DE69736828T2

DE69736828T2 - Antimikrobielles protein

Info

Publication number: DE69736828T2
Application number: DE1997636828
Authority: DE
Inventors: Michael John Paddington MANNERS; Paul John Corinda MARCUS; Clifford Kenneth Jamboree Heights GOULTER; Lyn Jodie Jamboree Heights GREEN; John Stuart Newmarket HARRISON
Original assignee: OF SUGAR EXPERIMENT STATIONS I; University of Queensland UQ; Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Queensland University of Technology QUT; Bureau of Sugar Experiment Stations; Queensland Department of Primary Industries and Fisheries
Current assignee: OF SUGAR EXPERIMENT STATIONS I; University of Queensland UQ; Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Queensland University of Technology QUT; Bureau of Sugar Experiment Stations; Queensland Department of Primary Industries and Fisheries
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2017-02-01
Also published as: EP0877756A4; JP2001521364A; CN1216550A; NZ326727A; ATE342993T1; EP0877756A1; CA2251537A1; AUPN780296A0; ES2277352T3; DE69736828D1; KR19990082212A; BR9707481A; WO1997028185A1; EP0877756B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf isolierte Proteine, die eine inhibitorische Aktivität auf das Wachstum von Pilzen und Bakterien ausüben, wobei Pilze und Bakterien irgendwelche mikrobiellen Pathogene von Pflanzen und Tieren miteinschließen. Die Erfindung bezieht sich auch auf rekombinante Gene, die Sequenzen kodierend für antimikrobielle Proteine enthalten, deren Expressionsprodukte etwas zur Abwehr einer Pflanzenzelle oder einer Zelle eines anderen Organismus gegen die Invasion durch mikrobielle Pathogene beisteuern können. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung der Proteine und/oder Gene kodierend für die Proteine zur Kontrolle von Mikroben in menschlichen und tierärztlichen klinischen Gegebenheiten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mikrobielle Krankheiten von Pflanzen sind ein bedeutendes Problem für die landwirtschaftlichen und gärtnerischen Industrien. Pflanzenkrankheiten im allgemeinen verursachen jährlich Erneteverluste im Bereich von Millionen Tonnen Ernte, wobei Pilzkrankheiten und bakterielle Krankheiten für bedeutende Anteile an diesen Verlusten verantwortlich sind. Ein möglicher Weg, die Pilz- und Bakterienkrankheiten zu bekämpfen, ist es, transgene Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, ein Protein oder Proteine zu exprimieren, die durch irgendeine Art und Weise die Resistenz der Pflanze gegenüber pathogenem Befall erhöhen. Eine einfache Strategie ist es, zuerst ein Protein mit antimikrobieller Aktivität in vitro zu identifizieren, die für das Protein kodierende DNA Sequenz zu klonieren, ein chimäres Genkonstrukt für die effiziente Expression des Proteins in Pflanzen herzustellen, dieses Gen auf transgene Pflanzen zu übertragen und den Effekt des eingeführten Gens auf die Resistenz gegenüber mikrobiellen Pathogenen durch den Vergleich mit Kontrollpflanzen zu untersuchen.
Der erste und wichtigste Schritt in der Strategie zur oben beschriebenen Krankheitskontrolle ist es, ein Protein mit starker antimikrobieller Aktivität zu identifizieren. In den letzten Jahren wurden viele verschiedene Pflanzenproteine mit antimikrobieller und/oder antimykotischer Aktivität identifiziert und beschrieben. Diese Proteine wurden in verschiedene Klassen eingeteilt, entweder anhand ihres vermuteten Wirkungsmechanismus und/oder ihrer Aminosäuresequenz-Homologien. Diese Klassen schließen die folgenden ein: Chitinasen (Roberts, W.K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161–170); β-1,3-Glukanasen (Manners, J.D. et al. [1973] Phytochemistry 12:547–553); Thionine (Bolmann, H. et al. [1988] EMBO J. 7:1559–1565 und Fernandez de Caleya, R. et al. [1972] Appl. Microbiol. 23:998–1000); Permatine (Roberts, W.K. et al. [1990] J. Gen. Microbiol. 136:1771–1778 und Vigers, A.J. et al. [1991] Mol. Plant-Microbe Interact. 4:315–323); Ribosomen-inaktivierende Proteine (Roberts, W.K. et al. [1986] Biochim. Biophys. Acta 880:161–170 und Leah, R. et al. [1991] J. Biol. Chem. 266:1564–1573); pflanzliche Defensine (Terras F.R.G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573588); Chitin-bindende Proteine (DeBolle, M.F.C. et al. [1992] Plant Mol. Biol. 22:1187–1190 und Van Parijs, J. et al. [1991] Planta 183:258–264); Thaumatin-ähnliche oder Osmotin-ähnliche Proteine (Woloshuk, C.P. et al. [1991] The Plant Cell 3:619–628 und Hejgaard, J. [1991] FEBS Letts. 291:127–131); PRI-Typ Proteine (Niderman, T. et al. [1995] Plant Physiol. 108:17–27); die unspezifischen Lipidtransfer-Proteine (Terras, F.R.G. et al. [1992] Plant Physiol. 100:1055–1058 und Molina, A. et al. [1993] FEBS Letts. 3166:119–122), und die knottin- oder knottin-ähnlichen-Proteine (Cammue, B.P.A. et al. [1992] J. Biol. Chem. 67:2228–2233). Außerdem sind Pflanzen nicht die einzige Quelle an antimikrobiellen Proteinen und es gibt viele Berichte über die Isolierung von antimikrobiellen Proteinen aus tierischen und mikrobiellen Zellen (Übersichtsartikel in Gabay, J.E. [1994] Science 264:373–374 und in "anti-microbial peptides" [1994] CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley and Sons Publ., Chichester, UK).
Es gibt einige Anzeichen dafür, dass die ektopische Expression von Genen kodierend für Proteine, die an vitro antimikrobielle Aktivität aufweisen, in transgenen Pflanzen zu einer erhöhten Resistenz gegenüber mikrobiellen Pathogenen führen kann. Beispiele für eine solche hergestellte Resistenz beinhalten transgene Pflanzen, die Gene exprimieren kodierend für: eine Pflanzen-Chitinase, entweder alleine (Broglie, K. et al. [1991] Science 254:1194–1197) oder in Kombination mit einer β-1,3-Glucanase (Van den Elzen, P.J.M. et al. [1993] Phil. Trans. Roy. Soc. 342:271–278); ein pflanzliches Defensin (Terras, F.R.G. et al. [1995] The Plant Cell 7:573–588); ein Osmotin-ähnliches Protein (Liu, D. et al. [1994] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1888–1892); ein Protein der PRI-Klasse (Alexander, D. et al. [1993] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327–7331) und ein Ribosomen-inaktivierendes Protein (Logemann, J. et al. [1992] Bio/Technology 10:305–308).
Auch wenn die mögliche Verwendung von antimikrobiellen Proteinen für die Herstellung von Krankheitsresistenz in transgenen Pflanzen extensiv beschrieben wurde, gibt es andere Anwendungen, die es wert sind, genannt zu werden. Erstens können hoch wirksame antimikrobielle Proteine für die Kontrolle von Pflanzenkrankheit durch direkte Anwendung verwendet werden (De Bolle, M.F.C. et al.: [1993] in Mechanisms of Plant Defence Responses, B. Fritig und M. Legrand eds., Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, NL, S. 433–436). Zusätzlich haben antimikrobielle Peptide mögliche therapeutische Anwendungen in der menschlichen und tierärztlichen Medizin. Auch wenn dies nicht für Peptide pflanzlichen Ursprungs beschrieben wurde, wird dies aktiv mit Peptiden aus Tieren untersucht und hat den Stand von klinischen Versuchsreihen erreicht (Jacob, L. und Zasloff, M. [1994] in "Anti-microbial Peptides", CIBA Foundation Symposium 186, John Wiley and Sons Publ., Chichester, UK, S. 197–223).
