ES2277352T3 - Proteina antimicrobiana. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UNA NUEVA FAMILIA DE PROTEINAS ANTIMICROBIANAS. SE PUEDE AISLAR UNA PROTEINA PROTOTIPO DE MACADAMIA INTEGRIFOLIA. TAMBIEN SE DESCRIBE DNA QUE CODIFICA LA PROTEINA ASI COMO ESTRUCTURA DE DNA QUE SE PUEDEN UTILIZAR PARA EXPRESAR LA PROTEINA ANTIMICROBIANA O PARA INTRODUCIR LA PROTEINA ANTIMICROBIANA EN UNA PLANTA. SE PUEDEN ADMINISTRAR COMPOSICIONES QUE LLEVAN LA PROTEINA ANTIMICROBIANA O LA PROTEINA ANTIMICROBIANA PER SE A PLANTAS O ANIMALES MAMIFEROS PARA COMBATIR LA INFESTACION MICROBIANA.
Description
Proteína antimicrobiana.
La presente invención se refiere a proteínas
aisladas que ejercen actividad inhibidora sobre el crecimiento de
hongos y bacterias, comprendiendo dichos hongos y bacterias algunos
patógenos microbianos de plantas y animales. La invención se
refiere asimismo a genes recombinantes que incluyen secuencias que
codifican la proteínas antimicrobianas, cuyos productos de
expresión pueden contribuir a la defensa de las células vegetales o
de otras células de organismos contra la invasión de patógenos
microbianos. La invención se refiere además a la utilización de las
proteínas y/o de los genes que codifican las proteínas para el
control de microbios en enfermedades clínicas humanas y
veterinarias.
Las enfermedades microbianas de plantas son un
problema significativo para las industrias agrícolas y hortícolas.
Las enfermedades de las plantas en general producen anualmente
millones de toneladas de pérdidas de cosechas siendo las
enfermedades micóticas y bacterianas responsables de partes
significativas de estas pérdidas. Una posible manera de combatir
las enfermedades micóticas y bacterianas consiste en proporcionar
plantas transgénicas capaces de expresar una proteína o proteínas
que de alguna manera aumentan la resistencia de la planta al ataque
patógeno. Una estrategia sencilla consiste en identificar en primer
lugar una proteína con actividad antimicrobiana in vitro,
clonar la secuencia de ADN que codifica la proteína, preparar un
constructo génico híbrido para la expresión eficaz de la proteína
en las plantas, transferir este gen a las plantas transgénicas y
evaluar el efecto del gen introducido sobre la resistencia a los
patógenos microbianos en comparación con las plantas de
referencia.
La primera y más importante etapa en la
estrategia para el control de la enfermedad descrita anteriormente
consiste en identificar una proteína con actividad antimicrobiana
potente. En los últimos años, se han identificado y descrito muchas
proteínas vegetales diferentes con actividad antimicrobiana y/o
antimicótica. Estas proteínas han sido clasificadas en varias
clases según su modo de acción supuesto y/o sus homologías de
secuencia de aminoácidos. Estas clases incluyen las siguientes:
quitinasas (Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys.
Acta 880:161-170);
\beta-1,3-glucanasas (Manners, J.
D. et al. [1973] Phytochemistry
12:547-553); tioninas (Bolmann, H. et al.
[1988] EMBO J. 7:1559-1565 y Fernández de
Celaya, R. et al. [1972] Appl. Microbiol.
23:998-1000); permatinas (Roberts, W. K. et
al. [1990] J. Gen. Microbiol.
136:1771-1778 y Vigers, A. J. et al. [1991]
Mol. Plant-Microbe Interact.
4:315-323); proteínas inactivadoras de ribosomas
(Roberts, W. K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta
880:161-170 y Leah, R. et al. [1991] J.
Biol. Chem. 266:1564-1573); defensinas vegetales
(Terras, F. R. G. et al. [1995] The Plant Cell
7:573-588); proteínas que se unen a quitina (De
Bolle, M. F. C. et al. [1992] Plant Mol. Biol.
22:1187-1190 y Van Parijs, J. et al. [1991]
Planta 183:258-264); proteínas similares a
taumatina o similares a osmotina (Woloshuk, C. P. et al.
[1991] The Plant Cell 3:619-628 y Hejgaard,
J. [1991] FEBS Letts. 291:127-131); proteínas
de tipo PR1 (Niderman, T. et al. [1995] Plant Physiol.
108:17-27); proteínas no específicas de
transferencia de lípidos (Terras, F. R. G. et al. [1992]
Plant Physiol. 100:1055-1058 y Molina, A.
et al. [1993] FEBS Letts.
3166:119-122); y, proteínas de knottin o similares a
knottin (Cammue, B. P. A. et al. [1992] J. Biol. Chem.
67:2228-2233). Además, las plantas no son la única
fuente de proteínas antimicrobianas y existen muchos informes del
aislamiento de proteínas antimicrobianas de animales y de células
microbianas (estudiado en Gabay, J. E. [1994] Science
264:373-374 y en "Antimicrobial peptides"
[1994] CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley y Sons
Publ., Chichester, UK).
Existen algunas pruebas de que la expresión
ectópica de los genes que codifican proteínas que presentan
actividad antimicrobiana in vitro en plantas transgénicas
puede producir aumento de resistencia a patógenos microbianos.
Ejemplos de esta resistencia manipulada genéticamente incluyen las
plantas transgénicas que expresan genes que codifican: una
quitinasa vegetal, ya sea sola (Broglie, K. et al. [1991]
Science 254:1194-1197) o en combinación con
una \beta-1,3-glucanasa (Van den
Elzen, P. J. M. et al. [1993] Phil. Trans. Roy. Soc.
342:271-278); una defensina vegetal (Terras, F. R.
G. et al. [1995] The Plant Cell
7:573-588); una proteína similar a osmotina (Liu, D.
et al. [1994] Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:1888-1892); una proteína de la clase PR1
(Alexander, D. et al. [1993] Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:7327-7331) y una proteína que inactiva
ribosomas (Logemann, J. et al. [1992] Bio/Technology
10:305-308).
Aunque la utilización potencial de proteínas
antimicrobianas para modificar genéticamente la resistencia a la
enfermedad en plantas transgénicas ha sido descrita extensamente,
existen otras aplicaciones que son dignas de mención. En primer
lugar, pueden utilizarse proteínas antimicrobianas muy potentes para
el control de enfermedades de plantas por aplicación directa (De
Bolle, M. F. C. et al. [1993] en Mechanisms of Plant
Defence Responses, B. Fritig y M. Legrand eds., Kluwer Acad.
Publ., Dordrecht, NL, págs. 433-436). Además, los
péptidos antimicrobianos tienen aplicaciones terapéuticas
potenciales en medicina humana y veterinaria. Aunque esto no ha sido
descrito para los péptidos de origen vegetal se está explorando
activamente en los péptidos de animales y se ha conseguido pruebas
clínicas (Jacob, L. y Zasloff, M. [1994] en "Antimicrobial
Peptides", CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley and
Sons Publ., Chichester, UK, págs. 197-223).
La invención descrita en la presente memoria
constituye una proteína no descubierta anteriormente y nueva con
actividad antimicrobiana. Esta proteína puede aislarse de las
plantas Macadamia integrifolia (Mi). Macadamia
integrifolia pertenece a la familia Proteaceae M.
integrifolia, conocida también como Bauple Nut o Queensland Nut
es considerada por algunos como la mejor nuez comestible del mundo.
Por esta razón se cultiva comercialmente extensamente, tanto en
Australia como en ultramar (Williams, Keith A. W., Native
Plants (Queensland), volumen II, 1984, publicado por
Keith A. W. Williams e impreso por Printcraft de Newstead, Qld,
Australia).
