ES2236931T3 - Peptidos derivados de mamiferos para el tratamiento de infecciones microbianas. - Google Patents
Peptidos derivados de mamiferos para el tratamiento de infecciones microbianas.Info
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Abstract
Método para la prevención de contaminación por hongos o por bacterias Gram positivas de alimentos, comprendiendo la aplicación o mezcla con dichos alimentos de una cantidad antimicrobiana efectiva de un fragmento de proteína de hemoglobina o fragmentos de polipéptido de la misma, seleccionados entre el grupo que consiste en cadena alfa de hemoglobina libre de heme, cadena beta de hemoglobina libre de heme, fragmento alfa-3 de he -moglobina libre de heme, fragmento beta-2 de hemoglobina libre de heme, secuencia de aminoácido de número de identificación secuencia: 3, secuencia de aminoácido de número de identificación secuencia: 2, secuencia de aminoácido de número de identificación secuencia: 5, secuencia de aminoácido de número de identificación secuencia: 6, fragmentos de dicho fragmento de proteína o fragmentos de polipéptido del mismo y combinaciones de los mismos.
Description
Péptidos derivados de mamíferos para el
tratamiento de infecciones microbianas.
La presente solicitud reivindica los beneficios
de la solicitud provisional U.S. Nº. de serie 60/061.454 presentada
en 8 de octubre de 1997.
La presente invención se refiere a un método para
la exterminación de bacterias Gram positivas y hongos, así como a
un método para el tratamiento de materiales sometidos a
contaminación microbiana por administración de una cantidad
antimicrobiana efectiva de las cadenas \alpha o \beta de
hemoglobina, libre de heme, o fragmentos de polipéptido de las
cadenas \alpha y \beta resultantes del fraccionamiento por
bromuro de cianógeno o fragmentos sintéticos del mismo.
Los péptidos antibacterianos procedentes de
fuentes de procedencia naturales tienen una larga historia. En 1939
Dubos demostró que un bacilo del suelo identificado posteriormente
como B. brevis, producía substancias que podían impedir las
infracciones de neumococos en ratones. Posteriormente, Hotchkiss y
Dubos purificaron dos substratos compuestos de aminoácidos y uno de
éstos, la gramicidina, resultó disponible como agente terapéutico.
Otros estudios posteriores de péptidos antimicrobianos han
identificado muchos agentes activos (1). (Dentro de la presente
solicitud se hace referencia a varias publicaciones en números
árabes dentro de paréntesis. Las referencia completas, listadas en
secuencia, se pueden encontrar al final de la descripción.
Muchas bacterias producen péptidos
antimicrobianos (bacteriocinas) y proteínas; las liberadas de
bacterias Gram negativas son las más potentes y tienen el espectro
de actividad más amplio (2). Las defensinas son pequeños péptidos
antimicrobianos que se encuentran en neutrófilos, macrófagos no
humanos y células Paneth (3). La piel de los anfibios es una rica
fuente de péptidos antimicrobianos, uno de éstos, la magainina,
aislada de Xenopus laevis, está sometida actualmente a
pruebas clínicas (4, 5). Las plantas forman una variedad de
péptidos antimicrobianos codificados por genes incluyendo las
fitoalexinas, las proteínas PR y las AMP (6, 7). Se ha demostrado
que los insectos sintetizan péptidos y proteínas bactericidas tales
como la cecropina obtenida de la polilla Cecropia (8, 9, 10)
y las sarcotoxinas obtenidas a partir de las larvas de la mosca de
la carne Sarcocphaga perigrina (11). Los hemocitos del
cangrejo de herradura Limulus son la fuente de las
taquiplesinas y escualamina, un aminoesteroide con actividad
antimicrobiana, que ha sido aislada del tiburón, Squalus
acanthias (12).
Por lo tanto, muchas substancias antimicrobianas
se encuentran dentro de las familias de antibióticos
"naturales" tales como las cecropinas, magaininas, defensinas,
serprocidinas y otras. Estas substancias están ampliamente
distribuidas en la naturaleza y proporcionan un mecanismo de defensa
innato contra las infecciones en especies comprendidas entre los
insectos y los anfibios hasta los mamíferos. En general estas
substancias están almacenadas en células, que serán inducidas y
segregadas dentro del animal cuando se presenta la agresión. Muchas
actúan interrumpiendo selectivamente la membrana celular
bacteriana; muchas serían tóxicas asimismo a las células principales
o huésped, si no fueran secuestradas (13). Un número de estos
compuestos han sido propuestos como útiles como agentes
antimicrobianos (14, 15).
La hemoglobina (Peso molecular=64.500) consiste
en cuatro cadenas de polipéptidos y cuatro grupos heme protésicos
en los que los átomos de hierro se encuentran en estado ferroso. El
heme es un complejo metálico que consiste en un átomo de hierro en
el centro de una estructura de porfirina. La proteína, llamada
globina, consiste en dos cadenas \alpha y dos cadenas \beta. En
los humanos hay dos cadenas \alpha, cada una de las cuales
contiene 141 residuos de aminoácidos y dos cadenas \beta, cada
una de las cuales contiene 146 residuos. La secuencia de aminoácido
de las cadenas \alpha y \beta de la hemoglobina humana es la
siguiente:
La estructura del heme (ferroprotoporfirina IX)
es bien conocido.
Un grupo heme está unido a cada una de las
cadenas de polipéptido a través de un enlace de coordinación entre
el átomo de hierro y el grupo R de un residuo de histidina. El
sexto enlace de coordinación del átomo de hierro se encuentra a
disposición para la unión de oxígeno. Además, la hemoglobina
transportar también H^{-}, CO_{2} y NO. La estructura de heme
es idéntica en todos los animales que tienen hemoglobina pero la
secuencia de las cadenas de globina varía considerablemente. A
pesar de esta variación, la configuración del tetrámero es muy
similar entre especies.