Die hier beschriebene Erfindung stellt ein bisher unentdecktes und neues Protein mit antimikrobieller Aktivität dar. Das Protein kann aus Macadamia integrifolia (Mi) Pflanzen isoliert werden. Macadamia integrifolia gehört zur Familie Proteaceae. M. integrifolia, auch bekannt als Bauple-Nuss oder Queensland-Nuss, wird von einigen als die weltbeste essbare Nuss angesehen. Aus diesem Grund wird sie extensiv kommerziell angebaut, sowohl in Australien als auch in Übersee (William, Keith A.W. Native Plants (Queensland), Volume II, 1984, veröffentlicht von Keith A.W. Williams und gedruckt von Printcraft aus Newstead, Qld, Australien).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes oder synthetisches antimikrobielles Protein zur Verfügung gestellt, ausgewählt aus:

(i) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz enthält, die den Resten 27 bis 102 der in 6 gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: 1) entspricht;
(ii) einem Homolog von (i);
(iii) einem Protein, das im wesentlichen dieselbe dreidimensionale Form wie (i) hat und welches im wesentlichen dieselbe antimikrobielle Aktivität wie (i) hat;
(iv) einem Protein, das einen Cystein-Platzhalter der Sequenz -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C- enthält, wobei es sich bei X um jede Aminosäure mit Ausnahme von Cystein handeln kann; und
(v) einem Protein, isoliert aus der Familie Proteaceae, das spezifisch mit gegen (i) hergestellten Antikörpern reagiert und das die gleiche antimikrobielle Aktivität wie (i) hat.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte oder synthetische DNA zur Verfügung gestellt, welche für ein Protein gemäß der ersten Ausführungsform kodiert.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, das eine DNA gemäß der zweiten Ausführungsform enthält, die operativ mit Elementen zur Expression des genannten kodierten Proteins verknüpft ist.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird eine Wirtszelle enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß der dritten Ausführungsform zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer fünften Ausführungsform der Erfindung wird eine transgene Pflanze enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß der dritten Ausführungsform zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer sechsten Ausführungsform der Erfindung wird reproduzierendes Material einer transgenen Pflanzen gemäß der fünften Ausführungsform zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer siebten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein antimikrobielles Protein gemäß der ersten Ausführungsform zusammen mit einem landwirtschaftlich verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfasst.
Gemäß einer achten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein antimikrobielles Protein gemäß der ersten Ausführungsform zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfasst.
Gemäß einer neunten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Kontrolle von mikrobiellem Pflanzenbefall zur Verfügung gestellt, wobei die Methode umfasst:

(i) Einführen eines DNA-Konstrukts gemäß der dritten Ausführungsform in die genannte Pflanze; oder
(ii) die Behandlung besagter Pflanze mit einem antimikrobiellen Protein gemäß der ersten Ausführungsform oder einer Zusammensetzung gemäß der siebten Ausführungsform.

Gemäß einer zehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Kontrolle von mikrobiellen Befall eines Säugetiers zur Verfügung gestellt, wobei die Methode die Behandlung des Tieres mit einem antimikrobiellen Protein gemäß der ersten Ausführungsform oder einer Zusammensetzung gemäß der achten Ausführungsform umfasst.
Andere Ausführungsformen der Erfindung enthalten Verfahren zur Produktion von antimikrobiellem Protein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt ein Kationenaustausch-Chromatographie-Profil der basischen Proteinfraktion, extrahiert aus Macadamia-Nüssen mit den Ergebnissen eines Bio-Assays gezeigt für die Fraktionen von Interesse.
2 zeigt ein Reversed-Phase-HPLC-Profil der stark inhibitorischen Fraktionen 31 und 32, die von der Kationenaustausch-Abtrennung abgenommen wurden und die entsprechenden Bio-Assay-Daten.
3 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von aufgereinigtem MiAMP1.
4 zeigt die Resultate einer massenspektrometrischen Analyse von MiAMP1.
5 stellt die Resultate einer massenspektrometrischen Analyse des reduzierten und alkylierten MiAMP1 dar.
6 zeigt die Aminosäuresequenz von MiAMP1 zusammen mit einer Nukleotidsequenz, die für das Protein kodiert.
7 stellt einen Westernblot von Proteinextrakten aus verschiedenen Proteaceae-Arten dar, für den Antiserum gegen MiAMP1 aus Kaninchen verwendet wurde.
8 ist eine Plasmidkarte von pPCV91-MiAMP1.
9 ist eine Plasmidkarte von pET-MiAMP1.
10 stellt ein gefärbtes SDS-PAGE-Gel dar, das benutzt wurde, um Proben von Kulturen von transformierten und nicht-transformierten E. colis zu analysieren.
BEVORZUGTE UND ANDERE ART UND WEISEN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden Abkürzungen werden wie hier aufgeführt verwendet:

FBS: fötales Rinderserum
EDTA: Ethylendiaminetraacetat
LDH: Lactatdehydrogenase
MeCN: Methylcyanid (Acetonitril)
Mi: Macadamia integrifolia
MiAMP1: Macadamia integrifolia antimikrobielles Protein 1
ND: nicht bestimmt
PCR: Polymerasekettenreaktion
PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid
SDS-PAGE: Sodiumdodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese
TFA: Trifluoressigsäure
TPCK: Tosylphenylalaninchlormethylketon
RACE: schnelle Amplifikation von cDNA Enden

Die vorliegenden Erfinder haben eine neue Klasse von antimikrobiellen Proteinen identifiziert. Ein prototypisches Protein kann aus den Samen von Macadamia integrifolia (abgekürzt Mi) isoliert werden. Die Erfindung stellt daher ein antimikrobielles Protein per se sowie eine DNA-Sequenz kodierend für ein antimikrobielles Protein zur Verfügung.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung, um verwandte Proteine von Pflanzengewebe der Familie Proteaceae zu erhalten. Mit Antikörpern, hergestellt gegen ein bestimmtes Beispiel des antimikrobiellen Proteins – Macadamia integrifolia antimikrobielles Protein Nummer 1 (MiAMP1)-, ist es möglich, Gewebe von anderen Spezies von Bäumen verwandt zu Macadamia integrifolia, zu untersuchen. Andere Spezies von Macadamia sowie Spezies in der breiteren Kategorie der Familie Proteaceae sind die hauptsächlichen Ziele für solche Untersuchungen. Wie in Beispiel 10 tatsächlich gezeigt, wurde eine solche Untersuchung benutzt, um mehrere Spezies zu identifizieren, die Proteine enthalten, die zu MiAMP1 aufgrund der Antigenantwort, der Größe und der Lokalisation im Samengewebe verwandt sind. Die Suche nach verwandten Proteinen sollte nicht auf die Familie der Proteaceae beschränkt werden, da es wahrscheinlich ist, dass auch andere Spezies ähnliche Proteine enthalten könnten.
Die Erfindung stellt auch eine Aminosäuresequenz des prototypischen antimikrobiellen Proteins zur Verfügung (Beispiel 9). Von dieser Sequenz kann die Sequenz einer DNA kodierend für das Protein durch reverse Übersetzung der Aminosäure-Sequenz abgeleitet werden. DNA, die eine Nukleotid-Sequenz kodierend für antimikrobielles Protein hat, kann dann chemisch (und/oder enzymatisch) synthetisiert werden oder von Pflanzengewebe der Macadamias isoliert werden, unter der Verwendung von Standard-Klonierungsmethoden wie in Laborhandbüchern beschrieben, so wie etwa den Current Protocols in Molecular Biology (copyright 1987–1995, edited by Ausubel F.M. et al. and published by John Wiley & Sons, Inc., printed in the USA).
Das antimikrobielle Protein per se wird eine bestimmte dreidimensionale Struktur aufweisen, die durch die Verwendung von Röntgenstrahlen-Kristallographie- oder NMR-Techniken bestimmt werden kann. Diese Struktur wird zum großen Teil für die antimikrobielle Aktivität des Proteins verantwortlich sein. Ausgehend von der Sequenz des Proteins ist es auch möglich, Vorhersagen zu machen, die mögliche Konformationen und strukturelle Motive (Sekundärstruktur) betreffen, die das Protein wahrscheinlich aufweist. Es wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann ein Protein mit einer bekannten Struktur nehmen und die Sequenz signifikant verändern kann und dennoch die dreidimensionale Form insgesamt und antimikrobielle Aktivität des Proteins beibehalten wird. Ein Aspekt der Struktur, der ziemlich sicher nicht ohne gravierende Konsequenzen verändert werden kann, ist der Cysteingehalt und die Platzierung der Cysteinreste, da dies die Formation von Disulfidbrücken zerstören würde, die kritisch sind, um die Struktur des Proteins insgesamt beizubehalten. Andere Reste, die wahrscheinlich entscheidend für die Bestimmung der Form und Funktion des Proteins sind, sind Glycine und Proline, welche ganz bestimmte Konformationen in dem Rückgrat von Proteinen einnehmen. Genauso wird die Verteilung von geladenen Resten (z.B. Arginin, Lysin, Histidin, Glutamat und Aspartat) im dreidimensionalen Raum des Proteins für die Struktur und Aktivität, die ausgeführt wird, wichtig sein. Speziell für eine hohe Dichte von positiv geladenen Resten wurde gezeigt, dass diese einer Vielzahl von Proteinen antimikrobielle Aktivität verleihen (Pathak et al. [1995] PROTEINS: Structure, Function and Genetics 22:182–186).
