EA002242B1

EA002242B1 - Пептиды млекопитающих для лечения микробной инфекции

Info

Publication number: EA002242B1
Application number: EA200000407A
Authority: EA
Inventors: Брайан Ф. Хоффман; Бернард Дубник
Original assignee: ТЕРАГЕМ, Инк.
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2002-02-28
Also published as: EP1066045A4; CA2309554A1; CN1280497A; AU8781098A; US6337314B1; DE69828443D1; NZ504405A; WO1999017786A1; ES2236931T3; EA200000407A1; DE69828443T2; AU750614B2; EP1066045B1; ATE285786T1; EP1066045A1; BR9813249A

Abstract

В настоящем изобретении предложены составы, полезные в качестве антимикробных агентов, которые содержат гемоглобин млекопитающих, α- и β-цепи гемоглобина, не содержащие гема, фрагменты α- и β-цепей, которые получают расщеплением бромцианом α- и β-цепей, а также полученные из них синтетические пептиды. По отношению к бактериям и грибкам указанные составы проявляют антимикробную активность, которая сравнима с известными антимикробными пептидами, полученными из нейтрофилов человека, катепсином G и азуроцидином. Чувствительные к воздействию организмы включают грам-отрицательные бактерии, в частности Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, грам-положительные бактерии, в частности Staphylococcus aureus и Streptococcus faecalis, и грибки Candida albicans. Кроме того, предложены способы получения указанных составов.

Description

Настоящее изобретение относится к способу лечения микробных инфекций у млекопитающих, включая человека и других приматов, к способу уничтожения бактерий и грибков, а также к способу лечения материала, подверженного микробному заражению, путем введения эффективной антимикробной дозы гемоглобина, α- или β-цепей этой молекулы, не содержащих гема, или полипептидных фрагментов α- или (β цепей, полученных в результате расщепления бромцианом, или их синтетических фрагментов. Изобретение относится также к составам, содержащим такие белки, полипептиды или фрагменты.

Антибактериальные пептиды из природных источников имеют долгую историю. В 1939 г. ИиЬоз показал, что почвенные бациллы, впоследствии названные В. Ьгеу18, вырабатывают вещества, которые могут предотвращать пневмококковые инфекции у мышей. Позднее Но1сйк188 и ИиЬоз выделили два вещества, состоящие из аминокислот, и одно из них, грамицидин, стало использоваться в качестве терапевтического средства. Последующие исследования антимикробных пептидов установили множество активных агентов (1). (В данном описании приводятся ссылки на несколько публикаций, которые обозначены арабскими цифрами, заключенными в скобки. Полные названия этих публикаций можно найти в конце данного описания. Все публикации, упоминаемые в настоящей заявке, включены в нее во всей их полноте в качестве ссылки).

Многие бактерии вырабатывают антимикробные пептиды (бактериоцины) и белки, при этом те из них, которые выделяются из грамотрицательных бактерий, являются более сильнодействующими и имеют более широкий спектр активности (2). Дефенсины являются мелкими антимикробными пептидами, которые обнаружены в нейтрофилах, нечеловеческих макрофагах и клетках РапеШ (3). Кожа амфибий является богатым источником антимикробных пептидов, один из которых, магаинин, полученный из Хепориз 1аеу18, в настоящее время проходит клинические испытания (4, 5). Растения образуют множество генетически кодированных антимикробных пептидов, включая фитоалексины, белки РК и аденозинмонофосфаты (6, 7). Насекомые, как было показано, синтезируют бактерицидные пептиды и белки, в частности, цекропин, полученный из мотылька Сесгор1а (8, 9, 10) и саркотоксины, выделенные из личинок мясной мухи 8агсосрйада репдгша (11). Гемоциты краба ЫшШиз являются источником тахиплезинов, а скваламин, аминостероид с антимикробной активностью, выделен из организма акулы 8циа1и8 асап1Ыаз (12).

Таким образом, многие антимикробные вещества относятся к семейству природных антибиотиков, в частности, цекропины, магаи нины, дефенсины, церпроцидины и другие. Эти вещества широко распространены в природе и обеспечивают врожденный механизм защиты от инфекций у различных видов от насекомых до амфибий и млекопитающих. Обычно эти вещества хранятся в клетках, чтобы возбудиться и выделиться в организме при определенном стимулировании. Многие из них действуют путем селективного разрушения оболочки бактериальной клетки, а многие - являются токсичными также для клеток хозяина, если последние не были изолированы (13). Предполагается, что ряд таких соединений является полезным в качестве антимикробных агентов (14, 15).

Гемоглобин (молекулярная масса = 64,500) состоит из четырех полипептидных цепей и из четырех гемопростетических групп, в которых атомы железа двухвалентны. Гем представляет собой металлический комплекс, в котором атом железа расположен в центре структуры порфирина. Белок, называемый глобином, состоит из двух α-цепей и двух β-цепей. В гемоглобине имеет следуючеловека имеются две α-цепи, каждая из которых содержит 141 радикал аминокислот и две βцепи, каждая из которых содержит 146 радикалов. Последовательность аминокислотных α- и β-цепей гемоглобина человека щий вид: а-цепь:

115 νίδΡΑϋΚΤΝνΚΑΑννΘ

45

ΡΜΡίδΡΡΤΤΚΤΥΡΡΗ

30

ΚνΘΑΗΑΟΕΥΟΑΕΑίΕ

60

ΕΟί.8ΗΟ8ΑθνΚΘΗΘΚ

75

ΚνΑΟΑίΤΝΑνΑΗνϋΟ

90

ΜΡΝΑΙ_δΑΙ_δΟΙ_ΗΑΗΚ

105

Ι.ΚνθΡνΝΡΚΙ_Ι_δΗΟΙ_

106 120

Ι_\/ΤΙ_ΑΑΗΙ_ΡΑΕΡΤΡΑ

121135 νΗΑ8Ι_ΟΚΕΙ_Αδν8Τν

136 ίτδκγρ β-цепь:

УН1_ТРЕЕКЗА\/ТА1_\Л/ (8ΕΟΙΟΝΟ:10)

30

ΟΚνΝνΟΕνΟΟΕΑΦΟΡ

45

Ι_Ι_ννΥΡννΤ0ΡίΕΕΕ8Ρ

60

6ϋΙ-8ΤΡ0ΑνΜ(3ΝΡΚν

75

ΚΑΗΟΚΚνΐ_(3ΑΡ8Ο(31_

90

ΑΗΙ.ΟΝΙ_ΚΟΤΡΑΤΙ_δΕ

91105

Ι_Η00ΚΙ_|-ΐν0ΡΕΝΕΡ1_

106 120

1_6Ννΐ_νθνΐΑΗΗΡΘΚ

121 135

ΕΡΤΡΡνΩΑΑΥΟΚννΑ

N0:1)

136 ΟνΑΝΑίΑΗΚΥΗ (8ЕО

Структура гема (ферропротопорфирин IX) хорошо известна.

Одна группа гема связана с каждой полипептидной цепью посредством координационной связи между атомом железа и группой К гистидинового радикала. Шестая координационная связь атома железа может обеспечивать соединение с кислородом. Кроме того, гемоглобин также переносит Н-, СО₂ и N0. Структура гема идентична у всех животных, имеющих гемоглобин, однако, последовательность цепей глобина существенно различается. Несмотря на эти вариации, конфигурация тетрамера у различных видов совершенно аналогична.

Взаимодействие гемоглобина с кислородом и диоксидом углерода зависит от состояния гема и окружающих его радикалов, а также регулируется гетеротропными лигандами, которые включают Н⁺, С1, СО₂, НСО₃ ^- и 2, 3, дифосфоглицерат. Эти лиганды регулируют равновесие между состоянием высокого сродства (релаксированная или К-структура) и напряженным состоянием низкого сродства (или Т-структура). Стереохимия гемоглобина подробно исследована (16,17).

