブリン（ヘック，ジー．アール．ら［１９９３］モル．ジェヌ．ジェネット．２３９（１−２），２０９−２１８）、およびソラマメコングリシニン（soybean conglycinin）（セバスチアニ，エフ．エル．ら．［１９９０］プラントモル．バイオル．１５（１）１９７−２０１）のごとき種子貯蔵タンパク質から誘導され、それら全ては抗微生物性活性を示すとここで示されている配列の中に存在する同じ重要要素を含む。ＭｉＡＭＰ２と相同の配列領域を含むタンパク質（図４参照）は、１）巨大タンパク質の活性断片、または２）多数の抗微生物性断片の融合物をコードするヌクレオチド配列を設計するのに用いられ得る。これは標準のコドン表やカレントプロトコルインモレキュラーバイオロジー（１９８７−１９９５年著作権保護、オースベルエフ．エム．らにより編集、ジョンウィレイ＆ソンズ，インク．により出版、合衆国で印刷）のごとき実験マニュアルに記述されているクローニング法を用いてなされる。続いて、これらは精製と検査のために液体培養物で発現し、または配列を適当な発現ベクターに組み込んだ後、形質転換植物の中で発現すればよい。抗微生物性タンパク質自体は、Ｘ線結晶または核磁気共鳴を用いて測定され得る特定の三次元構造を表す。この構造はタンパク質の抗微生物性活性に大きく影響するであろう。タンパク質の配列は、どの二次構造要素がタンパク質により提示されるかを評価する構造予測アルゴリズムをも供し得る（実施例８および図７参照）。こうして予測された二次元構造は、次いで、三次元の球状構造を設計するのに使用され得る。三次元構造の予測はほとんどのタンパク質で実行可能というわけではないが、ＭｉＡＭＰ２ｃの二次構造の予測がとても簡単で明確であったため、三次元のモデル構造はＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質の関しては得られた。同じシステイン間隔と他の重要要素を呈する相同物もまた、同様の三次元構造をとる。実施例８は、ＭｉＡＭＰ２ｃ（および相同物）がもっともとりそうな構造が、二つの逆平行のα−ヘリックス部分（図８参照）をつなぐ少なくとも二つのジスルフィド架橋により安定化されるヘリックス−ターン−ヘリックス構造であることを示す。付加的な安定化は、追加のジスルフィド架橋（例えばＭｉＡＭＰ２ｂにおけるごとき）や、上述の２ジスルフィド結合に関与するシステイン残基が常態で存在するαヘリックス部位の同じ表側におのおのが位置するチロシンおよび／またはフェニルアラニン残基（例えばＭｉＡＭＰ２ａやＭｉＡＭＰ２ｃ）間の疎水性リング−スタッキング相互作用により提供される。ＭｉＡＭＰ２ｃにより提示されるＮＭＲシグナルは上述の二次構造予測から作成された三次元球状モデルと一致する。当業者は構造既知のタンパク質を取り扱い、意味のあるように配列を変え、それでいて全三次元構造およびタンパク質の抗微生物活性を保持し得るということが認識されるであろう。構造（つまりそれゆえタンパク質の活性）にひどく影響を与えることなしには変えられない構造の一側面はシステイン残基の容量と間隔であるが、なぜならこれが、ａ）タンパク質の全構造を保持する、および／または、ｂ）タンパク質を変性やタンパク質分解に対してより耐性のあるものにする（タンパク質構造の安定化）のに不可欠なジスルフィド結合の形成を崩すためである。とりわけ、システイン残基が、その含まれているヘリックスの一表面に存することは重要である。これはおのおののヘリックス内のシステイン残基間の三残基間隔を保持することにより、最もよく成し遂げられるが、他のヘリックス領域のシステインが３塩基により分離される場合には《例えば、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−ｎＸ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ（Ｃがシステインであり、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、ｎは二つのαヘリックス領域間のターンを形成する残基の数である）》システイン残基間の２塩基間隔でも成し遂げられる。。芳香族チロシン（あるいはフェニルアラニン）残基も、システイン側鎖と同じヘリックス表側に存在していればタンパク質構造の安定性を付与するのに働きうる。これは芳香族残基とその直前のシステイン残基の間の二または三残基の適度な間隔を提供することにより逐行される《例えば、Ｚ− Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−ｎＸ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｚ（Ｃがシステインであり、Ｘが全アミノ酸であり、ｎが二つのαヘリックス領域間のターンを形成する残基の数である）》。タンパク質の様々な表面上の正（および負）電荷の分布もまた、タンパク質の構造および活性を決定するのに重要な役割を果たす。特に、タンパク質のαヘリックス領域における正荷電残基の分布の結果、ヘリックスの一表面上が正荷電を帯びるか、分子の特定の部位に電荷を帯びた残基に凝集することになりうる。正荷電残基の、それに代わる分布は、それらがタンパク質の核に対して放射状方向に溶媒中に突き出しているものである。この配向はＭｉＡＭＰ２相同物のいくらかについて予測される（データは示されていない）。ヘリックスの一表面に残基を位置付けるのに要される間隔や、核からの放射状配向を遂行するのに必要とされる間隔は、目的の配列を用いたヘリカルウィールプロット（ｈｅｌｉｃａｌｗｈｅｅｌｐｌｏｔ）を用いてその分野の技術者により容易に決定され得る。ヘリカルウィールプロットは、αヘリックス内ではヘリックスのおのおのの回転は平均して３．６残基から成るという事実を用いる。この数を一残基あたり１００°の回転の移動に翻訳すると、ヘリックス領域における側鎖の分布を示すプロットを構築することが可能になる。図８は帯電した残基の間隔がどのように正荷電を帯びた側鎖のほとんどをヘリックスの一側面上に位置させるよう導き得るかを示す。正荷電はアルギニンおよびリジン残基により授与されることは、当業者により認識されている。タンパク質がヘリックス−ターン−ヘリックス構造に発展するために、αヘリックス形成を促し、アミノ酸配列の中央でターン構造を促しもする（およびターン領域でヘリックス構造とならない）特別な残基を持つことも必要である。これは多くのＭｉＡＭＰ２相同物に関して見られるように、ターン箇所の中央の１個または複数のプロリン残基により逐行され得る。プロリンが存在しないとき、連続的なヘリックス構造を崩し、この部分でのターンの形成を誘導するのにグリシンもまた一助となる。一つのケースでは（例えばＴｃＡＭＰ１）、セリンがこの役割を持ち得ることが明らかである。タンパク質のこの領域の残基は通常、ターン構造の形成を助けることが認識されるであろう；この要求を満たす残基はプロリン、グリシン、セリン、およびアスパラギン酸を含む；しかし他の残基もまた許容される。ここで報告されているＤＮＡ配列は他の種から相同の遺伝子を得るのに用いられ得る強力な道具である。その分野の通常の技術者はＤＮＡ配列を用いて、ここで述べたものと相同の抗微生物タンパク質をコードしている遺伝子の存在を他の植物種からのｃＤＮＡライブラリーから探すのに用いられるオリゴヌクレオチドプローブを設計し、合成することができる。これは、ｃＤＮＡライブラリーの構築およびそれに続くここで報告された配列の一つあるいはその一部（配列番号２あるいは実施例９に記載されるＰＣＲ断片など）をオリゴヌクレオチドプローブとして用いたライブラリーのスクリーニングを単に含む。ＭｉＡＭＰ２と相同のタンパク質をコードしている他のオリゴヌクレオチド配列もこの目的のために用いられ得る（例えばコットンおよびココアヴィシリンに対応するＤＮＡ配列等）。ｃＤＮＡライブラリーの作成およびスクリーニングは該目的のためにキットを（例えばストラタジーンより）購入すること、または入手できるＤＮＡクローニングマニュアルに記述されているよく確立されたプロトコル（カレントプロトコルインモレキュラーバイオロジー既出参照）に従って遂行され得る。多くの種のライブラリーを構築すること、このようなライブラリーを調べるために単純なＤＮＡハイブリダイゼイション技術を用いて、マカダミア、コットン、またはココアヴィシリンに類似したヴィシリン相同物を特別に単離することは比較的、簡単である。一度クローン化されたら、これらヴィシリン関連配列はＭｉＡＭＰ２様サブユニットの存在を検証され得る。このようなサブユニットは、実施例１０および１１に記載されている系を用いて大腸菌の中で容易に発現され得る。続いてこれらのタンパク質は形質転換動植物中でも発現され得る。構造および誘導プロモーターの制御下で、遺伝子やその断片は、それによりコードされているタンパク質の発現を許容する生物組織中にクローン化され得る。様々な系の中でタンパク質が発現されるのを許容する形質転換法が知られている。次いでさらなる利用のためにタンパク質を作製することを目的としたどのような適切な系内でもタンパク質を発現させ得る。タンパク質の発現に適した宿主は、大腸菌、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、および植物を含む。このような宿主の中でタンパク質を発現する標準的な方法はカレントプロトコルズインモレキュラーバイオロジー（既出）のセクション１６（タンパク質発現）を含む様々なテキストに記述されている。様々な既知の方法（アグロバクテリウム、Ｔｉプラスミド、エレクトロポーレイション、マイクロ−インジェクション、マイクロ−プロジェクタイルガン、など）により、本発明のＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換させ得る。他の相同物をコードしているＤＮＡ同様、マカダミアインテグリフォリア抗微生物性タンパク質サブユニットをコードしているＤＮＡ配列（即ちＭｉＡＭＰ２クローンからの断片ａ、ｂ、ｃ、またはｄ）は、そこから成熟したタンパク質が作製される前駆タンパク質をコードしているＤＮＡ配列と共に用いられ得る。このタンパク質は、タンパク質を特定の細胞区画（例えば、アポプラストまたは液胞）に向かわせる、天然の、あるいは合成のシグナルペプチド配列を含みうる。これらのコード配列を植物細胞における強い発現を確保する植物プロモーター配列につなぎ得る。このプロモーター配列はほとんどまたは全ての植物細胞で、強くて連続的なタンパク質の発現を確実にするものであってもよいが、微生物の感染を受けやすい特定組織や細胞における発現を確実にするプロモーターであっても、感染過程において発現を強く誘導を確実するプロモーターであってもよい。