DE69828443T2

DE69828443T2 - Säugetierabkömmliche peptide zur behandlung von mikrobiellen infektionen

Info

Publication number: DE69828443T2
Application number: DE69828443T
Authority: DE
Inventors: F. Brian HOFFMAN; Bernard Dubnick
Original assignee: Theragem Inc
Current assignee: Theragem Inc
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: CA2309554A1; US6337314B1; EA002242B1; ATE285786T1; EA200000407A1; ES2236931T3; CN1280497A; AU750614B2; WO1999017786A1; NZ504405A; EP1066045A1; DE69828443D1; EP1066045A4; EP1066045B1; AU8781098A; BR9813249A

Description

Die vorliegende Beschreibung beansprucht den Nutzen der vorläufigen Anmeldung Seriennummer 60/061 454, angemeldet am 8. Oktober 1997.
Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtöten von Gram-positiven Bakterien und Pilzen, und ein Verfahren zum Behandeln eines Materials, das einer mikrobiellen Kontamination ausgesetzt ist, durch Verabreichen einer wirksamen antimikrobiellen Menge der α- oder β-Ketten von Hämoglobin, die frei von Häm sind, oder von Polypeptidfragmenten der α- und β-Ketten, die aus einer Spaltung durch Cyanogenbromid resultieren, oder von synthetischen Fragmenten davon.
Stand der Technik
Antibakterielle Peptide aus natürlichen Quellen haben eine lange Geschichte. Im Jahr 1939 zeigte Dubos, dass ein Bodenbacillus, der anschließend als B. brevis identifiziert wurde, Substanzen produzierte, die Pneumococcus-Infektionen bei Mäusen verhindern konnten. Anschließend reinigten Hotchkiss und Dubos zwei Substanzen, die aus Aminosäuren bestanden, wobei eine dieser Substanzen, Gramicidin, sich als therapeutisches Mittel bewährt hat. In hierauf folgenden Untersuchungen über antimikrobielle Peptide wurden zahlreiche Wirkstoffe identifiziert (1). (In dieser Anmeldung werden mehrere Veröffentlichungen durch arabische Ziffern in Klammern angegeben. Die vollständigen Zitate dieser Referenzen finden sich, in der Reihenfolge aufgelistet, am Ende der Beschreibung.)
Zahlreiche Bakterien erzeugen antimikrobielle Peptide (Bakteriocine) und Proteine; diejenigen Substanzen, die von Gram-negativen Bakterien freigesetzt werden, sind stärker wirksam und haben ein breiteres Wirkspektrum (2). Die Defensine sind kleine antimikrobielle Peptide, die in Neutrophilen, Nicht-Mensch-Makrophagen und Paneth-Zellen gefunden werden (3). Die Haut von Amphibien ist eine reichhaltige Quelle von antimikrobiellen Peptiden, eine dieser Substanzen, Magainin, isoliert aus Xenopus laevis, befindet sich zurzeit im klinischen Test (4, 5). Pflanzen bilden verschiedene Gen codierte antimikrobielle Peptide, umfassend die Phytoalexine, die PR-Proteine und die AMPs (6, 7). Für Insekten wurde gezeigt, dass sie bakterizide Peptide und Proteine synthetisieren, z.B. Cecropin, das aus dem Nachtfalter („moth") Cecropia erhalten wurde (8, 9, 10), und die Sarcotoxine, die aus den Larven der Fleischfliege Sarcophaga perigrina erhalten wurden (11). Aus den Hämozyten der Hufeisen-Krabbe („horse-shoe crab") Limulus stammen die Tachyplesine, außerdem wurde Squalamin, ein Aminosteroid mit antimikrobieller Aktivität, aus dem Hai Squalus acanthias isoliert (12).
Somit gehören viele antimikrobielle Substanzen zu Familien von „natürlichen" Antibiotika, z.B. den Cecropinen, Magaininen, Defensiven, Serprocidinen und anderen. Diese Substanzen sind in der Natur weit verbreitet und stellen in Arten, die von Insekten über Amphibien bis zu Säugetieren reichen, einen natürlichen Abwehrmechanismus gegen Infektionen dar. Im Allgemeinen sind diese Substanzen in Zellen gespeichert, so dass sie in dem Tier induziert und ausgeschieden werden können, wenn es erforderlich ist. Viele Substanzen wirken, indem sie die bakterielle Zellmembran selektiv aufreißen; viele wären auch für die Wirtszellen toxisch, wenn sie nicht abgeschieden vorliegen würden (13). Für verschiedene dieser Substanzen wurde vorgeschlagen, dass sie als antimikrobielle Mittel geeignet sind (14, 15).
Hämoglobin (Mw = 64 500) besteht aus vier Polypeptidketten und vier prosthetischen Häm-Gruppen, in denen die Eisenatome als Eisen(II) vorliegen. Häm ist ein Metallkomplex, der aus einem Eisenatom im Zentrum einer Porphyrinstruktur besteht. Das Protein, das Globin genannt wird, besteht aus zwei α-Ketten und zwei β-Ketten. Im Menschen gibt es zwei α-Ketten, die jeweils aus 141 Aminosäureresten bestehen, und zwei β-Ketten, die jeweils 146 Reste enthalten. Die Aminosäuresequenz der α- und β-Ketten des menschlichen Hämoglobins ist wie folgt:
α-Kette
β-Kette
Die Struktur von Häm (Ferroprotoporphyrin IX) ist bekannt.