На основе гемоглобина разработаны составы, предназначенные для введения в заменители крови (18, 19). Они включают химически модифицированный гемоглобин, который содержит кислородонесущую группу гема, необходимую для соответствующего переноса кислорода. Такие модифицированные соединения на основе гемоглобина используют в качестве заменителей крови, однако, введение немодифицированного гемоглобина, его подгрупп или фрагментов, не содержащих гема, или синтезированных из них пептидов не использовалось ранее для этой или для других терапевтических целей. Подгруппы α и β, не содержащие гема, действительно не использовались для получения заменителей крови, поскольку они не способны связывать кислород.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ уничтожения бактерий или грибков, включающий контактирование бактерий или грибков с эффективной антимикробной дозой белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, включающей исходный гемоглобин, α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8ЕО ГО N0: 3, последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 2, последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 6, фрагменты указанных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания.

Согласно изобретению предложен также способ лечения субъекта, имеющего бактериальную или грибковую инфекцию, включающий введение эффективной антимикробной дозы указанного белка, полипептидов и/или составов, содержащих их фрагменты, способ обработки материала, подверженного бактериальному или грибковому заражению, включающий нанесение на указанный материал или смешивание с указанным материалом эффективной антимикробной дозы указанных составов, и направлено на применение указанных составов для антимикробной терапии бактерий или грибков.

Кроме того, в изобретении предложена фармацевтически дозированная форма, включающая эффективную антимикробную дозу указанного белка, полипептида и/или составов, содержащих их фрагменты, и фармацевтически допустимый носитель, а также предложен полипептид последовательности аминокислот 8Е0

ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 6 и фрагменты указанных последовательностей.

Ниже приведено краткое описание прилагаемых фигур.

Фиг. 1 - активность гемоглобина относительно 8!арйу1ососсик аигеик при рН 5,5;

фиг. 2 - активность гемоглобина относительно 81тер!ососсик Гаесайк при трех значениях р^н;

фиг. 3 - активность гемоглобина относительно Ркеибошоиак аетидшока при трех значениях рН;

фиг. 4 - активность гемоглобина относительно СапФба а1Ысаик при рН 5,5;

фиг. 5 - активность гемоглобина относительно ЕксйеисЫа сой при рН 5,5;

фиг. 6 - Активность гемоглобина относительно ЕксйеисЫа сой при рН 7,4;

фиг. 7 - активность α-цепи относительно СаиФба а1Ысаик при рН 5,5;

фиг. 8 - активность α-цепи относительно ЕксйеисЫа сой при рН 5,5 и рН 7,4;

фиг. 9 - активность α-цепи относительно ЕксйеисЫа сой при рН 5,5 и рН 7,4;

фиг. 10 - активность α-цепи относительно Ркеибошоиак аетидшока при рН 5,5;

фиг. 11 - активность β-цепи относительно Ркеибошоиак аетидшока при рН 5,5;

фиг. 12 - активность β-цепи относительно Ркеибошоиак аетидшока при рН 5,5;

фиг. 13 - активность β-цепи относительно 8!арйу1ососсик аигеик и 81тер!ососсик Гаесайк при рН 5,5;

фиг. 14 - активность β-цепи относительно СаибЫа а1Ысаик при рН 5,5;

фиг. 15 - активность β-цепи относительно ЕксйеисЫа сой при рН 5,5 и рН 7,4;

фиг. 16 - график обращенной фазы С4 анализа жидкостной хроматографии высокого давления цепей гемоглобина человека, имеющий первый пик, который соответствует гему, и последующие более широкие пики β- и а-цепей, соответственно;

фиг. 17 - анализ трис-трицин -δΌδ-РАбЕ (электрофорез в полиакриламидном геле) гемоглобина человека, показывающий соошакы синюю окраску а- и β-цепей при 14,5 кДа;

фиг. 18А - отделение с помощью жидкостной хроматографии высокого давления расщепленных СИВт фрагментов α-цепи гемоглобина человека;

фиг. 18В - отделение с помощью жидкостной хроматографии высокого давления расщепленных САВг фрагментов β-цепи гемоглобина человека;

фиг. 19А - масс-спектроскопический анализ ΜΑΕΌΙ-Τ0Ε расщепленного СЯВт фрагмента α1 α-цепи гемоглобина человека;

фиг. 19В - масс-спектроскопический анализ ΜΑΕΌΙ-ΤΘΕ расщепленного СЫВг фрагмента α2 α-цепи гемоглобина человека;

фиг. 19С - масс-спектроскопический анализ ΜΑΕΌΙ-ΤΘΕ расщепленных СЫВг фрагментов α1 и α2 α-цепи гемоглобина человека;

фиг. 19Ό - масс-спектроскопический анализ ΜΑΕΌΙ-ΤΘΕ расщепленного СЫВг фрагмента α3 α-цепи гемоглобина человека;

фиг. 19Е - масс-спектроскопический анализ ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ расщепленного СЫВг фрагмента β 1 β-цепи гемоглобина человека;

фиг. 1 9Ε - масс-спектроскопический анализ ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ расщепленного СЫВг фрагмента β 1 β-цепи гемоглобина человека.

Предметом изобретения является антимикробная активность гемоглобина млекопитающих, его α- и β- цепей, не содержащих гема, их выбранных фрагментов, получаемых из них синтетических пептидов и составов, содержащих такие пептиды и фрагменты. Терапевтическое применение этих веществ включает использование в широком спектре локальных и общих антибактериальных и антигрибковых препаратов и агентов, проявляющих синергизм со стандартными антибиотиками.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены соответствующие составы, а также способы лечения микробных инфекций. Более конкретно, составы согласно настоящему изобретению содержат гемоглобин или его αили β-цепи, последние - без гема, полученные из красных кровяных телец человека или из красных кровяных телец млекопитающих.

Кроме того, эти составы включают также фрагменты полипептидов α- или β-цепей гемоглобина, которые получают путем расщепления α-или β-цепи бромцианом (СЫВг) или другими пептидазами, и полученные из них синтетические пептиды. Бактерии, против которых указанные составы обладают бактерицидной активностью, включают грам-отрицательные бактерии. Примерами таких грам-отрицательных бактерий являются ЕзсБепсЫа сой и Рзеибошопаз аегидшоза. Эти составы активны также против грам-положительных бактерий. Примеры таких грам-положительных бактерий: Б1арБу1ососсиз аигеиз и Б1гер1ососсиз Гаесайз. Кроме того, указанные составы действуют как антимикробные агенты против грибков, включая дрожжи. В одном из вариантов реализации изобретения дрожжи представляют собой СапбМа а1Ысапз.

Гемоглобин человека проявляет антимикробную активность против грибков, в частности, СапШба а1Ысапз, грам-отрицательных бактерий, в частности, ЕзсБепсЫа сой и Рзеибошопаз аегидшоза, и грам-положительных бактерий, в частности, Б1арБу1ососсиз аигеиз и 81гер1ососсиз ГаесаНз (фиг. 1-6). Антимикробная активность зависит от величины рН и при рН 5,5 оказывается большей, чем при рН 7,4.

Аналогичную антимикробную активность проявляют α- и β-цепи гемоглобина, не содержащие гема. (фиг. 7-10 относятся к α-цепи, не содержащей гема, фиг. 11-15 - к β-цепи, не содержащей гема). Как и для исходного гемоглобина, антимикробная активность α- и β-цепей гемоглобина, не содержащих гема, зависит от величины рН и при рН 5,5 оказывается большей, чем при рН 7,4.

Кроме того, антимикробную активность проявляют фрагменты α- и β-цепей, которые получены в результате расщепления гемоглобина или отдельных α- и β-цепей бромцианом (СЫВг).

Воздействие СЫВг вызывает образование трех фрагментов α-цепи и двух фрагментов β цепи.