DNA-Sequenzen kodierend für diese Proteine können unter Verwendung von Standard-Codon-Tabellen abgeleitet werden. Unter der Verwendung dieser endlichen Anzahl von möglichen DNA-Sequenzen können geeignete Oligonukleotid-Sonden abgeleitet werden und benutzt werden, um das oder die eigentlichen Gen(e) sowie auch Kontrollsequenzen zu isolieren (Beispiel 11). Es ist auch möglich, das Gen chemisch zu synthetisieren, unter der Verwendung eines Standard DNA-Synthesizer-Instruments (wie etwa eines Beckman Oligo 1000 Instruments) zusammen mit bekannten Techniken zum Zusammensetzen synthetisierter Genfragmente zu einem gesamten Gen (vgl. Current Protocols in Molecular Biology, supra).
Dieses Gen, unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors (Beispiele 12 und 14), kann dann in ein biologisches System kloniert werden, welches die Expression des Proteins (Beispiele 13 und 15) erlaubt. Transformationsmethoden, die es erlauben, das Protein in einer Vielzahl von Systemen zu exprimieren, sind bekannt. Das Protein kann daher in jedem passenden System zum Zweck der Produktion des Proteins für weitere Verwendung exprimiert werden. Geeignete Wirte zur Expression dieses Proteins beinhalten E. coli, Pilzzellen, Insektenzellen, Säugerzellen und Pflanzen. Standardmethoden zur Expression von Proteinen in solchen Wirten sind in einer Vielzahl von Texten einschließlich Sektion 16 (Protein Expression) der Current Protocols in Molecular Biology (supra) beschrieben.
Pflanzenzellen können mit DNA-Konstrukten der Erfindung gemäß einer Vielzahl von bekannten Methoden transformiert werden (Agrobacterium, Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilverfahren und ähnliche). Für die Expression in Pflanzen würde die DNA-Sequenz, kodierend z.B. für MiAMP1, in Verbindung mit einer DNA-Sequenz verwendet werden, die für die native oder eine heterologe Signalpeptidsequenz kodiert, welche dann das Protein zu einem bestimmten Zellkompartiment steuern würde (z.B. dem Apoplasten oder der Vacuole). Diese kodierenden Sequenzen könnten an eine Pflanzenpromotorsequenz, die eine starke Expression in Pflanzenzellen sicherstellen würde, ligiert werden. Diese Promotorsequenz könnte eine starke konstitutive Expression des Proteins in den meisten oder allen pflanzlichen Zellen sicherstellen, es könnte ein Promotor sein, der eine Expression in spezifischen Geweben oder Zellen sicherstellt, die für eine mikrobielle Infektion anfällig sind und es könnte auch ein Promotor sein, der eine starke Induktion der Expression während des Infektionsprozesses sicherstellt. Diese Typen von Genkassetten werden auch ein Transkriptionsende und eine Polyadenylierungs-Sequenz 3' von der MiAMP-kodierenden Region enthalten, um eine effiziente Produktion und Stabilisierung der mRNA kodierend für MiAMP sicherzustellen. Es ist möglich, dass eine effiziente Expression von MiAMP erleichtert werden könnte durch das Einschließen seiner DNA-Sequenz in eine Sequenz kodierend für ein viel größeres Protein, welches in planta prozessiert wird, um ein oder mehrere aktive MiAMP-Moleküle zu produzieren. Genkassetten kodierend für MiAMP wie oben beschrieben können dann in Pflanzenzellen unter der Verwendung von zwei herkömmlichen Methoden exprimiert werden. Erstens könnte die Genkassette in binäre Vektoren ligiert werden, aufweisend: i) linke und rechte Grenzsequenzen, die die T-DNA des Agrobakterium tumefacienes Ti-Plasmids flankieren, ii) ein geeignetes Selektionsmarker-Gen für die Selektion antibiotisch resistenter Pflanzenzellen, iii) Replikationsstartpunkte, die entweder in A. tumefaciens oder Escherichia coli funktionieren und iv) antibiotische Resistenzgene, die eine Selektion der Plasmid-tragenden Zellen von A. tumefaciens oder Escherichia coli erlauben. Dieser binäre Vektor, der das chimäre MiAMP1-kodierende Gen trägt, könnte entweder durch Elektroporation oder triparentales Mating in A. tumefaciens-Stämme eingeführt werden, die ein abgerüstetes Ti-Plasmid tragen, wie etwa die Stämme LBA4404, GV3101 und AGL1 oder in A. rhizogenes- Stämme, wie etwa R4 oder NCCP1885. Diese Agrobacterium-Stämme können dann mit passenden Pflanzen-Explantaten oder intakten Pflanzengeweben kokultiviert und die transformierten Pflanzenzellen und/oder Nachkömmlinge unter Verwendung der antibiotischen Resistenz selektiert werden (Beispiele 12 und 13). Die Expression des MiAMP1-Proteins in den transgenen Pflanzen kann entweder durch die Verwendung von Antikörpern, hergestellt gegen das Protein, oder durch antimikrobielle Bio-Assays detektiert werden. Eine zweite Methode des Gentransfers in Pflanzen kann durch direkte Insertion des Gens in die Zielpflanzenzellen erreicht werden. Zum Beispiel kann die für MiAMP1-kodierende Genkassette auf Gold- oder Wolframpartikel ko-präzipitiert werden, zusammen mit einem Plasmid kodierend für ein chimäres Gen für antibiotische Resistenz in Pflanzen. Die Wolframpartikel können unter Verwendung einer schnellen Strömung von Heliumgas beschleunigt werden und es den Partikel erlaubt werden, ein passendes Pflanzengewebe zu bombardieren. Dies kann eine embryonische Zellkultur sein, ein Pflanzen-Explanat, ein Kallusgewebe oder eine Zellsuspension oder ein intaktes Meristem. Pflanzen können unter Verwendung des antibiotischen Resistenzgens zur Selektion aufgezogen werden und Antikörper können verwendet werden, um Pflanzenzellen zu detektieren, die das MiAMP1-Protein exprimieren. Diese und andere verwandte Methoden zur Expression des MiAMP1 in Pflanzen sind beschrieben in "Plant Molecular Biology" (2. Ed., edited by Gelvin, S.B. und Schilperoort, R.A. [1994] published by Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands).
Beides, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen können transformiert und aufgezogen werden. Pflanzen, die genetisch modifiziert werden können, beinhalten Getreidearten, Viehfuttersaaten, Früchte, Gemüse, Ölsamensaaten, Palmen, Waldpflanzen und Weine. Spezifische Beispiele von Pflanzen, die modifiziert werden können, sind folgende: Mais, Bananen, Erdnuss, Feldbohnen, Sonnenblume, Tomate, Raps, Tabak, Weizen, Roggen, Hafer, Kartoffel, Sojabohnen, Baumwolle, Nelken, Hirse, Lupine und Reis. Diese wie auch andere landwirtschaftliche Pflanzen können mit den antimikrobiellen Genen transformiert werden, so dass sie ein größeres Ausmaß an Resistenz gegenüber pathogenen Attacken aufweisen. Alternativ können die Proteine zur Kontrolle von Krankheiten durch topologische Anwendung verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verabreichung von antimikrobiellen Proteinen zur Kontrolle von Pathogenen der Säugetiere, Menschen eingeschlossen. Das Protein kann entweder in topologischer oder intravenöser Anwendung zur Kontrolle von mikrobiellen Infektionen verwendet werden.
Macadamia integrifolia antimikrobielles Protein (MiAMP1)
Wie oben angezeigt, wurde eine neue Klasse von wirksamem antimikrobiellen Protein (isoliert aus den Samen von Mi) identifiziert und charakterisiert. Diese Klasse beinhaltet einen bestimmten Proteinfaktor, genannt MiAMP1, wie oben definiert. Das Protein ist stark basisch mit einem vorhergesagten pI-Wert von 10,1 und enthält 6 Cysteinreste (Beispiele 8 und 9), für welche angenommen wird, dass sie in der Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur des Proteins durch die Formation von Disulfidbrücken wichtig sind. Zusätzlich wurde die relative molekulare Masse des Proteins durch Massenspektrometrie bestimmt, welche sie bei 8134 ± 2 Da anzeigt. Die Aminosäuresequenz hat keine signifikante Homologie zu früher beschriebenen Proteinen in Sequenzdatenbanken (Swiss Prot and nicht-redundante Datenbanken), die unter der Verwendung des Blast-Algorithmus durchsucht wurden (Altschul, S.F. et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403), so dass dieses Protein ein bisher unbekanntes antimikrobielles Protein ist. Das Protein passt nicht in eine der früher beschriebenen Klassen von antimikrobiellen Proteinen, entweder aus pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Quellen.