Según una primera forma de realización de la
invención, se proporciona una proteína antimicrobiana aislada o
sintética seleccionada de entre las siguientes:
- (i)
- una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la Figura 6 (SEC. ID. nº: 1);
- (ii)
- un homólogo de (i);
- (iii)
- una proteína que tiene forma tridimensional esencialmente igual que (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i);
- (iv)
- una proteína que incluye un espaciamiento afín a la cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácidos distinto de cisteína; y
- (v)
- una proteína aislada de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i).
Según una segunda forma de realización de la
invención, se proporciona un ADN aislado o sintético que codifica
una proteína según la primera forma de realización.
Según una tercera forma de realización de la
invención, se proporciona un constructo de ADN que incluye un ADN
según la segunda forma de realización unido funcionalmente a
elementos para la expresión de dicha proteína codificada.
Según una cuarta forma de realización de la
invención, se proporciona una célula hospedadora que alberga un
constructo de ADN según la tercera forma de realización.
Según una quinta forma de realización de la
invención, se proporciona una planta transgénica que alberga un
constructo de ADN según la tercera forma de realización.
Según una sexta forma de realización de la
invención, se proporciona material reproductivo de una planta
transgénica según la quinta forma de realización.
Según una séptima forma de realización de la
invención, se proporciona una composición que comprende una proteína
antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un
vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista
agrícola.
Según una octava forma de realización de la
invención, se proporciona una composición que comprende una proteína
antimicrobiana según la primera forma de realización junto con un
vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una novena forma de realización de la
invención, se proporciona un procedimiento de control de la
infestación microbiana de una planta, comprendiendo dicho
procedimiento:
- i)
- introducir un constructo de ADN según la tercera forma de realización en dicha planta; o
- ii)
- tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la primera forma de realización o con una composición según la séptima forma de realización.
Según una décima forma de realización de la
invención, se proporciona un procedimiento de control de la
infestación microbiana de un animal mamífero, procedimiento que
comprende el tratamiento del animal con una proteína antimicrobiana
según la primera forma de realización o con una composición según la
octava forma de realización.
Otras formas de realización de la invención
incluyen procedimientos para producir proteína antimicrobiana.
La Figura 1 presenta un perfil de cromatografía
de intercambio catiónico de la fracción de proteína básica extraída
de nueces de Macadamia con los resultados de un bioanálisis mostrado
por fracciones de interés.
La Figura 2 presenta un perfil de HPLC en fase
inversa de las fracciones 31 y 32 muy inhibidoras tomadas de la
separación por intercambio catiónico y de los correspondientes datos
del bioanálisis.
La Figura 3 presenta un análisis por
SDS-PAGE de MiAMP1 purificada.
La Figura 4 presenta los resultados de un
análisis espectrométrico de masas de MiAMP1.
La Figura 5 representa los resultados de un
análisis espectrométrico de masas de MiAMP1 reducida y
alquilada.
La Figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos
de MiAMP1 junto con una secuencia nucleotídica que codifica la
proteína.
La Figura 7 representa una transferencia Western
de los extractos de proteína de varias especies de Proteaceae
utilizando antisuero de conejo contra MiAMP1.
La Figura 8 es una cartografía del plásmido
pPCV91-MiAMP1.
La Figura 9 es una cartografía del plásmido
pET-MiAMP1.
La Figura 10 representa un gel teñido de
SDS-PAGE utilizado para las muestras de análisis de
cultivos de E. coli transformada y no transformada.
En adelante se utilizan las abreviaturas
siguientes:
- FBS
- suero bovino fetal
- EDTA
- ácido etilendiamintetracético
- LDH
- lactato deshidrogenasa
- MeCN
- cianuro de metilo (acetonitrilo)
- Mi
- Macadamia integrifolia
- MiAMP1
- proteína 1 antimicrobiana de Macadamia integrifolia
- ND
- no determinado
- PCR
- reacción en cadena de polimerasa
- PMSF
- fluoruro de fenilmetilsulfonilo
- SDS-PAGE
- electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida
- TFA
- ácido trifluoroacético
- TPCK
- tosilfenilalanina clorometilcetona
- RACE
- ampliación rápida de los extremos de ADNc
Los presentes inventores han identificado una
nueva clase de proteínas antimicrobianas. Una proteína prototipo
puede aislarse de las semillas de Macadamia integrifolia (en
adelante Mi). La invención proporciona así una proteína
antimicrobiana de por sí así como secuencias de ADN que codifican la
proteína antimicrobiana.
La invención proporciona asimismo un
procedimiento de obtención de proteínas relacionadas procedentes del
tejido vegetal de la familia Proteaceae. Con los anticuerpos
producidos contra un ejemplo concreto de la proteína antimicrobiana
- proteína antimicrobiana de Macadamia integrifolia número
uno (MiAMP1), - es posible identificar el tejido de otras especies
de árboles relacionados con Macadamia integrifolia. Otras
especies de Macadamia así como especies en la categoría más amplia
de la familia Proteaceae son los objetivos primarios de dicha
identificación. De hecho, como se muestra en el Ejemplo 10, dicha
identificación ha sido utilizada para identificar varias especies
que contienen proteínas que están relacionadas con MiAMP1 basadas en
la respuesta antigénica, el tamaño y la localización en el tejido
de la semilla. La identificación de las proteínas relacionadas no
necesita estar limitada a la familia Proteaceae ya que es
probable que otras especies puedan contener también proteínas
similares.
La invención proporciona asimismo una secuencia
de aminoácidos del prototipo de proteína antimicrobiana (Ejemplo
9). A partir de esta secuencia, puede derivarse la secuencia de ADN
que codifica la proteína por traducción inversa de la secuencia de
aminoácidos. El ADN que tiene una secuencia nucleotídica que
codifica la proteína antimicrobiana puede sintetizarse a
continuación químicamente (y/o enzimáticamente) o aislarse del
tejido vegetal de las Macadamias utilizando procedimientos de
clonación normalizados como se describe en los manuales de
laboratorio tales como Current Protocols in Molecular Biology
(copyright 1987-1995, editado por Ausubel F. M.
et al. y publicado por John Wiley & Sons, Inc., impreso
en los EEUU).
La proteína antimicrobiana de por sí manifestará
una determinada estructura tridimensional que puede determinarse
utilizando técnicas de cristalografía de rayos X o resonancia
magnética nuclear. Esta estructura será responsable en gran parte
de la actividad antimicrobiana de la proteína. A partir de la
secuencia de la proteína, es posible asimismo hacer predicciones
que se refieren a posibles configuraciones y motivos estructurales
(estructura secundaria) que probablemente serán exhibidos por la
proteína. Se apreciará que un experto en la materia pueda tomar una
proteína de estructura conocida y alterar significativamente la
secuencia e incluso conservar la forma tridimensional general y la
actividad antimicrobiana de la proteína. Un aspecto de la estructura
es probablemente no pudiera alterarse sin graves consecuencias en
el contenido de cisteína y el espaciado de los restos de cisteína
ya que esto destruiría la formación de los enlaces disulfuro que son
críticos para mantener la estructura general de la proteína. Otros
restos que probablemente sean críticos al determinar la forma y
función de la proteína son la glicina y la prolina que suponen
configuraciones únicas en los ejes centrales de las proteínas.
Asimismo, la distribución de restos con carga (es decir, arginina,
lisina, histidina, glutamato y aspartato) en el espacio
tridimensional de la proteína serán importantes para la estructura y
la actividad que se presenta. En particular, se ha demostrado que
una densidad elevada de restos con carga positiva proporciona
actividad antimicrobiana en una variedad de proteínas (Pathak et
al. [1995] PROTEINS: Structure, Function and Genetics
22:182-186).