α - 1 <х-2 β-1 β-2 νΐ_8ΡΑ0ΚΤΝ\/ΚΑΑννΘ

ΚνΟΑΗΑΟΕΥΟΑΕΑΙ-Ε

ИМ

ЕЬЗЕРТТТКТУЕРН

Е01_8НСЗАСЛ/К(ЗНСК

ΚνΑΟΑίΤΝΑνΑΗνϋΟ

Μ (ЗЕО ΙΟ N0:8)

90

ΡΝΑΙ_δΑΙ_δΟ1_ΗΑΗΚ

121

135 νΗΑδΐ_οκπ_Αδνδτν

15 \/Н1-ТРЕЕК8А\/ТА1_У\/

ΟΟΙ,δΤΡΟΑνΜ (8ΕΟ ΙΟ N0:9)

60

ΟΝΡΚν

105

1_ΗΟΟΚΙ_Η\/0ΡΕΝΡΡΙ_

136

146

ΟΥΑΝΑΙ-ΑΗΚΥΗ

105

106

120

Ι_Ρ\/0Ρ\/ΝΕΚΚΙ_Ι_δΗΟΙ_

1_\/ΤΙ_ΑΑΗΙ_ΡΑΕΕΤΡΑ

136

Ι_ΤδΚΥΡ(δΕΟ ΙΟ N0:3)

30

ΘΚνΝνΟΕνΟΟΑΕΙ,ΟΡ

ΚΑΗΟΚΚνί-ΟΑΡδΟΟΙ106

120

ΙΘΝνΐ_νθνΐ_ΑΗΗΕ(3Κ (8ΕΟ Ю ΝΟ: 2)

Фрагмент α-3, полученный СЫВг, определяется как ΡΝΑΙ·8ΑΙ_5ΟΙ_ΗΑΗΚΙ_ΚνϋΡν

ЫЕКИЗНСИУПААНГРАЕЕ

ΤΡΑνΗΑ8Ι_0ΚΕΙ_Α8ν8ΤνΐΤ8ΚΥΚ

1_1_\Λ/ΥΡν\/ΤΩΡΕΡΕ8Ρ

ΑΗ1_ΟΝ1_ΚΟΤΈΑΤΙ_δΕ

121

135

ΕΡΤΡΡνθΑΑΥΟΚ\Λ/Α расщеплением (8ΕΟ Ю ΝΟ: 3) а следующий фрагмент определяется как

ΚΑΗ6ΚΚνΐ_ΘΑΕ80ΘΙ_ΑΗ1.0Ν

Ι_Κ(3ΤΡΑΤί.8ΕΙ_Η00ΚΙΗν0Ρ

ΕΝΕΚΙ_Ι_6Ννΐ_νθνΐ_ΑΗΗΕ6Κ

ΕΕΤΡΡνΟΑΑΥΘΚννΑΟνΑΝΑ

86

Ι_ΑΗΚΥΗ (8ΕΩ Ю ΝΟ: 4)

Обнаружение антимикробной активности гемоглобина человека и его двух подгрупп подсказало минимальные требования к биологической активности для построения модели соединений с аналогичной активностью. Как указано выше, расщепление СЫВг приводит к образова002242 нию 5 фрагментов: 3 из α-цепи и 2 из β-цепи. Фрагмент β2 имел высокую активность против Е. со11 и С. а1Ысаик. Третичная структура β2 указывает на то, что оба конца этого фрагмента представляют собой спирали. Два пептида, полученные из концов β2, были синтезированы и испытаны на антибиотическую активность. Пептид I: СПРКУКАНОККУЬОАТ8 (8Еф Ιϋ ΝΟ: 5) Пептид II: ННЕОКЕЕТРРУффААУфКУУАОУАΝΑΤΑΗΚΥΗ (8Еф Ιϋ ΝΟ: 6)

Каждый из синтетических пептидов проявляет антимикробную активность. (См. табл. 3, примеры 9 и 10).

Хотя любой механизм, предлагаемый для объяснения механизма действия этих пептидов, не следует рассматривать как ограничительный, возможно, что антимикробная активность связана со спиральной структурой пептидов, которые могут образовывать поры внутри оболочки микроорганизмов. Благодаря сходству структуры и конфигурации гемоглобинов разных млекопитающих, можно предполагать, что гемоглобин, его а- и β-цепи и их фрагменты, полученные из других источников, кроме организма человека, будут обладать существенной антимикробной активностью. Таким образом, настоящее изобретение включает также тетрамеры гемоглобина и составляющие их мономеры, не содержащие гема, других млекопитающих.

Составы согласно изобретению можно использовать в лечебных целях в качестве консервантов или дезинфектантов. Таким образом, настоящее изобретение включает способ антимикробного лечения бактерий или грибков. Этот способ включает воздействие на бактерии или грибки эффективной антимикробной дозы одного из описанных составов согласно одной или нескольким методикам, описанным далее. При реализации данного способа составы обычно растворяют в соответствующем буфере. Примеры таких буферов известны и включают фосфатный буфер (для грибков) или фосфатный буферный физиологический раствор с соответствующими значениями рН.

Кроме того, согласно изобретению предложен фармацевтический состав, полезный для лечения бактерий или грибков у человека или других млекопитающих и предназначенный для местного или общего применения. Этот фармацевтический состав содержит эффективную антимикробную дозу одного из составов согласно изобретению и фармацевтически допустимый носитель. Пригодные фармацевтически допустимые носители для местного перорального или общего применения известны и описаны в литературе РНагтасораа о£ 1Пс ИиНеб 81а1ек, Тйс Ναΐίοηαΐ Еогти1агу апб Рйагтасеибса1 8с1еисе (8‘^ь Ебйюп, С11ар1ег8 83, 84 апб 89).

В зависимости от конкретно предполагаемого применения, фармацевтический состав согласно настоящему изобретению можно приготовлять в форме раствора, суспензии, парен терального состава, мази, крема, лосьона, аэрозоля, порошка, таблетки или капсулы, которые вводят определенными дозами, наносят или смешивают соответствующим образом. Парентеральные составы могут включать наполнитель, в частности, специально дистиллированную апирогенную воду, фосфатный буфер или обычный физиологический раствор. Мази, кремы, лосьоны и аэрозоли могут включать носитель, в частности, растительное или минеральное масло, белый вазелин или высокомолекулярный спирт, т. е. содержащий более 12 атомов углерода. Таблетки или капсулы могут включать разбавители, например лактозу, связывающие вещества, смазывающие вещества, в частности стеариновую кислоту, а также средство расщепления, например кукурузный крахмал.

Все составы согласно настоящему изобретению могут сочетаться с другими антибиотиками или антимикробными агентами, антипротозойными агентами, средствами заживления ран и т. п. для повышения их активности или терапевтического спектра.

Согласно изобретению предложен также способ лечения человека или другого млекопитающего субъекта, имеющего бактериальную или грибковую инфекцию, включающий введение эффективной антимикробной дозы одного из фармацевтических составов согласно настоящему изобретению. Состав можно вводить субъекту путем, например, внутривенной инъекции, интраперитонеальной инъекции, перорального приема или аэрозольного распыления состава. Липидные пузырьки или препараты с липидной эмульсией, содержащие составы согласно изобретению, также могут быть использованы для введения указанных составов. Конкретный способ введения зависит от патогена, подлежащего уничтожению. Конкретный путь введения и дозировка должны быть подобраны или проверены титрованием консультирующим врачом в соответствии с известными ему методиками с целью получения оптимальной клинической ответной реакции. Величина вводимой дозы должна обеспечивать антимикробный эффект. Предписываемая дозировка зависит также от индивидуальных характеристик субъекта, подвергаемого лечению, в частности, от вида млекопитающего, возраста, массы, состояния здоровья, других типов параллельно проводимого лечения при наличии такового, частоты курсов лечения и терапевтического индекса. В случае лечения человека эффективная антимикробная доза обычно лежит в пределах примерно от 0,5 до 50 мг/кг массы тела и в пределах примерно от 0,5 до 5,0 мг/мл для одной дозы.