Das MiAMP1-Protein zeigt einen weiten Bereich an antimykotischer Aktivität (Beispiel 4). MiAMP1 zeigt eine sehr signifikante Inhibition des Pilzwachstums bei so niedrigen Konzentrationen wie ein 1 μg/ml für einige der Pathogene/Mikroben, gegen die das Protein getestet wurde, mit so niedrigen IC₅₀-Werten wie 2 μg/ml. Daher kann es verwendet werden, um Schutz gegen verschiedene Pflanzenkrankheiten zur Verfügung zu stellen. MiAMP1 kann als Fungizid oder Antibiotikum durch die Verabreichung auf Pflanzenteile verwendet werden. Das Protein kann auch verwendet wurden, um das Wachstum von Pathogenen dadurch zu inhibieren, dass es in vollständig transgenen Pflanzen exprimiert wird (Beispiel 13). Das Protein kann zur Kontrolle von humanen Pathogenen durch topologische Anwendung oder intravenöse Injektion verwendet werden. Ein Charakteristikum des Proteins ist, dass die Inhibition einiger Mikroben durch die Präsenz von Ca²⁺ (1 mM) unterdrückt wird.
Unter spezifischer Bezugnahme auf die oben definierten Ausführungsformen der Erfindung ist ein bevorzugtes antimikrobielles Protein gemäß der ersten Ausführungsform MiAMP1. Dieses Protein hat eine Sequenz entsprechend der Reste 27 bis 102 der in 6 gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:1).
Antimikrobielle Proteine gemäß der Erfindung können durch jede der Methoden isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich der hier ausgeführten Methoden. Antimikrobielle Proteine können entweder chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Auch diese Methoden werden dem Fachmann bekannt sein und sind z.B. beschrieben in Hancock, D.C. et al. [1995] Mol. Biotech. 4(1):73–86 und Wong, C.H. und Wang K.T. [1991] Experientia (Basel) 48(11–12):1123–1129.
Ein Homolog des Proteins in 6 ist als ein Protein definiert, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die in der Abbildung gezeigte Sequenz hat. Dies bedeutet, dass die Mehrzahl der in MiAMP1 vorhandenen Reste in einem Homolog in derselben relativen Position zueinander vorhanden sind oder aus einem anderen Aminosäurerest bestehen, der eine Seitenkette mit ähnlichen Eigenschaften besitzt. Z.B. ist es häufig möglich, Asparagin und Asparaginsäure auszutauschen; Alanin und Glycin; Serin, Threonin und Alanin; Isoleucin, Valin und Leucin; sowie Lysin und Arginin; wohingegen Cystein- und Histidinreste selten gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden können (Bordo, D. und Argos, P. [1991] J. Mol. Biol. 217:721–729). Es wird von einem Fachmann verstanden, dass eine Homolog viele konservative Austausche haben könnte, von den schon erwähnten Beispielen abgesehen.
Unter Bezugnahme zur dritten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet der Ausdruck "Konstrukt" Vektoren wie etwa Plasmide, Cosmide, Viren und dergeleichen sowie nackte DNA per se. Kontrollelemente, die in Konstrukte einbezogen werden können, werden dem Fachmann bekannt sein. Beispiele solcher Elemente sind Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungs-Signale und Transkriptions-Terminatoren.
Reproduktives Material einer transgenen Pflanze, wie in der sechsten Ausführungsform ausgeführt, beinhaltet Samen, Pflanzenabkömmlinge und kloniertes Material.
Wie in der siebten und achten oben definierten Ausführungsform der Erfindung aufgezeigt, können antimikrobielle Proteine gemäß der ersten Ausführungsform Zusammensetzungen zur Anwendung in Pflanzen und Säugetieren zugesetzt werden. Ein antimikrobielles Protein kann in einer Zusammensetzung als ein Salz des Proteins vorhanden sein. Solche Salze werden dem Fachmann bekannt sein, wie auch die Art an Trägern, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen, die solche Zusammensetzungen zugesetzt werden können. Zum Beispiel kann der in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Träger ein physiologisch kompatibler Puffer wie etwa Hank's- oder Ringer-Lösung sein, eine physiologische Salzlösung, eine Mixtur bestehend aus Saline und Glukose und heparinizierter Natriumcitrat-Citratsäuredextrose-Lösung. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann oral oder parenteral im Einklang mit dem Behandlungszweck verabreicht werden und kann als Pulver, Körnchen, einer Lösung für die Injektion oder orale Gabe, Tabletten, Hilfsmitteln, Pessarien, Salben, Cremes, Gel oder Aerosol zubereitet sein. Zusammensetzungen für die landwirtschaftliche Verwendung werden üblicherweise durch Sprühen verabreicht. Zusammensetzungen können andere antimikrobielle Wirkstoffe zusätzlich zum antimikrobiellen Protein gemäß der Erfindung beinhalten. Solche Wirkstoffe werden normalerweise antimykotische Wirkstoffe sein.
Es folgen nicht beschränkende Beispiele der Erfindung.
Beispiel 1
Extraktion von basischem Protein aus Macadamia integrifolia Samen
Fünfundzwanzig Kilogramm von Mi Nüssen (gekauft von der Macadamia Nut Factory, Queensland, Australien) wurden in einer Universal-Küchenmaschine (The Big Oscar, Sunbeam) gemahlen und das resultierende Mehl wurde für 2–4 Stunden bei 4°C extrahiert mit 50 l eines eiskalten Extraktionspuffers enthaltend 10 mM NaH₂PO₄, 15 mM Na₂HPO₄, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,75% Polyvinylpolypyrrolidon und 0,5 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF). Das resultierende Homogenisat wurde durch ein Küchensieb laufen gelassen, um größeres partikuläres Material zu entfernen und dann weiter durch Zentrifugation (4,000 rpm für 15 Min) in einer Zentrifuge mit großer Kapazität geklärt. Festes Ammoniumsulfat wurde zum Überstand zugegeben um 30% relative Sättigung zu erreichen und dem Präzipitat gestattet, sich über Nacht unter Rühren bei 4°C zu formen. Einer Zentrifugation bei 4,000 rpm für 30 Min folgend wurde der Überstand genommen und Ammoniumsulfat zugegeben um 70% relative Sättigung zu erreichen. Der Lösung wurde gestattet, über Nacht zu präzipitieren und dann bei 4,000 rpm für 30 Min zentrifugiert, um die präzipitierte Proteinfraktion zu sammeln. Das präzipitierte Protein wurde in einem minimalen Volumen des Extraktionspuffers resuspendiert und noch einmal zentrifugiert (13,000 rpm × 30 Min), um den ungelösten Anteil zu entfernen. Nach Dialyse (10 mM Ethanolamin pH 9.2, 2 mM EDTA und 1 mM PMSF) um rückständiges Ammoniumsulfat zu entfernen, wurde die Proteinlösung durch eine Q-Sepharose Fast Flow Säule (5 × 12 cm) geschickt, die zuvor mit 10 mM Ethanolamin (pH 9), 2 mM EDTA äquilibriert worden war.
Der gesammelte Durchfluß von dieser Säule stellt die basische (pI > 9) Proteinfraktion der Samen dar. Diese Faktion wurde weiter aufgereinigt wie im Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 2
Antimikrobielle Aktivitäts-Assays
Gewöhnlich wurden Bio-Assays zur Bestimmung von antimykotischer und antibakterieller Aktivität in Mikrotiter-Platten mit 96-Vertiefungen ausgeführt. Üblicherweise wurde der Testorganismus in einem synthetischen Wachstumsmedium bestehend aus K₂HPO₄ (2.5 mM), MgSO₄ (50 μm), CaCl₂ (50 μM), FeSO₄ (5 μM), CoCl₂ (0.1 μM), CuSO₄ (0.1 μM), Na₂MoO₄ (2 μM), H₃BO₃ (0.5 μM), KI (0.1 μM), ZnSO₄ (0.5 μM), MnSO₄ (0.1 μM), Glukose (10 g/l), Asparagin (1 g/l), Methionin (20 mg/l), Myo-Inositol (2 mg/l), Biotin (0.2 mg/l), Thiamin-HCl (1 mg/l) und Pyridoxin-HCl (0.2 mg/l) suspendiert. Der Testorganismus bestand aus bakteriellen Zellen, Pilzsporen (50.000 Sporen/ml) oder Fragmenten aus mykotischem Mycelial (hergestellt durch das Vermengen einer hyphalen Masse einer Kultur des Pilzes, der untersucht werden soll und dann Filtern durch ein feines Netzwerk um größere hyphale Massen zu entfernen). Fünfzig Mikroliter des in Medium suspendierten Testorganismus wurden in jede Vertiefung der Mikrotiter-Platte platziert. Weitere 50 μl der zu testenden antimikrobiellen Lösung wurden zu entsprechenden Vertiefungen hinzugefügt. Um mit einer Variabilität von Vertiefung zu Vertiefung im Bio-Assay umzugehen, wurden 4 Replikate von jeder Test-Lösung durchgeführt. Sechzehn Vertiefungen von jeder Platte mit 96 Vertiefungen wurden als Kontrollen für Vergleiche mit den Test-Lösungen verwendet.