遺伝子カセットのこれらの型は、抗微生物性タンパク質をコードするｍＲＮＡの効果的な作製と安定化を確実にするよう抗微生物性タンパク質の３’に転写終結、およびポリアデニル化配列も含む。ここに記載されている抗微生物性タンパク質の効果的な発現は、一または複数の活性ＭｉＡＭＰ２様断片を生み出すよう、インプランタでプロセシングされるよりもっと大きなタンパク質をコードしている配列中にそれら個々のＤＮＡ配列を含ませることにより容易になりうる。ＭｉＡＭＰ２関連の抗微生物性タンパク質（即ち、ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃ、またはｄ；または全サブユニットをあわせたもの；または全ＭｉＡＭＰ２クローン）または上述のＭｉＡＭＰ２タンパク質の相同物をコードしている遺伝子カセットは次いで、二つの共通の方法を用いて植物細胞内に発現されうる。まず、遺伝子カセットは、ｉ）アグロバクテイリウムテュームファシエンス（Agrobact erium tumefaciens）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに離接する左右縁端配列；ｉｉ）抗生物質耐性植物細胞の選択のための適切な選択マーカー遺伝子；ｉｉｉ）Ａ．テュームファシエンス（A．tumefaciens）大腸菌（Escherichia coli）で機能する複製拠点；およびｉｖ）Ａ．テュームファシエンスおよび大腸菌（E．col i）のプラスミド運搬タンパク質の選択を許容する抗生物質耐性遺伝子：を有するバイナリーベクターにつながれ得る。キメラＭｉＡＭＰ２遺伝子をコードするこのバイナリーベクターは、株ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、およびＧＧＬ１株のごとき安全化されたＴｉプラスミドを有するＡ．テュームファシエンス株中、またはＡ４またはＮＣＣＰ１８８５のごときＡ．リゾジーンズ（rhizogenes）株に、エレクトロポーレイションまたはトリペアレンタルメイティング（trip arental mating）のどちらかにより導入され得る。これらのアグロバクテリウム株は適切な植物エクスプラントあるいは無傷の植物組織および抗生物質耐性を用いて選択された形質転換植物および／または再生剤とともに共培養される。植物に対する遺伝子移送の次なる方法は、目的植物細胞内での遺伝子の直接導入により成し遂げられる。例えば、ＭｉＡＭＰ２コード遺伝子カセットを、植物の抗生物質耐性のためのキメラ遺伝子をコードするプラスミドと共に金またはタングステン上に沈殿させ得る。タングステン粒子は高速のヘリウムガス流を用いて加速され、その粒子は適切な植物組織を砲撃することを許容される。これは胚発生の細胞培養組織、植物エクスプラント、カルス組織または細胞懸濁または無傷分裂組織でありうる。植物は、選択のための抗生物耐性遺伝子およびＭｉＡＭＰ２タンパク質または関連断片を発現している植物細胞を同定するのに用いられる抗体を用いて回収され得る。ＭｉＡＭＰ２タンパク質の形質転換植物における発現はタンパク質に対する抗体を用いるか、抗微生物性バイオアッセイを用いて検出されうる。植物におけるＭｉＡＭＰ２タンパク質およびその断片の発現のためのこれらおよび他の関連方法はプラントモレキュラーバイオロジー（セカンドエド.，ゲルビン，エス.ビー.およびシルペルールト，アール.エイ.により編集、１９９４年、オランダドルドレヒトのクルーワーアカデミック出版社により出版）に記述されている。単子葉および双子葉植物の両方を形質転換し、再生し得る。遺伝子的に変更された植物の例はトウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウ、ヒマワリ、トマト、カノーラ（canola）、タバコ、コムギ、オオムギ、ポテト、ソラマメ、コットン、カーネーション、バラ、サトウモロコシを含む。他の農植物と同様、これらは抗微生物性遺伝子とともに形質転換して病原体の攻撃に対して強い抵抗力を示すようにできる。または、タンパク質は局所への適用による病気のコントロールに用いられる。本発明はヒトを含む哺乳動物の病原体の制御に関する抗微生物性タンパク質の適用にも関する。タンパク質は微生物の感染の制御に関して、局所投与か、静脈内投与かのどちらかで用い得る。第十態様の記述で指摘されているように、本発明の範囲は原ＭｉＡＭＰ２関連タンパク質に基づく抗微生物性タンパク質の調製法を含む。ＭｉＡＭＰ２タンパク質に見出されるごときシステイン残基に関して、正荷電残基の分布を実質上保持する新たな配列がＭｉＡＭＰ２アミノ酸配列から設計され得る。新しい配列は合成されるか、または適切な宿主細胞内で配列をコードしている遺伝子から発現され得る。この手法に関する適切な方法は上述されている。遺伝的に工作された細胞内での新しいタンパク質の発現はシステイン残基間に正確に形成されたジスルフィド結合を含む、正確な三次元構造を持つ産物を典型的に生む。しかし、たとえタンパク質が化学的に合成されても、その分野で、不必要なジスルフィド架橋を壊し、望まれるシステイン残基間での架橋を形成して必要な所望の三次元構造を得る、タンパク質の更なるプロセシング方法は公知である。マカダミアインテグリフォリア抗微生物性タンパク質シリーズ２上述したように、強力な抗微生物性タンパク質の新しいクラスをマカダミアインテグリフォリアから同定した。そのタンパク質は各々が抗微生物活性を示すより小さなサブユニットになる、一つの大きなプレプロプロテイン上に全て見出されるために、ひとまとめにして抗微生物性タンパク質のＭｉＡＭＰシリーズ（またはＭｉＡＭＰ２タンパク質）と呼ばれ、マカダミアインテグリフォリアから単離される抗微生物性タンパク質の第二のクラスを表す。シリーズの各々のタンパク質断片は特徴的なＰＩ値を持つ。図４に示されるように、ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃ、およびｄサブユニットは各々４．４、４．６、１１．５、および１１．６の推定ＰＩ値を持ち（Ｈｉｓ標識を持たない未処理の配列データ、又はベクターＰＥＴ１６ｂ内の断片の発現と関係する分裂配列を用いて予測される）、ジスルフィド結合の形成を通してタンパク質の三次元構造を安定化するのに重要な２セットのＣＸＸＸＣモチーフを含む。加えてタンパク質は、上および実施例８に記載されているような、ヘリックス−ターン−ヘリックス構造にもっと安定性を与えるであろう位置に位置する芳香族（チロシン／フェニルアラニン）残基の更なるセット、あるいは、システイン残基の更なるセットかのどちらかを含む。ＭｉＡＭＰ２シリーズのタンパク質のアミノ酸配列は、ブラストプアルゴリズム（アルトシュル，エス.エフ.ら［１９９０］ジェイ.モル.バイオル.２１５：４０３）を用いて探索された配列データベース（スイスプロットおよびノン −リダンダント−データベース）上に以前に記載された断片と有意な相同性を有する。特に、ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、ｃ、およびｄ配列はココアヴィシリンおよびコットンヴィシリンの領域と有意な相同性を示す（図６参照）。ピーナッツ（バークス，エイ.ダブリュ.ら［１９９５］ジェイ.クリン.インベスト.９６（４），１７１５−１７２１）、トウモロコシ（ベランガー，エフ.シー.およびクリズ，エイ.エル.［１９９１］ジェネティクス１２９（３），８６３−８７２）、オオムギ（ヘック，ジル.アール.ら.［１９９３］モル.ジェヌ.ジェネット.２３９（１−２）、２０９−２１８）およびソラマメ（セバスティヤン，エフ.エル.ら［１９９０］プラントモル.バイオル.１５（１），１９７−２０１）の、他の種子貯蔵タンパク質由来の断片に関してもいくらかの類似性が見られる。いくらかの場合、相同性はあまり高くはないが（例えば、ＭｉＡＭＰ２ａとコットンサブユニット１間の１８％の同一性；図４参照）、主な４システイン残基の間隔は全サブユニットと相同物の中で保存される。加えて、コットンおよびココアヴィシリン誘導サブユニットは共に、三次構造の付加的な安定化剤としてチロシン又はフェニルアラニン残基を保存する。それぞれ５２５および５９０アミノ酸をもつコットンおよびココアヴィシリンはＭｉＡＭＰ２ｃ（４７アミノ酸）よりももっと大きなタンパク質である（図４および図６参照）。ＭｉＡＭＰ２サブユニットはトウモロコシ由来のＭＢＰ−１抗微生物性タンパク質ともいくらかの相同性を有するが（デュビック，ジェイ.ピー.ら［１９９２］ジェイバイオルケム２６７：１８８１４−２０）、ＣＸＸＸＣモチーフ間の塩基の数は１３であり、この出願で与えられている間隔からＭＢＰ−１は明細書の範囲外となる。ＭＢＰ−１はまた、全体的に見てここで請求されている配列よりも小さいタンパク質であり（３３アミノ酸）、トウモロコシのグロブリンタンパク質のある部分とのいくらかの相同性以外に、ＭＢＰ−１がより大きな種子貯蔵タンパク質から誘導される、有力な証拠はない。しかしながら、二つのＣＸＸＸＣモチーフの間にＭＢＰ−１は１３残基含むのに対して、トウモロコシのグロブリンは１０残基を含むので、ＭＢＰ−１はトウモロコシのグロブリンからは誘導されえない。図４と６の配列はＭｉＡＭＰ２サブユニットとココアおよびコットンヴィシリン誘導分子の間のシステイン間隔に関する相同性を示す。図４と６のシステインおよび芳香族チロシン／フェニルアラニン残基は太く下線を引いた文字にて強調されている。図４は、液体培養物中で発現される、抗微生物活性を呈すると見られる更なるタンパク質の配列もまた示す。既に検証された全ＭｉＡＭＰ２相同物は抗真菌性活性を呈する。ＭｉＡＭＰ２相同物は、そのタンパク質が検証された、いくらかの病原体／微生物に対し、２ μｇ／ｍｌの低さの濃度で、顕著な菌成長の抑制を示す。従ってそれらは、いくらかの植物病に対し保護効果を提供するために用いられ得る。ＭｉＡＭＰ２相同物は、植物部分への適用により、殺菌剤または抗微生物剤として用いられ得る。タンパク質は形質転換植物内でそれらを発現することにより、病原体の成長を抑制するのにも用いられる。該タンパク質は局所投与または静脈注射により、ヒト病原体の制御に対しても用いられる。タンパク質の一つの特徴は、いくらかの微生物に対する抑制がＣａ²⁺（１ｍＭ）の存在により抑制されるということである。この効果の例を、表１にＭｉＡＭＰ２ｃサブユニットに関して示した。ＭｉＡＭＰ２タンパク質と相同物のあるものは昆虫制御剤としても機能し得る。タンパク質は強い塩基性であるので（例えばＭｉＡＭＰ２ｃおよびｄサブユニットは、ＰＩ＞１１．５である）、昆虫の消化管の高いアルカリ性環境においてすら、強いネット−正電荷を維持する。