В соответствии с изобретением предложен также способ применения указанных пептидов для предотвращения микробного заражения пищи, т.е. в качестве консервантов или для устранения потенциальных патогенов. Так, например, моллюски, а также продукты из мяса и птицы обычно способствуют росту тонкокишечных патогенов. Такие патогены можно устранить с помощью эффективной антимикробной дозы пептидных соединений согласно изобретению. Пищевые культуры, в частности, фрукты и овощи, также можно обрабатывать для предотвращения порчи после сбора урожая. Пептиды можно вводить локально или путем трансгенной экспрессии рекомбинантного пептида согласно изобретению. В тех случаях, когда материал, подлежащий консервации, смешивают с составом согласно изобретению, эффективную антимикробную дозу соответствующего пептида добавляют путем простого подмешивания. Эффективная антимикробная доза обычно составляет примерно от 1500 мкг до 50 мг на кг обрабатываемого материала. В случае локального применения составов эффективная антимикробная доза обычно составляет примерно от 0,1 до 1,0 мг/см².

Кроме того, пептиды согласно изобретению можно использовать в качестве дезинфицирующих агентов для стерилизации или поддержания чистоты продуктов в отношении микробов. Такие продукты могут включать детские подгузники, полотенца, повязки, салфетки, косметические продукты, растворы для глазных примочек и контактных линз. Составы согласно изобретению можно вводить в указанные продукты локально, в соответствующих буферных или липосомных составах. Эффективная антимикробная доза обычно лежит в пределах примерно от 1500 мкг до 50 мг/кг обрабатываемого материала.

Следующие примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения, но не ограничивают его.

Примеры

Способы и препараты

Отделение а- и β-цепей от гемоглобина (30, 31).

Сырой гемоглобин (50 мл), приобретенный у 81дта Сйеш1са18, ввели в колонку с обращенной фазой С4 для жидкостной хроматографии высокого давления (УМС Рго1еш-ВР, 150 х 4,5 мм внутренний диаметр) и разбавили водой/ацетонитрилом (подвижная фаза А: 80% Н₂О/20% АсСЫ/0,1 ТРА, подвижная фаза В: 40% Н₂О/60% АсСЫ/0,1 ТРА). Колонку предварительно промывали 40%-ной подвижной фазой В в течение 10 мин, после чего в течение 90 мин поддерживали линейный градиент от 45 до 60%. Второй линейный градиент от 55 до 95% В поддерживали 10 мин, затем колонку промывали 95% В в течение 15 мин. Скорость потока в колонке составляла 1 мл/мин и элюированный материал определяли при 210 нм. Элюированный объем собрали в 4 мл фракции, которые сконцентрировали в вакууме. Гем элюировал в виде острого пика при 7,15 мин, в то время как подгруппы β и а элюировали в виде широких пиков на 28 и 38 минуте соответственно (фиг.

16).

Анализ трис/трицин-8О 8-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле) гемоглобина и его а- и β-цепей (32).

Аликвоты (20 мл) гемоглобина и его а- и β-цепей смешали с 6Х буфером пробы (4 мл), прогрели при 95°С в течение 5 мин и провели анализ 808-РАСЕ (гель 16,5%) с использованием трис/трициновой буферной системы. Полосы проявлялись за счет окрашивания соошакы в синий цвет (0,1% соошазы синего С-250 в 50% метанола/10% уксусной кислоты) в течение 1 ч с последующим обесцвечиванием каждого геля (5% метанол/7% уксусная кислота) в течение ночи (фиг. 17).

Расщепление бромцианом (СЫВг) а- и βцепи гемоглобина человека.

а- и β-цепи гемоглобина человека разбавили муравьиной кислотой (конечная концентрация муравьиной кислоты 60%). Затем добавили бромциан (с избыточным коэффициентом 500-1000) для получения раствора АсСЫ (4,7 М). Каждый продукт реакции промывали аргоном и выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. Поскольку в процессе расщепления использовалась НСООН, могли образоваться любые получающиеся при этом фрагменты, что привело бы к появлению множества пиков для каждого фрагмента при анализе способом жидкостной хроматографии высокого давления. Чтобы решить эту проблему, к образцам добавляли этаноламин (100 мкл этаноламина на 1 мг исходного материала), после чего образцы взбалтывали, обрабатывали ультразвуком и снова сушили в вакууме. Затем материалы повторно растворяли с обработкой ультразвуком в 10 мМ буферном растворе фосфата натрия (ЫаРВ) при рН 5,5.

Жидкостную хроматографию высокого давления с обращенной фазой использовали для отделения пептидных фрагментов (фиг. 18А и В).

Теоретический механизм расщепления аи β-цепи гемоглобина человека предполагает выход для а-цепи трех пептидов, содержащих 32, 44 и 65 аминокислот, а для β-цепи - двух пептидов, содержащих 55 и 91 аминокислоту. Масс-спектрометрический анализ МАЬО1-ТОР фрагментов а- и β-цепей, расщепленных СЫВг, показан на фиг. 19А-Р.

Измерение антимикробной активности.

В описанных анализах использовали следующие микробы:

81ар11у1ососси5 аигеиз - штамм ΚΝ6390. Рзеибо топаз аегидшоза - штамм РА01, Езсйег1сЫа сой - штамм МС4100, 81гер1ососси5 ГаесаВз - АТСС 8043 и Сапб1ба а1Ысапз - клиническая культура из Пресвитерианской больницы.

Антибактериальная активность.

А. Испытание пластинок.

Антибактериальную активность очищенных фракций гемоглобина или его а- и β-цепей или фрагментов этих цепей, полученных с помощью Ο'ΝΒγ. испытывали против бактерий на примере ЕксйейсЫа сой, которые выдерживали на агаровых пластинках в трипсиновом соевом бульоне. ЕксйейсЫа сой использовали в качестве представителя грам-отрицательных организмов. Одинарную колонию посеяли в трипсиновом соевом бульоне и вырастили до середины экспоненциальной фазы (ОИ₆₀₀ = 0.75). Культуры промыли и разбавили ΝαΡΒ (рН 5.5 или 7.4). 150 мМ №101 (фосфатно-солевой буферный раствор) до конечной концентрации 2 х 10⁴ колониеобразующих ед./мл. Бактерии выдержали в термостате в течение 1 ч при 37°С с соответствующими концентрациями гемоглобина или аили β-цепей в испытуемом фосфатно-солевом буферном растворе. В конце испытания аликвоты разбавили фосфатно-солевым буферным раствором 1:10 и поместили в чашки с агаровой средой, содержащие 0.8% мягкого агара, чтобы определить выживание бактерий после выдержки в термостате при 37°С в течение ночи. Бактерицидную активность определяли, рассчитывая уменьшение колониеобразующих единиц для бактерий, выдержанных в термостате с гемоглобином или его а- или β-цепями, по сравнению с бактериями, выдержанными в термостате только с буферным раствором.

Б. Радиальный диффузионный анализ антибиотической активности против 81арйу1ососсик аигеик ΚΝ6390.