Wenn nicht anders angegeben, war der verwendete Test-Organismus Phytophthora cryptogea und Inkubation war bei 25°C für 48 Stunden. Alle Pilze, Hefen eingeschlossen, wurden bei 25°C herangezogen und E.coli wurde herangezogen bei 37°C. Prozent Wachstumsinhibition wurde gemessen durch das Verfolgen der Absorption bei 600 nm der wachsenden Kulturen über verschiedene Zeitintervalle und definiert als 100 Mal das Verhältnis der durchschnittlichen Veränderung in der Absorption in den Kontroll-Vertiefungen minus der Veränderung in der Absorption in der Test-Vertiefung geteilt durch die durchschnittliche Veränderung in der Absorption bei 600 nm für die Kontroll-Vertiefungen (z.B. [durchschn. Veränderung in Kontroll-Vertiefungen – Veränderung in Test-Vertiefung)/(durchschn. Veränderung in Kontroll-Vertiefungen)] × 100). Üblicherweise wurden Messungen in 24 Stunden Intervallen genommen und die Periode von 24–48 Stunden wurde benutzt für die %Inhibitions-Messungen.
Beispiel 3
Aufreinigung von antimikrobiellem Protein aus der Macadamia integrifolia basischen Protein-Fraktion
Das Ausgangsmaterial für die Isolierung des Mi antimikrobiellen Proteins war die basische Fraktion extrahiert aus den ausgereiften Samen wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Protein wurde weiter aufgereinigt durch Kationen-Austauscher Chromatographie wie in 1 gezeigt.
Ungefähr 4 g der basischen Protein-Fraktion gelöst in 20 mM Natrium Succinat (pH 4) wurden auf eine S-Sepharose High Performance Säule (5 × 60 cm) (Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit Succinat-Puffer äquilibiriert worden war. Die Säule wurde bei 17 ml/Min mit einem linearen Gradienten von 20 Litern von 0 bis 2 M NaCl in 20 mM Natrium Succinat (pH 4) eluiert. Das Eluat wurde durch on-line Messung der Absorption bei 280 nm auf Anwesenheit von Protein (vergleiche 1) überwacht und in 200 ml Fraktionen gesammelt. Anteile von jeder Fraktion wurden anschließend im antimykotischen Aktivitäts-Assay bei einer Konzentration von 100 μg/ml getestet. Ergebnisse dieses Bio-Assays sind in 1 eingefügt: schattierte Balken repräsentieren Prozent Inhibition, wobei die am meisten aktive Fraktion 100% Inhibition zeigt. Die Fraktionierung ergab eine Nummer von ungelösten Peaks, die zwischen 0.05 und 1 M NaCl eluierten. Ein bedeutender Peak, der bei ungefähr 6 Stunden in die Abtrennung eluierte (Fraktionen 31 und 32) zeigte die signifikanteste antimikrobielle Aktivität.
Die Fraktionen, die signifikante antimikrobielle Aktivität zeigten, wurden weiter durch reversed-Phase Chromatographie aufgereinigt. Ungefähr 1 mg Mengen der kombinierten Fraktionen 31 und 32 wurden auf eine Pep-S (C₂/C₁₈) Säule (25 × 0.93 cm) (Pharmacia) äquilibriert mit 95% H₂O/5% MeCN/0.1% TFA (= 100%A) geladen. Die Säule wurde bei 3 ml/Min mit einem 300 ml linearem Gradienten (100 Min) von 100%A nach 5% H₂O/95% MeCN/0.1 % TFA (= 100%B) eluiert. Einzelne Peaks wurden manuell gesammelt, drei Mal im Vakuum getrocknet um Spuren von TFA zu entfernen und anschließend in 500 μl Milli-Q Wasser (Millipore Corporation Wasser Aufreinigungssystem) zur Verwendung in wie in Beispiel 2 beschriebenen Bio-Assays resuspendiert. 2 zeigt das HPLC Profil der aufgereinigten Fraktion 31/32 der Kationen-Austauscher Chromatographie, die in 1 gezeigt ist. Die Protein-Elution wurde bei 214 nm überwacht. Einzelne Peaks wurden im Bio-Assay auf antimikrobielle Aktivität hin gestestet: die Balken in 2 zeigen die Inhibition, die zu 100 μg/ml des Materials von jedem der Peaks gehört. Der aktives Protein enthaltende Peak 7, der bei ungefähr 47 Min (35% MeCN) eluiert, wurde als MiAMP1 bezeichnet.
Beispiel 4
Antimikrobielle Wirksamkeit von MiAMP1
MiAMP1 wurde wie in Beispiel 3 aufgereinigt. Antimikrobielle Wirksamkeit wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben getestet. Tabelle 1 unten zeigt die IC₅₀ Werte von reinem MiAMP1, wenn getestet gegen verschiedenen Pilze und Bakterien. In der Tabelle zeigt "> 100" an, dass Konzentrationen höher als 100 μg/ml nicht getestet wurden; "< x" zeigt an, dass eine Konzentration weniger als dieser Wert (x) nicht getestet wurde. Die Abkürzung "ND" zeigt an, dass der Test nicht durchgeführt wurde oder dass die Resultate nicht ausgewertet werden konnten. Das antimikrobielle Protein wurde auch in der Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺ im Testmedium getestet und die IC₅₀ Werte für diese Tests sind in der rechten Spalte angegeben.
Wie man der Tabelle entnehmen kann, ist die inhibitorische Aktivität von MiAMP1 in der Anwesenheit von Ca²⁺ stark reduziert (aber nicht vollständig verschwunden).
Konzentrationen von MiAMP1, bei denen 50 % Inhibition des Wachstums beobachtet wurde Tabelle 1
Beispiel 5
Effekt von aufgereinigtem MiAMP1 auf Pflanzenzellen
Da MiAMP1 ein nützliches Protein zur Expression in transgenen landwirtschaftlichen Pflanzen sein könnte, testeten wir, ob MiAMP1 toxisch für Pflanzenzellen ist. Tabak (Nicotiana plumbaginofolia) Mikrocallus-Kulturen wurden in modifiziertem CSV Medium (Gibson, 1976 #219) im Dunkeln unter Schütteln bei 110 rpm bei 28° C kultiviert, wie in der in Gibson et al. (Gibsen et al. [1976] Plant 128:223–229) beschriebenen Methode. 50 μl Aliquots von filtersterilisiertem antimikrobiellen Protein in 1 × CSV Medium wurden zu 50 μl Pflanzenzellsuspensionen zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 μg/ml zu erreichen. Nach Inkubation über Nacht bei 28° C wurde ein Phenosafranin plus Fluorescein Diacetat-Assay durchgeführt, um die Zellviabilität zu bestimmen. Fünfzig Mikroliter der FDA Stammlösung (5 mg/ml in Aceton) wurden zu 2.5 ml der PS Stammlösung (0.05 % in Wachstumsmedium) zugegeben, um die gemischte Färbelösung herzustellen (Widholm, J.M. [1972] Stain Technology 47:189–194). Ein Tropfen der gemischten Färbelösung wurde zu einem Tropfen der Zellsuspension zugegeben und dann durch Hellfeld-Lichtmikroskopie und durch UV-Anregungsmikroskopie visualisiert, um die Zellviabilität zu bestimmen. Eine 0,1% Triton X-100 Lösung wurde als Positivkontrolle in diesen Experimenten verwendet. Tabakmikrokallus-Kulturen zeigten keine Abnahme in der Viabilität, wie durch die Anzahl der fluoreszierenden Zellen bestimmt, (Fluorescein Diacetat-Färbung) und keinen Anstieg in der Anzahl der toten Zellen (Phenosafranin-Färbung) unter der Exposition zu MiAMP1 bei Konzentrationen bis zu 100 μg/ml für bis zu 72 Stunden.