Las interacciones de la hemoglobina con oxígeno y
dióxido de carbono dependen del estado del heme y de los residuos
que lo rodean, así como de la regulación de ligandos heterotróficos
incluyendo H^{+}, Cl^{-}, CO_{2}, HCO_{3} y
2,3,difosfoglicerato. Estos ligandos regulan el equilibrio entre el
estado de alta afinidad (estructura relajada o R mayúscula), y
estado de baja afinidad en tensión (o estructura T). La
estereoquímica de la hemoglobina ha sido resumida extensamente (16,
17).
Se han desarrollado compuestos basados en
hemoglobina para administración como sustitutos de la sangre (18,
19). Estos incluyen hemoglobina modificada químicamente que
contiene el grupo heme portador de oxígeno requerido para el
transporte apropiado de oxígeno. Si bien dichos compuestos basados
en hemoglobina, modificados, han sido administrados como sustitutos
de la sangre, la administración de hemoglobina no modificada, sus
subunidades libres de heme o fragmentos de péptidos sintéticos de
la misma no se han dado a conocer anteriormente para esta finalidad
o para otros usos terapéuticos. Ciertamente, la subunidades
\alpha y \beta libres de heme no serían utilizadas con el
objetivo de conseguir substitutos de la sangre puesto que son
incapaces de unión con el oxígeno.
Hobson y otros, Journal of Experiment. med.
(1958) 107(2), páginas 167-183 y Wood y
otros, Laborat. Invest. (1958), 7(1), páginas
1-8, dan a conocer el efecto antibacteriano de la
hemoglobina contra bacterias gram negativas. El documento
DE-A-2523052 da a conocer que hongos
patogénicos pueden ser controlados utilizando hemoglo-
bina.
bina.
La presente invención da a conocer un método para
el exterminio de bacterias Gram positivas o de hongos que comprende
el contacto de las bacterias Gram positivas o los hongos con una
cantidad antimicrobiana efectiva de un fragmento de proteína de
hemoglobina o fragmentos de polipéptido de la misma seleccionados
entre el grupo que consiste en cadena \alpha de hemoglobina libre
de heme, cadena \beta de hemoglobina libre de heme, un fragmento
\alpha-3 de hemoglobina, un fragmento
\beta-2 de hemoglobina, una secuencia de
aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3, una secuencia
de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2, una
secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5,
una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA:
6, fragmentos de dichas proteínas o fragmentos de polipéptidos de
las mismas y combinaciones de los indicados.
La invención da a conocer asimismo un método para
esterilizar o mantener hongos o productos libres de bacterias Gram
positivas, comprendiendo la aplicación o mezcla con dichos
productos de una cantidad antimicrobiana efectiva de un fragmento
de proteína de hemoglobina o fragmentos de polipéptidos de la misma
seleccionados del grupo que consiste en cadena \alpha de
hemoglobina libre de heme, cadena \beta de hemoglobina libre de
heme, fragmento \alpha-3 de hemoglobina libre de
heme, fragmento \beta-2 de hemoglobina libre de
heme, una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA: 3, una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN
DE SECUENCIA: 2, una secuencia de aminoácido de Nº DE
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5, una secuencia de aminoácido de Nº
DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6, fragmentos de dicho fragmento de
proteína o fragmentos de polipéptidos de la misma y combinaciones de
los mismos.
La invención da a conocer además la utilización
de un fragmento de proteína de hemoglobina o fragmentos de
polipéptidos de la misma seleccionados entre el grupo que consiste
en cadena \alpha de hemoglobina libre de heme, fragmento
\alpha-3 de hemoglobina libre de heme, un
fragmento \beta-2 de hemoglobina libre de heme,
una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA:
3, una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA:
2, una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA: 5, una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN
DE SECUENCIA: 6, fragmentos de dicho fragmento de proteína o
fragmentos del polipéptido de la misma y combinaciones de los
mismos, para la fabricación de un producto farmacéutico para el
tratamiento de infecciones bacterianas Gram positivas o
fúngicas.
La presente invención da a conocer asimismo un
método para la prevención de contaminación bacteriana Gram negativa
de alimentos, comprendiendo la aplicación o mezcla a dicho alimento
de una cantidad antimicrobiana efectiva de fragmentos de
polipéptido de la misma seleccionados del grupo que consiste en una
secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5,
una secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6
o combinaciones de los mismos. Además, la invención da a conocer un
método para esterilizar o mantener productos libres de bacterias
Gram negativas, comprendiendo la aplicación o mezcla con dichos
productos de una cantidad antimicrobiana efectiva de una secuencia
de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5 o una
secuencia de aminoácido de Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6 o
combinaciones de los mismos.
Figura 1: Actividad de hemoglobina contra
Staphylococcus aureus a pH 5,5.
Figura 2: Actividad de hemoglobina contra
Streptococcus faecalis a tres valores de pH
Figura 3: Actividad de hemoglobina contra
Pseudomonas aeruginosa a tres valores de pH
Figura 4: Actividad de hemoglobina contra
Candida albicans a pH 5,5.
Figura 5: Actividad de hemoglobina contra
Escherichia coli a pH 5,5.
Figura 6: Actividad de hemoblobina contra
Escherichia coli a pH 7,4.
Figura 7: Actividad de la cadena alfa contra
Candida albicans a pH 5,5.
Figura 8: Actividad de la cadena alfa contra
Escherichia coli a pH 5,5 y pH 7,4.
Figura 9: Actividad de la cadena alfa contra
Escherichia coli a pH 5,5 y pH 7,4.
Figura 10: Actividad de la cadena alfa contra
Pseudomonas aeruginosa a pH 5,5.
Figura 11: Actividad de la cadena beta contra
Pseudomonas aeruginosa a pH 5,5.
Figura 12: Actividad de la cadena beta contra
Pseudomonas aeruginosa a pH 5,5.