Las secuencias de ADN que codifican estas
proteínas puede deducirse utilizando las tablas de codones
habituales. Utilizando este número finito de posibles secuencias de
ADN, pueden derivarse sondas oligonucleotídicas y utilizarse para
aislar el gen o genes existente(s) (Ejemplo 11) así como
secuencias de referencia. Es posible también sintetizar
químicamente el gen utilizando un instrumento de síntesis de ADN
habitual (tal como un instrumento Beckman Oligo 1000) junto con
técnicas conocidas para construir fragmentos de gen sintetizados en
un gen completo (véase Current Protocols in Molecular Biology,
supra).
Este gen, bajo el control de un activador
constitutivo o inducible (Ejemplos 12 y 14), puede clonarse a
continuación en un sistema biológico que permite la expresión de la
proteína (Ejemplos 13 y 15). Son conocidos los procedimientos de
transformación que permiten a la proteína expresarse en una variedad
de sistemas. La proteína puede de esta manera expresarse en
cualquier sistema adecuado a fin de producir la proteína para su
utilización posterior. Los hospedadores adecuados para la expresión
de esta proteína incluyen E. coli, células de hongos, células
de insecto, células de mamífero y plantas. Los procedimientos
normalizados para expresar las proteínas en dichos hospedadores se
describen en una variedad de textos que se incluyen en el apartado
16 (Protein Expression) de Current Protocols in Molecular
Biology (supra).
Las células vegetales pueden transformarse con
constructos de ADN de la invención según una variedad de
procedimientos conocidos (Agrobacterium, plásmidos Ti,
electroporación, microinyecciones, pistola de microproyectiles y
similares). Para la expresión en plantas, la secuencia de ADN que
codifica, MiAMP1, por ejemplo, se utilizaría junto con una
secuencia de ADN que codifica la secuencia de péptido señal
heteróloga que dirigiría la proteína a un compartimento celular
concreto (p. ej., al apoplasto o la vacuola). Estas secuencias de
codificación podrían estar ligadas a una secuencia activadora de la
planta que aseguraría la expresión acusada en las células vegetales.
Esta secuencia activadora puede asegurar la expresión constitutiva
acusada de la proteína en la mayoría o en todas las células
vegetales, puede ser un activador que asegure la expresión en los
tejidos o células específicos que son susceptibles a las
infecciones microbianas y puede ser también un activador que asegure
la inducción acusada de la expresión durante el proceso de
infección. Estos tipos de casetes génicos incluirán asimismo una
terminación de la transcripción y una secuencia 3' de
poliadenilación de la zona de codificación de MiAMP para asegurar
la producción y la estabilización eficaz del ARNm que codifica la
MiAMP. Es posible que la expresión eficaz de la MiAMP pueda
facilitarse por inclusión de su secuencia de ADN en una secuencia
que codifica una proteína mucho mayor que se procesa en la planta
para producir una o más moléculas activas de MiAMP. Los casetes
génicos que codifican MiAMP tal como se describió anteriormente
pueden expresarse a continuación en células vegetales utilizando
dos procedimientos corrientes. En primer lugar, los casetes génicos
podrían ligarse en vectores binarios que llevan, i) secuencias en
el extremo izquierdo y derecho que flanquean el
T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens, ii) un gen marcador seleccionable adecuado para la
selección de células vegetales resistentes a antibióticos, iii)
orígenes de replicación que funcionan en A. tumefaciens o
Escherichia coli y iv) genes con resistencia a antibióticos
que permiten la selección de células que llevan plásmidos de A.
tumefaciens y E. coli. Este vector binario que lleva el
gen híbrido que codifica a MiAMP1 podría introducirse por
electroporación o por acoplamiento tripaterno en cepas de A.
tumefaciens que llevan plásmidos de Ti desarmados tales como
las cepas LBA4404, GV3101 y AGL1 o en las cepas de A.
rhizogenes tales como R4 o NCCP1885. Estas cepas de
Agrobacterium pueden cultivarse conjuntamente a continuación
con explantes vegetales adecuados o tejido vegetal intacto y las
células vegetales transformadas y/o los regenerantes seleccionarse
utilizando la resistencia al antibiótico (Ejemplos 12 y 13). La
expresión de la proteína MiAMP1 en las plantas transgénicas puede
detectarse utilizando anticuerpos producidos contra la proteína o
utilizando bioanálisis antimicrobiano. Un segundo procedimiento de
transferencia génica a plantas puede conseguirse mediante la
inserción directa del gen en las células vegetales diana. Por
ejemplo, el casete génico que codifica a MiAMP1 puede precipitarse
conjuntamente en partículas de oro o tungsteno junto con un plásmido
que codifica un gen híbrido para la resistencia a antibióticos en
plantas. Las partículas de tungsteno pueden acelerarse utilizando un
flujo rápido de gas helio y permitir que las partículas bombardeen
un tejido vegetal adecuado. Éste puede ser un cultivo celular
embrionario, un explante vegetal, un tejido calloso o una suspensión
celular o un meristema intacto. Las plantas pueden recuperarse
utilizando el gen con resistencia al antibiótico para la selección y
los anticuerpos utilizarse para detectar células vegetales que
expresan la proteína MiAMP1. Estos y otros procedimientos
relacionados para la expresión de la MiAMP1 en plantas se describen
en "Plant Molecular Biology" (2ª ed., editada por Gelvin, S. B.
y Schilperoort, R. A., © 1994 publicado por Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, Países Bajos).
Tanto las plantas monocotiledóneas como las
dicotiledóneas pueden transformarse y regenerarse. Las plantas que
pueden modificarse genéticamente incluyen granos, cultivos de
forraje, frutos, vegetales, cultivos de semilla y de aceite,
palmeras, silvicultura y vinos. Ejemplos específicos de plantas que
pueden modificarse son los siguientes: maíz, plátanos, cacahuete,
guisantes, girasol, tomates, canela, tabaco, trigo, cebada, avena,
patatas, soja, algodón, clavel, sorgo, altramuz y arroz. Éstos, así
como otras plantas agrícolas, pueden transformarse con los genes
antimicrobianos de modo que presenten un mayor grado de resistencia
al ataque patógeno. Alternativamente, pueden utilizarse proteínas
para el control de enfermedades por aplicación tópica.
La invención se refiere también a la aplicación
de la proteína antimicrobiana en el control de patógenos de
mamíferos incluyendo los humanos. La proteína puede utilizarse en
aplicaciones tópicas o intravenosas para el control de infecciones
microbianas.
Como se indicó anteriormente, se ha identificado
y caracterizado una nueva clase de proteína antimicrobiana potente
(aislada de las semillas de Mi). La clase incluye un factor proteico
específico, denominado MiAMP1 como se definió anteriormente. La
proteína es muy básica con un valor pI previsto de 10,1 y contiene 6
restos de cisteína (Ejemplos 8 y 9) que se supone que son
importantes en la creación de la estructura tridimensional de la
proteína mediante la formación de enlaces disulfuro. Además, la masa
molecular relativa de la proteína se ha determinado por
espectrometría de masas que se demuestra que es de 8.134 \pm 2 Da.
La secuencia de aminoácidos no comparte ninguna homología
significativa con las proteínas descritas anteriormente en las bases
de datos de la secuencia (Swiss Prot y bases de datos no
redundantes) investigadas utilizando el algoritmo blast (Altschul,
S. F. et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403)
construyendo éste una proteína antimicrobiana desconocida hasta
ahora. La proteína no se ajusta a ninguna de las clases descritas
anteriormente de proteínas antimicrobianas de ninguna de las
fuentes vegetales, animales o microbianas.
La proteína MiAMP1 presenta una gama amplia de
actividad antimicótica (Ejemplo 4). MiAMP1 presenta una inhibición
muy significativa del crecimiento micótico a concentraciones tan
bajas como 1 \mug/ml para alguno de los patógenos/microbios
contra los que se probó la proteína con valores de IC_{50} tan
bajos como 2 \mug/ml. Por lo tanto, puede utilizarse para
proporcionar protección contra varias enfermedades vegetales. MiAMP1
puede utilizarse como fungicida o antibiótico mediante aplicación a
partes de la planta. La proteína puede utilizarse también para
inhibir el crecimiento de patógenos expresándolos en todas las
plantas transgénicas (Ejemplo 13). La proteína puede utilizarse
para el control de los patógenos humanos por aplicación tópica o
inyección intravenosa. Una característica de la proteína consiste
en que la inhibición de algunos microbios se suprime por la
presencia de Ca^{2+} (1mM).