この強いネット−正電荷により、それが消化管中の負電荷を帯びた構造と相互作用することを可能となる。この相互作用は無効摂食、成長遅延、害虫の死の可能性につながりうる。以下は本発明の非限定実施例である：実施例１マカダミア・インテグリフォリア（Macadamia integrifolia）種子からの塩基性タンパク質の抽出Ｍｉナッツ（ザ・マカダミア・ナッツ・ファクトリー(the Macadamia Nut Fac tory)，オーストラリア、クイーンズランドから購入）２５kgをフードプロセッサー（ザ・ビッグ・オスカー(The Big Oscar),サンビーム（Sunbeam））で粉末にし、得た粉末物を１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０.７５％ポリビニルポリピロリドンおよび０.５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）含有の氷冷抽出用緩衝液５０Ｌで２〜４時間４℃で抽出した。得たホモジェネートは、台所用濾過器を通して大きい粒子物を除き、高容量遠心機で遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間）して、さらに澄明にした。上澄液に固形アンモニウムスルフェートを加えて、３０％相対飽和度を得て、一夜４℃で撹拌して沈殿を形成せしめた。３０分間４０００ｒｐｍでの遠心分離後、上澄液を採取し、アンモニウム・スルフェートを加えて、７０％相対飽和度を得た。溶液を一夜に沈殿せしめ、沈殿タンパク質フラクションを得るために、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈殿タンパク質を抽出用緩衝液の最小容量に再懸濁し、再び遠心分離して（１３０００ｒｐｍ×３０分間）、不溶のタンパク質を除去した。透析（１０ｍＭエタノールアミンｐＨ９.０、２ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦ）で残渣のアンモニウム・スルフェートを除去した後、あらかじめ１０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ９）および２ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＱ−セファローズ・ファストフロー・カラム（５×１２ｃｍ）にかけた。このカラムから採取の流物は種子の塩基性（ｐＩ＞９）タンパク質フラクションを表す。このフラクションは実施例３記載のように、さらに精製した。実施例２抗真菌および抗微生物活性検定一般に抗真菌および抗菌活性の検定は、９６−ウエルミクロタイタープレートにおいて実施した。典型的には、Ｋ₂ＨＰＯ₄（２.５ｍＭ）、ＭｇＳＯ₄（５０μＭ）、ＣａＣｌ₂（５０μＭ）、ＦｅＳＯ₄（５μＭ）、ＣｏＣｌ₂（０.１μ Ｍ）、ＣｕＳＯ₄（０.１μＭ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄（２μＭ）、Ｈ₃ＢＯ₃（０.５μ Ｍ）、ＫＩ（０.１μＭ）、ＺｎＳＯ₄（０.５μＭ）、ＭｎＳＯ₄（０.１μＭ）、グルコース（１０ｇ／ｌ）、アスパラギン（１ｇ／ｌ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ）、ミオ−イノシトール（２ｍｇ／ｌ）、ビオチン（０.２ｍｇ／ｌ）、チアミンＨＣｌ（１ｍｇ／ｌ）およびピリドキシン−ＨＣｌ（０.２ｍｇ／ｌ）含有の合成生育培地に試験生物体を懸濁せしめた。試験生物体は、細菌細胞、真菌胞子（５０，０００胞子／ｍｌ）または真菌糸体断片（試験する真菌培養物から菌糸マスを混じ、次いで細メッシュで濾過して大きい菌糸マスを除去することによりつくられる）からなる。培地に懸濁した試験生物体各５０μｌをマイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。試験抗微生物性溶液５０μｌを適当なウエルに加えた。バイオアッセイにおけるウエル対ウエルの多様性を処理するために各試験液につき４複製をつくった。各９６ウエルプレートのうちの１６ウエルを試験溶液との比較のための対照として用いた。特に断らない限り、インキュベーションは２５℃で４８時間行った。イーストを含むすべての真菌は２５℃で生育させた。大腸菌はは３７℃で生育させ、他の細菌は２８℃でバイオアッセイを行った。生育阻止％は、種々の時間間隔で生育培地の６００ｎｍでの吸収を測定し、対照ウエルでの吸収の平均変化から試験ウエルの吸収の変化を引き、それを対照ウエルの６００ｎｍでの吸収の平均変化で割った商を１００倍したものと定義した（すなわち、［（対照ウエルの平均変化 −試験ウエルの変化）／対照ウエルの平均変化］×１００）。典型的には、測定は２４時間間隔で行い、２４−４８時間の間を阻止％測定に用いた。実施例３マカダミア・インテグリフォリア（Macadamia integrifolia）塩基性タンパク質フラクションから抗微生物性タンパク質の精製Ｍｉ抗微生物性タンパク質の単離のための出発材料は、実施例１記載の成熟種子から抽出された塩基性フラクションである。このタンパク質を図１に示すようにカチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。２０ｍＭナトリウム・サクシネート（ｐＨ４）に溶解した塩基性タンパク質フラクション約４ｇを、あらかじめサクシネート緩衝液で平衡にしたＳ−セファロース高性能カラム（５×６０ｃｍ）（ファルマシア（Pharmacia））にかけた。カラムを２０ｍＭナトリウム・サクシネート（ｐＨ４）中の０−２ＭのＮａＣｌ直線勾配液２０リットルで１７ｍｌ／分の流速にて溶出した。２８０ｎｍでの吸収オンライン測定によって溶出物をタンパク質について調べ、２００ｍｌのフラクションに収集した。各フラクションの一部分について１００μｇ／ｍｌの濃度でフィトホラ・クリプトギア(Phytophora criptoge)に対する抗真菌活性アッセイを、１ｍＭＣａ²⁺の存在下及び非存在下で順次試験した。このバイオアッセイの結果を図１ａおよび図１ｂに示す。ここで溶出勾配は黒線で、網かけ棒は阻止％を示す。図１ａでは、アッセイをＣａ²⁺を添加せずに行い、図１ｂでは１ｍＭのＣａ²⁺存在下で行った。フラクション化により、０.０５から２ＭのＮａＣｌで溶出する非解像ピークが得られた。別このフラクションに導入され、約１６時間で溶出されたピーク（フラクション９０-９２）が最も顕著な抗微生物活性を示した。顕著な抗微生物活性を示したフラクションを、さらに逆相クロマトグラフィーにより精製した。フラクション９０−９２のアリコートを９５％Ｈ₂Ｏ／５％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ（＝１００％Ａ）で平衡にしたＰｅｐ−Ｓ（Ｃ２／Ｃ１８）カラム（２５×０.９３ｃｍ）（ファルマシア(Pharmacia)）に充填した。カラムを２４０ｍｌの１００％Ａから１００％Ｂ（＝５％Ｈ₂Ｏ／９５％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ）の直線勾配液（８０分）にて３ｍｌ／分で溶出した。個々のピークを収集し、真空乾燥を３回してＴＦＡの極微量を除去し、次いで、実施例２記載のバイオアッセイでの使用のために、ミリ−Ｑ水（ミリポア（ Millipore）社水分精製システム）５００μｌに再懸濁した。図２は、図１および２に示したカチオン交換単離によるフラクション９２から精製されたフラクションのＨＰＬＣプロファイルを示す。タンパク質溶出は２１４ｎｍで調べた。アセトニトリル勾配を直線で示した。個々のピークを抗微生物活性についてバイオアッセイした。図３中の棒グラフは各ピークからの１５μｇ／ｍｌの物質に対応する阻止を示す。活性タンパク質は約２７分（〜３０％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ）で溶出し、これをＭｉＡＭＰ２ｃと名付ける。実施例４単離ＭｉＡＭＰ２ｃの純度単離抗微生物性タンパク質の純度を天然ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、次いでコーマシー・ブルータンパク質染色液で染色した。１０−２０％トリシン勾配ゲル（ Novex）で、製造者の指示通りに（１００Ｖ、分離１−２時間）電気泳動を行った。これらの条件下において、精製されたＭｉＡＭＰ２ｃは単一不連続帯として移動した（＜１０ｋＤａのサイズ）。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析における単一メジャーバンドの検出は、カチオン交換および逆相分離(示さず)で単一ピークが溶出されることと併せて、ＭｉＡＭＰ２ｃが９５％以上の純度であること、またそれゆえ、標品の活性が他の不純物に由来するのではなくほとんどＭｉＡＭＰ２ｃ単独に由来することを示す。質量分析(以下の実施例５)の明白なシグナルもまた、この結論を支持するものである。実施例５ＭｉＡＭＰ２ｃの質量分析精製ＭｉＡＭＰ２ｃを質量分析にかけた。タンパク質約１μｇの溶液を検査に用いた。分析の結果、タンパク質の分子量は６２１６.８Ｄａ±２Ｄａであった。さらに、タンパク質についてジチオトレイトールによるジスルフィド結合の還元および４−ビニルピリジンでのアルキル化を行った。この還元／アルキル化の産物を質量分析にかけると、４２７質量単位を取得していること（すなわち、分子量がおよそ４×１０６Ｄａ増加したこと）が示された。この質量の増加は６個の４−ビニルピロリドン基（質量１０６Ｄａ）が還元タンパク質に反応したことを示し、タンパク質が計４このシステイン残基を有しているものと解釈される。システインについてはアミノ酸およびヌクレオチド配列によっても確認された。実施例６ＭｉＡＭＰ２ｃのアミノ酸配列還元およびアルキル化した精製タンパク質約１μｇを自動エドマン分解Ｎ−末配列決定にかけた。最初の配列決定操作において、最初の３９残基の配列が決定された。次いで、メチオニン-２６のＣ末端側を切断する、シアノーゲンブロミドと１ｍｇのＭｉＡＭＰ２ｃとを反応させた。切断反応により得られたＣ-末端断片を、逆相ＨＰＬＣにて精製し、ＭｉＡＭＰ２ｃの残りの配列（即ち２７−４７残基）を決定した。全アミノ酸配列はRQRDP QQQYE QCQER CQRHE TEPRH MQTCQ QRCER RYEKE KRKQQ KRであり、実施例９のクローン３のアミノ酸１１８から１６４（図６および配列番号５参照）に該当する。図において、システイン残基を太字で示し下線を引いて、空間パターンが認識しやすいようにしている。