Figura 13: Actividad de la cadena beta contra
Staphylococcus aureus y Streptococcus faecalis a pH
5,5.
Figura 14: Actividad de la cadena beta contra
Candida albicans a pH 5,5.
Figura 15: Actividad de la cadena beta contra
Escherichia coli a pH 5,5 y pH 7,4.
Figura 16: Gráfico de análisis HPLC de fase
C4-inversa de cadenas de hemoglobina humana que
muestran un pico anticipado que representa heme y a continuación
picos más amplios que representan, respectivamente, las cadenas beta
y alfa.
Figura 17: Análisis
tris-tricina-SDS-PAGE
de hemoglobina humana mostrando teñido azul "coomassie" de las
cadenas alfa y beta en 14,5 kDa.
Figura 18A: Separación HPLC de fragmentos
fraccionados por CNBr de la cadena \alpha de hemoglobina
humana.
Figura 18B: Separación HPLC de fragmentos
fraccionados por CNBr de la cadena \beta de hemoglobina
humana.
Figura 19A: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de un fragmento \alpha1 fraccionado por
CNBr de la cadena \alpha de hemoglobina humana.
Figura 19B: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de un fragmento \alpha2 fraccionado por
CNBr de la cadena \alpha de hemoglobina humana.
Figura 19C: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de fragmentos \alpha1 y \alpha2
fraccionados por CNBr de la cadena \alpha de hemoglobina
humana.
Figura 19D: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de un fragmento \alpha3 fraccionado por
CNBr de la cadena \alpha de hemoglobina humana.
Figura 19E: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de un fragmento \beta1 fraccionado por
CNBr de la cadena \beta de hemoglobina humana.
Figura 19F: Análisis espectroscópico de masas
MALDI-TOF de un fragmento \beta2 fraccionado por
CNBr de la cadena \beta de hemoglobina humana.
La materia de la invención es la actividad
antimicrobiana de hemoglobina de mamíferos, cadenas \alpha y
\beta libres de heme, fragmentos seleccionados de la misma,
péptidos sintéticos de la misma y compuestos que comprenden dichos
péptidos y fragmentos. Las aplicaciones terapéuticas de estas
sustancias incluyen la utilización como agente sistémico contra
bacterias Gram positivas y contra hongos, y agentes que muestran
sinergia con antibióticos estándar.
Además, estas sustancias incluyen también
fragmentos de polipéptidos de las cadenas \alpha y \beta de
hemoglobina que resultan del fraccionamiento de la cadena \alpha
o \beta con bromuro de cianógeno (CNBr) u otras péptidasas y
péptidos sintéticos de las mismas. Las bacterias contra las cuales
las sustancias tienen actividad bactericida incluyen las bacterias
Gram positivas. Son ejemplos de dichas bacterias Gram positivas los
Staphylococcus aureus y Streptococcus faecalis.
Además, los compuestos actúan como agentes antimicrobianos contra
hongos incluyendo levaduras. En una realización de la invención, la
levadura es Candida albicans.
La hemoglobina humana ejerce actividad
antimicrobiana contra los hongos tales como Candida
albicans, bacterias Gram-negativas, tales como
Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa y bacterias
Gram-positvas tales como Staphylococcus
aureus y Streptococcus faecalis (figuras 1 a 6). La
actividad antimicrobiana está influida por el pH, siendo mayor a pH
5,5 que a pH 7,4.
Se muestra actividad antimicrobiana similar para
las cadenas \alpha y \beta de la hemoglobina libres de heme.
(Figuras 7 a 10 para la cadena \alpha libre de heme; y figuras 11
a 15 para la cadena \beta libre de heme). Igual que con la
hemoglobina intacta, la actividad antimicrobiana para las cadenas
\alpha y \beta de hemoglobina libres de heme está influida por
el pH, siendo superior a pH 5,5 que a pH 7,4.
Además, se demuestra la actividad antimicrobiana
por fragmentos de las cadenas \alpha y \beta que resultan
cuando la hemoglobina o las cadenas \alpha y \beta individuales
son fraccionadas por CNBr.
El tratamiento por CNBr tiene como resultado tres
fragmentos para la cadena \alpha y dos fragmentos para la cadena
\beta.
El fragmento \alpha3 por fraccionamiento por
CNBr se identifica del modo siguiente:
El descubrimiento de actividades antimicrobianas
de la hemoglobina humana y sus dos subunidades ha fomentado el
examen de las exigencias mínimas para actividad biológica a efectos
de diseñar compuestos modelo con actividad similar. Tal como se ha
explicado anteriormente, el fraccionamiento con CNBr da lugar a 5
fragmentos: 3 de la cadena \alpha y 2 de la cadena \beta. El
fragmento \beta2 era altamente activo contra E. coli y
C. albicans. La estructura terciaria de \beta2 indica que
ambos extremos de este fragmento son hélices. Dos péptidos
derivados de los extremos de \beta2 fueron sintetizados y
comprobados en cuanto a actividad antibiótica.
Péptido I: GNPKVKAHGKKVLGAFS
\hskip0.5cm(Nº IDENT. SEC.: 5)
Péptido II: HHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
\hskip0.5cm(Nº IDENT. SEC.: 6)
Cada uno de los péptidos sintéticos muestra
actividades antimicrobianas. (Ver Tabla 3, ejemplos 9 y 10).
Si bien cualquier mecanismo propuesto para tener
en cuenta la acción de estos péptidos no se debe considerar
limitador, puede ocurrir que la actividad antimicrobiana sea
aportada por la estructura de hélice de los péptidos que pueden
formar poros dentro de la membrana de los microorganismos. A causa
de similitudes en la estructura y configuración de las hemoglobinas
de una serie de mamíferos, es probable que la hemoglobina, sus
cadenas \alpha y \beta y fragmentos de la misma obtenidos por
fuentes distintas de los humanos ejerzan actividad antimicrobiana
significativa. Por lo tanto, la presente invención abarca también
los tetrámeros de la hemoglobina y sus monómeros constituyentes
libres de heme procedentes de otros mamíferos.