Haciendo referencia de manera específica a las
formas de realización de la invención definidas anteriormente, una
proteína antimicrobiana preferida según la primera forma de
realización es MiAMP1. Esta proteína tiene una secuencia
correspondiente a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la
Figura 6 (SEC. ID. nº: 1).
Las proteínas antimicrobianas según la invención
pueden aislarse por cualquiera de los procedimientos conocidos por
los expertos en la materia incluyendo el procedimiento ejemplificado
en la presente memoria. Las proteínas antimicrobianas pueden
sintetizarse bien por vía química o enzimática. Estos procedimientos
de nuevo serán conocidos por los expertos en la materia y se
describen, por ejemplo, en Hancock, D. C. et al. (1995)
Mol. Biotech. 4(1):73-86, y Wong, C.
H. y Wang, K. T. (1991) Experientia (Basel)
47(11-12):1123-1129.
Un homólogo de la proteína de la Figura 6 se
define como una proteína que presenta sustancialmente la misma
secuencia de aminoácidos que la secuencia mostrada en la figura.
Esto significa que la mayoría de los restos presentes en MiAMP1
estarán presentes en un homólogo en la misma posición relativa entre
sí o estará representado por otro resto de aminoácido que contenga
una cadena lateral con propiedades similares. Por ejemplo, es
posible frecuentemente intercambiar asparagina y ácido aspártico;
alanina y glicina; serina, treonina y alanina; isoleucina, valina y
leucina; así como lisina y arginina; mientras que, los restos de
cisteína e histidina pueden ser sustituidos raras veces con otros
aminoácidos (Bordo, D. y Argos, P. [1991] J. Mol. Biol.
217:721-729). Un experto en la materia apreciará
que un homólogo pueda tener muchas sustituciones conservadoras
aparte de los ejemplos ya mencionados. Haciendo referencia a la
tercera forma de realización de la invención, el término
"constructo" incluye vectores tales como plásmidos, cósmidos,
virus y similares, así como ADN desnudo de por sí. Los elementos de
control que pueden incluirse en los constructos son conocidos por
los expertos en la materia. Ejemplos de dichos elementos son los
activadores, los potenciadores, las señales de poliadenilación y
los terminadores de transcripción.
El material reproductivo de un vegetal
transgénico, como el referido en la sexta forma de realización,
incluye semillas, plantas de la descendencia y material clonal.
Como se aborda en las séptima y octava formas de
realización de la invención definidas anteriormente, las proteínas
antimicrobianas según la primera forma de realización pueden
incluirse en las composiciones para la administración a plantas y
animales mamíferos. Una proteína antimicrobiana puede estar presente
en una composición como sal de la proteína. Dichas sales serán
conocidas por los expertos en la materia como dispone la naturaleza
de los vehículos, diluyentes o excipientes que puedan incluirse en
las composiciones. Por ejemplo, el vehículo presente en una
composición farmacéutica puede ser un tampón fisiológicamente
compatible tal como la solución de Hank o de Ringer, la solución
salina fisiológica, una mezcla constituida por solución salina y
glucosa, y solución heparinizada de citrato sódico-ácido cítrico y
dextrosa. La composición farmacéutica puede administrarse por vía
oral o parenteral según el objeto del tratamiento, y puede
prepararse en polvo, gránulos, una solución para administración por
inyección u oral, comprimidos, supositorios, óvulos vaginales,
pomada, crema, gel o aerosol. Las composiciones para utilización
agrícola se administran típicamente por atomización.
Las composiciones pueden incluir otros agentes
antimicrobianos además de una proteína antimicrobiana según la
invención. Dichos agentes serán típicamente un agente
antimicótico.
Los ejemplos no limitativos de la invención se
exponen a continuación.
Veinticinco kilogramos de nueces de Mi
(adquiridas en la Macadamia Nut Factory Queensland, Australia) se
molieron en un procesador de alimentos (The Big Oscar, Sunbeam) y
la harina resultante se extrajo durante 2 a 4 horas a 4ºC con 50 l
de un tampón de extracción enfriado en hielo que contenía
NaH_{2}PO_{4} 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 15 mM, KCl 100 mM, EDTA
2 mM, polivinilpirrolidona al 0,75% y fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM. El homogeneizado resultante se
pasó a través de un colador de cocina para eliminar el material en
partículas mayores y a continuación se clarificó más por
centrifugación (4.000 rpm durante 15 min.) en una centrifugadora de
gran capacidad. Se añadió sulfato amónico sólido al sobrenadante
para obtener 30% de saturación relativa y el precipitado se dejó
formar toda la noche en agitación a 4ºC. Después de la
centrifugación a 4.000 rpm durante 30 min., se extrajo el
sobrenadante y se añadió sulfato amónico para conseguir 70% de
saturación relativa. Se dejó precipitar la solución durante a noche
y a continuación se centrifugó a 4.000 rpm durante 30 min. para
recoger la fracción proteica precipitada. La proteína precipitada se
volvió a poner en suspensión en un volumen mínimo de tampón de
extracción y se centrifugó una vez más (13.000 rpm \times 30 min.)
para eliminar la fracción no disuelta. Después de la diálisis
(etanolamina 10 mM pH 9,0, EDTA 2 mM y PMSF 1 mM) para eliminar el
sulfato amónico residual, la solución proteica se pasó a través de
una columna Q-Sepharose Fast Flow (5 \times 12
cm) equilibrada previamente con etanolamina 10 mM (pH 9) en EDTA 2
mM.
El flujo a través recogido de esta columna
representa la fracción proteica básica (pI > 9) de las semillas.
Esta fracción se continúa purificando tal como se describe en el
Ejemplo 3.
En general, los bioanálisis para evaluar la
actividad antimicótica y antibacteriana se realizaron en placas de
microvaloración de 96 pocillos. Típicamente, el organismo de ensayo
se puso en suspensión en un medio de cultivo sintético constituido
por K_{2}HPO_{4} (2,5 mM), MgSO_{4} (50 \muM), CaCl_{2}
(50 \muM), FeSO_{4} (5 \muM), CoCl_{2} (0,1 \muM),
CuSO_{4} (0,1 \muM), Na_{2}MoO_{4} (2 \muM),
H_{3}BO_{3} (0,5 \muM), Kl (0,1 \muM), ZnSO_{4} (0,5
\muM), MnSO_{4} (0,1 \muM), glucosa (10 g/l), asparagina (1
g/l), metionina (20 mg/l), mio-inositol (2 mg),
biotina (0,2 mg/l), tiamina-HCl (1 mg/l) y
piridoxina-HCl (0,2 mg/l). El organismo de ensayo
estaba constituido por células bacterianas, esporas de hongos
(50.000 esporas/ml) o fragmentos de micelio de hongos (producidos
por mezclado de una masa de hifas procedentes de un cultivo del
hongo que va a ensayarse y a continuación filtrando a través de una
malla fina para eliminar las masas de hifas mayores). En cada
pocillo de la placa de microvaloración se colocaron cincuenta
microlitros del organismo de ensayo suspendidos en el medio. Se
añadieron 50 \mul más de la solución antimicrobiana de ensayo a
los pocillos apropiados. Para tratar la variabilidad pocillo a
pocillo en el bioanálisis, se realizaron 4 réplicas de cada
solución de ensayo. Se utilizaron dieciséis pocillos de cada placa
de 96 pocillos como referencias para comparación con las soluciones
de ensayo.