形成されているジスルフィド結合の数によって、このタンパク質の重量は６２１５．６から６２１９．６Ｄａの範囲内となる。この値は、質量分析で得られた値である６２１６．８Ｄａ（実施例５）とよく一致する。測定された質量はＭｉＡＭＰ２ｃの質量は、二つのジスルフィド結合がある形として予測される質量と非常によく一致する。実施例７ＭｉＡＭＰ２ｃをリーダーペプチドと共にコードする合成ＤＮＡ配列標準的なコドン表を用いて、タンパク質を逆翻訳して、抗微生物活性を有するタンパク質をコードするであろうＤＮＡ配列を得ることが可能である。マックベクター４.５.３ソフトウエアを用いて、タンパク質配列を入力し、そして縮退ヌクレオチド配列を得た。試験植物中への高発現を得ることを目的として、タバコで適当に選択されるコドンを選ぶべく、タバコのコドン利用表を参考にした。３０アミノ酸のリーダーペプチドもまた、シグナルペプチドのプロセシングおよびペプチドの細胞外への分泌がうまく行われるように、デザインした。この目的のため、ボン・ヒージェン(Von Hiejne)方法を用いて、一連のリーダー配列が、正しい位置にて分割される可能性の評価を行った[ボン・ヒージェン,G.(1986)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ14(11):4683-4690]。特に、アミノ酸配列MAWFH VSVCN AVFVV IIIIM LLMFV PVVRG(配列番号１１)が、Ｇ（Ｇｌｙ）に直接続くシグナルペプチドを正しくプロセシングするのに最適であることが見出された。タバコモザイクウイルスの５’未翻訳領域もまた，この合成遺伝子に付加して、翻訳効率を高めるようにした[ダウソン,M.J.,ら（1994）プラント・モル・バイオール・レプ（Plant Mol Biol Rep．）12(4):347-3571].。合成遺伝子にはまた、効率の良いクローニングおよびサブクローニングのため、５’および３’末端および出発ＡＴＧのすぐ５’側に制限部位を有している。図５は植物の発現試験に有用な合成ＤＮΛ配列を示す。この図面において、矢印は翻訳開始部位を示し、三角形のシンボルはシグナルペプチドの切断部位を示す。実施例８ＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質の構造予測配列分析アルゴリズムを用いて、タンパク質の推定される第二構造のモチーフを得ることができる。５つの異なるアルゴリズムを用いてαヘリックス、βシートまたはターンがＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質に生ずるかどうかを解析した（図４）。方法は以下の文献から得た：:ＤＰＭ法,デレーグ（Deleage,G）.とルックス (Roux,B.）(1987)プロト・エング(Prot.Eng）.1:289-294;SOPMA法，ジョワーリン(Geourjon,C.)，とデレーグ(1994)プロト・エング.7:157-164;ギルバート法，ギルバート(Gibrat,J.F)ゲイナー(Garnier,J.)とロブソン(Robson,B).(1987)ジェイ・モル・バイオール(J.Mol.Biol).198:425-443;レバイン(Levin)法レバイン、ロブソン及びゲイナー.(1986)FEBSレターt.205:303-308;およびPhD法,ロスト( Rost,B.)，およびサンダー(Sander,C.)(1994)プロテインズ19:55-72.。図７はα ヘリックス、βシート及びターンの推定存在箇所を示す。図７では以下の記号を用いた：Ｃコイル（未構築）；Ｈ αヘリックス；Ｅ βシート；およびＳターン。下線の残基は少なくとも二以上の別この構造推定法にてαヘリックス構造を有すると推定されるものである。これらを、図８にヘリックスとして示した。２次構造推定より、このタンパク質が高αヘリックス度を有することが明かになった。２次構造推定はしばしば、困難であり、正確ではないのであるが、この発明においては，２次構造推定はタンパク質の構造の明らかな指標となる。２次構造推定試験により、２つのαヘリックス領域が約５から８残基長を挟んで途切れているものが大勢を占めることが示された。このことは、ヘリックス-ターン- ヘリックスモチーフであることを強く示唆するものである。ＭｉＡＭＰ２ｃアミノ酸配列のヘリックスホイール分析によれば、システイン残基はそのヘリックス内の存在位置において、ＣＸＸＸＣスペーシングの形でヘリックスの表面に並んでいることが示される。システインはジスルフィド結合形成に関与することから、１のヘリックス中のシステイン側鎖は必ず他のヘリックス内に存在するシステイン側鎖と共有結合を形成している。ヘリックス部分がシステイン側鎖を、もう一方のヘリックスのシステイン側鎖に近づけるような形に配置されている場合に得られる三次元構造を図８に示した。この構造では、ジスルフィド結合で保持されている二つのヘリックスからなるタンパク質の１の表面上に正荷電タンパク質残基が分布する。図８はこの分子のヘリックス領域における正荷電残基のスペーシングが、ヘリックスの１表面上に側鎖を保持するのに関与しているかについてを示す。正荷電残基は黒で郭線を書いた暗く塗った側鎖である。他の暗く塗った側鎖は酸性残基を示す。プロリン残基（灰色でＰと記した）はこの分子のターン領域の左端に存在している。黒線はジスルフィド結合が二つのヘリックスを結合させている箇所を示す。点線は、二つの芳香性疎水性残基の相互作用によりヘリックス-ターン-ヘリックス構造へ安定性が増している部分を示す。このヘリックス-ターン-ヘリックス構造は、同じシステインスペーシングおよび残基を有する全てのＭｉＡＭＰ２相同物の、ヘリックスとターン形成傾向に適用できる。他のＭｉＡＭＰ２断片の配列は図８に示された全体的な構造に重ね合わせることができる。全体の構造は本質的に同じに保たれるが、含まれている配列によって、荷電分布は変化する。ＭｉＡＭＰ２ｂの場合、点線は疎水性相互作用に代わって付加されたジスルフィドブリッジを示す。実施例９ＭｉＡＭＰ２ｃ遺伝子のゲノム断片のＰＣＲ増幅逆翻訳ヌクレオチド配列を用いて変性プライマーを調製し、これをマカダミアからのゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた。ＪＰＭ１７プライマー配列は、５’ CAG CAG CAG TAT GAG CAG TG ３’であり、ＪＰＭ２０変性配列は５’TTT TTC G TA(T/T)C(T/G)(G/T)C(T/G)TTC GCA 3’である(配列番号１２および１３)。ＪＰＭ１７およびＪＰＭ２０プライマーを用い、３０秒間９５℃、１分間５０℃、及び１分間７２℃のサイクルのＰＣＲ増幅反応を３０サイクル行った。アガロースゲルからＤＮＡバンドを切り、キアゲン(Qiagen)ＤＮＡクリーンナップキットを用いて精製した後に予測されたサイズに近いＰＣＲ産物を直接配列決定した（AB Iプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット(PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactio n Kit）。この方法を用い、ポリメラーゼ連鎖反応における鋳型としてｃＤＮＡを使用して、およそ１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できた。このヌクレオチド断片の直接配列決定によって、ＭｉＡＭＰ２ｃ抗微生物性タンパク質のある部分のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を得た(図４のアミノ酸７−３９)。上述の断片から得られた部分ヌクレオチド配列からプライマー配列を除いたものは、５’TCA GAA GCG CTG CCA ACG GCG CGA GAC AGA GCC ACG ACA CAT GCA AAT TT G TCA ACA ACG C ３’（配列番号６の２６４から３２４位の塩基対に対応）であった。この配列は、様々な目的例えば、ＭｉＡＭＰ２相同物のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニングまたは、デザインＰＣＲ増幅反応の特別なプライマーのデザインに用いることができる。マカダミアナッツの仁からのメッセンジャーＲＮＡの単離５８グラムのマカダミアナッツの仁を液体窒素の存在下で乳鉢とペステル(pes tel)を用いて粉にひいた。粉砕したものからのＲＮＡを次いで、グアニジンチオシアナート／セシウムクロライド法(カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、既出)を用いて精製した。この方法を用いて総量およそ５ｍｇのＲＮＡを単離することができた。メッセンジャーＲＮＡを次いでスパンカラムＲＮＡ精製キット(ファルマシア)を用いて総ＲＮＡから精製した。ｃＤＮΛライブラリーの構築ｃＤＮＡライブラリはラムダＺＡＰベクター内にストラタジェンのライブラリーキットを用いて構築した。２５μｇのメッセンジャーＲＮＡを用いて全６反応を行った。第１および第２ストランドｃＤＮＡの合成はＭＭＬＶ逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼＩをそれぞれ用いて行った。ｃＤＮＡをＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにてブラント末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカーアダプターをこのＤＮＡに連結させた。次いでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化を行い、次いでＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼにて処理した。この時点でキットと共に供給されるセファクリルーＳ５００カラムを用い、ｃＤＮＡ物質をサイズによって分けた。ＤＮＡを次いでラムダＺＡＰベクター内に連結させた。連結された挿入物を有するベクターを次いでラムダファージ内へパッケージ化した（ギガパックIII、ストラタジェンのパッケージ用抽出物）。ライブラリーのスクリーニング上記で構築されたライブラリーを次いで、上層のアガロース内に大腸菌ローンを増殖させているＸＬ１-ブルー大腸菌ローン上に撒いて、スクリーニングを行った。個々のクローンを含有するプラークをハイボンドＮ＋膜（アマシャム，ライフサイエンス）上に取り、放射線標識した上記で増幅させたゲノムＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ブロットを可視化し、陽性のクローンを選択して第２ラウンドのスクリーニングに供した。