An jede Polypeptidkette ist eine Häm-Gruppe über eine Koordinations-Bindung zwischen dem Eisenatom und der R-Gruppe eines Histidinrestes gebunden. Die sechste Koordinations-Bindung des Eisenatoms ist für die Bindung von Sauerstoff verfügbar. Außerdem transportiert Hämoglobin auch H^–, CO₂ und NO. Die Struktur von Häm ist in allen Tieren, die Hämoglobin besitzen, identisch, jedoch variiert die Sequenz der Globinketten beträchtlich. Trotz dieser Variation ist die Konfiguration des Tetramers unter den Arten ziemlich ähnlich.
Die Wechselwirkungen von Hämoglobin mit Sauerstoff und Kohlendioxid hängen ab vom Zustand des Häm und der Reste, die es umgeben, sowie außerdem von der Regulation durch heterotrophe Liganden, umfassend H⁺, Cl^–, CO₂, HCO₃ und 2,3-Diphosphoglycerat. Diese Liganden regulieren das Gleichgewicht zwischen dem Zustand hoher Affinität (der entspannten oder R-Struktur) und dem gespannten Zustand geringer Affinität (oder der T-Struktur). Die Stereochemie von Hämoglobin wurde ausführlich beschrieben (16, 17).
Auf Hämoglobin basierende Zusammensetzungen wurden zu dem Zweck entwickelt, sie als Blutersatzstoffe zu verabreichen (18, 19). Diese Mittel umfassen ein chemisch modifiziertes Hämoglobin, das die Sauerstoff-tragende Häm-Gruppe enthält, die für den richtigen Sauerstofftransport erforderlich ist. Während solche, auf modifiziertem Häm basierenden Verbindungen als Blutersatzstoffe verabreicht wurden, wurde die Verabreichung von unmodifiziertem Hämoglobin, seinen Häm-freien Untereinheiten oder Fragmenten oder synthetischen Peptiden davon bisher für diesen Zweck oder für andere therapeutische Anwendungen noch nicht beschrieben. Tatsächlich wären die Häm-freien α- und β-Untereinheiten für den Zweck zum Bereitstellen von Blutersatzstoffen nicht geeignet, da sie nicht in der Lage sind, Sauerstoff zu binden.
Hobson et al., Journal of Experiment. Med. (1958), 107 (2), S. 167–183, und Wood et al., Laborat. Invest. (1958), 7 (1), S. 1–8, beschreiben die antibakterielle Wir kung von Hämoglobin gegen Gram-negative Bakterien; DE-A-2523052 offenbart, dass pathogene Pilze unter Verwendung von Hämoglobin kontrolliert werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Abtöten von Gram-positiven Bakterien oder Pilzen bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Gram-positiven Bakterien oder Pilze mit einer antimikrobiell wirksamen Menge von einem Hämoglobin-Proteinfragment oder Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämoglobin-β-Kette, einem Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten der Proteine oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Sterilisieren oder Aufrechterhalten von Pilz- oder Gram-positiv-Bakterien-freien Produkten bereit, umfassend das Applizieren oder Vermischen der Produkte mit einer antimikrobiell wirksamen Menge von einem Hämoglobin-Proteinfragment oder Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämo-globin-β-Kette, einem Häm-freien Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Häm-freien Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten des Proteinfragments oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht.
Außerdem stellt die Erfindung die Verwendung von einem Hämoglobin-Proteinfragment oder Polypeptidfragmenten davon bereit, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämoglobin-β-Kette, einem Häm-freien Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Häm-freien Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten des Proteinfragments oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht, zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln von Infektionen mit Gram-positiven Bakterien oder Pilzen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Verhindern der Kontamination von Nahrungsmitteln durch Gram-negative Bakterien bereit, umfassend das Applizieren oder Vermischen des Nahrungsmittels mit einer antimikrobiell wirksamen Menge von Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 oder Kombinationen davon besteht. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sterilisieren oder Aufrechterhalten von Gram-negativ-Bakterien-freien Produkten bereit, umfassend das Applizieren oder Vermischen der Produkte mit einer antimikrobiell wirksamen Menge einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 oder einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 oder Kombinationen davon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Aktivität von Hämoglobin gegen Staphylococcus aureus bei pH 5,5.
2: Aktivität von Hämoglobin gegen Streptococcus faecalis bei drei pH-Werten.
3: Aktivität von Hämoglobin gegen Pseudomonas aeruginosa bei drei pH-Werten.
4: Aktivität von Hämoglobin gegen Candida albicans bei pH 5,5.
5: Aktivität von Hämoglobin gegen Escherichia coli bei pH 5,5.
6: Aktivität von Hämoglobin gegen Escherichia coli bei pH 7,4.
7: Aktivität der α-Kette gegen Candida albicans bei pH 5,5.
8: Aktivität der α-Kette gegen Escherichia coli bei pH 5,5 und pH 7,4.
9: Aktivität der α-Kette gegen Escherichia coli bei pH 5,5 und pH 7,4.
10: Aktivität der α-Kette gegen Pseudomonas aeruginosa bei pH 5,5.
11: Aktivität der β-Kette gegen Pseudomonas aeruginosa bei pH 5,5.
12: Aktivität der β-Kette gegen Pseudomonas aeruginosa bei pH 5,5.
13: Aktivität der β-Kette gegen Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis bei pH 5,5.
14: Aktivität der β-Kette gegen Candida albicans bei pH 5,5.
15: Aktivität der β-Kette gegen Escherichia coli bei pH 5,5 und pH 7,4.