Beispiel 6
Effekt von MiAMP1 auf menschliche kultivierte Zellen und rote Blutzellen
Es wurden Toxizitäts-Assays mit HeLa Zellkulturen durchgeführt, um die Toxizität von MiAMP1 gegenüber humanen Zellen zu untersuchen. Eine HeLa Zellkultur wurde in einer Kultur mit einfacher Zellschicht bei 37 °C mit 5% CO₂ in modifiziertem RPMI 1640 Medium (Trace Biosciences, NSW, Australia) gehalten. RPMI Medium wurde mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 2 g/l NaHCO₃ plus Penicillin G (10,000 U/l) und Streptomycinsulfat (100 g/l) supplementiert. Einhundert Mikroliter Mengen von frisch geernteten und verdünnten Zellen wurden auf Mikrotiter-Platten transferiert (10⁴–10⁵ Zellen pro Vertiefung). Nachdem sich die Zellen angeheftet hatten und fast konfluent waren, wurde der Überstand abgenommen und mit 100 μl filtersterilisiertem antimikrobiellen Protein ersetzt, das vorher in 1 × Zellkulturmedium suspendiert worden war. Bis zu 1 mg/ml Konzentrationen des antimikrobiellen Proteins wurden in Triplikaten zu den Vertiefungen zugegeben, die eine einfache Zellschicht von HeLa Zellen beinhalteten und die Kulturen wurden dann über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden auch unter der Anwesenheit von Hordothionin bei Konzentrationen von 10–400 μg/ml als positive Kontrollen inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand abgenommen, die Zellen mit 2 × Phosphat-gepufferter Saline (1,5 mM KH₂PO₄, 8mM K₂HPO₄, 2.7 mM KCl, 135 mM NaCl bei 37 °C) gewaschen und dann mit neutraler roter Färbelösung gefärbt (Terras, F.R.G. et al. [1992] Journal of Biol. Chem. 267:15301–15309). Der Kulturüberstand wurde auch auf Lactatdehydrogenase (LDH) Aktivität als eine Bestimmungsmöglichkeit des Zelltodes (Legrand [1992] J. Biotech. 25:231–243) getestet. Zusätzlich zu Tests im normalen Medium wurden die Zellen auch in Medium ohne FBS getestet, aufgrund der Möglichkeit, dass FBS die Toxizität maskieren könnte.
Die Zellviabilität oder Proliferation war bei Konzentrationen so hoch wie 1 mg/ml nicht betroffen, wobei dies durch mikroskopische Untersuchung und Quantifizierung der Aufnahme der Färbelösung nach dem Färben nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu führte Hordothionin (ein Protein, das bekanntermaßen antibiotisch gegenüber menschlichen Zellen ist) zu einem kompletten Verlust der Zellviabilität bei Konzentrationen von 10 μg/ml und höher. Das Fehlen eines Effekts durch MiAMP1 auf die Zellviabilität wurde durch Messungen der LDH Levels in Kulturüberständen bestätigt, die keine Veränderung in den Levels zeigten.
Zusätzlich zu den Zellviabilitäts-Assays wurden hämolytische Assays mit menschlichen Erythrozyten gemäß Cammue (Cammue, B.P.A. et al. [19995] Plant Physiolo. 109:445–455) durchgeführt. Menschliche Erythrozyten wurden mehrere Male gewaschen durch Resuspendieren der Zellen in 10 mM Phosphat, 120 mM NaCl, 27 mM KCl (pH 7,2), leichtes Vermischen und Absetzen der Zellen mittels milder Zentrifugation (3 Minuten, 300 g). Wenn der Überstand keine sichtbare Farbveränderung aufwies, wurden die Zellen in PBS resuspendiert, um eine 0,5% Suspension zu erhalten. Aliquots von 100 μl wurden zu Mikrotiterplatten-Vertiefungen zugegeben. Proteinlösungen (100 μl) wurden zu den einzelnen Vertiefungen zugegeben, um eine Endkonzentration von 10–500 μg/ml zu erreichen. Triton X-100 (0,05 % Endkonzentration) wurde als eine positive Kontrolle für Hämolyse benutzt und Wasser wurde als eine negative Kontrolle benutzt. Zellsuspensionen wurden für eine Stunde bei 37 °C inkubiert, die Mikrotiterplatte wurde bei 300g, 10 °C für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde zu einer frischen Platte überführt, auf welcher die Absorption (405 nm) gemessen wurde. Diese Tests zeigten keine Lyse der roten Blutzellen nach Exposition zu MiAMP1 bei Konzentrationen bis zu 100 μg/ml. Die Ergebnisse sind konträr zu Ergebnissen mit Thionin antimikrobiellen Peptiden (z.B. Hordothionin), von denen berichtet wurde, dass sie eine Zerstörung von kultivierten Erythrozyten bei Konzentrationen von 5–40 μg/ml verursachen (Terras, F.R.G. et al. [1992] J. Biol. Chem. 267:15301–15309).
Beispiel 7
Reinheit von isoliertem MiAMP1
Die Reinheit des isolierten antimikrobiellen Protein wurde durch native SDS-PAGE gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Blau Proteinfärbelösung (vergleiche 3) verifiziert. Die Elektrophorese wurde auf einem 10–20 % Trizin Gradientengel (Novex) wie vom Hersteller empfohlen (100 V, 1–2 Stunden Trennzeit) durchgeführt. Standards (Kaleidascope polypeditide standards, Biorad) wurden auf Spur 3 aufgetragen, um ein ungefähres Molekulargewicht des Proteins zu bestimmen.
Es kann 3 entnommen werden, dass das aufgereinigte MiAMP1 bei ungefähr 8 kDa neben Aprotinin in den Molekulargewichts-Standards läuft (Molekulargewicht der Standards, auftretend von oben nach unten in 3: 38,6 kDa, 25,0 kDA, 16,3 kDa, 7,8 kDa, 3,4 kDa). Der Nachweis einer einzigen Hauptbande in der SDS-PAGE Analyse, zusammen mit einzelnen Peaks, die in den analytischen Kationen-Austauscher und Reversed-Phase Auftrennungen (nicht gezeigt) eluierten, gibt einen starken Hinweis darauf, dass die Aktivität von MiAMP1 auf das aufgereinigte Protein alleine zurückzuführen war und nicht auf eine kleinere kontaminierende Komponente.
Beispiel 8
Massenspektroskopische Analyse von MiAMP1
Aufgereinigtes MiAMP1 wurde einer massenspektroskopischen Analyse unterzogen. Ungefähr 1 μg Protein in Lösung wurde für den Test verwendet. Die Analyse zeigte, dass das Protein ein Molekulargewicht von 8134 Da ± 2 Da (vergleiche 4) hat. Zusätzlich wurde das Protein einer Reduktion der Disulfidbrücken mit Dithiothreitol und einer Alkylierung mit 4-Vinylpyridin unterzogen. Das Produkt dieser Reduktion/Alkylierung wurde dann ebenfalls einer massenspektroskopische Analyse unterzogen und es konnte gezeigt werden, dass es 638 Masseneinheiten hinzugewonnen hatte (das heißt, das Molekulargewicht war auf 8773 ± 2 Da erhöht worden – vergleiche 5). Der Zugewinn in Masse wurde so interpretiert, dass er anzeigt, dass sechs 4-Vinylpyridin Gruppen (Masse 106 Da) mit dem reduzierten Protein reagiert hatten, was anzeigt, dass das Protein insgesamt 6 Cysteinreste enthält. Der Cysteinanteil wurde ferner danach durch die Aminosäure- und Nukleotidsequenzierung bestätigt (vergleiche Beispiel 9 und 11).