Одинарную колонию 81арйу1ососсик аигеик Κ.Ν6390 ввели в бульон СУРС и вырастили до середины экспоненциальной фазы (ОИ₆₀₀ = 0.7). Культуры промыли в №1РВ при рН 5.5 и растворили до конечной концентрации 5 х 10⁷ колониеобразующих ед./мл. Аликвоту 0.2 мл этой бактериальной суспензии (10⁷ колониеобразующих единиц) добавили к 10 мл обработанного в автоклаве и охлажденного (до 42°С) буферного раствора ИаРВ с 1% по массе/объему агарозы низкого электрофорезного типа (81дша). После подмешивания бактерий агарозу перелили в квадратные чашки Петри Ьай-Тек и получили однородный толстый слой. В слое проделали лунки диаметром 2.7 мм и заполнили 4.5 мкл контрольного раствора или образца, пластинки выдержали в термостате в течение 3 ч при 37°С и покрыли 10 мл стерильного агара, выдержанного при 42°С. Поверхностный агар содержал 2 х СУСР бульон и 1% по массе/объем бактоагара. После выдержки в термостате в течение 18-24 ч при 37°С измерили диаметр прозрачной зоны, окружающей лунки, содержащие антибактериальный агент.

В. Радиальный диффузионный анализ антибиотической активности против Ркеибошоиак аетидшока РА01.

Одинарную колонию Ркеибошоиак аегищпока РА01 ввели в трипсиновый соевый бульон и вырастили до середины экспоненциальной фазы (ОИ₆₀₀ = 0.7). Культуры промыли в ИаРВ при рН 5.5 и растворили до конечной концентрации 5 х 10⁷ колониеобразующих ед./мл. Аликвоту 0.2 мл этой бактериальной суспензии (10⁷колониеобразующих единиц) добавили к 10 мл обработанного в автоклаве и охлажденного (до 42°С) буферного раствора ИаРВ с 1% по массе/объему агарозы низкого электрофорезного типа (8щша). После подмешивания бактерий агарозу перелили в квадратные чашки Петри ЬаЬ-Тек и получили однородный толстый слой. В слое проделали лунки диаметром 2.7 мм и заполнили 4.5 мкл контрольного раствора или образца, пластинки выдержали в термостате в течение 3 ч при 37°С и покрыли 10 мл стерильного агара, выдержанного при 42°С. Поверхностный агар содержал 6% (по массе/объем) трипсинового соевого бульона и 1% по массе/объем бактоагара. После выдержки в термостате в течение 18-24 ч при 37°С измерили диаметр прозрачной зоны, окружающей лунки, содержащие антибактериальный агент.

Г. Радиальный диффузионный анализ антибиотической активности против ЕксйейсЫа сой МС4100.

Одинарную колонию ЕксйейсЫа сой МС41 00 ввели в трипсиновый соевый бульон и вырастили до середины экспоненциальной фазы (ОИ₆₀₀=0.7). Культуры промыли в ИаРВ при рН 5.5 и растворили до конечной концентрации 5 х 10⁷ колониеобразующих ед./мл. Аликвоту 0.2 мл этой бактериальной суспензии (10⁷ колониеобразующих единиц) добавили к 10 мл обработанного в автоклаве и охлажденного (до 42°С) буферного раствора №РВ. содержащего 0.02% бычьего сывороточного альбумина и 0.02% Тп1ои Х100 с 1% по массе/объему агарозы низкого электрофорезного типа (8щша). После подмешивания бактерий агарозу перелили в квадратные чашки Петри ЬаЬ-Тек и получили однородный толстый слой. В слое проделали лунки диаметром 2.7 мм и заполнили 4.5 мкл контрольного раствора или образца, пластинки выдержали в термостате в течение 3 ч при 37°С и покрыли 10 мл стерильного агара, выдержанного при 42°С. Поверхностный агар содержал 6% (по массе/объем) трипсинового соевого бульона и 1% по массе/объем бактоагара. После выдержки в термостате в течение 18-24 ч при 37°С измерили диаметр прозрачной зоны, окружающей лунки, содержащие антибактериальный агент.

Д. Радиальный диффузионный анализ антибиотической активности против 81гер1ососси5 1аеса1щ АТСС 8043.

Одинарную колонию ввели в 10 мл трипсинового соевого бульона, взбалтывая при 37°С в течение ночи. Около 0,3 мл добавили в 10 мл свежего трипсинового соевого бульона и взбалтывали при 37°С. Это обеспечило рост до середины логарифмической фазы (ΟΌ₆₀₀=0,6). Культуру промыли дважды в NаΡΒ с рН 5,5 при вращении со скоростью 5000 об/мин в течение 10 мин. После промывки повторно проконтролировали оптическую плотность (ΟΌ) для того, чтобы определить точную концентрацию бактерий. Промытые бактерии с концентрацией 10⁷ на пластинку добавили к нижнему слою (НаРВ с рН 5,5/1% агарозы с низким электрофорезом). Разбавленные растворы гемоглобина в ΝαΡΒ с рН 5,5 добавили в чашку Петри, обеспечили диффузию в слой и выдержали в камере влаги при 37°С в течение 3 ч. После выдержки 10 мл питательной среды, 6% трипсинового соевого бульона 1% бактоагара добавили в виде верхнего слоя и выдержали чашки Петри в камере влаги при 37°С в течение ночи.

Антигрибковая активность.

А. Испытание в чашках с агаровой средой.

Антигрибковую активность гемоглобина или его α- или β-цепей испытывали против грибка, представленного СаиФба а1Ысаи8 и содержащегося на агаровых пластинках с декстрозой 8аЬоигаиб. Грибок СаиФба а1Ысаи8, который использовали в данном случае для данного испытания, представлял собой клиническую культуру, полученную в Колумбийской пресвитерианской больнице, Нью-Йорк. Одинарную колонию ввели в бульон декстрозы 8аЬоигаиб и культивировали в течение 16-18 ч при 37°С. Аликвоту выращенной за ночь культуры ввели в свежий бульон и вырастили в течение 3 ч до плотности 7 х 10⁶/мл, как определено счетной камерой. Грибковую культуру разбавили до окончательной концентрации 2 х 10⁴ колониеобразующих ед./мл в 10 мМ буферном растворе фосфата натрия при рН 5,5 и полученную суспензию выдержали в термостате в течение 3 ч с гемоглобином или его α- или β-цепями в NаРΒ с рН 5,5. Аликвоты разбавили в отношении 1:10 минимальной питательной средой М63 и распределили по поверхности агаровой среды с декстрозой 8аЬоигаиб для определения сохранения колониеобразующих единиц через 20 ч при 37°С.

Б. Радиальный диффузионный анализ.

Грибок выращивали в течение 3 ч из культуры, оставленной на ночь в бульоне декстрозы 8аЬоигаиб, центрифугировали при 10000 д в течение 10 мин, дважды промыли в NаРΒ при рН 5,5 и снова суспендировали в NаРΒ (рН 5,5) при конечной концентрации 4 х 10⁷/мл. Аликвоту 0,1 мл этой грибковой суспензии (4 х 10⁶ коло ниеобразующих единиц) добавили к 10 мл обработанного в автоклаве и охлажденного (до 42°С) NаРΒ с рН 5,5 и 1% по массе/объему агарозы низкого электрофорезного типа (81дша). После подмешивания грибка агарозу перелили в квадратные чашки Петри ЬаЬ-Тек и получили однородный слой толщиной 1 мм. В слое проделали лунки диаметром 3 мм и заполнили 5 мкл контрольного раствора или образца, чашки выдержали в термостате в течение 3 ч при 37°С и покрыли 10 мл стерильного агара, выдержанного при 42°С. Поверхностный агар содержал 2 х агар 8аЬоигаиб. После выдержки в термостате в течение 18-24 ч при 37°С измерили диаметр прозрачной зоны, окружающей лунки, содержащие антигрибковый агент.

Антимикробная активность пептидов.

Измерение антимикробной активности гемоглобина человека, его α- и β-цепей, не содержащих гема, или фрагментов α- и β-цепей, полученных с помощью ΟΝΒγ. и синтетических пептидов, полученных из них, определяли способом радиальной диффузии и в некоторых случаях - с помощью анализа пластинок. Для данных, представленных на фиг. 1-15, ордината показывает диаметр прозрачной зоны, выраженной в произвольных единицах, где десять единиц = 1,0 мм (23). Абсцисса показывает концентрацию белка в мг/мл. Минимальную ингибирующую концентрацию оценивали с помощью линейной экстраполяции кривой в точке пересечения с осью X.