A menos que se indique de otra manera, el
organismo de ensayo utilizado fue Phytophthora cryptogea y la
incubación fue a 25ºC durante 48 horas. Todos los hongos incluyendo
la levadura se cultivaron a 25ºC y E. coli se cultivó a
37ºC. El porcentaje de inhibición del crecimiento se midió siguiendo
la absorbancia a 600 nm de los cultivos en crecimiento durante
varios intervalos de tiempo y se define como 100 veces la relación
del cambio medio en la absorbancia en los pocillos de referencia
menos el cambio de absorbancia en el pocillo de ensayo dividido por
el cambio medio de absorbancia a 600 nm para los pocillos de
referencia (es decir [(cambio medio en los pocillos de referencia -
cambio en el pocillo de referencia) / (cambio medio en los pocillos
de referencia)] \times 100). Típicamente, se tomaron mediciones a
intervalos de 24 horas y se utilizó el periodo de 24 a 48 horas
para las mediciones de % de inhibición.
El material de partida para el aislamiento de la
proteína antimicrobiana Mi fue la fracción básica extraída de las
semillas maduras tal como se describió anteriormente en el Ejemplo
1. Esta proteína se siguió purificando por cromatografía de
intercambio catiónico como se muestra en la Figura 1.
Aproximadamente 4 g de la fracción proteica
básica disueltos en succinato sódico 20 mM (pH 4) se aplicaron a
una columna S-Sepharose High Performance (5 \times
60 cm) (Pharmacia) equilibrada previamente con el tampón de
succinato. Se eluyó la columna a 17 ml/min con un gradiente lineal
de 20 litros de NaCl desde 0 hasta 2 M en succinato sódico 20 mM
(pH 4). Se controló el eluído para la proteína mediante una medición
en línea de la absorbancia a 280 nm (véase Figura 1) y se recogió
en fracciones de 200 ml. Las porciones de cada fracción se
determinaron posteriormente en el ensayo de actividad antimicótica a
una concentración de 100 \mug/ml. Los resultados de este
bioanálisis están incluidos en la Figura 1: las barras sombreadas
representan el porcentaje de inhibición mostrando la fracción más
activa el 100% de inhibición. El fraccionamiento proporcionó
numerosos picos no resueltos eluyendo entre 0,05 y 1 M de NaCl. Un
pico mayor eluyendo a aproximadamente 6 horas en la separación
(fracciones 31 y 32) presentó la actividad antimicrobiana más
significativa.
Las fracciones que presentan actividad
antimicrobiana significativa se continuaron purificando por
cromatografía en fase inversa. Cantidades de aproximadamente 1 mg
de las fracciones 31 y 32 combinadas se cargaron en una columna
Pep-S (C_{2}/C_{18}) (25 \times 0,93 cm)
(Pharmacia) equilibrada con 95% de H_{2}O/5% de MeCN/0,1% de TFA
(=100% de A). La columna se eluyó a razón de 3 ml/min con un
gradiente lineal de 300 ml (100 min.) desde 100% de A hasta 5% de
H_{2}O/95% de MeCN/0,1% de TFA (=100% de B). Los picos
individuales se recogieron manualmente, se secó al vacío tres veces
para eliminar los vestigios de TFA y se volvieron a poner en
suspensión posteriormente en 500 \mul de agua
milli-Q (sistema de purificación de agua de
Millipore Corporation) para su utilización en bioanálisis tal como
se describe en el Ejemplo 2. La Figura 2 presenta el perfil de HPLC
de la fracción 31/32 purificada procedente de la separación por
intercambio catiónico mostrada en la Figura 1. La elución de la
proteína se controló a 214 nm. La actividad antimicrobiana fue
bioanalizada en los picos individuales: las barras en la Figura 2
muestran la inhibición correspondiente a 100 \mug/ml de material
de cada uno de los picos. La proteína activa que constituye el pico
7 que eluye a aproximadamente 47 min (35% de MeCN) se denominó
MiAMP1.
MiAMP1 se purificó como en el Ejemplo 3. Se
determinó la potencia antimicrobiana tal como se describió
anteriormente en el Ejemplo 2. La Tabla 1 a continuación presenta
el índice IC_{50} de MiAMP1 pura cuando se determina frente a
varios hongos y bacterias. En la tabla, ">100" indica que no
se determinaron las concentraciones mayores de 100 \mug/ml;
"<x" indica que no se determinó una concentración menor del
valor (x). La abreviatura "ND" indica que no se realizó el
ensayo o que no se pudieron interpretar los resultados. La proteína
antimicrobiana se determinó también en presencia de Ca^{2+} 1 mM
en el ensayo medio y los índices IC_{50} para estos ensayos se
dan en la columna de la izquierda. Como puede apreciarse en la
tabla, la actividad inhibidora de MiAMP1 está reducida en gran
medida (aunque no completamente eliminada) en presencia de
Ca^{2+}.
| Organismo | IC_{50} (\mug/ml) | IC_{50} + Ca^{2+} |
| Alternaria helianthi | 2-5 | > 100 |
| Aspergillus fumigatus | > 100 | > 100 |
| Botrytis cinerea | 2-5 | > 100 |
| Candida albicans | > 100 | > 100 |
| Ceratocystis paradoxa | 20 | 75 |
| Colletotrichum falcatum | > 100 | > 100 |
| Colletotrichum gloeosporioides | 2-5 | > 100 |
| Fusarium oxysporum | 2-5 | 100 |
| Leptosphaeria maculans | 5 | > 100 |
| Macrophomina phaseolina | <25 | > 100 |
| Microsporum gypseum | > 100 | > 100 |
| Phytophthora cryptogea | 5-10 | > 100 |
| Pythium graminicola | 5 | > 100 |
| Organismo | IC_{50} (\mug/ml) | IC_{50} + Ca^{2+} |
| Sclerotinia sclerotiorum | 5 | > 100 |
| Sclerotium rolfsii | > 100 | > 100 |
| Verticillium dahliae | 2-5 | > 100 |
| Saccharomyces cerevisiae | ND | 1-5 |
| Clavibacter michiganensis | <10 | <10 |
| Pseudomonas rubrilineans | > 100 | > 100 |
| Escherichia coli | > 100 | ND |
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que MiAMP1 puede ser una proteína útil para
expresarse en las plantas agrícolas transgénicas, los investigadores
determinaron si MiAMP1 era tóxica para las células vegetales. Se
cultivaron cultivos de microcallos de tabaco (Nicotiana
plumbaginofolia) en medio CSV modificado (Gibson, 1976 nº 219)
en la oscuridad con agitación a 110 rpm a 28ºC como para el
procedimiento descrito en Gibson et al. (Gibson et al.
[1976] Plant 128:223-229). Alícuotas de
cincuenta microlitros de proteína antimicrobiana esterilizada por
filtración en medio 1 \times CSV se añadieron a 50 \mul de
suspensiones celulares vegetales para obtener una concentración
final de 100 \mug/ml. Después de incubación durante la noche a
28ºC, se realizó un ensayo con fenosafranina más diacetato de
fluoresceína para estimar la viabilidad celular. Se añadieron
cincuenta microlitros de solución madre de FDA (5 mg/ml en acetona)
a 2,5 ml de solución madre PS (0,05% en medio de cultivo) para
preparar la mezcla colorante (Widholm, J. M. [1972] Stain
Technology 47:189-194). Una gota del colorante
mezclado se añadió a una gota de suspensión celular y se observó a
continuación al microscopio de campo brillante y al microscopio de
excitación de UV para determinar la viabilidad celular. Se utilizó
una solución al 0,1% de Triton X-100 como referencia
positiva en estos experimentos. Los cultivos de microcallos del
tabaco no presentaban ninguna disminución de viabilidad medida por
el número de células fluorescentes (tinción con diacetato de
fluoresceína) ni ningún aumento en el número de células muertas
(tinción con fenosafranina) en la exposición a MiAMP1 a
concentraciones hasta de 100 \mug/ml durante hasta 72 horas.