16: Kurve einer C4-Reverse-Phase-HPLC-Analyse von menschlichen Hämoglobin-Ketten, wobei ein früher Peak zu sehen ist, der Häm darstellt, und darauf breitere Peaks folgen, welche die β- bzw. die α-Kette darstellen.
17: Tris-Tricin-SDS-PAGE-Analyse von menschlichem Hämoglobin, die eine Färbung mit Coomassie-Blau von sowohl der α- als auch der β-Kette bei 14,5 kDa zeigt.
18A: HPLC-Trennung von CNBr-gespaltenen Fragmenten der menschlichen Hämoglobin-α-Kette.
18B: HPLC-Trennung von CNBr-gespaltenen Fragmenten der menschlichen Hämoglobin-β-Kette.
19A: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse des CNBr-gespaltenen α1-Fragments der menschlichen Hämoglobin-α-Kette.
19B: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse des CNBr-gespaltenen α2-Fragments der menschlichen Hämoglobin-α-Kette.
19C: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse der CNBr-gespaltenen Fragmente α1 und α2 der menschlichen Hämoglobin-α-Kette.
19D: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse des CNBr-gespaltenen α3-Fragments der menschlichen Hämoglobin-α-Kette.
19E: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse des CNBr-gespaltenen β1-Fragments der menschlichen Hämoglobin-β-Kette.
19F: MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse des CNBr-gespaltenen β2-Fragments der menschlichen Hämoglobin-β-Kette.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Der Gegenstand der Erfindung ist die antimikrobielle Aktivität von Säuger-Hämoglobin, Häm-freien α- und β-Ketten, ausgewählten Fragmenten davon, synthetischen Peptiden daraus und Zusammensetzungen, die solche Peptide und Fragmente enthalten. Therapeutische Anwendungen für diese Substanzen umfassen die Verwendung als systemische Mittel gegen Gram-positive Bakterien und gegen Pilze und als Mittel, die einen Synergismus mit herkömmlichen Antibiotika zeigen.
Weiterhin umfassen diese Substanzen auch Polypeptidfragmente der α- und β-Ketten von Hämoglobin, die aus der Spaltung der α- oder der β-Kette mit Cyanogenbromid (CNBr) oder anderen Peptidasen resultieren, und synthetische Peptide daraus. Bakterien, gegen welche die Substanzen eine bakterizide Aktivität aufweisen, umfassen Gram-positive Bakterien. Beispiele solcher Gram-positiver Bakterien sind Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis. Außerdem wirken die Zusammensetzungen als antimikrobielle Mittel gegen Pilze, einschließlich Hefen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Hefe Candida albicans.
Menschliches Hämoglobin zeigt eine antimikrobielle Aktivität gegen Pilze, z.B. Candida albicans, Gram-negative Bakterien, z.B. Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa, und Gram-positive Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis (1 bis 6). Die antimikrobielle Aktivität wird durch den pH-Wert beeinflusst, wobei sie bei pH 5,5 größer ist als bei pH 7,4.
Eine ähnliche antimikrobielle Aktivität wird für Häm-freie α- und β-Ketten von Hämoglobin gezeigt (7 bis 10 für die Häm-freie α-Kette; und 11 bis 15 für die Häm-freie β-Kette). Wie beim intakten Hämoglobin wird die antimikrobielle Aktivität für die Häm-freien α- und β-Ketten von Hämoglobin durch den pH-Wert beeinflusst, wobei sie bei pH 5,5 größer ist als bei pH 7,4.
Weiterhin wird eine antimikrobielle Aktivität durch Fragmente der α- und β-Ketten gezeigt, die entstehen, wenn entweder Hämoglobin oder die einzelnen α- und β-Ketten durch CNBr gespalten werden.
Die CNBr-Behandlung führt bei der α-Kette zu drei Fragmenten und bei der β-Kette zu zwei Fragmenten.
Das α-3-Fragment der CNBr-Spaltung wurde identifiziert als:
Die Entdeckung von antimikrobiellen Aktivitäten des menschlichen Hämoglobins und seiner zwei Untereinheiten hatte zur Folge, dass die Mindestanforderungen für die biologische Aktivität untersucht wurden, um Modellverbindungen mit einer ähnlichen Aktivität entwerfen zu können. Wie vorstehend diskutiert ergab die Spaltung mit CNBr fünf Fragmente: drei aus der α-Kette und zwei aus der β-Kette. Fragment β2 war stark wirksam gegen E. coli und C. albicans. Die Tertiärstruktur von β2 zeigt, dass beide Enden dieses Fragments Helices sind. Zwei Peptide, die von den Enden von β2 hergeleitet sind, wurden synthetisiert und auf eine antibiotische Aktivität getestet.
Jedes der synthetischen Peptide zeigt antimikrobielle Aktivitäten (vgl. Tabelle 3, Beispiele 9 und 10).