Каждый анализ выполняли с тремя сериями опытов, если не указано иного. Способ радиальной диффузии является надежным и дает согласующиеся результаты при использовании очищенных или полуочищенных составов согласно изобретению. Методика анализа соответствовала описанию в литературе Бее е! а1 (23).

Пример 1.

Антимикробная активность гемоглобина человека была подтверждена методом радиальной диффузии и представлена в табл. 1, пример 1, а также на фиг. 1-6.

Пример 2.

Антимикробная активность гемоглобина человека была подтверждена с помощью анализа пластинок и выражается следующими данными. 1С₅₀ для СаиФба а1Ысаи8 лежит в пределах от 5 до 6 мг/мл, а для Е. сой - в пределах от 8 до 10 мг/л. 1С₅₀ выражается как концентрация белка, которая требуется для уничтожения 50% испытуемых организмов (т.е. 50%-ное снижение колониеобразующих единиц).

Примеры 3 и 4.

Антимикробная активность не содержащей гема α-цепи гемоглобина приведена в табл. 1, пример 3, антимикробная активность не содержащей гема β-цепи гемоглобина приведена в табл. 1, пример 4.

Пример 5.

Антимикробная активность а- и β-цепей гемоглобина человека была подтверждена с помощью анализа пластинок и выражается сле дующими данными. Значения 1С₅₀ для а-цепи составили от 4 до 5 мг/мл для Сапб1ба а1Ьюапз и от 10 до 15 мг/мл для ЕзсйейсЫа сой.

Таблица 1

Антимикробная активность

Анализ радиальной диффузии

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в мг/мл гемоглобина человека и а- и β-подгрупп, не содержащих гема

	Гемоглобин	а-цепи	β-цепи
	Пример 1	Пример 3	Пример 4
р^н	5,5	7,4	5,5	7,4	5,5	7,4
Микроорганизм
Сапб1ба а1Ысапз	50-70	НО	7	НО	>50	НО
ЕзсйейсЫа сой	1-5	35-100	1-2	-	1,5-5	10-30
З1арйу1ососсиз аигеиз	4-6	-	300	НО	10	НО
Рзеиботопаз аегидтоза	5	50	50	НО	40-60	НО
З1гер1ососсиз !аесайз	200-1000	-	3*	НО	20	НО

Недостаточная эффективность обозначена (-) НО = не определялось * Одна серия опытов

Примеры 6-10.

Антимикробная активность фрагментов, полученных из а- и β-цепей, не содержащих гема, путем расщепления СИБг, описана в табл. 2, примеры 6-10. Примеры 6, 7 и 8 относятся соответственно к фрагментам а-1, а-2 и а-3, полученным путем расщепления СИБг, а при меры 9 и 10 относятся соответственно к фрагментам β-1 и β-2, полученным путем расщепления СИБг. Полученные данные показывают, что наиболее активными являются фрагменты а-3 (ЗЕЦ. ГО. N0: 3) и β-2 (ЗЕф ГО. N0: 2).

Таблица 2 Антимикробная активность

Анализы радиальной диффузии Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в мг/мл а- и β-цепей гемоглобина человека, не содержащих гема и полученных путем расщепления бромцианом (СИВг)

Микроорганизм	а-1 Пример 6	а-2 Пример 7	а-3 Пример 8	β-1 Пример 9	β-2 Пример 10
ЕзсйейсЫа сой	>100	>100	5-8	>100	5
Сапб1ба а1Ысап8	НО	НО	10-50	25	25
З1гер1ососсиз !аесайз	>100	НО	7	>50	8

Примеры 11 и 12.

Синтетические пептиды I и II (8Ер. ГО N0. 5 и 6 соответственно) были получены обычными средствами в химическом синтезаторе белков медицинского института Говард Хьюджес в Колумбийском университете. Антимикробная активность синтетических пептидов I (8Ер. ГО N0: 5) и II (ЗЕр. ГО N0: 6) показана в табл. 3, примеры 11 и 12 соответственно.

Таблица 3 Радиальный диффузионный анализ Результаты испытаний двух синтетических пептидов Минимальная ингибиторная концентрация (МИК) мг/мл

Микроорганизм	Пептид I Пример 11	Пептид II Пример 12
Е. сой	15	1,5
С. а1Ь1сапз	10	40

Приведенные выше примеры описывают опыты, выполненные и рассмотренные автора ми при разработке и реализации настоящего изобретения. Предполагается, что эти примеры включают описания методик, которые демонстрируют практичность и полезность изобретения. Для специалистов в данной области очевидно, что в варианты реализации и методики, описанные в приведенных примерах, могут быть внесены различные изменения без отклонения от области распространения изобретения.

Литература

1) МоЬегд СБ, Сойп ΖΑ (ебз). 1990. БаиисЫид 1йе аийЫойс ега. Регзопа1 ассошИз о! 1йе б1зсоуегу апб изе о! 1йе Пгз( аийЫойсз. Коске!е11ег Ишуегайу Ргезз, кса Уогк.

2) Зай1 Н-С. 1994. Сепе епс1озеб апйЫойсз табе ш Ьас1ейа, ш: Апйт1сгоЫа1 Рерйбез, \УПеу. Сй1сйез1ег, рр 27-53.

3) Сап/ Т. 1994. Вюзуп1Ье818 о! бе!епзтз апб о!йег апйт1сгоЫа1 рерйбез, Ш: Апйт1сгоЫа1 Рерйбез, ХУПеу, СЫсйез1ег, рр 63-37.

4) Ζαδίοίϊ Μ. 1987. Мадашшз, а с1азз о£ ап11Ш1егоЫа1 рерййез йот Хепориз зкт: 1зо1айоп, скагае1ег17айоп ой !со асйуе йогтз апй рагйа1 οΌΝΆ зециепсе ой ргесигзог. Ргос Ыа11 Асай 8с1 84: 5449-5453.

5) Оюуапт МО, РоиЙег Ь, О1Ьзоп ВШ, ШППатз ΌΗ. 1987. Вюзуп!йез1з апй йедгайайоп ой рерййе йепуей йот Хепориз Йаеу1з ргойогтопез. Вюсйет й 243:113-120.

6) Б17оп КА, 1)еу РМ, ЬатЬ Сй. 1983. Рйу!оа1ехтз: еп/уто1о§у апй то1еси1аг Ью1оду. Айу Еп/уто1 Ке1а! Агеаз ой Мо1 Вю1 55: 1-135.

7) 8ΐίιιΙζί А, Нег1/ Т, Ргайай V, е! а1. 1993. Р1ап! ра!йодепез1з-ге1а!ей рго!етз апй !йей го1е т йейепзе адатз! ра!йодепз. Вюсйет1е 75: 687-706.

8) НиИтагк Ό, 8!етег Н, Казти1зоп Т, Вотап НС. 1980. тзес! 1ттипйу: рипйсайоп апй ргорегйез ой !йгее тйис1Ь1е Ьас!епос1йа1 рго!етз йот йето1утрй ой ^ттип^ζей рирае ой Ну1огрйога сесгор1а. Еиг Й Вюсйет 106: 7-16.

9) Ни1!тагк Ό. 1993. 1ттипе геасйопз т Бгозрййа апй о!йег тзес!з; а тойе1 йог тпа!е 1ттипйу. Тгепйз Оепе! 9: 178-183.

10) 8!етег Н, Ни1!тагк Ό, Епдзйот А, Вептсй Н, Вотап НО. 1981. 8ециепсе апй зресЕ йсйу ой !со ап!1Ьас!епа1 рго!етз туокей т тзес! 1ттипйу. №!иге 292: 245-248.