Se realizaron ensayos de toxicidad con cultivos
de células HeLa para investigar la toxicidad de MiAMP1 para con las
células humanas. Se mantuvo un cultivo de células HeLa en un cultivo
de monocapa a 37ºC con 5% de CO_{2} en medio RPMI 1640 modificado
(Trace Biosciences, NSW, Australia). Se enriqueció medio RPMI con
suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM,
2 g/l de NaHCO_{3} más penicilina G (10.000 U/l) y sulfato de
estreptomicina (100 g/l). Cantidades de cien microlitros de células
recién recogidas y diluidas se transfirieron a placas de
microvaloración (10^{4} - 10^{5} células por pocillo). Una vez
las células se habían llegado a acoplar y casi confluentes, se
eliminó el sobrenadante y se reemplazó con 100 \mul de proteína
antimicrobiana esterilizada por filtración previamente suspendida
en 1 \times medio de cultivo celular. Se añadieron por triplicado
concentraciones de hasta 1 mg/ml de proteína antimicrobiana a
pocillos que contenían una microcapa de células HeLa y los cultivos
se incubaron a continuación durante la noche a 37ºC con 5% de
CO_{2}. Las células se incubaron también en presencia de
hordotionina a concentraciones entre 10 y 400 \mug/ml como
referencias positivas. Tras la incubación, se eliminó el
sobrenadante, se enjuagaron las células con 2\times solución
salina tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 1,5 mM,
K_{2}HPO_{4} 8 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 135 mM a 37ºC) y se tiñeron
a continuación con colorante rojo neutro (Terras, F. R. G. et
al. [1992] J. Biol. Chem.
267:15301-15309). En el sobrenadante del cultivo se
determinó asimismo la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) como
una medición de la muerte celular (Legrand [1992] J.
Biotech. 25:231-243). Además de la determinación
en el medio normal, se determinaron también las células en el medio
que carece de FBS debido a la posibilidad de que FBS pueda
enmascarar la toxicidad.
La viabilidad o proliferación celular no se
afectó a concentraciones tan elevadas como 1 mg/ml tal como se
demostró por examen microscópico y cuantificación de la absorción de
colorante tras la tinción. En cambio, la hordotionina (una proteína
conocida por ser antibiótico para con las células humanas) produjo
una pérdida completa de viabilidad celular a concentraciones de 10
\mug/ml y superiores. La falta de efecto sobre la viabilidad
celular de MiAMP1 se confirmó midiendo las concentraciones de LDH en
sobrenadantes de cultivo que no presentaban ningún cambio en las
concentraciones.
Además de los ensayos de viabilidad celular, se
realizaron ensayos hemolíticos con eritrocitos humanos según Cammue
(Cammue, B. P. A. et al. [1995] Plant Physiol.
109:445-455). Se lavaron los eritrocitos humanos
varias veces volviendo a poner en suspensión las células en fosfato
10 mM, NaCl 120 mM, KCl 27 mM (pH 7,2), mezclando suavemente y
sedimentando las células con centrifugación suave (3 min., 300 g).
Cuando el sobrenadante no presentaba ninguna decoloración visible,
se volvieron a poner en suspensión las células en PBS para obtener
una suspensión al 0,5%. Se añadieron alícuotas de 100 \mul a
pocillos de placa de microvaloración. Se añadieron soluciones
proteicas (100 \mul) a pocillos individuales para conseguir
concentraciones finales entre 10 y 500 \mug/ml. Se utilizó Triton
X-100 (concentración final del 0,05%) como
referencia positiva para hemolisis y se utilizó agua como
referencia negativa. Se incubaron las suspensiones celulares durante
1 h a 37ºC, se centrifugó la placa de microvaloración a 300 g,
10ºC, durante 5 min y el sobrenadante se transfirió a una placa
fresca tras lo cual se midió la absorbancia (405 nm). Estos ensayos
no mostraron ninguna lisis de glóbulos rojos en el momento de la
exposición a MiAMP1 a concentraciones hasta de 100 \mug/ml. Los
resultados contrastan con los péptidos antimicrobianos de tionina
(p. ej. hordotionina) que se ha descrito que producen la destrucción
de los eritrocitos cultivados a concentraciones entre 5 y 40
\mug/ml (Terras, F. R. G. et al. [1992] J. Biol.
Chem. 267:15301-15309).
Se verificó la pureza de la proteína
antimicrobiana aislada por SDS-PAGE natural seguido
de tinción con solución de tinción de proteínas azul coomassie
(véase Figura 3). Se realizó la electroforesis en un gel con
gradiente entre el 10 y el 20% de tricina (Novex) siguiendo las
recomendaciones de los fabricantes (100 V, tiempo de separación de
1 a 2 horas). Se incluyen las normas (Kaleidascope polypeptide
standards, Biorad) en la banda 3, para determinar un peso molecular
aproximado de la proteína.
En la Figura 3 puede apreciarse que la MiAMP1
purificada migra a aproximadamente 8 kDa junto con la aprotinina en
patrones de peso molecular (P.M. de los patrones que aparecen desde
la parte superior a la inferior en la Figura 3: 38,6 kDa, 25,0 kDa,
16,3 kDa, 7,8 kDa, 3,4 kDa). La detección de una única banda
principal en el análisis SDS-PAGE junto con un
único pico que eluye en intercambio catiónico analítico y
separaciones en fase inversa (no mostradas), proporciona una
indicación acusada de que la actividad de la MiAMP1 era debido a la
proteína purificada sola y no a un componente contaminante
menor.
MiAMP1 purificada se sometió a análisis
espectroscópico de masas. Se utilizó aproximadamente 1 \mug de
proteína en solución para el análisis. El análisis demostró que la
proteína tiene un peso molecular de 8.134 Da \pm 2 Da (véase la
Figura 4). Además, la proteína se sometió a reducción de enlaces
disulfuros con ditiotreitol y alquilación con
4-vinilpiridina. El producto de esta
reducción/alquilación se sometió también a continuación a análisis
espectroscópico de masas y se demostró que había ganado 638 unidades
de masa (es decir, el peso molecular aumentó hasta 8.773 \pm 2
Da, véase la Figura 5). La ganancia de masa se interpretó que
indicaba que seis grupos 4-vinilpiridina (masa 106
Da) habían reaccionado con la proteína reducida, lo que indica que
la proteína contiene un total de 6 restos de cisteína. El contenido
de cisteína se ha confirmado también posteriormente por secuenciado
de aminoácidos y de nucleótidos (véase los Ejemplos 9 y 11).
Aproximadamente 1 \mug de la proteína pura que
había sido reducida y alquilada se sometió a secuenciado
N-terminal por degradación automática de Edman. En
un primer secuenciado, se determinaron 35 restos de la secuencia.
Posteriormente, se digirió MiAMP1 con la endoproteinasa
Lys-C que escinde después el grupo carboxilo de los
restos lisilo. Se digirió un miligramo de la proteína
reducida/alquilada con Lys-C (Boehringer Mannheim)
siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se purificaron los
fragmentos por HPLC en fase inversa y se secuenciaron. Utilizando
este digesto, se determinó la secuencia de la proteína hasta el
resto 68. Tras la digestión del fragmento Lys-C con
la enzima de endoproteinasa (TPCK tratada, Sigma) proporcionó dos
fragmentos. El secuenciado ulterior proporcionó dos restos
adicionales de la secuencia para dar 70 restos de la secuencia
parcial (véase la Figura 6 para la secuencia completa de la
proteína madura). Posteriormente, los 6 aminoácidos restantes se
dedujeron de la secuencia del ADN (véase Figura 8) para dar la
secuencia de la proteína completa de 76 restos de aminoácidos. La
Figura 6 presenta la secuencia de la proteína madura (encasillada)
así como la secuencia del péptido señal (subrayada) determinada a
partir de la secuencia del ADNc (Ejemplo 8). El comienzo ATG de la
traducción y los codones de terminación TAG están también subrayados
en la secuencia nucleotídica presentada anteriormente en la
secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína
que se ha determinado, fue posible para predecir la masa de la
proteína. Utilizando el programa informático MacVector 4.5.3, se
obtuvo una masa prevista de 8.137,51 Da. Dependiendo del número de
enlaces disulfuros que se formen, la masa de proteína estará
comprendida entre 8.131,5 y 8.137,5 Da. Esta es una coincidencia
estrecha con la masa de 8.134,4 \pm 2 Da obtenida por análisis
espectrométrico de masas (Ejemplo 5) incluso si la proteína forma
supuestamente 3 enlaces disulfuros (disminuyendo la masa en 6 Da).