El compuesto de la invención puede ser utilizado
terapéuticamente, como preservante o como desinfectante por
exposición de las bacterias o de los hongos a una cantidad
antimicrobiana efectiva de uno de los compuesto descritos en esta
solicitud de acuerdo con cualquiera de las tecnologías que se
describen. Cuando se lleva a cabo el método, los compuestos se
disuelven de manera típica en un tampón apropiado. Se conoce en la
técnica ejemplos de tampones apropiados y se incluyen el tampón
fosfato (para hongos) o solución salina con tampón fosfato para
valores apropiados de pH.
Este compuesto farmacéutico comprende una
cantidad antimicrobiana efectiva de uno de los compuestos de la
invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se conocen en
esta técnica vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables para
utilización tópica, oral o sistémica y se dan a conocer en la
farmacopea de los Estados Unidos, The National Formulary and
Pharmaceutical Science (8ª Edición, Capítulos 83, 84 y 89).
Dependiendo de la aplicación específica que se
prevé, el compuesto farmacéutico que se da a conocer en la presente
invención puede ser formulado como solución, suspensión,
preparación parenteral, ungüento, crema, loción, pulverización,
material en polvo, tableta o cápsula que es dosificada, aplicada o
mezclada de la forma apropiada. Las preparaciones parenterales
pueden incluir un vehículo tal como agua destilada especialmente
libre de pirógenos, tampón fosfato o solución salina normal.
Ungüentos, cremas, lociones y pulverizaciones pueden incluir un
vehículo tal como un aceite vegetal o mineral, petrolatum blanco o
un alcohol de alto peso molecular, es decir, que tiene más de 12
átomos de carbono. Las tabletas o cápsulas pueden incluir
diluyentes, por ejemplo, lactosa, aglomerantes, lubrificantes, por
ejemplo, ácido esteárico y coadyuvantes de desintegración, por
ejemplo, almidón de maíz.
Cada uno de los compuestos puede ser combinado
con otros antibióticos o agentes antimicrobianos, agentes
antiprotozoos, agentes para la curación de heridas y similares para
aumentar su actividad o su espectro terapéutico.
Los compuesto pueden ser administrados al
paciente, por ejemplo, por inyección intravenosa, inyección
intraperitoneal, oralmente, o en forma de un compuesto para
pulverización por aerosol. También se pueden utilizar para
administrar los compuestos vesículas de lípidos o preparados para
emulsión de lípidos que contienen los péptidos de la invención. Las
formas específicas de administración dependerán del patógeno al
cual se dirigen. La selección de la ruta específica de
administración y el régimen de dosis se deberá ajustar o determinar
por el clínico de acuerdo con los métodos conocidos por el mismo a
efectos de obtener la respuesta clínica óptima. La cantidad a
administrar es la cantidad en la que un antimicrobiano es eficaz.
La dosis administrada dependerá también de las características del
paciente objeto de tratamiento, por ejemplo, el mamífero específico
sometido a tratamiento, edad, peso, salud, tipos de tratamiento
simultáneo si existen, frecuencia de los tratamientos y proporción
terapéutica. En el caso del tratamiento de humanos, la cantidad
antimicrobianamente efectiva se encontrará de manera típica en una
gama de aproximadamente 0,5 a 50 mg/kg de peso corporal, y en una
gama aproximada de 0,5-5,0 mg/ml por dosis.
También se prevé un método para utilizar dichos
péptidos para impedir contaminación microbiana de alimentos, es
decir, como conservante o para eliminar patógenos potenciales. Por
ejemplo, los moluscos, productos de carne y de aves averían de
manera rutinaria el crecimiento de patógenos entéricos. Estos
patógenos pueden ser eliminados por tratamientos con una cantidad
antimicrobiana efectiva de los compuesto de péptidos de la
invención. Las cosechas de productos alimenticios, tales como
frutas y verduras podrían ser también tratados para eliminar su
avería posterior a la cosecha. Los péptidos pueden ser administrados
de forma tópica o con intermedio de expresión transgénica de un
péptido recombinante según la invención. En el caso en el que el
material a conservar es mezclado con el compuesto de la invención,
se añade una cantidad antimicrobiana efectiva del péptido
seleccionado por un simple método de mezcla. La cantidad
antimicrobiana efectiva se encontrara de manera típica en una gama
de 1500 \mug a 50 mg/kg de material tratado. En el caso en el que
los compuestos se administran por vía tópica, la cantidad
antimicrobiana efectiva se encontrará de manera típica en una gama
aproximada de 0,1-1,0 mg/cm^{2}.
Además, los péptidos de la invención se pueden
utilizar como agentes desinfectantes para esterilizar o mantener
productos libres de microbios. Estos productos pueden incluir
toallitas infantiles, pañales, vendajes, toallas para cosmética,
productos de cosmética, productos de lavado de ojos y soluciones
para lentes de contacto. Los compuestos de la invención pueden ser
administrados a dichos productos de manera tópica, en un tampón
apropiado o en compuestos de liposomas. La cantidad antimicrobiana
efectiva a administrar se encontrará de manera típica en una gama
aproximada de 1500 \mug a 50 mg/kg de material tratado.
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar la invención pero a no limitar la misma.