11) №!оп 8. 1990. 1)иа1 ййпсйопз ой тзес! 1ттипйу рго!етз т йейепзе апй йеуе1ортеп!. Кез 1ттипо1. 141: 938-939.

12) Мооге К8, ШойгИ 8, Кодег Н, е! а1. 1993. 8циа1атте; ап аттоз!епой апйЬюйс йот !йе зйагк. Ргос №11 Асай 8с1 90: 1354-1358.

13) Кгей О. 1994. Апйт1сгоЫа1 рерййез йот атрй1Ь1ап зкт; ап оуетехт, т, Апйт1сгоЫа1 Рерййез, С1Ьа Еоипйайопз 8утрозшт 186, рр 77-90. йойп Ш11еу & 8опз, Сй1сйез!ег, Ν.Υ.

14) йасоЬ й, Ζаз1οйй М. 1994. Ро!епйа1 !йегареийс аррйсайопз ой тадаттз апй о!йег апйтЕ сгоЫа1 адеп!з ой атта1 опдт, т Ап!1т1сгоЫа1 Рерййез, йойп Ш11еу & 8опз, Сй1сйез!ег, ΝΥ.

15) Мсо1аз Р, Мог А. 1995. Рерййез аз сеаропз адатз! тюгоогдатзтз т !йе сйет1са1 йейепзе зуз!ет ой уег!еЬга!ез. Апп Кеу М1сгоЬю1 49: 277-304.

16) РегШз МЕ. 1990. Месйатзтз геди1а!тд !йе геасйопз ой йитап йетод1оЬ1п χνίΐΐι охудеп апй сагЬоп топох1йе. Аппи Кеу Рйузю1 52:1-25, 1990.

17) Регий МЕ. 1979. Кеди1а!юп ой охудеп аййпйу ой йетод1оЬ1п: тйиепсе ой з!гис!иге ой !йе д1оЬ1п оп !йе йете. Аппи Кеу Вюсйет 48:327386.

18) Кй!ег, 8.К. 1998. Раззтд а Воой Тез!. 8с1епсе/Тесйпо1оду, С&ЕN Мау 18, 1998:37-44.

19) Ш1пз1ос, К.М. 1995. В1оой 8иЬз!йи!ез: 1995 т !йе ййегаШге йот В1оой 8иЬз!йи!ез: Рйузю1од1са1 Ваз1з ой Еййсасу, Сйра!ег 1. Ейз. Штз1ос, К-М. е! а1., Вйкйаизег, Воз!оп.

20) Сйпз!епзеп 8М, Мейта Р, Штз1ос КШ, 8пе11 8М, Ζедпа А, Мапт МА. 1988. Ргерагайоп ой йитап йетод1оЬ1п Ао йог розз1Ь1е изе аз а

Ь1оой зиЬз!йи!е. й Вюсйет Вюрйуз Ме!йой. 17:143-154.

21) Маза1а В, Мапса й. 1994. Бе!ес!юп ой д1оЬ1п сйатз Ьу геуегзей-рйазе Шдй-регйогтапсе Нцийй сйгота!одгарйу. Ме!йойз т Е^уто1оду 231:21-44.

22) 8сйаддег Н, уоп йадос О. 1987. Тпстезойшт йойесу1 зи1рйа!е-ро1уасгу1ат1йе де1 е1ес!горйогез1з йог !йе зерагайоп ой рго!етз т !йе гапде йот 1 !о 100 кБа. Апа1 Вюсйет 166:368376.

23) йее 1Н, Сйо Υ, йейгег К1. 1997. Еййес!з ой рН апй зайпйу оп !йе апйт1сгоЫа1 ргорегйез ой С1ауаптз. 1пйес!юпз & 1ттипйу 65:2898-2903.

Распечатка последовательностей <110> Терагем, Инк.

Хоффман, Брайен Ф.

Дабник, Бернард <120> ПЕПТИДЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

МИКРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ <130>

<140>

<141 >

<150> РСТ/11898/16746 <151> 1998-08-10 <150> 60/061,454 <151 >1997-10-08 <160> 10 <170> Раз18Е0 Тог \Мпйо\л/5 Уегзюп 3.0 <210> 1 <211> 146 <212> РЯТ <213> Ното δθρϊβηδ <400> 1 \/а1 ΗΪ8 Ьеи ТЬг Рго С1и С1и Ьуз 8ег А1а \/а1 ТЬг А1а Ьеи Тгр С1у

1015

1_уз \/а1 Азп \/а1 Азр С1и \/а1 С!у <31у С1и А1а Ьеи С1у Агд Ьеи Ьеи

2530 \/а1 \/а1 Туг Рго Тгр ТЬг 6Ιη Агд РЬе РЬе С1и Зег РЬе О1у Азр Ьеи

4045 бег ТЫ Рго Азр А1а \/а1 Ме1 61у Азп Рго Ьуз \/а11_уз А1а Ηΐβ С1у

5560

1_уз 1_уз \/а1 Ьеи С1у А1а РЬе 8ег Азр С1у Ьеи А1а ΗΪ8 Ьеи Азр Азп

70 7580

Ьеи Ьуз С1у ТЫ РЬе А1а ТЫ Ьеи Зег С31и Ьеи ΗΪ8 Суз Азр Ьуз Ьеи

9095

ΗΪ8 \/а1 Азр Рго С1и Азп РЬе Агд Ьеи Ьеи О1у Азп \/а1 Ьеи \/а1 Суз

100 105110 \/а1 Ьеи А1а Ηΐβ Ηΐβ РЬе О1у Ьуз <31и РЬе ТЫ Рго Рго \/а1 ΘΙη А1а

115 120125

А1а Туг С1п Ьуз ХЛа! Х/а! А1а С1у Х/а! А1а Азп А1а Ьеи А!а Ηΐβ Ьуз

130 135140

Туг ΗΪ8

145 <210>2 <211 >91 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 2 (31у Азп Рго Ьуз \/а1 Ьуз А1а Ηίβ 61у Ьуз Ьуз \/а1 Ьеи С1у А1а РЬе

1015

Зег Азр <31у Ьеи А1а Ηΐβ Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз О1у ТЬг РЬе А1а ТЫ

2530

Ьеи Зег С1и Ьеи Ηΐβ Суз Азр Ьуз Ьеи Ηΐβ \/а1 Азр Рго 61и Азп РЬе

4045

Агд Ьеи Ьеи 61у Азп Уа1 Ьеи \/а1 Суз \/а1 Ьеи А1а Ηΐβ Ηΐβ РЬе С1у

5560

Ьуз 61и РЬе ТЬг Рго Рго \/а1 ΘΙη А1а А1а Туг ΘΙη Ьуз \/а1 νθΙ А1а

70 7580

61у \/а1 А1а Азп А1а Ьеи А1а Ηΐβ Ьуз Туг Ηΐβ

8590 <210>3 <211 >65 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 3

Рго Азп А1а Ьеи Зег А1а Ьеи Зег Азр Ьеи Ηΐβ А1а ΗΪ3 Ьуз Ьеи Агд 15 1015 \/а1 Азр Рго \/а1 Азп РЬе Ьуз Ьеи Ьеи Зег ΗΪ3 Суз Ьеи Ьеи Х/а1 ТЬг

2530

Ьеи А1а А1а Ηΐβ Ьеи Рго А1а С1и РЬе ТЬг Рго А1а \/а1 ΗΪ3 А1а Зег

4045

Ьеи Азр Ьуз РЬе Ьеи А1а Зег \/а1 Зег ТЬг \/а1 Ьеи ТЬг Зег Ьуз Туг 50 5560

Агд <210>4 <211 >86 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 4

Ьуз А1а Ηΐβ О1у Ьуз Ьуз \/а1 Ьеи С1у А1а РЬе Зег Азр С1у Ьеи А1а 15 1015

ΗΪ3 Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз С1у ТЬг РЬе А1а ТЬг Ьеи Зег С1и Ьеи Ηΐβ