Dado que la masa de la proteína medida por espectrometría de masas
y la masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos
coincidió casi exactamente, la secuencia de aminoácidos se
interpretó que es correcta.
Se inmunizaron por vía intramuscular conejos
según los protocolos normalizados con MiAMP1 conjugada con vacuna
contra la difteria en suspensión en adyuvante incompleto de Freund.
Se extrajo suero de los animales a intervalos regulares
administrando después a los animales dosis añadidas de adyuvante
MiAMP1 para potenciar la respuesta inmunitaria. Se extrajeron
aproximadamente 100 ml de suero y se utilizaron para identificar los
extractos en bruto obtenidos de varias semillas vegetales. Se
cultivaron cantidades de cien gramos de semillas y se extrajeron
para obtener un extracto en bruto como en el Ejemplo 1. Se separaron
alícuotas que contenían cantidades de 5 y 50 \mug en geles de
SDS-PAGE y los geles se transfirieron a continuación
sobre membrana de nitrocelulosa para la detección ulterior de las
proteínas antigénicas. Se incubaron las membranas con anticuerpos
primarios de conejo MiAMP1, se lavaron y a continuación se
incubaron con IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa
alcalina para la detección colorimétrica de las bandas antigénicas
utilizando el sistema de sustrato químico fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul
tetrazolio (Schleicher y Schuell). En la Figura 7 se representa una
membrana teñida.
La Figura 7 demuestra que varias especies de
Proteaceae contienen proteínas relacionadas antigénicamente
de tamaño similar a MiAMP1. Las bandas 1 a 22 contienen los
extractos siguientes: 1) Persoonia levis, 2) Stirlingia
simplex, 3) Isopogon trilobus, 4) Protea pulchra,
5) Cardwellia sublimis, 6) Stenocarpus sinuatus, 7)
Telopea oreades, 8) Xylomelum protocea, 9)
Macadamia integrifolia, 10) Grevillea robusta, 11)
Hakea platysperma, 12) Banksia asplenifolia, 13)
Banksia robur, 14) MiAMP1 (pura), 15) arroz, 16) cebada, 17)
garbanzo, 18) judía mungo, 19) Flindersia australis, 20)
rábano, 21) canela, 22) MiAMP1 (pura). Las bandas 1 a 14 contienen
extractos de la familia Proteaceae y todas presentan la
presencia de proteínas relacionadas antigénicamente de un tamaño
similar a MiAMP1 (incluyendo una señal muy débil en la banda 2 que
no se fotografió bien). Las bandas de referencia (15 a 21) que
contienen extractos de las especies no relacionadas no presentan
ninguna proteína de tamaño y antigenicidad similares.
Se realizaron también bioanálisis utilizando
varios extractos en bruto de la especie Proteáceas. Específicamente,
se ha demostrado que los extractos de Banksia robur, Banksia
canei, Hakea gibbosa, Stenocarpus sinuatus, Stirlingia
latifolia y Macadamia integrifolia que presentan
actividad antimicrobiana.
Se utilizaron cebadores degenerados
correspondientes a la secuencia nucleotídica traducida a la inversa
en reacciones de PCR con transcriptasa inversa (secuencia del
cebador \alpha 5' CCG AAG CAG TTG CA[C/G/T]
GC[C/G/T] C 3' y la secuencia del cebador \beta 5' GAG
[C/A]G[T/G] TAT [T/A][C/G][T/G] AAG TGT GG 3'). Los
productos de la PCR se secuenciaron a continuación directamente
(ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de
Perkin Elmer Corporation) después de la escisión de las bandas de
ADN en geles de agarosa y purificándolos utilizando un kit de
limpieza de ADN de Qiagen. Utilizando este método, los
investigadores fueron capaces de ampliar un fragmento de 160 pares
de bases de ADN procedente de de ARNm de almendras de Mi utilizando
ADNc como plantilla en la reacción en cadena de polimerasa. Se
diseñaron a continuación cebadores de oligonucleótidos específicos
a partir de esta secuencia nucleotídica para su utilización en la
ampliación rápida de 5' y 3' de los extremos del ADNc (RACE). El
protocolo 3' RACE utilizó un cebador específico procedente de la
secuencia nucleotídica conocida (cebador alfa, 5' TGC TCT CTA CAA
CCA GGC TG 3') junto con un cebador oligo d(T)_{25}
(cebador \beta) para ampliar un fragmento correspondiente al
extremo 3' del ADNc (Figura 6, posiciones 334 a 493). El protocolo
5' RACE utiliza otro cebador específico (cebador \beta,
5'-GCA TTG GAT GAA GAT ACT C-3')
procedente de la secuencia conocida en combinación con un cebador
(cebador \alpha, 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG
GGI IGG GII GGG IIG-3') diseñado para hibridar
eficazmente al ADNc terminado en poli-C utilizado
en el protocolo 5' RACE (Frohman, M. A. [1990] "RACE: Rapid
amplification of cDNA ends", en PCR Protocols, a Guide to
Methods and Applications, Innis, M. A., Gelfan, D. H., Sninsky,
J. J. y White, T. J. eds., págs. 28-38, Academic
Press, Londres). El protocolo 5' RACE condujo a la determinación de
las bases 1 a 282 (Figura 6). Posteriormente, se sintetizaron dos
cebadores específicos correspondientes a los extremos 5' y 3' y se
utilizaron para ampliar un fragmento nucleotídico casi completo
(Figura 6, posiciones 15 a 481) que se ligó directamente en el
punto de clonación de un vector pGEM-T (Promega)
para manipulaciones y secuenciado posteriores.
El vector de expresión
pPCV91-MiAMP1 (Figura 8) contiene la zona de
codificación completa del ADN de MiAMP1 flanqueada en su extremo 5'
por el activador constitutivo potente de ARN de 35S del virus del
mosaico de la coliflor (pCaMV35S) (Odel et al., [1985]
Nature 313:810-812) con un elemento
potenciador de la repetición cuádruple (e-35S) que
permite la actividad de transcripción elevada (Kay et al.
[1987] Science 236:1299-1302). La zona de
codificación del ADN de MiAMP1 está flanqueada en su extremo 3' por
la secuencia de poliadenilación del ARN de 35S del virus del
mosaico de la coliflor (pA35S). El eje central del plásmido de este
vector es el plásmido pPCV91 (Walden, R. et al. [1990]
Methods Mol. Cell. Biol. 1:175-194). El
plásmido contiene también otros elementos útiles para la
transformación de la planta tal como un gen con resistencia a la
ampicilina (bla) y un gen con resistencia a la higromicina (hph)
conducido por el activador nos (pnos). Estas y otras
características permiten la selección en varios procedimientos de
clonación y transformación. El plásmido
pPCV-91-MiAMP1 se construyó de la
forma siguiente: El fragmento clonado por PCR en el vector
pGEM-T (Ejemplo 11) se digirió utilizando las
enzimas de restricción Sac II y Spe I para liberar el fragmento
génico MiAMP1. El vector binario pPCV91 se digirió con la enzima de
restricción Bam HI. Tanto el fragmento de ADN de MiAMP1 como
el vector binario se trataron a continuación con T4 ADN polimerasa
para truncar las prolongaciones. Posteriormente, se ligaron los dos
fragmentos utilizando T4 ADN ligasa para producir el vector binario
pPCV91-MiAMP1 para la transformación de la planta
(Figura 8).