Hb en crudo (50 \muL), adquirido de Sigma
Chemicals, fue inyectado en una columna de HPLC de fase
C4-inversa (YMC Protein-RP, 150x4,6
mm Diámetro Interior) y se eluyó con agua/acetonitrilo (fase móvil
A; 80% H_{2}O/20% AcCN/0,1 TFA; fase móvil B: 40% H_{2}O/60%
AcCN/0,1 TFA). La columna fue barrada inicialmente con 40% de fase
móvil B durante 10 min, después de lo cual se hizo pasar un
gradiente lineal de 45% a 60% de B durante 90 min. Un segundo
gradiente lineal de 55% a 95% de B se hizo pasar durante 10 min,
después de lo cual la columna fue mantenida a 95% de B durante 15
min. El caudal de la columna fue de 1 mL/min y el material eludido
fue detectado a 210 nm. El volumen eludido fue recogido en
fracciones de 4 mL que se concentraron en vacío. El heme fue
eludido como pico agudo a 7,15 min, mientras que las subunidades
\beta y \alpha se eluyeron en forma de picos amplios centrados
en 28 min y 38 min, respectivamente (Figura 16).
Partes alícuotas (20 \muL) de Hb y sus cadenas
\alpha y \beta se combinaron con tampón de muestras -6X- (4
\muL), se calentaron a 95ºC durante 5 min y se analizaron
mediante SDS-PAGE (16,5% de gel) utilizando un
sistema de tampón tris/tricina. Las bandas fueron visualizadas por
teñido de azul coomassie (0,1% de azul coomassie
G-250 en 50% de metanol/10% de ácido acético)
durante 1 hora, seguido de desteñido de cada gel (5% de metanol/7%
de ácido acético) durante una noche (Figura 17).
Las cadenas humanas \alpha y \beta fueron
diluidas con ácido fórmico (60% de concentración final de ácido
fórmico). A continuación, se añadió bromuro de cianógeno (exceso de
500-1.000 veces) como solución de AcCN (4,7 M). Cada
una de las reacciones fue tratada con argón y colocada en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. Dado que el
proceso de fraccionamiento utilizó HCOOH, cualesquiera fragmentos
resultantes serían formulados de manera similar, resultado que
proporcionaría múltiples picos para cada fragmento de análisis
HPLC. Para superar este problema, se añadió etanolamina (100 \muL
de etanolamina por 1 mg de material de partida) a las muestras que
a continuación fueron sometidas a vortexed, sonicación y secadas
nuevamente in vacuo. Los materiales se redisolvieron con
sonicado en 10 mM de tampón de fosfato sódico (NaPB) a pH 5,5.
El modelo de fraccionamiento teórico de las
cadenas \alpha y \beta de la hemoglobina humana se espera que
dé lugar para la cadena \alpha a tres péptidos que contienen 32,
44 y 65 aminoácidos y, para la cadena \beta, dos péptidos que
contienen 55 y 91 aminoácidos. El análisis espectroescópico de
masas MALDI-TOF de los fragmentos fraccionados por
CNBr de las cadenas \alpha y \beta se muestran en la figura 19,
A-F.
Staphylococcus aureus cepa RN6390,
Pseudomonas aeruginosa cepa PA01, Escherichia coli
cepa MC4100, Streptococcus faecalis cepa ATCC 8043 y
Candida albicans aislado clínico del Hospital
Presbiteriano.
La actividad antibacteriana de fracciones
purificadas, hemoglobina o sus cadenas \alpha y \beta, o los
fragmentos derivados de CNBr de estas cadenas fueron sometidos a
prueba contra bacterias tipificadas por Escherichia coli,
mantenidas sobre placas de agar con caldo de soja Trypicase (TSB).
Se utiliza Escherichia coli como representante de organismos
Gram negativos. Se inocula una colonia única en el caldo de soja
trypticase y se cultiva hasta la fase exponencial media (OD_{600}
= 0,75). Los cultivos son lavados y diluidos en NaPB (pH 5,5 ó
7,4), 150 mM NaCl (PBS) a una concentración final de 2 x 10^{4}
unidades formadoras de colonias (CFU/ml). Las bacterias se incuban
durante 1 hora a 37ºC con concentraciones adecuadas de hemoglobina
o las cadenas \alpha o \beta en tampón de ensayo PBS. Al final
del ensayo se diluyen partes alícuotas 1:10 en PBS y se aplican en
placas de agar con 0,8% de agar suave para determinar la
supervivencia bacteriana después de incubación durante una noche a
37ºC. La actividad bactericida es determinada calculando la
disminución en las unidades formadoras de colonias para bacterias
incubadas con hemoglobina o sus cadenas \alpha o \beta en
comparación con bacterias incubadas con el tampón solo.
Se inocula una sola colonia de Staphylococcus
aureus RN6390 en caldo CYGP y se cultiva hasta fase exponencial
media (OD_{600} = 0,7). Los cultivos son lavados en NaPB pH 5,5 y
se disuelven hasta una concentración final de 5 x 10^{7} CFU/ml.
Una parte alícuota de 0,2 ml de esta suspensión bacteriana
(10^{7} CFU) es añadida a 10 ml de tampón NaPB sometido a
autoclave y enfriado (a 42ºC), 1% peso/volumen de agarosa de tipo
de baja electroendosmosis (Sigma). Después de mezclar las
bacterias, la agarosa es vertida en platos Petri cuadrados
Lab-Tek para formar una capa gruesa uniforme. Se
punzonan pocillos con un diámetro de 2,7 mm y se llenan con 4,5
\mul de control o muestra, las placas se incuban durante 3 horas
a 37ºC, y se colocan 10 ml de agar estéril en superposición
manteniéndolo a 42ºC. El agar de superposición es un caldo 2 x CYGP
y 1% peso/volumen Bacto-agar. Después de incubación
durante 18-24 horas a 37ºC, se mide el diámetro de
la zona transparente que rodea los pocillos que contienen el agente
antibacteriano.
Una única colonia de Pseudomonas
aeroginosa PA01 es inoculada en caldo de soja trypticase y se
cultiva a fase exponencial media (OD_{600} - 0,7). Los cultivos
son lavados en NaPB pH 5,5 y disueltos a una concentración final de
5 x 10^{7} CFU/ml. Una parte alícuota de 0,2 ml de esta
suspensión bacteriana (10^{7} CFU/ml) es añadida a 10 ml de
tampón NaPB sometido a autoclave y enfriado (a 42ºC), 1%
peso/volumen de agarosa de tipo de electroendosmosis baja (Sigma).