Zwar sollte ein Mechanismus, den man vorschlägt, um die Wirkung dieser Peptide zu erklären, nicht als Einschränkung angesehen werden, man kann jedoch vermuten, dass die antimikrobielle Aktivität durch eine Beteiligung der Helixstruktur der Peptide zustande kommt, wodurch möglicherweise innerhalb der Membranen von Mikroorganismen Poren gebildet werden. Aufgrund der Ähnlichkeit in der Struktur und Konfiguration von Hämoglobinen aus verschiedenen Säugetieren ist es wahrscheinlich, dass Hämoglobin, seine α- und β-Ketten und Fragmente davon, die aus anderen Quellen als dem Menschen stammen, eine signifikante antimikrobielle Aktivität zeigen. Somit umfasst die Erfindung auch Hämoglobin-Tetramere und ihre enthaltenen Häm-freien Monomere aus anderen Säugetieren.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann therapeutisch, prophylaktisch oder als Desinfektionsmittel eingesetzt werden, indem die Bakterien oder Pilze einer antimikrobiell wirksamen Menge von einer der hier beschriebenen Zusammensetzungen gemäß einem der hier beschriebenen Verfahren ausgesetzt werden. Wenn das Verfahren durchgeführt wird, werden die Zusammensetzungen typischerweise in einem geeigneten Puffer gelöst. Beispiele von geeigneten Puffern sind dem Fachmann bekannt und umfassen Phosphatpuffer (für Pilze) oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung bei geeigneten pH-Werten.
Diese pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine antimikrobiell wirksame Menge von einer der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger für die äußerliche, orale oder systemische Verwendung sind dem Fachmann bekannt und in der Pharmakopöe der Vereinigten Staaten („Pharmacopeia of the United States"), The National Formulary and Pharmaceutical Science (8. Auflage, Kapitel 83, 84 und 89), beschrieben.
Abhängig von der jeweiligen spezifischen Anwendung kann die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte pharmazeutische Zusammensetzung als eine Lösung, Suspension, ein parenterales Präparat, eine Salbe, Creme, Lotion, ein Spray, Pulver, eine Tablette oder Kapsel formuliert werden, wobei sie passend dosiert, appliziert oder gemischt wird. Parenterale Präparate können einen Träger umfassen, z.B. speziell destilliertes, Pyrogen-freies Wasser, Phosphatpuffer oder normale Kochsalzlösung. Sal ben, Cremes, Lotionen und Sprays können einen Träger enthalten, z.B. pflanzliches Öl oder Mineralöl, entfärbtes Petrolatum oder einen Alkohol mit hohem Molekulargewicht, d.h. der mehr als zwölf Kohlenstoffatome besitzt. Tabletten oder Kapseln können Verdünnungsmittel, z.B. Lactose, Bindemittel, Gleitmittel, z.B. Stearinsäure, und ein Zerfallshilfsmittel, z.B. Maisstärke, enthalten.
Jede der Zusammensetzungen kann mit anderen Antibiotika oder antimikrobiellen Mitteln, Mitteln gegen Protozoen, Mitteln für die Wundheilung und dergleichen kombiniert werden, um ihre Aktivität oder ihr therapeutisches Spektrum zu vergrößern.
Die Zusammensetzungen können an das Individuum z.B. durch intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, oral oder in Form einer Aerosolspray-Zusammensetzung verabreicht werden. Außerdem können zum Verabreichen der Zusammensetzungen Lipidvesikel oder Lipidemulsionspräparate, welche die Peptide der Erfindung enthalten, verwendet werden. Spezifische Verabreichungsarten hängen von dem Krankheitserreger ab, auf den abgezielt werden soll. Der spezifische Verabreichungsweg und das spezifische Dosierungsschema muss vom klinischen Arzt ausgewählt und nach den in der Klinik bekannten Verfahren entsprechend eingestellt oder angepasst werden, so dass die optimale klinische Antwort erhalten wird. Die Menge, die verabreicht werden soll, ist die Menge, die antimikrobiell wirksam ist. Die verabreichte Dosis hängt auch von den Eigenschaften des Individuums ab, das behandelt werden soll, z.B. von dem bestimmten behandelten Säugetier, dem Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, gegebenenfalls der Art einer gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlungen und der kleinsten therapeutischen Dosis. Im Fall der Behandlung von Menschen liegt die antimikrobiell wirksame Menge typischerweise im Bereich von etwa 0,5 bis 50 mg/kg Körpergewicht und im Bereich von etwa 0,5 bis 5,0 mg/ml pro Dosis.
Außerdem wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Peptide bereitgestellt, um eine mikrobielle Kontamination von Nahrungsmitteln zu verhindern, d.h. als Konservierungsmittel, oder um mögliche Krankheitserreger zu eliminieren. Z.B. kommt es in Schalentier-, Fleisch- und Geflügelprodukten normalerweise zum Wachstum von darmpathogenen Organismen. Solche Krankheitserreger können durch die Behandlung mit einer antimikrobiell wirksamen Menge der Peptidzusammensetzungen der Erfindung entfernt werden. Außerdem können als Nahrungsmittel dienende Feldfrüchte, z.B. Früchte und Gemüse, behandelt werden, um zu verhindern, dass sie nach der Ernte verderben. Die Peptide können äußerlich zugegeben oder durch transgene Expression eines rekombinanten Peptids der Erfindung verabreicht werden. In dem Fall, wenn das Material, das konserviert werden soll, mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vermischt wird, wird eine antimikrobiell wirksame Menge des ausgewählten Peptids durch ein einfaches Mischverfahren zugegeben. Die antimikrobiell wirksame Menge liegt typischerweise im Bereich von etwa 1500 μg bis 50 mg/kg des behandelten Mate rials. In dem Fall, wenn die Zusammensetzungen äußerlich verabreicht werden, liegt die antimikrobiell wirksame Menge typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 mg/cm².