第２および第３のスクリーニングの後、プラークを単一クローンを取ることができるよう十分単離した。数このクローンを得、次いで大きいほうのラムダベクターからpBK-CMVベクター部分を切り出した。ＭｉＡＭＰ２ｃのｃＤＮＡクローンの配列推定ＭｉＡＭＰ２ｃクローンを含むｐＢＫ-CMVベクターの配列決定を行い、クローン化した挿入部のＤＮＡ配列を得た。７つのクローンを部分的に配列決定し、さらに３つのクローンの全配列を決定した（マカダミアクローンのＤＮＡ配列については配列番号２，４および６参照）。ＤＮＡ配列の翻訳により、全長クローンは６６６アミノ酸の非常に類似したタンパク質をコード化することがわかった。図６はこれらのタンパク質がココアおよび綿からのヴィシリン(vicilin)種子貯蔵タンパク質と顕著な同一性を有することを示す。星印は保存されている同一部分を示し、点線部分は、保存されている類似部分を示す。タンパク質配列を調べたところ、正確なＭｉＡＭＰ２ｃ配列がクローン３の翻訳タンパク質アミノ酸部位１１８から１６４(図６参照)に認められることがわかった(図６参照)；クローン１および２はＭｉＡＭＰ２ｃ全４７アミノ酸配列のうちの、ＭｉＡＭＰ２ｃとはそれぞれ２残基および３残基異だけが異なる配列を含有する。全長クローンの翻訳産物（クローン１および２）は、１〜２８位の残基の短いシグナルペプチド、２９〜２４６位の残基の親水性領域、および５２４〜５４６位の酸性残基によって分けられている〜２４６から６６６にわたる２つのセグメントをから構成される。特に、ＭｉＡＭＰ２ｃの配列を含有する親水性領域にはまた、ＭｉＡＭＰ２と非常に類似する３つのさらなるセグメント（ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂおよびｄと名づける）を含有する。これらの４つのセグメント（２８〜２４６位の残基に認められる）は、およそ４または５残基の酸性である(通常はグルタミン酸である)伸展部分によって分離されている。これら酸性伸展部分は、６４-６８位、１１１-１１５位、１７１-１７４位、及び２４１-２４６位に認められ、６６６残基プレプロタンパク質をより小さな機能性断片へと切断するためのプロセシングサイトの輪郭を形成する（切断部位を示す酸性伸展部分は、図６において太字で示した）。４つのＭｉＡＭＰ２様セグメントはすべて１０-１２残基で分けられている２つのシステインダブレットを含有する２つのセグメントを有し、以下のごときパターン：C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-Cを有する。ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、Ｃはシステインである。全４セグメントは上記実施例８に示したごとくヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを形成するものと予測される。これらの位置においてシステインがジスルフィド結合を形成し、これが二つのヘリックス部分を共に保持することによってタンパク質の構造を安定化することは明らかである。予測されるヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフは、いくつかの別の方法によってもさらに安定化され得る。第１の安定化方法はセグメント１および３(即ち６６６残基のマカダミアヴィシリン様タンパク質のそれぞれ２９-６３位及び１１８-１７０位の残基)に示される。これらのセグメントは二つの芳香族残基（それぞれのαヘリックスに１つずつ）の間の疎水性リング−スタッキング相互作用により、安定化されている。この安定化は通常はチロシン残基により達成されるが、フェニルアラニンもまた用いられる。システイン残基と同様、予測されるαヘリックスセグメント内のこれらの芳香族残基の位置は、これがヘリックス -ターン-ヘリックス構造を安定化させるのであれば、重要である。セグメント１および３において、芳香族残基は以下のごとくシステインダブレットから２〜３残基離れている：Z-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X-X-X-Z（式中、Ｃはシステイン、Ｚは通常チロシンであるがセグメント１のようにフェニルアラニンで置換されている場合もある。ヘリックス-ターン-ヘリックス断片安定化の第２の方法は、断片２に認められるように、追加のジスルフィドブリッジ(７１-１１０位の残基)を用いるものである。これは、さらなるシステイン残基をシステインダブレットから２〜３残基離して置くことにより達成される：nX-C-X-X-C-X-X-X-C-(10-12X)-C-X-X-X-C-X- X-X-C-nX。これは、発明者が知る、ある抗微生物性タンパク質においてヘリックス-ターン-ヘリックスドメインのいずこが三つのジスルフィドブリッジによって安定化されているかについて示された唯一の報告である。セグメント４（１７５から２４１位の残基）は過剰なジスルフィドブリッジまたは疎水性リング−スタッキング相互作用安定化部分を有していないのであるが、この分子は弱いイオン性および水素結合相互作用により安定化されていると考えられる。実施例１０ＭｉＡＭＰ２及びその相同物の液体培養物発現のためのベクターＭｉＡＭＰ２ｃをコードするヌクレオチド領域に隣接するＰＣＲプライマーをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位（それぞれコード領域の５’および３’末端に対応する）を含むように操作した。プライマーＪＰＭ３１配列５’A CAC CAT ATG CGA CAA CGT GAT CC ３'；プライマーＪＰＭ３２配列：３’C GTT GTT TTC TCT ATT CCT AGG GTT G 5'，配列番号:14および15)。これらのプライマーは、ＭｉＡＭＰ２ｃのＤＮＡのコーディング領域を増副するのに用いた。この増幅物のＰＣＲ産物を、次いでＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴ１７Ｂベクター(ノヴァジェン／スチュディアー(Studier，F．W)ら[1986]ジェイ・モル・バイオール189:113)に、コーディング領域と、インフレームで連結し、ベクターｐＥＴ１７−ＭｉＡＭＰ２ｃを調製した。上述の方法と同様の方法にて、ＭｉＡＭＰ２ｃ相同物(即ちＭｉＡＭＰ２ａ、ｂ、およびｄまた、ＴｃＡＮＰ１およびＴｃＡＭＰ２）のコーディング領域を有するベクターを構築するのに用いた。ＭｉＡＭＰ２クローン１内のａ、ｂおよびｄ断片のための発現ベクターを構築するために、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを有する特別なＰＣＲプライマーをデザインし、これを用いて目的の断片を増幅させた。生成物を適当な制限酵素にて消化し、ＨｉｓタグおよびＸａ因子開裂部位(アミノ酸配列MGHHH HHHHH HHSSG HIEGR HM、配列番号16)を含有するｐＥＴ１６ｂベクター（ノバジェン）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイトに連結させた。ｐＥＴ１６ｂベクターから発現されるタンパク質生成物は、抗微生物性タンパク質の融合物である。ココアからのＭｉＡＭＰ２様タンパク質サブユニットのコーディング配列（図４、ＴｃＡＭＰ１およびＴｃＡＭＰ２）は、ココアヴィシリン遺伝子の公開されたＤＮＡ(スペンサー(Spencer，M．E.)とホッジ(Hodge R.)［199 2］プランタ186:567-576)から得た。ココアヴィシリン遺伝子内の二つのＭｉＡＭＰ２様断片は、５’末端（図４に示した残基に対応）にあることが確認され、また所望のコーディング領域に対応する二組の相補的オリゴヌクレオチドをデザインした。各ココアサブユニットの相補的オリゴヌクレオチド(９０-１００塩基 )は、２０ｂｐのオーバーラップを含有し、またＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する。ＴｃＡＭＰ用に以下のヌクレオチドを合成した： TcAMP1フォワードオリゴ5’GGGAATTCCA TATGTATGAG CGTGATCCTC GACAGCAATA CGAGCAATGC CAGAGGCGAT GCGAGTCGGA AGCGACTGAA GAAAGGGAGC 3'； TcAMP1リバースオリゴ 5’GAAGCGACTG AAGAAAGGGA GCAAGAGCAG TGTGAACAAC GCTGTGAAAG GGAGTACAAG GAGCAGCAGA GACAGCAATA GGGATCCACA C 3'． TcAMP2用には以下のオリゴヌクレオチドを用いた: TcAMP2フォワードオリゴ5’GGGAATTCCA TATGCTTCAA AGGCAATACC AGCAATGTCA AGGGCGTTGT CAAGAGCAAC AACAGGGGCA GAGAGAGCAG CAGCAGTGCC AGAGAAAATG C 3'; TcAMP2リバースオリゴ 5’GTGTGGATCC CTAGCTCCTA TTTTTTTTGT GATTATGGTA ATTCTCGTGC TCGCCTCTCT CTTGTTCCTT ATATTGCTCC CAGCATTTTC TCTGGCACTG CT 3'．これらのオリゴヌクレオチドのセットを各ＰＣＲ増幅反応中に加えて、所望のコーディング領域を有するＰＣＲ断片を得た。最初のＰＣＲ増幅物ではぼんやりとしたバンドであったため、オリジナル産物の再増幅を新しい２０マーのプライマー（上記フォーワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的である）を用いて行った。一旦増幅した後、ＰＣＲ産物を適当な酵素にて制限消化し、上記ｐＥＴ１６ｂベクターに連結した。この操作を、ＭｉＡＭＰ２ｃに相同性を有するココア断片(図４に示す)両方に対して行った。実施例１１ＭｉＡＭＰ２ｃおよびその相同物の大腸菌内への発現と精製適当なｐＥＴ構築体（実施例１０）で形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（グロッドベルグ(Grodberg，J.)［1988］ジェイ・バクテリオール(J．Bacteriol.)170:1 245）の出発培養物(50ml)を500mlのＮＺＣＹＭ培地(カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー,既出)に添加し、光学濃度０.