Después de mezclar las bacterias, la agarosa es vertida en platos
Petri cuadrados Lab-Tek para formar una capa gruesa
uniforme. Se punzonan pocillos con un diámetro de 2,7 mm y se
llenan con 4,5 \mul de control o muestra, incubándose las placas
durante 3 horas a 37ºC, y efectuándose superposición con 10 ml de
agar estéril mantenido a 42ºC. El agar de superposición es 6%
(peso/volumen) TSB y 1% peso/volumen de Bacto-agar.
Después de incubación durante 18-24 horas a 37ºC,
el diámetro de la zona transparente que rodea los pocillos que
contienen un agente antibacteriano es objeto de medición.
Una única colonia de Escherichia coli
MC4100 es inoculada en caldo de soja trypicase y cultivada a fase
exponencial media (OD_{600} - 0,7). Los cultivos son lavados en
NaPB pH 5,5 y disueltos a una concentración final de 5 x 10^{7}
CFU/ml. Una parte alícuota de 0,2 ml de esta suspensión bacteriana
(10^{7} CFU/ml) es añadida a 10 ml de NaPB sometido a autoclave y
enfriado (a 42ºC) que contenía 0,02% de albúmina de suero bovino
(BSA) y 0,02% Triton X100, 1% peso/volumen de agarosa de tipo de
baja electroendosmosis (Sigma). Después de mezclar las bacterias,
la agarosa es vertida en platos Petri cuadrados
Lab-Tek para formar una capa gruesa uniforme. Se
punzonan pozos con diámetro de 2,7 mm y se llenan con 4,5 \mul de
control o muestra, las placas son incubadas durante 3 horas a 37ºC
y se efectúa la superposición de 10 ml de agar estéril mantenido a
42ºC. El agar de superposición es 6% (peso/volumen) TSB y 1%
peso/volumen de Bacto-agar. Después de incubación
durante 18-24 horas a 37ºC, se mide el diámetro de
la zona transparente que rodea los pocillos que contienen el agente
antibacteriano.
Se inocula una colonia única en 10 mL de TSB
durante una noche con agitación a 37ºC. Se añaden aproximadamente
0,3 ml a 10mL de TSB fresco y se agita a 37ºC. Se permite el
cultivo hasta fase logarítmica media (OD_{600} = 0,6). El cultivo
es lavado 2X en NaPB pH 5,5 por centrifugación a 5.000 rpm durante
10 min. Se vuelve a comprobar OD después de lavado para determinar
la concentración bacteriana exacta. Las bacterias lavadas son
añadidas a una concentración de 10^{7}/placa a la capa inferior
(NaPB pH 5,5/1% de agarosa de baja electroendosmosis). Se añaden
diluciones de hemoglobina NaPB pH 5,5 a la placa, dejando que se
difunda en la capa, e incubando en una caja húmeda a 37ºC durante 3
horas. Después de la incubación, se añaden 10mL de medio nutriente,
6% TSB y 1% de Bactoagar, como capa superior y se incuban placas en
la caja húmeda durante una noche a 37ºC.
La actividad antihongos de la hemoglobina o sus
cadenas \alpha o \beta es comprobada contra un hongo,
tipificado por Candida albicans, mantenido en placas de agar
de dextrosa Sabouraud. El hongo Candida albicans utilizado en
estos ensayos es un aislado clínico del Hospital Presbiteriano de
Columbia, Nueva York. Se inocula una colonia única en caldo de
dextrosa de Sabouraud y se cultiva durante 16-18
horas a 37ºC. Una parte alícuota del cultivo durante una noche es
inoculada en caldo fresco y se permite el crecimiento durante 3
horas a una densidad de 7 x 10^{6}/ml según determinación con una
cámara de contaje. El cultivo de hongos es diluido a una
concentración final de 2 x 10^{4} CFU/ml en 10 mM de tampón de
fosfato sódico, pH 5,5 y esta suspensión es incubada durante 3
horas con hemoglobina o sus cadenas \alpha o \beta en NaPB pH
5,5. Se diluyen partes alícuotas 1:10 en medio mínimo M63 y se
extiende sobre placas de agar de dextrosa Sabouraud para determinar
las CFU que sobreviven después de 20 horas a 37ºC.
Los hongos se dejan crecer durante 3 horas a
partir de un cultivo de una noche en caldo de dextrosa Sabouraud,
centrifugado a 10.000g durante 10 min, lavado dos veces en NaPB pH
5,5, y resuspendido en NaPB (pH 5,5) a una concentración final de 4
x 10^{7}/ml. Una parte alícuota de 0,1 ml de esta suspensión de
hongos (4 x 10^{6} CFU) es añadida a 10 ml de NaPB pH 5,5 sometido
a autoclave y enfriado (a 42ºC) conteniendo 1% peso/volumen de
agarosa de tipo de baja electroendosmosis (Sigma). Después de
mezclar los hongos, el agar es vertido en platos Petri cuadrados
Lab-Tek para formar una capa uniforme con un grosor
de 1 mm. Se punzonan pocillos con un diámetro de 3 mm y se llenan
con 5 \mul de control o muestra, las placas se incuban durante 3
horas a 37ºC y se superpone 10 ml de agar estéril mantenido a 42ºC.
El agar superpuesto es agar 2x Sabouraud. Después de incubación de
18-24 horas a 37ºC, se mide el diámetro de la zona
transparente que rodea los pocillos que contienen el agente
antihongos.
La medición de la actividad antimicrobiana de
hemoglobina humana, sus cadenas \alpha y \beta libres de heme,
fragmentos derivados CNBr de las cadenas \alpha y \beta, y
péptidos sintéticos derivados de las mismas se determinaron por
ensayo de difusión radial y en algunos casos por ensayo de placas.