Beispiel 9
Aminosäuresequenz von MiAMP1
Ungefähr 1 μg des reinen Proteins, das reduziert und alkyliert worden war, wurde einem automatischen Edman-Abbau zur N-terminalen Sequenzierung unterzogen. In einem ersten Sequenzierungslauf wurden 35 Reste der Sequenz bestimmt. Nachfolgend wurde MiAMP1 mit der Endoproteinase Lys-C verdaut, welche nach der Carbonylgruppe von Lysylresten schneidet. Ein Milligramm des reduzierten/alkylierten Proteins wurde mit Lys-C (Boehringer Mannheim) wie vom Hersteller angegeben verdaut. Die Fragmente wurden durch reversed-Phase HPLC aufgereinigt und sequenziert. Unter Verwendung dieses Verdaus wurde die Sequenz des Proteins bis zum Rest 68 bestimmt. Weiterer Verdau des Lys-C-Fragments mit der Endoproteinase Trypsin (TPCK-behandelt, Sigma) ergab zwei Fragmente. Die nachfolgende Sequenzierung ergab 2 weitere Reste der Sequenz, um damit 70 Reste der partiellen Sequenz zu ergeben (vgl. 6 für die gesamte Sequenz des ausgereiften Proteins). Anschließend wurden die verbleibenden 6 Aminosäuren von der von DNA- Sequenz abgeleitet (vgl. Beispiel 8), um somit die gesamte Proteinsequenz von 76 Aminosäureresten zu ergeben. 6 zeigt die Sequenz des ausgereiften Proteins (in der Box) sowie die aus der cDNA-Sequenz bestimmten Sequenz (Beispiel 8) des Signalpeptides (unterstrichen). Die ATG Start-der-Translation- und TAG Stop-Codons sind ebenfalls in der Nukleotidsequenz unterstrichen, die oben mit der Aminosäuresequenz gezeigt ist. Nachdem die Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt worden war, war es möglich, die Masse des Proteins vorherzusagen. Unter der Verwendung des Softwareprogramms MacVector 4.5.3 wurde eine vorhergesagte Masse von 8137,51 Da erhalten. Abhängig von der Anzahl der Disulfidbrücken, die geformt werden, wird sich die Proteinmasse von 8131,5 bis 8137,5 Da erstrecken. Dies ist in naher Übereinstimmung mit der Masse von 8134,4 ± 2 Da, die durch die massenspektrometrische Analyse erhalten wurde (Beispiel 5), auch wenn das Protein wahrscheinlich 3 Disulfidbrücken bildet (die Masse um 6 Da erniedrigend). Da die durch die Massenspektrometrie bestimmte Masse des Proteins und die ausgehend von der Aminosäuresequenz berechnete Masse fast exakt übereinstimmten, wurde die Aminosäuresequenz als akkurat bewertet.
Beispiel 10
Identifizierung von verwandten Proteinen in anderen Arten der Familie Proteaceae
Kaninchen wurden intramuskulär gemäß Standardprotokollen mit MiAMP1, das an das Diphteria-Toxoid konjugiert und in nicht-kompletten Freud's Adjuvants suspendiert vorlag, immunisiert. Das Serum wurde den Tieren in regelmäßigen Intervallen nach der Gabe von zusätzlichen Dosierungen von MiAMP1-Adjuvants zur Verstärkung der Immunantwort abgenommen. Ungefähr 100 ml des Serums wurden gesammelt und für die Untersuchung der Rohextrakte verwendet, die von verschiedenen Pflanzensamen erhalten worden waren. 100 g-Mengen der Samen wurden gemahlen und extrahiert, um einen Rohextrakt wie in Beispiel 1 zu erhalten. Aliquots, die 5 und 50 μg Mengen des Proteins enthielten, wurden auf SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und die Gele wurden dann auf Nitrocellulosemembranen für die nachfolgende Detektion der antigenen Proteine geblotted. Die Membranen wurden mit den primären Kaninchen-MiAMP1 Antikörpern inkubiert, gewaschen und dann mit alkalischer Phosphatase-konjugierten anti-Kaninchen-IgG aus der Ziege zur farblichen Bestimmung der antigen-reaktiven Banden unter Verwendung des chemischen 5-Bromo-4-Chloro-3- Indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium-Substratfärbesystem (Schleicher und Schuell) gefärbt. Eine gefärbte Membran ist in 7 gezeigt.
7 zeigt, dass verschiedene Proteaceae-Arten antigenverwandte Proteine von ähnlicher Größe zu MiAMP1 enthalten. Spuren 1–22 enthalten die folgenden Extrakte: 1) Persoonia levis, 2) Stirlingia simplex, 3) Isopogon trilobus, 4) Proteia pulchra, 5) Cardwellia sublimis, 6) Stenocarpus sinuatus, 7) Telopea oreades, 8) Xylomelum protocea, 9) Macadamia integrifolia, 10) Grevillea robusta, 11) Hakea platysperma, 12) Banksia asplenifolia, 13) Banksia robur, 14) MiAMP1 (in purer Form), 15) Reis, 16) Roggen, 17) Kichererbse, 18) Mung-Bohne, 19) Flindersia australis, 20) Rettich, 21) Raps, 22) MiAMP1 (in purer Form). Spuren 1–14 enthalten Extrakte der Familie Proteaceae und alle zeigen die Anwesenheit von Antigen-verwandten Proteinen von einer ähnlichen Größe zu MiAMP1 (einschließlich eines sehr schwachen Signals in Spur 2, das sich nicht gut photographieren ließ). Die Kontrollspuren (15–21), Extrakte von nicht verwandten Spezies enthaltend, zeigen keine Proteine von ähnlicher Größe und Antigenreaktion.
Bio-Assays wurden auch unter der Verwendung mehrerer Rohextrakte von Proteaceae-Arten durchgeführt. Speziell für Extrakte aus Banksia robur, Banksia canei, Hakea gibbosa, Stenocarpus sinuatus, Stirlingia latifolia und Macadamia integrifolia wurde gezeigt, dass sie alle antimikrobielle Aktivität ausüben.
Beispiel 11
Molekulare Klonierung der DNA kodierend für MiAMP1
Degenerierte Primer korrespondierend zur zurückübersetzten Nukleotidsequenz wurden in reverser Transkriptase PCR-Reaktionen verwendet (Primer α-Sequenz 5' CCG AAG CAG TTG CA[C/G/T] CG[C/G/T] C 3' und Primer β-Sequenz 5' GAG [C/A]G[T/G] TAT [T/A][C/G][T/G] AAG TGT GG 3'). PCR-Produkte wurden dann nach dem Ausschneiden der DNA-Banden aus Agarosegelen und deren Aufreinigung unter Verwendung eines Qiagen DNA-clean-up-Kits direkt sequenziert (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin Elmer Corporation). Bei dieser Herangehensweise konnten wir ein 160 DNA-Basenpaarfragment aus der mRNA aus Mi-Kernen unter der Verwendung von cDNA als Matrize in der Polymerasekettenreaktion amplifizieren. Spezifische Oligonukleotid-Primer wurden dann ausgehend von dieser Nukleotidsequenz für die Verwendung in einer 5' und 3' schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) hergestellt. Das 3'-RACE-Protokoll verwendete einen spezifischen Primer, abgeleitet von der bekannten Nukleotidsequenz (Primer α, 5' TGC TCT CTA CAA CCA GGC TG 3') zusammen mit einem Oligo d(T)₂₅ Primer (Primer β), um ein Fragment entsprechend dem 3'-Ende der cDNA zu amplifizieren (6, Positionen 334–493). Das 5'-RACE-Protokoll verwendete einen anderen spezifischen Primer (Primer β, 5'-GCA TTG GAT GAA GAT ACT C-3'), abgeleitet von der bekannten Sequenz zusammen mit einem Primer (Primer α, 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3'), hergestellt, um effizient an poly-C-endende cDNA zu annealen, die im 5'-RACE-Protokoll verwendet wurde (Frohman, M.A. [1990] "RACE: Rapid amplification of cDNA ends", in PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Innis, M.A., Gelfan, D.h., Sninsky, J.H. and White, T.J. eds. S. 28–38, Academic Press, London). Das 5'-RACE-Protokoll führte zur Bestimmung der Basen 1–282 (6). Nachfolgend wurden zwei spezifische Primer korrespondierend zum 5'- und zum 3'-Ende des Gens synthetisiert und verwendet, um ein nahezu Volllängen-Nukleotidfragment zu amplifizieren (6, Positionen 15–481), das direkt in die Klonierungsstelle des pGEM-T-Vektors (Promega) für weitere Manipulationen und zur Sequenzierung ligiert wurde.