６(600nm)まで培養し、ｐＥＴ１７ｂ（Ｔ７プロモーター含有）またはｐＥＴ１６ｂ（Ｈｉｓタグ融合およびＴ７プロモーター/lacオペレーター含有）のいずれを用いたかによって、０.４または１.０ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えて誘導した。細胞を誘導した後培養物を４時間生育させて回収した。生育培養物のアリコットを時間間隔をおいて取り、タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、培養中でＭｉＡＭＰ２及び相同物の発現レベルを調べた。ヒスチジンタグと共に発現された断片(即ち、ｐＥＴ１６ｂベクター)を、誘導細胞培養物を５０００ｇにて１０分間遠心分離して回収した。細胞のペレットを再懸濁し、１時間、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭトリス緩衝液にてｐＨ８.０とした６Ｍグアニジン-ＨＣｌ内で攪拌して破壊した。破壊細胞懸濁物を１０,０００ｇにて２０から３０分間、遠心分離し、細胞残渣を沈殿させた。上清を新たな管に取り、５００ｍｇのＮｉＮＴＡファストフローレジン(キアジェン(Qiagen))を各上清に添加した。４℃にて３０〜６０分間穏やかに混合した後、懸濁液を小さなカラムにかけ、８Ｍ尿素で２回（ｐＨ８，次いでｐＨ６.３）ゆすぎ、次いで８ＭウレアｐＨ４.５にてタンパク質を溶出した。こうして得られたタンパク質フラクションは実質的に純粋であるが、さらに９.３×２５０ｍｍＣ２／Ｃ１８逆相カラム（ファルマシア）を用い、３ｍｌ/分の流速、７５分かけた５％から５０％アセトニトリル（０.１％ＴＦＡ）濃度勾配にてさらに精製した（データ示さず）。全てのＭｉＡＭＰ２ｃ相同物（ｐＥＴ１７ｂ内に発現されたＭｉＡＭＰ２ｃは除く）をヒスチジンｔａｇを含有するｐＥＴ１６Ｂベクター内に発現させた。ＭｉＡＭＰ２ｃ培養物の誘導は上述の通りに行ったが、精製処理を少々異なる方法にて行った。ここでは、ＭｉＡＭＰ２ｃ発現細胞を遠心分離によって回収したが、次いでリン酸緩衝液(１００ｍＭ，ｐＨ７.０、１０ｍＭのＥＤＴＡと１ｍＭのＰＭＳＦ含有)内に再懸濁させ、フレンチプレス装置を用いて破壊した。ＭｉＡＭＰ２ｃ封入体(inclusion body)を含有する細胞残渣を６Ｍグアニジン-ＨＣｌ、１０ｍＭＭＥＳｐＨ６.０バッファーを用いて可溶化した。次いでこの可溶化過程にて残った不溶性残渣を遠心分離により除いた後、溶解性物質を回収した。グアニジンＨＣｌ可溶性物質を次いでＰＭＳＦ(１ｍｍ)およびＥＤＴＡ(１０ｍＭ)を含有する１０ｍＭＭＥＳｐＨ６.０に対して透析した。カチオン交換フラクション化を、小規模で行う以外は実施例３に記載の方法にて透析後に行った。次いで、カチオン交換カラムからの主溶出タンパク質、これはＭｉＡＭＰ２ｃであるが、これを逆相ＨＰＬＣを用いて実施例３記載のごとくさらに精製した。図９はＩＰＴＧと共に誘導し、次いで発現タンパク質の精製を行って得られた様々な精製段階におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル解析の結果を示す。TcAMP1精製の間に解析した試料は以下の通りである。レーン１，分子量マーカー；レーン２、Ｎｉ−ＮＴＡ非結合フラクション；Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂のｐＨ８尿素ゆすぎ液；レーン４、Ｎｉ−ＮＴＡのｐＨ６.３尿素ゆすぎ液；レーン５、pH４.５の尿素で溶出したＴｃＡＭＰ１；およびレーン６、pH４.５の尿素で２回目の溶出したＴｃＡＭＰ１。TcAMP2も同様にして精製し、Ni-NTA樹脂から溶出したフラクションをさらに逆相HPLCにて精製した。図１０はココアサブユニット番号２（ＴｃＡＭＰ２）の逆相精製を示す。ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂおよびｄ断片精製物のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル分析を、図９の第２パネルに示した。レーンの内容は以下の通りである：レーン1、分子量マーカー;レーン2，ＭｉＡＭＰ２aプレ誘導細胞抽出物；レーン3，ＭｉＡＭＰ２ａ IPTG誘導細胞抽出物;レーン4，ＭｉＡＭＰ2a Ni-NTA非結合フラクション;レーン5，Ni-NTAからのＭｉＡＭＰ２a溶出物；レーン6，ＭｉＡＭＰ２ｂプレ誘導細胞抽出物；レーン7，ＭｉＡＭＰ２ｂ IPTG誘導細胞抽出物；レーン8，ＭｉＡＭＰ２ｂ Ni-NTA非結合フラクション;レーン9，Ni-NTAからのＭｉＡＭＰ2b溶出物；レーン10，ＭｉＡＭＰ２dプレ誘導細胞抽出物；レーン11，ＭｉＡＭＰ２ｄ IP TG誘導細胞抽出物；レーン12，ＭｉＡＭＰ２ｄＮｉ-ＮＴＡ非結合フラクション ;およびレーン１３，Ｎｉ-ＮＴＡからのＭｉＡＭＰ２ｄ溶出物。実施例１０に開示したベクターを用いて、ＭｉＡＭＰ２ｃおよび５つの相同物（即ちＭｉＡＭＰ２ａ，ＭｉＡＭＰ２ｂ，ＭｉＡＭＰ２ｄ，ＴｃＡＭＰ１およびＴｃＡＭＰ２）をすべて発現させ、精製し、抗微生物活性を調べた。上記で採用したアプローチは、図４に記載した抗微生物断片の全てに適用可能である。精製した断片は次いで、目的とする微生物に対する阻害活性について調べればよい。実施例１２ＭｉＡＭＰ２ｃに対する抗体を用いる、他の種内のＭｉＡＭＰ２相同物の検出常套の方法に従い、ＭｉＡＭＰ２をフロインド不完全アジュバンドに懸濁したジフテリア毒素と共役させ、これを筋肉内注射してウサギを免疫した。この動物へＭｉＡＭＰ２アジュバンドの様々な濃度を与えて免疫応答をブーストした後、一定の間隔で血清を採取した。およそ１００ｍｌの血清を回収し、数種の植物種子からの粗抽出物のスクリーニングに用いた。実施例１のごとく種子１００ｇを挽き、抽出して粗抽出物を得た。タンパク質のアリコートをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにて分離し、ゲルをニトロセルロース膜へブロッティングし、さらなる抗体反応性タンパク質の検出に供した。得られた膜をＭｉＡＭＰ２ｃウサギ一次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、次いでアルカリ性フォスファターゼ-共役ヤギ抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、５−ブロモ−４−クロロー３−インドリルホスフェート/にトロブルーテトラゾリウム系(SchleicherとSchuell)を用いて抗原性バンドを化学的に着色させ、検出した。図１１は様々な他種がＭｉＡＭＰ２ｃと同じ大きさの免疫的な関連タンパク質を含有することを示す。レーン１-１５は以下の種からの抽出物を含む：1）Stenocarpus sinuatus，2）Stenocarpus sinuatus(1/10量の測定)，3）Restio tremulus，4）Mesomalaenatetragona，5） Nitraria billardieri，6）Petrophile canescens，7）Synaphae acutiloba，8 ）Dryandra formosa，9）Lambertia inermis，10）Stirlingia latifolia，11） Xylomelum angustifolium，12）Conospermum bracteosum，13）Conospermum tri plinernium，14）分子量マーカー，15）Macacamia integrifolia精製ＭｉＡＭＰ２c。レーン１-１３は様々な種を含有し、これらのうちのいくつかは同じ大きさのＭｉＡＭＰ２ｃ関連抗原性の存在を示す。より高い分子量を示す他のバンドは多分、抗微生物性タンパク質が誘導される種子貯蔵タンパク質のより大きなプレカーサーを示しているものと考えられる。抗原性関連タンパク質は、レーン１，２，４，６，７，８，９及び１１-１３に認められる。様々なプロテアケア(Proteaceae)ファミリーの他の種の粗抽出物を用いてのバイオアッセイをまた行った。特に、Banksia robur，Banksia canei，Hakea gjbb osa，Stenocarpus sinuatus，およびStirlingia latifolia、が抗微生物活性を示すことが示された。かかる種はマカダミアと関連するため、この活性は、ＭｉＡＭＰ２相同物から得られるものと考えられる。実施例１３ＭｉＡＭＰ２ｃに対する抗体を用いる、多種内ＭｉＡＭＰ２ｃ相同物類の精製プロテエースエファミリーの他の種内の免疫的に関連するタンパク質の検出および粗抽出物内の抗微生物活性に基づき、Stenocarpus sinuatusをＭｉＡＭＰ２ C相同物を単離するための大容量フラクション化試験に供した。５ｋｇのS.sinua tusの種子を液体窒素中で凍結し、フードプロセッサー（ビッグ・オスカー・サンビーム）にて挽いた。挽いた種子をすぐに１２Ｌの５０ｍＭＨ₂ＳＯ₄抽出バッファー内へ移し、４℃にて１時間、攪拌しながら抽出した。上清を次いでｐＨ９に、５０ｍＭアンモニア溶液を用いてあわせた。ＰＭＳＦおよびＥＤＴＡを、最終濃度がそれぞれ１および１０ｍＭとなるよう、添加した。粗タンパク質抽出物を、流速４０ｍｌ/分の５０ｍＭＮＨ₄ＡｃｐＨ９.０にて平衡化したアニオン交換カラム（アンバーライトＩＲＡ-９３８、ロームアンドハース）(３ｃｍ×９０ｃｍ)にかけた。塩基性タンパク質フラクションを含む非結合タンパク質を集め、続いて精製工程に供した。塩基性タンパク質フラクションを酢酸によりｐＨ５.５にあわせ、次いで１０ｍｌ/分の速度で１２時間、２５ｍＭの酢酸アンモニウムにて先に平衡化させたＳＰ-セファデックスファストフロー(ファルマシア)カラム(５cm×６０ｃｍ)にかけた。結合したタンパク質の溶出は、１０ｍｌ/分、１０時間のＮＨ₄Ａｃの２５ｍＭから２.０Ｍ(ｐＨ５.５)の濃度勾配によって行った。溶出物の吸収を２８０ｎｍにて測定し、１００ｍｌのフラクションを集めた(図１２参照)。抗血清と交差反応したカチオン交換フラクション(フラクション１４-２８、図１２)を、さらに逆相クロマトグラフィーにて精製した。交差反応フラクションを９０％Ｈ₂Ｏ、１０%アセトニトリル０.１％トリフルオロサクサン(ＴＦＡ)(= １００％Ａ)で先に平衡にした７μｍＣ１８逆相カラム（ブラウンリー）にかけた。結合タンパク質を１００％Ａから１００％Ｂ（５%Ｈ２Ｏ、９５％アセトニトリル、０.０８%ＴＦＡ）までの直線濃度勾配により溶出させた。