Para los datos proporcionados en las figuras 1-15,
las ordenadas muestran el diámetro de la zona transparente
expresada en unidades arbitrarias en las que diez unidades = 1,0 mm
(23). Las abscisas muestran concentración de proteína en \mug/ml.
El MIC es estimado por extrapolación lineal de puntos de datos
hasta interceptación con el eje x.
Cada uno de los ensayos fue llevado a cabo con 3
pasadas experimentales excepto en el caso indicado. El ensayo de
difusión radial es fiable y proporciona resultados consistentes
cuando se utiliza con los compuestos purificados o semipurificados
de la invención. El método de ensayo fue modelado de acuerdo con el
de Lee y otros (23).
Se demostró actividad antimicrobiana para
hemoglobina humana por ensayo de difusión radial y se resume en la
Tabla 1, Ejemplo 1 y figuras 1 a 6.
Se demostró actividad antimicrobiana para
hemoglobina humana por ensayo de placas y proporcionó los
siguientes datos. El IC_{50} para Candida albicans se
encuentra en una gama de 5 a 6 \mug/ml y para E. coli se
encuentra en una gama de 8 a 10 \mug/ml. El IC_{50} se expresa
como concentración de proteína requerida para exterminar 50% de los
organismos de prueba (es decir, disminución al 50% en unidades de
formación de colonias).
Ejemplos 3 y
4
La actividad antimicrobiana para la cadena
\alpha libre de heme de la hemoglobina se resume en la Tabla 1,
la actividad antimicrobiana del Ejemplo 3 de la cadena \beta
libre de heme de la hemoglobina se resume en la Tabla 1, Ejemplo
4.
Se demostró la actividad antimicrobiana para las
cadenas \alpha y \beta de hemoglobina humana por ensayo de
placas y ello proporcionó los siguientes datos. Los valores
IC_{50} para la cadena \alpha fueron de 4 a 5 \mug/ml para
Candida albicans y 15 a 20 \mug/ml para Escherichia
coli. Los valores IC_{50} para la cadena \beta fueron de 4
a 5 \mug/ml para Candida albicans y 10 a 15 \mug/ml para
Escherichia coli.
Ejemplos
6-10
Se describe en la Tabla 2, Ejemplos
6-10 la actividad antimicrobiana de los fragmentos
con fraccionamiento CNBr de las cadenas \alpha y \beta libres de
heme. Los Ejemplos 6, 7 y 8 corresponden a los fragmentos de
fraccionamiento CNBr \alpha-1,
\alpha-2 y \alpha-3,
respectivamente, y los Ejemplos 9 y 10 corresponden,
respectivamente, a los fragmentos de fraccionamiento por CNBr
\beta-1 y \beta-2. Los datos
demuestran que los fragmentos \alpha-3 (Nº DE
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3) y \beta-2 (Nº DE
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2) son los más activos.
Ejemplos 11 y
12
Se sintetizaron los péptidos sintéticos I y II
(N^{OS} DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 5 y 6, respectivamente)
por las instalaciones de Química de Proteínas de Núcleo en el
Instituto Médico Howard Hughes en la Universidad de Columbia de
acuerdo con medios convencionales. La actividad antimicrobiana de
los péptidos sintéticos I (Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5) y
II (Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6) se muestra en la Tabla 3,
Ejemplos 11 y 12, respectivamente.
Los ejemplos anteriores demuestran los
experimentos llevados a cabo y previstos por los presentes
inventores en la realización de la invención. Se cree que estos
ejemplos incluyen la manifestación de técnicas que sirven para
demostrar la práctica y utilidad de la invención. Se observará por
los técnicos de la materia que se pueden realizar diferentes
cambios en las realizaciones y en las técnicas que se han mostrado
como ejemplo, sin salir del ámbito de la invención.
1) Moberg CL, Cohn ZA (eds). 1990.
Launching the antibiotic era. Personal accounts of the discovery
and use of the first antibiotics. Rockefeller University Press, New
York.
2) Sahl H-G. 1994.
Gene enclosed antibiotics made in bacteria, in: Antimicrobial
Peptides, Wiley, Chichester, páginas 27-53.
3) Ganz T. 1994. Biosynthesis of
defensins and other antimicrobial peptides, In: Antimicrobial
Peptides, Wiley, Chichester, páginas 63-37.
4) Zasloff M. 1987. Magainins, a
class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation,
characterization of two active forms and partial cDNA sequence of
precursor. Proc Natl Acad Sci 84:
5449-5453.
5) Giovanni MG, Poulter L,
Gibson BW, Williams DH. 1987. Biosynthesis and
degradation of peptide derived from Xenopus Laevis prohormones.
Biochem J 243:113-120.
6) Dizon RA, Dey PM, Lamb
CJ. 1983. Phytoalexins: enzymology and molecular biology.
Adv Enzymol Relat Areas of Mol Biol 55:
1-135.
7) Stintzi A, Hertz T,
Pradad V, y otros. 1993. Plant
pathogenesis-related proteins and their role in
defense against pathogens. Biochemie 75:
687-706.
8) Hultmark D, Steiner H,
Rasmulson T, Boman HC. 1980. insect immunity:
purification and properties of three inducible bacteriocidal
proteins from hemolymph of immunized pupae of Hylorphora cecropia.
Eur J Biochem 106: 7-16.
9) Hultmark D. 1993. Immune
reactions in Drosphila and other insects; a model for innate
immunity. Trends Genet 9: 178-183.
10) Steiner H, Hultmark D,
Engstrom A, Bennich H, Boman HG. 1981.
Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in
insect immunity. Nature 292: 245-248.
11) Natori S. 1990. Dual functions
of insect immunity proteins in defense and development. Res
Immunol. 141: 938-939.
12) Moore KS, Wohrli S,
Roger H, y otros. 1993. Squalamine; and aminosteriod
antibiotic from the shark. Proc Natl Acad Sci 90:
1354-1358.