Beispiel 12
Herstellung des Pflanzen-Transformations-Vektors pPCV91-MiAMP1
Der Expressionsvektor pPCV91-MiAMP1 (8) enthält die vollständige kodierende Region der MiAMP1-DNA, an seinem 5'-Ende flankiert vom starken konstitutiven Promoter der 35S RNA aus dem Blumenkohl Mosaikvirus (pCaMV35S) (Odel et al., [1985] Nature 313:810–812) mit einem vierfach wiederholten Enhancer-Element (e-35S), um hohe transkriptionelle Aktivität zu gewährleisten (Kay et al., [1987] Science 236:1299–1302). Die kodierende Region der MiAMP1-DNA ist an ihrem 3'-Ende von der Polyadenylierungs-Sequenz der 35S RNA des Blumenkohl Mosaikvirus (pA35S) flankiert. Das Plasmidrückgrat dieses Vektors ist das Plasmid pPCV91 (Walden, R. et al. [1990] Methods Mol. Cell. Biol. 1:175–194). Das Plasmid enthält auch andere Elemente, die für die Pflanzen-Transformation hilfreich sind, wie etwa ein Ampicillin-Resistenzgen (bla) und eine Hygromycin-Resistenzgen (hph) unter Kontrolle des nos-Promoters (pnos). Diese und andere Eigenschaften erlauben es, in verschiedenen Klonierungs- und Transformations-Prozeduren zu selektieren. Das Plasmid pPCV91-MiAMP1 wurde wie folgt konstruiert: Das PCR-klonierte Fragment im pGEM-T-Vektor (Beispiel 11) wurde unter der Verwendung der Restriktionsenzyme Sac II und Spe I verdaut, um das MiAMP1-Genfragment herauszuschneiden. Der binäre Vektor pPCV91 wurde mit dem Restriktionsenzym Bam HI verdaut. Beide, sowohl das MiAMP1 DNA-Fragment als auch der binäre Vektor wurden dann mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um die Überhänge in stumpfe Enden zu überführen. Nachfolgend wurden die zwei Fragmente unter der Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert, um den binären Vektor pPCV91-MiAMP1 für die Transformation von Pflanzen zu produzieren (8).
Beispiel 13
Pflanzentransformation
Der abgerüstete Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 (pMP90RK) (Koncz, C.S. [1986] Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) wurde mit dem Vektor pPCV91-MiAMP1 (Beispiel 12) unter Verwendung der Methode von Walkerpeach et al. (Walkerpeach, C.R. et al. [1994] Plant Mol. Biol. Manual B1:1–19) adaptiert von Van Haute (Van Haute, E., et al. [1983] EMBO J. 2:411–417) transformiert.
Die Transformation von Tabak wurde durchgeführt unter der Verwendung von Blätter-Disks von Nicotiana tabacum basierend auf der Methode von Horsch et al. (Horsch et al. [1985] Science 227:1229–1231) und von ko-kultivierten Stämmen, die pPCV91-MiAMP1 enthielten. Nach Ko-Kultivierung des Agrobacterium und der Tabakblätter-Disks wurden transgene Pflanzen (transformiert mit pPCV91-MiAMP1) auf Medium enhaltend 50 μg/ml Hygromycin und 500 μg/ml Cefotaxim regeneriert. Diese transgenen Pflanzen können auf die Expression des neu eingeführten Gens unter der Verwendung von Standard-Westernblot-Techniken analysiert werden. Pflanzen, die zur konstitutiven Expression des eingeführten Gens fähig sind, können selektiert und selbst bestäubt werden, um Samen zu ergeben. F1-Setzlinge der transgenen Pflanzen können weiter analysiert werden.
Beispiel 14
Konstruktion des bakteriellen Expressionsvektors pET-MiAMP1
PCR-Primer, welche die kodierende Region des MiAMP1-Gens flankieren, wurden so hergestellt, dass sie Restriktionsseiten für Nde I und Bam HI (korrespondierend zum 5'- bzw. 3'-Ende der kodierenden Region) enthielten. Diese Primer wurden dann verwendet, um die kodierende Region der MiAMP1 cDNA zu amplifizieren. Nach dem Verdau mit Nde I und Bam HI wurde das PCR-Produkt dieser Amplifikation dann in den Vektor pET-17b (Novagen/Studier F.W. et al. [1986] J. Mol. Biol. 189:113) mit der kodierenden Region im Leserahmen ligiert, um den Vektor pET-MiAMP1 herzustellen (9).
Beispiel 15
Expression von MiAMP1-Protein in flüssiger Kultur
Der mit dem Vektor pET-MiAMP1 (Beispiel 14) transfomierte E. coli-Stamm BL21 (Grodberg, J. [1988] J. Bacteriol. 170:1245) wurde bis zu einer optischen Dichte von 0,6 herangezogen und durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert. Aliquots der wachsenden Kultur wurden zu bestimmten Zeitintervallen genommen und die Proteinextrakte auf SDS-PAGE-Gelen laufengelassen, um die Expressionslevel von MiAMP1 in der Kultur zu verfolgen.
10 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Extrakte, die auf die Induktion folgend erhalten wurden. Spur 1 enthält einen molekularen Gewichtsstandard. Spuren 2–7 enthalten Extrakte der Kultur zum Zeitpunkt 0, 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden nach Induktion. Spur 8 enthält einen Extrakt eines nicht transformierten E. coli-Stammes BL21. Spur 9 enthält reines MiAMP1. Der Pfeil in 10 hebt die Bande des MiAMP1-Proteins hervor, welches in der Kultur produziert wurde. Eine drastische Akkumulation in den Levels von MiAMP1 nach der Induktion ist offensichtlich.
Es wird dem Fachmann klar sein, dass viele Veränderungen an den oben ausgeführten Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne den breiten Geltungsbereich und Umfang der Erfindung zu verlassen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes oder synthetisches antimikrobielles Protein ausgewählt aus: (i) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz hat, die den Positionen 27 bis 102 der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz entspricht; (ii) einem Homolog von (i); (iii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz enthält, die den Resten 27 bis 102 der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz entspricht; (iv) einem Protein, das einen Cystein-Platzhalter der Sequenz -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C- enthält, wobei es sich bei X um jede Aminosäure mit Ausnahme von Cystein handeln kann; und (v) einem Protein, das aus der Familie Proteaceae isolierbar ist und spezifisch mit gegen (i) hergestellten Antikörpern reagiert und das die gleiche antimikrobielle Aktivität wie (i) hat.
Protein gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz der Reste 27 bis 102 SEQ ID NO:1 aufweist.
Eine isolierte oder synthetische DNA, die für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus: (i) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz hat, die den Positionen 27 bis 102 der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz entspricht; (ii) einem Homolog von (i); (iii) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz enthält, die den Resten 27 bis 102 der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz entspricht; (iv) einem Protein, das einen Cystein-Platzhalter der Sequenz -C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C- enthält, wobei es sich bei X um jede Aminosäure mit Ausnahme von Cystein handeln kann; und (v) einem Protein das aus der Familie Proteaceae isolierbar ist, und spezifisch mit gegen (i) hergestellten Antikörpern reagiert und das die gleiche antimikrobielle Aktivität wie (i) hat.
DNA gemäß Anspruch 3 umfassend die Nukleotide 148 bis 375 der SEQ ID NO:2.
DNA-Konstrukt, das eine DNA gemäß Anspruch 3 enthält, die operativ mit Elementen zur Expression des genannten kodierten Proteins verknüpft ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 5, wobei besagte DNA die Nukleotide 70 bis 375 der SEQ ID NO:2 enthält.
Konstrukt gemäß Anspruch 5 das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pPCV91-MiAMP1 und pET-MiAMP1, die jeweils in den 8 und 9 gezeigt sind.
Wirtszelle enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 5.
Wirtszelle gemäß Anspruch 8, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer bakteriellen Zelle, einer Pilzzelle, einer Insektenzelle, einer Pflanzenzelle und einer Säugetierzelle.
Transgene Pflanze enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 5.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, die eine monokotylodone oder eine dikotylodone Pflanze ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, die ausgewählt ist aus der Pflanzengruppe bestehend aus Getreiden, Futterpflanzen, Früchten, Gemüsen, Ölsamenpflanzen, Palmen, Forstpflanzen und Weinen.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mais, Banane, Erdnuß, Felderbse, Sonnenblume, Tomate, Raps, Tabak, Weizen, Gerste, Hafer, Kartoffel, Sojabohnen, Baumwolle, Nelke, Hirse, Lupine und Reis.
Reproduktives Material einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch 11.
Reproduktives Material gemäß Anspruch 14, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Samen, Pflanzenabkömmlingen und klonalem Material.
Zusammensetzung umfassend ein antimikrobielles Protein gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem landwirtschaftlich verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
Zusammensetzung umfassend ein antikmikrobielles Protein gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel.
Verfahren zur Kontrolle von mikrobiellem Pflanzenbefall umfassend: (i) Einführen eines DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 5 in die genannte Pflanze; oder (ii) Behandeln besagter Pflanze mit einem antimikrobiellen Protein gemäß Anspruch 1 oder einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 16.
Verwendung eines antimikrobiellen Proteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments bei der Kontrolle des mikrobiellen Befalls eines Säugetiers.