溶出タンパク質の吸光度を２１４ｎｍと２８０ｎｍにてモニターした。溶出タンパク質を真空下で乾燥、水に再懸濁を３回繰り返し、試料からＴＦＡの残渣を除いた。逆相タンパク質溶出フラクション２０から６１は、隣接する２フラクションをプールして、ウエスタンブロッド分析を行った（図１３参照）。抗ＭｉＡＭＰ２ｃの抗血清に対してフラクション２２-４１に弱い陽性反応が認められ、フラクション４２-５７に強い陽性反応が認められた。S.Sclerotiorumに対して、５０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ/ｍｌの濃度にて抗真菌活性を示すフラクションを、クロマトグラム上に矢印で示した。上記アプローチを用い、いくつかの活性フラクション（ＳｓＡＭＰ１およびＳｓＡＭＰ２と命名）を得、そのSclerotinia sclerotiorum，Alternaria brassic ola，Leptosphaeria maculans，Verticilium dahliaeおよびFusarium oxysporum に対する抗真菌活性を評価した。バイオアッセイを実施例２に記載の方法のごとく行い、結果を図１５に示した。ＭｉＡＭＰ２抗血清と反応する他の断片を精製、配列決定した（ＳｓＡＭＰ３）が、抗微生物活性の解析には不充分なタンパク質しか得られなかった。これらのタンパク質から得られた部分的配列を図４(配列番号２６，２７及び２８)に示した。ペプチドまたはこの種からの種子貯蔵タンパク質をコード化するｃＤＮＡのクローニング全配列決定によって、これらのペプチドとＭｉＡＭＰ２−シリーズ相同物とのホモロジーの程度が判明する。実施例１４ＭｉＡＭＰ２ｃ小断片の合成全ＭｉＡＭＰ２ｃ分子が抗微生物活性を示すために絶対的に必要なものであるか否かを確認するために、別この２つのペプチドをAuspep Pty.Ltd．(Australia )により化学合成した。各ペプチドにおいてシステイン残基をアラニン残基に換え、ジスルフィド結合がふたつの別のタンパク質鎖間に形成されないようにした。チロシン残基もまた、アラニン残基に換えた、というのは、チロシンもまたヘリックス-ターン-ヘリックス安定化に関与しており、1のヘリックスを欠く合成ペプチドにおいては，必要でないと考えられるからである。アラニンはまた、α ヘリックスを形成するのにも好ましいため、天然のヘリックス構造と大きく衝突することはない。ペプチド１はクローン3の118から139位、22のアミノ酸からなる(配列RQRDP QQQAE QAQKR AQRRETE：配列番号9)。ペプチド２はクローン３の１４０から１６４位、２５のアミノ酸からなる（配列：PRHMQ IAQQR AERRA EKEKR KQQKR，配列番号10）。ペプチド１および２を、それぞれＭｉＡＭＰ２ｃpeplおよびＭｉＡＭＰ２ｃ pep2と名付けた。これらのペプチドをミリＱ水に再懸濁させ、真菌に対してのバイオアッセイを行った。表２に示すように、ペプチド２は様々な真菌に対する阻害活性を有するが、ペプチド１はほとんど，あるいは全く活性が無かった。ペプチド１とペプチド２の混合物が、ペプチド２単独の場合と同レベルの活性を示したということは、この活性がペプチド２のみの活性であることを示す。ＭｉＡＭＰ２ｃの示すヘリックス-ターン-ヘリックス構造無しでペプチド２が抗微生物活性を示すという事実から、ヘリックス-ターン-ヘリックス構造がペプチドが活性を保持するために必須ではないことを示す。しかしながらモルベースで見た場合、ペプチド２はＭｉＡＭＰ２ｃの全断片の活性と同程度の活性を示すわけではないことから、ヘリックス-ターン-ヘリックス構造が含有される断片により抗微生物活性を最大に発現するためには、重要であることがわかる。ヘリックス-ターン-ヘリックス構造が、ＭｉＡＭＰ２相同物の安定性をより高めるものであると期待できる。安定性が高いと、抗微生物活性をより長期間に渡って保つことができると考えられる。実施例１５ＭｉＡＭＰ２ｃ相同物及び断片の抗微生物活性ＭｉＡＭＰ２ｃおよびＭｉＡＭＰ２の様々な相同物それぞれについて、様々な真菌に対する活性を２から５０μｇ/ｍｌの濃度で試験した。表１は純粋ＭｉＡＭＰ２ｃのＩＣ５０値を様々な真菌および細菌について示す。表において、「＞５０」との記載は試験した最高濃度である５０μｇ／ｍｌの濃度では５０％阻害に達しないことを示す。「ＮＤ」との略号は試験が行われなかったか、結果が解析できなかったものを示す。ＭｉＡＭＰ２ｃの抗微生物活性をまた、被検培地中に１ｍＭのＣａ²⁺の存在下で試験し、この条件下でのＩＣ₅₀値を右欄に示した。表からわかるように、ＭｉＡＭＰ２ｃの阻害活性は、Ｃａ²⁺の存在によって(無くなりはしないものの)非常に減弱された。表２は、ＭｉＡＭＰ２ｃの様々な相同物類及び断片類の抗微生物活性を示す。表において、以下の略号を使用した：Ab，Alternaria brassicola;Cp:Ceratocys tis paradoxa;Foc:Fusarium oxysporum;Lm:Leptosphaeria maculans;Ss:Sclerot inia sclerotiorum;Vd:Verticillium dahliae。表において、「＞５０」との記載は、５０μｇ／ｍｌを超える濃度では試験をしておらず、従ってＩＣ₅₀値が達成できなかったことを示す。空白部分は試験を行わなかったか、結果の解析ができなかったケースである。表２の結果を得るのに使用したＴｃＡＭＰ１および２は、ココアのヴィシリンから誘導されたものである(実施例１０及び１１)。ＳｓＡＭＰ１および２はＭｉＡＭＰ２ｃ抗体との反応性を示し、表２に示すごとく抗微生物活性を示す。ＭｉＡＭＰ２ａ、ｂおよびｄはＴｃＡＭＰ１およびＴｃＡＭＰ２と同様、ベクターｐＥＴ１６ｂ内に発現することによりＨｉｓタグ融合タンパク質を含有するものに対してバイオアッセイを行った。ＭｉＡＭＰ２ｃｐｅｐ１および２はそれぞれ実施例１４で特定したＭｉＡＭＰ２ｃ抗微生物ペプチドのＮおよびＣ末端領域である。ＭｉＡＭＰ２ｃｐｅｐ１＋２の濃度値は、各独立したペプチドの濃度である。ＭｉＡＭＰ２ｃｐｅｐ１および２のいずれも、ＭｉＡＭＰ２ｃのおよそ１／２の大きさである。これらのペプチドの活性を、ＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質と比較する場合には、厳密なμｇ／ｍｌ濃度ではなくモルを基順に行わなくてはならない。ペプチドの試験は、Ｃａ²⁺を添加しない培地Ａのみで行った。ＴｃＡＭＰ１および２の配列は一般のデータベースで容易に得ることができるのにもかかわらず、抗微生物活性が今まで見出されていなかったことは、注目に値する。これらの配列は、種子貯蔵機能に関与するものよりかなり大きなタンパク質から誘導される。従って本発明は、ココアヴィシリン分子全体の小さな部分に対する完全に新しい活性を提供するものである。綿断片１，２および３の活性については、他の者が開示している(チャン(Chung，R.P.T)ら、[1997]プラント・サイエンス127:1-16)。実施例１６植物形質転換ベクターＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃの構築発現ベクターｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃ（図１４）はＭｉＡＭＰ２ｃ（実施例７）ＤＮＡの全コーディング領域、その５’末端に隣接しているカリフラワーモザイクウイルスからの３５ＳＲＮＡの強い構造プロモーター（ｐＣａＭＶ３５ｓ）（オーデル(Odel)ら[1985]ネイチャー313:810-812)を含有し、さらに高い転写活性を可能とする4倍の繰り返しエンハンサーエレメント(E-35S)を含む(カイら、[1987]サイエンス236:1299-1302)。ＭｉＡＭＰ２ｃのＤＮＡのコーディング領域はその３’末端に３５ＳＲＮＡカリフラワーモザイクウイルスのポリアデニル化配列（ｐＡ３５Ｓ）を有する。このベクターのプラスミドバックボーンは、プラスミドｐＰＣＶ９１(ワルデン（Walden，R.）ら[1990]メソッズ・モル・セル・バイオール(Methods Mol．Cell．Biol.)1:175-194)である。このプラスミドにはまた、ｎｏｓプロモーター(pnos)に司られるアンピシリン抵抗性遺伝子（ｂｌａ）およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｐｈ）のごとき他の植物形質転換に有用なエレメントもまた含有する。これら、および他の性質によって、様々なクローニング及び形質転換における選択が可能となる。プラスミドｐＰＣ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃは以下のごとく構築した：ＭｉＡＭＰ２ｃ（実施例７）をコード化するクローンニングした断片を制限酵素を用いて消化して合成リーダー配列を含有するＭｉＡＭＰ２ｃ遺伝子断片を遊離させた。バイナリ-ベクターｐＰＣＶ９１をＢａｍＨＩ制限酵素にて消化した。ＭｉＡＭＰ２ｃＤＮＡ断片含有物およびこのバイナリ-ベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、植物形質転換用ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃバイナリーベクターを調製した（図１２）。このアプローチを用い、他のＭｉＡＭＰ２ｃ相同物を植物内に発現させることができる。個々の相同物が発現できるだけでなく、他のタンパク質と共に組み合わせて融合タンパク質として発現してもよいし、またはより大きな前駆体タンパク質の一部として発現させてもよい。例えばＭｉＡＭＰ２ｃクローン１のＮ末端領域(アミノ酸１から〜２４６)は、シグナルペプチドおよび４つの抗微生物セグメントを有する親水性領域を含む。形質転換植物について、個々の断片が植物細胞に既に存在するプロセシング機構により所望の断片にプロセシングされているかどうかについて評価し得る。全ＭｉＡＭＰ２クローン１(アミノ酸１から６６６)を発現させ、そして全タンパク質が形質転換植物に発現された際のプロセシングを試験することも可能である。他の配列からのホモロガスな領もまた、例えば１０またはそれ以上のＭｉＡＭＰ２様断片と様々に組み合わせてそれぞれの断片の間の適当な部位に酸性開裂部位を有する大きな融合タンパク質として発現させて使用し得る。リンキングＭｉＡＭＰ２断片同様、ＭｉＡＭＰ２断片を植物内への発現のための他の有用なタンパク質と連結させることも可能である。実施例１７ＭｉＡＭＰ２ｃ（または関連断片）を発現する形質転換植物安全にした、アグロバクテリウム・テュームファシエンス(Agrobacterium tum efaciens)GV3101株（pMP90RK）(コンズ(Koncz，Cs.)