Außerdem können die Peptide der Erfindung als Desinfektionsmittel verwendet werden, um Mikroorganismen-freie Produkte zu sterilisieren oder aufrechtzuerhalten. Solche Produkte können Babytücher, Windeln, Bandagen, Papierhandtücher, kosmetische Produkte, Augenwaschlösungen und Kontaktlinsenlösungen umfassen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können zu solchen Produkten in einem geeigneten Puffer oder in Liposomzusammensetzungen äußerlich zugegeben werden. Die antimikrobiell wirksame Menge, die verabreicht werden soll, liegt typischerweise im Bereich von etwa 1500 μg bis 50 mg/kg des behandelten Materials.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, sie sollen sie jedoch in keiner Weise einschränken.
Beispiele
Verfahren und Präparate
Auftrennen von α- und β-Ketten aus dem Hämoglobin (30, 31)
Rohes Hb (50 μl), bezogen von Sigma Chemicals, wurde in eine C4-Reverse-Phase-HPLC-Säule (YMC Protein-RP, 150 × 4,6 mm I.D.) injiziert und mit Wasser/Acetonitril eluiert (mobile Phase A: 80% H₂O/20% AcCN/0,1 TFA; mobile Phase B: 40% H₂O/60% AcCN/0,1 TFA). Die Säule wurde anfangs zehn Minuten mit 40% der mobilen Phase B gewaschen, danach wurde ein linearer Gradient von 45% bis 60% von B 90 Minuten laufen gelassen. Ein zweiter linearer Gradient von 55% bis 95% von B wurde zehn Minuten laufen gelassen, danach wurde die Säule 15 Minuten bei 95% B gehalten. Die Fließrate der Säule betrug 1 ml/Min., und das eluierte Material wurde bei 210 nm nachgewiesen. Das eluierte Volumen wurde in 4-ml-Fraktionen gesammelt, die unter Vakuum eingeengt wurden. Das Häm wurde als ein spitzer Peak bei 7,15 Min. eluiert, während die β- und die α-Untereinheit als breite Peaks eluiert wurden, deren Mitte bei 28 Min. bzw. 38 Min. lag (16).
Tris/Tricin-SDS-PAGE-Analyse von Hämoglobin und seinen α- und β-Ketten (32)
Aliquots (20 μl) von Hb und seinen α- und β-Ketten wurden mit 6 × Probenpuffer (4 μl) versetzt, fünf Minuten auf 95°C erhitzt und durch SDS-PAGE (16,5% Gel) unter Verwendung eines Tris/Tricin-Puffersystems analysiert. Die Banden wurden durch eine einstündige Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht (0,1% Coomassie-Blau G-250 in 50% Methanol/10% Essigsäure), anschließend wurde jedes Gel über Nacht entfärbt (5% Methanol/7% Essigsäure) (17).
Spalten der menschlichen α- und β-Hämoglobin-Ketten mit Cyanogenbromid (CNBr)
Menschliche α- und β-Ketten wurden mit Ameisensäure verdünnt (Endkonzentration von 60% Ameisensäure). Danach wurde Cyanogenbromid (500- bis 1000-facher Überschuss) als eine Lösung von AcCN (4,7 M) zugegeben. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit Argon durchgespült und 24 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen. Da beim Spaltverfahren HCOOH eingesetzt wurde, bestand die Wahrscheinlichkeit, dass die resultierenden Fragmente formyliert waren, das heißt, das bei der HPLC-Analyse für jedes Fragment mehrere Peaks ergeben würde. Um dieses Problem zu umgehen, wurde Ethanolamin (100 μl Ethanolamin pro 1 mg Ausgangsmaterial) zu den Proben zugegeben, die danach gevortext, beschallt und erneut im Vakuum getrocknet wurden. Das Material wurde unter Beschallung in 10 mM Natriumphosphatpuffer (NaPB) bei pH 5,5 wieder gelöst.
Die Reverse-Phase-HPLC wurde eingesetzt, um die Peptidfragmente aufzutrennen (18, A und B)
Das theoretische Spaltmuster der α- und β-Ketten des menschlichen Hämoglobins lässt erwarten, dass man für die α-Kette drei Peptide mit 32, 44 und 65 Aminosäuren und für die β-Kette zwei Peptide mit 55 und 91 Aminosäuren erhält. Die MALDI-TOF-massenspektroskopische Analyse der CNBr-gespaltenen Fragmente der α- und β-Ketten ist in 19, A bis F, dargestellt.
Messen der antimikrobiellen Aktivität
Die in den beschriebenen Tests verwendeten Mikroorganismen waren wie folgt: Staphylococcus aureus war Stamm RN6390, Pseudomonas aeruginosa war Stamm PA01, Escherichia coli war Stamm MC4100, Streptococcus faecalis war ATCC 8043, und Candida albicans war ein klinisches Isolat auf dem Presbyterian Hospital.
Antibakterielle Aktivität
A. Plattentest
Die antibakterielle Aktivität von gereinigten Fraktionen, Hämoglobin oder seinen α- und β-Ketten, oder von den durch CNBr erhaltenen Fragmenten dieser Ketten wurden gegenüber Bakterien getestet, vertreten durch Escherichia coli, das auf Agarplatten mit Trypicase-Soja-Brühe (TSB) gehalten wurde. Escherichia coli dient als repräsentativer Vertreter von Gram-negativen Organismen. Eine Einzelkolonie wird in Trypticase-Soja-Brühe eingeimpft und bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (OD₆₀₀ = 0,75). Die Kulturen werden in NaPB (pH 5,5 oder 7,4), 150 mM NaCl (PBS) gewaschen und auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁴ koloniebildende Einheiten (CFU) pro ml verdünnt. Die Bakterien werden eine Stunde bei 37°C mit geeigneten Konzentrationen von Hämoglobin oder den α- oder β-Ketten in PBS-Testpuffer inkubiert. Am Ende des Tests werden Aliquots in PBS 1:10 verdünnt und zusammen mit 0,8% Weichagar auf Agarplatten plattiert, um das Überleben der Bakterien nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht zu bestimmen. Die bakterizide Aktivität wird bestimmt, indem die Abnahme der koloniebildenden Einheiten für die mit Hämoglobin oder mit seinen α- oder β-Ketten inkubierten Bakterien im Vergleich zu den mit Puffer alleine inkubierten Bakterien berechnet wird.