2530

Суз Азр Ьуз Ьеи Ηΐβ \/а1 Азр Рго С1и Азп РЬе Агд Ьеи Ьеи <3!у Азп 35 4045 \/а1 Ьеи \/а1 Суз Х/а1 Ьеи А1а Ηΐβ Ηΐβ РЬе О1у Ьуз О1и РЬе ТЬг Рго 50 5560

Рго Уа1 ΘΙη А1а А1а Туг ΘΙη Ьуз Уа! Уа1 А1а С1у Уа1 А1а Азп А1а

70 7580

Ьеи А1а Ηΐβ Ьуз Туг Ηΐβ <210>5 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 5

С1у Азп Рго Ьуз \/а1 Ьуз А1а Ηΐβ О1у Ьуз Ьуз \/а1 Ьеи С1у А1а РЬе 15 10 15

Зег <210>6 <211 >31 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 6

Ηΐβ ΗΪ3 РЬе С!у Ьуз С1и РЬе ТЬг Рго Рго \/а1 ΘΙη А1а А1а Туг С1п 15 10 15

Ьуз Х/а1 \Ла! А1а С1у Х/а! А1а Азп А1а Ьеи А!а Ηΐβ Ьуз Туг Ηΐβ

25 30 <210> 7 <211 >32 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 7

Х/а! Ьеи Зег Рго А1а Азр Ьуз ТЬг Азп \/а1 Ьуз А1а А1а Тгр О1у Ьуз 15 10 15

Уа1 С1у А1а Ηΐβ А1а С1у 61и Туг С1у А1а С1и А1а Ьеи 61и Агд Μβΐ

25 30 <210> 8 <211 >45 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 8

РЬе Ьеи Зег РЬе Рго ТЬг ТЬг ТЬг Ьуз ТЬг Туг РЬе Рго Ηΐβ РЬе Азр

10 15

Ьеи 8ег Ηϊβ С1у Зег А1а С1п \/а1Ьуз С1у ΗΪ3 О1у Ьуз Ьуз \/а1 А1а

25 30

Азр А1а Ьеи ТЬг Азл А1а \/а1 А1а Ηίβ \/а1 Азр Азр Ме!

40 45 <210> 9 <211 >55 <212> РИТ <213> Ното зар1епз <400> 9

Х/а! ΗΪ3 Ьеи ТНг Рго О1и С1и 1_уз Зег А1а Уа1 ТНг А1а Ьеи Тгр С1у

1015

Ьуз \/а1 Азл \/а1 Азр 61и \/а1 С1у О1у А1а С1и Ьеи О1у Агд Ьеи Ьеи

2530

Х/а1 Уа1 Туг Рго Тгр ТКг ΘΙη Агд РЛе РЛе 61и 8ег РЛе 61у Азр Ьеи

4045

Зег ТЛг Рго Азр А1а \/а1 Ме!

5055 <210> 10 <211> 141 <212> РИТ <213> Ното зар1епз <400> 10 \/а1 Ьеи 8ег Рго А1а Азр Ьуз ТЛг Азл Х/а1 Ьуз А1а А1а Тгр О1у Ьуз 15 1015

Х/а1 С1у А1а ΗΪ3 А!а 61у 61и Туг 61у А1а С1и А1а Ьеи 61и Агд Ме!

2530

РЛе Ьеи Зег РЛе Рго ТЛг ТЛг Ьуз ТЛг Туг РЛе Рго Ηΐβ РЛе Азр Ьеи

4045

Зег ΗΪ3 С1у Зег А1а С1п \/а1 Ьуз О1у Ηΐβ О1у Ьуз Ьуз \Ла! А1а Азр

5560

А1а Ьеи ТНг Азл А1а \/а1 А1а ΗΪ8 Х/а1 Азр Азр Ме! Рго Азл А1а Ьеи

70 7580

Зег А1а Ьеи Зег Азр Ьеи ΗΪ8 А1а ΗΪ3 Ьуз Ьеи Агд \/а1 Азр Рго \/а1

9095

Азл РЛе Ьуз Ьеи Ьеи Зег ΗΪ8 Суз Ьеи Ьеи Х/а! ТЛг Ьеи А1а А1а ΗΪ3

100 105110

Ьеи Рго А1а С1и РЛе ТЛг Рго А1а Х/а! ΗΪ8 А1а Зег Ьеи Азр Ьуз РЛе

115 120125

Ьеи А1а Зег \/а1 Зег ТЛг \/а1 Ьеи ТЛг Зег Ьуз Туг Агд

130 135140

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ уничтожения бактерий или грибков, включающий контактирование бактерий или грибков с эффективной антимикробной дозой белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, включающей α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 3, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 2, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 5, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 6, фрагменты указан ных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный белок гемоглобина, фрагмент белка гемоглобина или полипептидные фрагменты получают из организма человека.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-отрицательными бактериями.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что грам-отрицательные бактерии выбирают из группы, включающей ЕзсйепсЫа сой и Рзеибошоиаз аегидтоза.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-положительными бактериями.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что грам-положительные бактерии выбирают из группы, включающей 81арйу1ососсиз аигеиз и 81гер1ососсиз Гаесайз.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что грибки представляют собой СаиФба а1Ысаиз.
8. Способ лечения субъекта, имеющего бактериальную или грибковую инфекцию, который включает введение эффективной антимикробной дозы белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, включающей α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 3, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 2, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 5, последовательность аминокислот 8Ер ΙΌ N0: 6, фрагменты указанных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный белок гемоглобина, фрагмент белка гемоглобина или полипептидные фрагменты получают из организма человека.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-отрицательными бактериями.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что грам-отрицательные бактерии выбирают из группы, включающей ЕзсйепсЫа сой и Рзеибошоиаз аегидтоза.
12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-положительными бактериями.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что грам-положительные бактерии выбирают из группы, включающей 81арйу1ососсиз аигеиз и 81гер1ососсиз Гаесайз.
14. Способ по п.8, отличающийся тем, что грибки представляют собой СаиФба а1Ысаиз.
15. Способ обработки материала, подверженного бактериальному или грибковому заражению, включающий нанесение на указанный материал или смешивание с указанным материалом эффективной антимикробной дозы белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, включающей α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 3, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 6, фрагменты указанных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный белок гемоглобина, фрагмент белка гемоглобина или полипептидные фрагменты получают из организма человека.
17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-отрицательными бактериями.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что грам-отрицательные бактерии выбирают из группы, включающей ЕзсйепсЫа сой и Рзеиботопаз аегидтоза.
19. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанные бактерии являются грам-положительными бактериями.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что грам-положительные бактерии выбирают из группы, включающей 81арйу1ососсиз аигеиз и 81гер1ососсиз Гаесайз.
21. Способ по п.15, отличающийся тем, что грибки представляют собой Сапб1ба а1Ысапз.
22. Фармацевтическая дозированная форма, содержащая эффективную антимикробную дозу белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, вклю- чающей α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 3, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 6, фрагменты указанных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания.
23. Фармацевтическая дозированная форма по п.22, отличающаяся тем, что указанный белок гемоглобина, фрагмент белка гемоглобина или полипептидные фрагменты получают из организма человека.
24. Полипептид, выбранный из группы, включающей последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 3, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 6, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 8, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 9 и фрагменты указанных последовательностей.
25. Применение белка гемоглобина млекопитающих, фрагмента белка гемоглобина или их полипептидных фрагментов, выбранных из группы, включающей α-цепь гемоглобина, не содержащую гема, β-цепь гемоглобина, не содержащую гема, фрагмент гемоглобина α-3, фрагмент гемоглобина β-2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 3, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 2, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 5, последовательность аминокислот 8ЕР ГО N0: 6, фрагменты указанных белков или их полипептидные фрагменты и их сочетания, для антимикробного лечения от бактерий или грибков.