[1986]モル・ジェン・ジェネット(Mol．Gen．Genet.)204:383-396)をベクターｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃ（実施例１６）にて、バン・ホイテ(Van Haute)（EMBO J．2:411-417）1983]) を修正したウォーカーピーチ(Walkerpeach)らの方法（プラント・モル・バイオール・マニュアルＢ１(Plant Mol．Biol．Manual B1):1-19[1994])にて形質転換した。タバコの形質転換は、ホーシュ(Horsch)ら（Horsch et al．[1985]サイエンス 227:1229-1231)の方法に基づき、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)の葉を用いて、ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２含有の株を共培養して、実施した。アグロバクテリウムとタバコ葉の共培養の後に、形質転換植物（ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２で転換）を５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンおよび５００μｇ／ｍｌセフォタキシム含有の培地上で再生した。これらの形質転換植物は、標準ウエスタンブロット法を用いて、新たに導入された遺伝子の発現のために分析され得る（図１５）。図１５は、実施例16で得たＭｉＡＭＰ２ｃの構築体を含有する形質転換タバコからの抽出物のウエスタンブロッドを示す。レーン１は精製ＭｉＡＭＰ２ｃをスタンダードとして含有し、レーン２および３はｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ２ｃ構築体を有する形質転換植物からの抽出物を含む。図からわかるように、かすかなバンドがほぼ正しい分子量の位置に存在し、これは形質転換植物がＭｉＡＭＰ２ｃタンパク質を発現していることを示す。誘導遺伝子を構造的に発現し得る植物を、選択し、自己受粉させて種子を得ることができる。形質転換植物のＦ１世代をさらに解析する。実施例１８ＭｉＡＭＰ２ｃ相同物類試験を行ったＭｉＡＭＰ２ｃの各相同物は全ていくらかの抗微生物活性を示した。この結果は，他の相同物類も抗微生物活性を有するであろうことを示す。これらの相同物には１）ピーナッツ（バークス(Burks，A.W.)ら[1995]ジェイ・クリン・インヴェスト（J．Clin．Invest.）96(4)，1715-1721)，2)トウモロコシ（ベランジャー(Belanger，F.C.)とクリッツ(Kriz，A.L.)[1991]ジェネティクス 129(3)，863-872)，3)大麦（ヘック(Heck，G.R.)ら[1993]モル・ジェン・ジェネット239(1-2)，209-218)，および4)大豆(セバスチアーニ（Sebastiani，F.L.)ら［1990］プラント・モル・バイオール15(1)，197-201）から得られるものが挙げられる(配列番号２１、２２、２４および２５参照)。７Ｓクラスの種子貯蔵タンパク質から得られる他の配列からもまた、ＭｉＡＭＰ２タンパク質の相同物類を得ることができると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/10 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 4/10 14/415 7/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 14/415 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ザ・ステイト・オブ・クイーンズランド・スルー・イッツ・デパートメント・オブ・プライマリー・インダストリーズオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、アン・ストリート80番、プライマリー・インダストリーズ・ビルディング (71)出願人ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランドオーストラリア4067クイーンズランド州セント・ルチア (71)出願人ビューロー・オブ・シュガー・エクスペリメント・ステイションズオーストラリア4068クイーンズランド州インドアルーピリー、マイアーズ・ロード50 番 (71)出願人クイーンズランド・ユニバーシティ・オブ・テクノロジーオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、ジョージ・ストリート２番 (72)発明者マナーズ，ジョン・マイケルオーストラリア4064クイーンズランド州パディントン、ウォーミントン・ストリート 28番 (72)発明者マーカス，ジョン・ポールオーストラリア4075クイーンズランド州コリンダ、ボールダーストーン・ストリート１―10番 (72)発明者グールター，ケネス・クリフォードオーストラリア4074クイーンズランド州ジャンボリー・ハイツ、エンブレム・ストリート26番 (72)発明者グリーン，ジョディ・リンオーストラリア4074クイーンズランド州ジャンボリー・ハイツ、リーフ・クロース４番 (72)発明者バウアー，ニール・アイバンオーストラリア4069クイーンズランド州ケンモア、フォールブルック・ストリート22 番

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質断片が（ｉ）配列番号１の２９から７３までの残基配列番号１の７４から１１６までの残基配列番号１の１１７から１８５までの残基配列番号１の１８６から２４８までの残基配列番号３の２９から７３までの残基配列番号３の７４から１１６までの残基配列番号３の１１７から１８５までの残基配列番号３の１８６から２４８までの残基配列番号５の１から３２までの残基配列番号５の３３から７５までの残基配列番号５の７６から１４４までの残基配列番号５の１４５から２１０までの残基配列番号７の３４から８０までの残基配列番号７の８１から１４０までの残基配列番号８の３３から７９までの残基配列番号８の８０から１１９までの残基配列番号８の１２０から１６１までの残基配列番号２１の３２から９１までの残基配列番号２２の２５から８４までの残基配列番号２４の２９から９４までの残基配列番号２５の３１から８５までの残基配列番号２６の１から２３までの残基配列番号２７の１から１７までの残基配列番号２８の１から２８までの残基から選択されるアミノ酸配列を持つポリペプチド：（ｉｉ）（ｉ）の相同物；（ｉｉｉ）Ｃ−２Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−３Ｘ− Ｃ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインである）の相対システイン間隔を含むポリペプチド；（ｉｖ）Ｚ−２Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｚ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインであり、Ｚはチロシンまたはフェニルアラニンである）の相対システインおよびチロシン／フェニルアラニン間隔を含むポリペプチド；（ｖ）Ｃ−３Ｘ−Ｃ−（１０−１２）Ｘ−Ｃ−３Ｘ−Ｃ（Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｃはシステインである）の相対システイン間隔を含むポリペプチド；（ｖｉ）実質的に（ｉ）と同じシステイン残基の間隔に相対的な、正荷電残基の間隔を持つポリペプチド；および（ｖｉｉ）実質上（ｉ）と同一の抗微生物活性を持つ（ｉ）から（ｖｉ）のうちのいずれか一つであるポリペプチドの断片；から選択される、抗微生物性活性を有するタンパク質断片。２．該ポリペプチド断片が配列番号１、配列番号３または配列番号５を含む配列の中から選択される配列を持つ、請求項１記載の少なくとも一つのポリペプチド断片を含むタンパク質。３．配列番号１、配列番号３または配列番号５から選択される配列を持つタンパク質。４．請求項１記載のポリペプチド断片をコードする単離あるいは合成ＤＮＡ。５．該ＤＮＡが配列番号２、配列番号４、配列番号６から選択された配列を持つ、請求項４記載のＤＮＡ。６．該コードされたタンパク質の発現のためのエレメントに作用的に結合した、請求項４記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。７．請求項６記載のＤＮＡを収容する形質転換植物。８．該植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項７記載の形質転換植物。９．該植物が、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウ、ヒマワリ、トマト、カノーラ、タバコ、コムギ、オオムギ、オート、ポテト、ソラマメ、コットン、カーネーション、バラ、またはソラマメから選択される、請求項７記載の形質転換植物。１０．請求項７記載の形質転換植物の再生物。１１．農学的に許容される担体希釈剤または賦形剤を共に含有する請求項１記載の抗微生物性タンパク質を含む組成物。１２．薬剤学的に許容される担体希釈剤または賦形剤を共に含有する請求項１記載の抗微生物性タンパク質を含む組成物。１３．ｉ）請求項１記載の抗微生物性タンパク質または請求項１１による組成物で該植物を処理すること；またはｉｉ）該植物に請求項６記載のＤＮΛ構築物を導入することを含む、植物の微生物感染を制御する方法。１４．請求項１記載の抗微生物性タンパク質または請求項１２記載の組成物で哺乳動物を治療することを含む、哺乳動物の微生物感染を制御する方法。１５．該哺乳動物がヒトである、請求項１４の方法。１６．ａ）ヘリックス−ターン−ヘリックス構造を形成するアミノ酸配列を得ることまたは設計すること；ｂ）個々の残基を置換して、図４に示されている一または複数のアミノ酸配列と実質上同じ正荷電残基とシステイン残基の分布を得ること；ｃ）化学的にまたは液体培養物中での組換えＤＮＡ技術により、該アミノ酸配列を含むタンパク質を合成すること；ｄ）所望により該システイン残基間のジスルフィド結合を形成すること、の段階を含む、抗微生物性タンパク質を調製する方法。