B. Kreisdiffusionstest auf antibiotische Aktivität gegen Staphylococcus aureus RN6390
Eine Einzelkolonie von Staphylococcus aureus RN6390 wird in CYGP-Brühe eingeimpft und bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (OD₆₀₀ = 0,7). Die Kulturen werden in NaPB, pH 5,5, gewaschen und auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁷ CFU/ml verdünnt. Ein 0,2-ml-Aliquot dieser Bakterensuspension (10⁷ CFU) wird zu 10 ml autoklaviertem und abgekühltem (auf 42°C) NaPB-Puffer, 1% (Gew./Vol.) Agarose des Niedrig-Elektroendosmose-Typs (Sigma) zugegeben. Nachdem die Bakterien mit der Agarose gemischt wurden, wird diese in quadratische Lab-Tek-Petrischalen gegossen, so dass eine gleichmäßig dicke Schicht entsteht. Sodann werden Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,7 mm ausgestochen und mit 4,5 μl der Kontrolle oder der Probe gefüllt, danach werden die Platten drei Stunden bei 37°C inkubiert und mit 10 ml sterilem Agar überschichtet, der bei 42°C gehalten wurde. Der Deckagar ist 2 × CYGP-Brühe und 1% (Gew./Vol.) Bacto-Agar. Nach einer Inkubation von 18 bis 24 Stunden bei 37°C wird der Durchmesser der klaren Zone, welche die Vertiefungen umgibt, die ein antibakterielles Mittel enthalten, gemessen.
C. Kreisdiffusionstest auf antibiotische Aktivität gegen Pseudomonas aeruginosa PA01
Eine Einzelkolonie von Pseudomonas aeruginosa PA01 wird in Trypticase-Soja-Brühe eingeimpft und bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (OD₆₀₀ = 0,7). Die Kulturen werden in NaPB, pH 5,5, gewaschen und auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁷ CFU/ml verdünnt. Ein 0,2-ml-Aliquot dieser Bakteriensuspension (10⁷ CFU/ml) wird zu 10 ml autoklaviertem und abgekühltem (auf 42°C) NaPB-Puffer, 1% (Gew./Vol.) Agarose des Niedrig-Elektroendosmose-Typs (Sigma) zugegeben. Nachdem die Bakterien mit der Agarose gemischt wurden, wird diese in quadratische Lab-Tek-Petrischalen gegossen, so dass eine gleichmäßig dicke Schicht entsteht. Sodann werden Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,7 mm ausgestochen und mit 4,5 μl der Kontrolle oder der Probe gefüllt, danach werden die Platten drei Stunden bei 37°C inkubiert und mit 10 ml sterilem Agar überschichtet, der bei 42°C gehalten wurde. Der Deckagar ist 6% (Gew./Vol.) TSB und 1% (Gew./Vol.) Bacto-Agar. Nach einer Inkubation von 18 bis 24 Stunden bei 37°C wird der Durchmesser der klaren Zone, welche die Vertiefungen umgibt, die ein antibakterielles Mittel enthalten, gemessen.
D. Kreisdiffusionstest auf antibiotische Aktivität gegen Escherichia coli MC4100
Eine Einzelkolonie von Escherichia coli MC4100 wird in Trypticase-Soja-Brühe eingeimpft und bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (OD₆₀₀ = 0,7). Die Kulturen werden in NaPB, pH 5,5, gewaschen und auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁷ CFU/ml verdünnt. Ein 0,2-ml-Aliquot dieser Bakteriensuspension (10⁷ CFU/ml) wird zu 10 ml autoklaviertem und abgekühltem (auf 42°C) NaPB-Puffer, enthaltend 0,02% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% Triton X100, 1% (Gew./Vol.) Agarose des Niedrig-Elektroendosmose-Typs (Sigma) zugegeben. Nachdem die Bakterien mit der Agarose gemischt wurden, wird diese in quadratische Lab-Tek-Petrischalen gegossen, so dass eine gleichmäßig dicke Schicht entsteht. Sodann werden Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,7 mm ausgestochen und mit 4,5 μl der Kontrolle oder der Probe gefüllt, danach werden die Platten drei Stunden bei 37°C inkubiert und mit 10 ml sterilem Agar überschichtet, der bei 42°C gehalten wurde. Der Deckagar ist 6% (Gew./Vol.) TSB und 1% (Gew./Vol.) Bacto-Agar. Nach einer Inkubation von 18 bis 24 Stunden bei 37°C wird der Durchmesser der klaren Zone, welche die Vertiefungen umgibt, die ein antibakterielles Mittel enthalten, gemessen.