La cepa GV3101 (pMP90RK) de Agrobacterium
tumefaciens desarmada (Koncz, C. S. [1986] Mol. Gen.
Genet. 204:383-396) se transformó con el vector
pPCV91-MiAMP1 (Ejemplo 12) utilizando el
procedimiento de Walkerpeach et al. (Walkerpeach, C. R.
et al. [1994] Plant Mol. Biol. Manual
B1:1-19) adaptado de Van Haute (Van Haute, E. et
al. [1983] EMBO J. 2:411-417).
La transformación del tabaco se realizó
utilizando discos foliares de Nicotiana tabacum basándose en
el procedimiento de Horsch et al. (Horsch et al.
[1985] Science 227:1129-1231) y cultivando
conjuntamente cepas que contienen pPCV91-MiAMP1.
Tras el cultivo conjunto de discos foliares de Agrobacterium
y tabaco, las plantas transgénicas (transformadas con
pPCV91-MiAMP1) se regeneraron en un medio que
contiene 50 \mug/ml de hidromicina y 500 \mug/ml de Cefotaxima.
En estas plantas transgénicas se analizó a continuación la expresión
de los genes recién introducidos utilizando técnicas de
transferencia Western habituales. Las plantas capaces de expresión
constitutiva de los genes introducidos pueden seleccionarse y
autopolinizarse para dar semillas. Los plantones F1 de las plantas
transgénicas pueden analizarse más.
Los cebadores por PCR que flanquean la zona de
codificación del gen de MiAMP1 se manipularon genéticamente para
que contengan los puntos de restricción de Nde I y Bam
HI (correspondientes a los extremos 5' y 3' de la zona de
codificación, respectivamente). Estos cebadores se utilizaron a
continuación para ampliar la zona de codificación del ADNc de
MiAMP1. Tras la digestión con Nde I y Bam HI, el
producto de PCR de esta ampliación se ligó a continuación en un
vector pET-17b (Novagen/Studier, F. W. et al.
[1986] J. Mol. Biol. 189:113) con la zona de codificación en
el marco para producir el vector pET-MiAMP1 (Figura
9).
La cepa BL21 de E. coli (Grodberg, J.
[1988] J. Bacteriol. 170:1245) transformada con el vector
pET-MiAMP1 (Ejemplo 14) se cultivó hasta una
densidad óptica de 0,6 y se provocó con adición de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido)
0,4 mM. Las alícuotas del cultivo de crecimiento se eliminaron a
intervalos de tiempo y los extractos de proteína se introdujeron en
un gel SDS-PAGE para seguir los niveles de expresión
de MiAMP1 en el cultivo.
La Figura 10 presenta el análisis por
SDS-PAGE de los extractos obtenidos después de la
provocación. La banda 1 contiene marcadores de peso molecular. Las
bandas 2 a 7 contienen extractos del cultivo a 0, 1, 2, 3, 4 y 5
horas después de la provocación. La banda 8 contiene extracto de una
cepa BL21 de E. coli no transformada. La banda 9 contiene
MiAMP1 pura. La flecha en la Figura 10 señala la banda de la
proteína MiAMP1 producida en el cultivo. Es evidente una
acumulación drástica de las concentraciones de MiAMP1 después de la
provocación.
Los expertos en la materia apreciarán que pueden
introducirse muchos cambios en las formas de realización
ejemplificadas anteriormente sin apartarse del ámbito y del alcance
amplios de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOLICITANTE: COOPERATIVE RESEARCH CENTRE FOR TROPICAL PLANT PATHOLOGY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: The University of Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: St. Lucía
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4067
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MANNERS, John M. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28 Warmington Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Paddington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4064
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MARCUS, John P. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1-10 Balderstone Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Corinda
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4075
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: GOULTER, Kenneth C. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 26 Emblem Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Jamboree Heights
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: GREEN, Jodie L. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4 Reef Close
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Jamboree Heights
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HARRISON, Stuart J. (EEUU solamente)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 8 Thurlow Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Newmarket
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Queensland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4051
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína antimicrobiana
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Macadamia integrifolia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Semillas
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 480 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Macadamia integrifolia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Semillas
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 70..147
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 148..375
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Proteína antimicrobiana aislada o sintética
seleccionada de entre las siguientes:
- (i)
- una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
- (ii)
- un homólogo de (i);
- (iii)
- una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
- (iv)
- una proteína que incluye un espaciamiento de cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; y
- (v)
- una proteína aislable de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta la misma actividad antimicrobiana que (i).
2. Proteína según la reivindicación 1, que
presenta una secuencia de aminoácidos de los restos 27 a 102 de SEC.
ID. nº: 1.
3. ADN aislado o sintético que codifica una
proteína seleccionada de entre:
- (i)
- una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
- (ii)
- un homólogo de (i);
- (iii)
- una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 27 a 102 de la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 1;
- (iv)
- una proteína que incluye un espaciamiento de cisteína de -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-, en el que X es cualquier resto de aminoácido distinto de la cisteína; y
- (v)
- una proteína aislable de la familia Proteaceae que reacciona específicamente con anticuerpos producidos contra (i) y que presenta esencialmente la misma actividad antimicrobiana que (i).
4. ADN según la reivindicación 3 que comprende
los nucleótidos 148 a 375 de la SEC. ID. nº: 2.
5. Constructo de ADN que incluye un ADN según la
reivindicación 3, unido funcionalmente a elementos para la expresión
de dicha proteína codificada.
6. Constructo según la reivindicación 5, en el
que dicho ADN incluye los nucleótidos 70 a 375 de la SEC. ID. nº:
2.
7. Constructo según la reivindicación 5, que se
selecciona de entre el grupo constituido por
pPCV91-MiAMP1 y pET-MiAMP1, como se
muestra en las Figuras 8 y 9, respectivamente.
8. Célula hospedadora que alberga un constructo
de ADN según la reivindicación 5.
9. Célula hospedadora según la reivindicación 8,
que se selecciona de entre el grupo constituido por una célula
bacteriana, una célula micótica, una célula de insecto, una célula
vegetal y una célula de mamífero.
10. Planta transgénica que alberga un constructo
de ADN según la reivindicación 5.
11. Planta transgénica según la reivindicación
10, que es monocotiledónea o dicotiledónea.
12. Planta transgénica según la reivindicación
11, que se selecciona de entre el grupo de plantas constituido por
granos, cultivos de forraje, frutos, vegetales, cultivos de semilla
de aceite, palmeras, silvicultura y vinos.
13. Planta transgénica según la reivindicación
11, que se selecciona de entre el grupo constituido por maíz,
plátano, cacahuete, guisantes, girasol, tomate, canela, tabaco,
trigo, cebada, avena, patata, soja, algodón, clavel, sorgo, altramuz
y arroz.
14. Material reproductivo de una planta
transgénica según la reivindicación 11.
\newpage
15. Material reproductivo según la
reivindicación 14, que se selecciona de entre el grupo constituido
por semillas, plantas de la descendencia y material clonal.
16. Composición que comprende una proteína
antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo,
diluyente o excipiente aceptable desde un punto de vista
agrícola.
17. Composición que comprende una proteína
antimicrobiana según la reivindicación 1, junto con un vehículo,
diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. Procedimiento de control de infestación
microbiana de una planta, comprendiendo dicho procedimiento:
- i)
- introducir un constructo de ADN según la la reivindicación 5 en dicha planta; o
- ii)
- tratar dicha planta con una proteína antimicrobiana según la reivindicación 1 o con una composición según la reivindicación 16.
19. Utilización de una proteína antimicrobiana
según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para
controlar la infestación microbiana de un animal mamífero.
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