E. Kreisdiffusionstest auf antibiotische Aktivität gegen Streptococcus faecalis ATCC 8043
Eine Einzelkolonie wird in 10 ml TSB eingeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Etwa 0,3 ml werden zu 10 ml frischem TSB zugegeben und bei 37°C geschüttelt. Diese Kultur lässt man bis zur mittleren exponentiellen Phase wachsen (OD₆₀₀ = 0,6). Die Kultur wird zweimal in NaPB, pH 5,5, gewaschen und bei 5000 UpM zehn Minuten abzentrifugiert. Nach dem Waschen wird der OD-Wert erneut bestimmt, um die genaue Bakterienkonzentration zu ermitteln. Die gewaschenen Bakterien werden in einer Konzentration von 10⁷ pro Platte zu der unteren Schicht zugegeben (NaPB pH 5,5/1% Niedrig-Elektroendosmose-Agarose). Verdünnungen von Hämoglobin-Verdünnungen in NaPB, pH 5,5, werden zu der Platte zugegeben, man lässt sie in die Schicht diffundieren, anschließend wird die Platte in einer Feuchtkammer drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation werden 10 ml Nährmedium, 6% TSB und 1% Bacto-Agar als Deckschicht zugefügt und die Platten in einer Feuchtkammer über Nacht bei 37°C inkubiert.
Anti-Pilz-Aktivität
A. Plattentest
Die Anti-Pilz-Aktivität von Hämoglobin oder seinen α- oder β-Ketten wird gegen einen Pilz getestet, vertreten durch Candida albicans, der auf Sabouraud-Dextrose-Agarplatten gehalten wird. Der Pilz Candida albicans, der in diesen Tests verwendet wird, ist ein Isolat aus dem Columbia Presbyterian Hospital, NY. Eine Einzelkolonie wird in Sabouraud-Dextrose-Brühe eingeimpft und 16 bis 18 Stunden bei 37°C gezüchtet. Ein Aliquot der Übernacht-Kultur wird in frische Brühe eingeimpft und drei Stunden bis zu einer Dichte von 7 × 10⁶/ml gezüchtet, dies wird mit einer Zählkammer bestimmt. Die Pilzkultur wird in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,5, auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁴ CFU/ml verdünnt und diese Suspension drei Stunden mit Hämoglobin oder seinen α- oder β-Ketten in NaPB, pH 5,5, inkubiert. Aliquots werden in M63- Minimalmedium 1:10 verdünnt und auf Sabouraud-Dextrose-Agarplatten ausgestrichen, um nach 20 Stunden bei 37°C die überlebenden CFU zu bestimmen.
B. Kreisdiffusionstest
Der Pilz wird drei Stunden aus einer Übernacht-Kultur in Sabouraud-Dextrose-Brühe gezüchtet, bei 10 000 g zehn Minuten zentrifugiert, zweimal in NaPB, pH 5,5, gewaschen und in NaPB (pH 5,5) auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁷/ml resuspendiert. Ein 0,1-ml-Aliquot dieser Pilzsuspension (4 × 10⁶ CFU) wird zu 10 ml autoklaviertem und abgekühltem (auf 42°C) NaPB, pH 5,5, enthaltend 1% (Gew./Vol.) Agarose des Niedrig-Elektroendosmose-Typs (Sigma), zugegeben. Nachdem der Pilz dazu gemischt wurde, wird der Agar in quadratische Lab-Tek-Petrischalen gegossen, so dass eine gleichmäßige, 1 mm dicke Schicht entsteht. Sodann werden Vertiefungen mit einem Durchmesser von 3 mm ausgestochen und mit 5 μl der Kontrolle oder der Probe gefüllt, danach werden die Platten drei Stunden bei 37°C inkubiert und mit 10 ml sterilem Agar überschichtet, der bei 42°C gehalten wurde. Der Deckagar ist 2 × Sabouraud-Agar. Nach einer Inkubation von 18 bis 24 Stunden bei 37°C wird der Durchmesser der klaren Zone, welche die Vertiefungen umgibt, die ein Anti-Pilz-Mittel enthalten, gemessen.
Antimikrobielle Aktivität von Peptiden
Die antimikrobielle Aktivität des menschlichen Hämoglobins, seiner Häm-freien α- und β-Ketten, der durch CNBr erhaltenen Fragmente der α- und β-Ketten und von hieraus stammenden synthetischen Peptiden wurde durch Kreisdiffusionstests und in einigen Fällen durch Plattentests bestimmt. Für die in den 1 bis 15 dargestellten Ergebnisse gibt die Ordinate den Durchmesser der klaren Zone an, der in willkürlichen Einheiten ausgedrückt ist, wobei zehn Einheiten = 1,0 mm (23). Auf der Abszisse ist die Proteinkonzentration in μg/ml aufgetragen. Die MHK wird durch lineare Extrapolation der Messpunkte auf einen Achsenabschnitt der x-Achse abgeschätzt.
Jeder Test wurde mit drei Versuchsläufen durchgeführt, außer wenn etwas anderes angegeben ist. Der Kreisdiffusionstest ist zuverlässig und ergibt reproduzierbare Ergebnisse, wenn er mit den gereinigten oder den teilweise gereinigten Zusammensetzungen der Erfindung verwendet wird. Das Testverfahren wurden nach dem Muster von Lee et al. (23) durchgeführt.
Beispiel 1
Die antimikrobielle Aktivität für menschliches Hämoglobin wurde durch den Kreisdiffusionstest gezeigt und ist in Tabelle 1, Beispiel 1 und den 1 bis 6 zusammengestellt.
Beispiel 2
Die antimikrobielle Aktivität für menschliches Hämoglobin wurde durch den Plattentest gezeigt und stellte die folgenden Daten bereit. Der IC₅₀-Wert für Candida albicans liegt im Bereich von 5 bis 6 μg/ml, und für E. coli liegt er im Bereich von 8 bis 10 μg/ml. Der IC₅₀-Wert ist als die Proteinkonzentration ausgedrückt, die erforderlich ist, um 50% der Testorganismen abzutöten (d.h. 50% Abnahme der koloniebildenden Einheiten).
Beispiele 3 und 4
Die antimikrobielle Aktivität für die Häm-freie α-Kette von Hämoglobin ist in Tabelle 1, Beispiel 3, zusammengefasst, die antimikrobielle Aktivität für die Häm-freie β-Kette von Hämoglobin ist in Tabelle 1, Beispiel 4, zusammengefasst.
Beispiel 5
Die antimikrobielle Aktivität für die α- und β-Ketten des menschlichen Hämoglobins wurde durch den Plattentest gezeigt und stellte die folgenden Daten bereit. Die IC₅₀-Werte für die α-Kette betrugen für Candida albicans 4 bis 5 μg/ml und für Escherichia coli 15 bis 20 μg/ml. Die IC₅₀-Werte für die β-Kette betrugen für Candida albicans 4 bis 5 μg/ml und für Escherichia coli 10 bis 15 μg/ml.
Tabelle 1
Beispiele 6 bis 10
Die antimikrobielle Aktivität für die Fragmente der CNBr-Spaltung der Häm-freien α- und β-Ketten ist in Tabelle 2, Beispiele 6 bis 10, angegeben. Die Beispiele 6, 7 und 8 entsprechen den α-1-, α-2- bzw. α-3-CNBr-Spaltfragmenten, und die Beispiele 9 und 10 entsprechen den β-1- bzw. β-2-CNBr-Spaltfragmenten. Die Werte zeigen, dass die Fragmente α-3 (SEQ ID NO: 3) und β-2 (SEQ ID NO: 2) am wirksamsten sind.
Tabelle 2
Beispiele 11 und 12
Die synthetischen Peptide I und II (SEQ ID NO: 5 bzw. 6) wurden durch die Protein Chemistry Core Facility in Howard Hughes Medical Insitute an der Columbia University gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Die antimikrobielle Aktivität der synthetischen Peptide I (SEQ ID NO: 5) und II (SEQ ID NO: 6) ist in Tabelle 3, Beispiele 11 bzw. 12, dargestellt.
Tabelle 3
Die vorstehenden Beispiele zeigen Experimente, die von den Erfindern durchgeführt und erdacht wurden, indem sie die vorliegende Erfindung zustande gebracht und ausgeführt haben. Man geht davon aus, dass diese Beispiele eine Beschreibung von Verfahren umfassen, die dazu dienen, die Durchführbarkeit und den Nutzen der Erfindung zu demonstrieren. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass in den angegebenen Ausführungsformen und Verfahren verschiedenen Änderungen vorgenommen werden können, ohne dass vom Umfang der Erfindung abgewichen wird.
Referenzen

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Claims

Verfahren zur Verhinderung der Kontamination von Nahrungsmitteln durch Pilze oder Gram-positive Bakterien, umfassend das Applizieren oder Vermischen des Nahrungsmittels mit einer antimikrobiell wirksamen Menge eines Hämoglobin-Proteinfragments oder Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämoglobin-β-Kette, einem Häm-freien Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Häm-freien Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten des besagten Proteinfragments oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht.
Verfahren zum Sterilisieren oder Aufrechterhalten von Pilz- oder Gram-positiv-Bakterien-freien Produkten, umfassend das Applizieren oder Vermischen der Produkte mit einer antimikrobiell wirksamen Menge eines Hämoglobin-Proteinfragments oder Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämoglobin-β-Kette, einem Häm-freien Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Häm-freien Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten des besagten Proteinfragments oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Hämoglobin-Proteinfragmente oder Polypeptidfragmente vom Menschen stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Gram-positiven Bakterien aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Pilze Candida albicans sind.
Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 oder der SEQ ID NO: 6 besteht.
Verwendung eines Hämoglobin-Proteinfragments oder Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Häm-freien Hämoglobin-α-Kette, der Häm-freien Hämoglobin-β-Kette, einem Häm-freien Hämoglobin-α-3-Fragment, einem Häm-freien Hämoglobin-β-2-Fragment, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, Fragmenten des besagten Proteinfragments oder der Polypeptidfragmente davon, sowie Kombinationen davon besteht, zur Herstellung eines Medikaments zur antimikrobiellen Behandlung von Gram-positiv-Bakterien- oder Pilzinfektionen.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Hämoglobin-Proteinfragmente oder -Polypeptidfragmente vom Menschen stammen.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Bakterien Gram-positive Bakterien sind.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Gram-positiven Bakterien ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Pilze Candida albicans sind.
Verfahren zum Verhindern der Kontamination von Nahrungsmitteln mit Gramnegativen Bakterien, umfassend das Applizieren oder Vermischen des Nahrungsmittels mit einer antimikrobiell wirksamen Menge von Polypeptidfragmenten davon, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 oder Kombinationen davon besteht.
Verfahren zum Sterilisieren oder Aufrechterhalten von Gram-negativ-Bakterien-freien Produkten, umfassend das Applizieren oder Vermischen der Produkte mit einer antimikrobiell wirksamen Menge einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 oder Kombinationen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 12 und 13, wobei die Gram-negativen Bakterien ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa besteht.
Verwendung von Polypeptidfragmenten, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 oder Kombinationen davon besteht, zur Herstellung eines Medikaments für eine antimikrobielle Behandlung von Gram-negativ-Bakterien-Infektionen.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die Gram-negativen Bakterien ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa besteht.