13) Kreil G. 1994. Antimicrobial
peptides from amphibian skin; an overview, in, Antimicrobial
Peptides, Ciba Foundations Symposium 186, páginas
77-90. John Wiley & Sons, Chichester, N.Y.
14) Jacob L, Zasloff M.
1994. Potential therapeutic applications of magainins and
other antimicrobial agents of animal origin, in Antimicrobial
Peptides, John Wiley & Sons, Chichester, NY.
15) Nicolas P, Mor A. 1995.
Peptides as weapons against microorganisms in the chemical defense
system of vertebrates. Ann Rev Microbiol 49:
277-304.
16) Perutz MF. 1990. Mechanisms
regulating the reactions of human hemoglobin with oxygen and carbon
monoxide. Annu Rev Physiol 52: 1-25,
1990.
17) Perutz MF. 1979. Regulation of
oxygen affinity of hemoglobin: influence of structure of the globin
on the heme. Annu Rev Biochem
48:327-386.
18) Ritter, S.K. 1998. Passing a
Bood Test. Science/Technology, C&EN 18 de Mayo,
1998:37-44.
19) Winslow, R.M. 1995. "Blood
Substitutes: 1995 in the Literature" de Blood Substitutes:
Physiological Basis of Efficacy, Capítulo 1. Eds. Winslow, R.M.
y otros, Birkhäuser, Boston.
20) Christensen SM, Medina P,
Winslow RW, Snell SM, Zegna A, Marini
MA. 1988. Preparation of human hemoglobin Ao for possible use
as a blood substitute. J Biochem Biophys Method
17:143-154.
21) Masala B, Manca L. 1994.
Detection of globin chains by reversed-phase
high-performance liquid chromatography. Methods
in Enzymology 231:21-44.
22) Schagger H, von Jagow G.
1987. Tricine-sodium dodecyl
sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the
separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal
Biochem 166:368-376.
23) Lee IH, Cho Y, Lehrer
RI. 1997. Effects of pH and salinity on the antimicrobial
properties of Clavanins. Infections & Immunity
65:2898-2903.
Claims (16)
1. Método para la prevención de contaminación por
hongos o por bacterias Gram positivas de alimentos, comprendiendo
la aplicación o mezcla con dichos alimentos de una cantidad
antimicrobiana efectiva de un fragmento de proteína de hemoglobina
o fragmentos de polipéptido de la misma, seleccionados entre el
grupo que consiste en cadena \alpha de hemoglobina libre de heme,
cadena \beta de hemoglobina libre de heme, fragmento
\alpha-3 de hemoglobina libre de heme, fragmento
\beta-2 de hemoglobina libre de heme, secuencia de
aminoácido de número de identificación secuencia: 3, secuencia de
aminoácido de número de identificación secuencia: 2, secuencia de
aminoácido de número de identificación secuencia: 5, secuencia de
aminoácido de número de identificación secuencia: 6, fragmentos de
dicho fragmento de proteína o fragmentos de polipéptido del mismo y
combinaciones de los
mismos.
mismos.
2. Método para esterilizar o mantener productos
libres de hongos o de bacterias Gram positivas, compren-
diendo la aplicación o mezcla con dichos productos de una cantidad antimicrobiana efectiva de un fragmento de proteína de hemoglobina o fragmentos de polipéptido de los mismos seleccionados del grupo que consiste en cadena \alpha de hemoglobina libre de heme, cadena \beta de hemoglobina libre heme, fragmento \alpha-3 de hemoglobina libre de
heme, fragmento \beta-2 de hemoglobina libre de heme, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 3, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 2, secuencia de aminoácido de nú-
mero de identificación de secuencia: 5, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia:
6, fragmentos de dicho fragmento de proteína o fragmentos de polipéptido del mismo y combinaciones de los
mismos.
diendo la aplicación o mezcla con dichos productos de una cantidad antimicrobiana efectiva de un fragmento de proteína de hemoglobina o fragmentos de polipéptido de los mismos seleccionados del grupo que consiste en cadena \alpha de hemoglobina libre de heme, cadena \beta de hemoglobina libre heme, fragmento \alpha-3 de hemoglobina libre de
heme, fragmento \beta-2 de hemoglobina libre de heme, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 3, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 2, secuencia de aminoácido de nú-
mero de identificación de secuencia: 5, secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia:
6, fragmentos de dicho fragmento de proteína o fragmentos de polipéptido del mismo y combinaciones de los
mismos.
3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dichos fragmentos de hemoglobina o fragmentos de polipéptido se
derivan de humanos.
4. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el
que las bacterias Gram positivas son seleccionadas del grupo que
consiste en Staphylococcus aureus y Streptococcus
faecalis.
5. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el
que los hongos son Candida albicans.
6. Polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en una secuencia de aminoácido de número de identificación
de secuencia: 5, y número de identificación de secuencia: 6.
7. Utilización de un fragmento de proteína de
hemoglobina o fragmentos de polipéptido del mismo seleccionados del
grupo que consiste en cadena \alpha de hemoglobina libre de heme,
cadena \beta de hemoglobina libre de heme, fragmento
\alpha-3 de hemoglobina libre de heme, fragmento
\beta-2 de hemoglobina libre de heme, secuencia
de aminoácido de número de identificación secuencia: 3, secuencia
de aminoácido de número de identificación secuencia: 2, secuencia
de aminoácido de número de identificación secuencia: 5, secuencia de
aminoácido de número de identificación secuencia: 6, fragmentos de
dicho fragmento o fragmentos de polipéptido del mismo y
combinaciones del mismo para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento antimicrobiano de infecciones bacterianas Gram
positivas o infecciones por hongos.
8. Utilización, según la reivindicación 7, en la
que dichos fragmentos de proteína de hemoglobina o fragmentos de
polipéptido se derivan de humanos.
9. Utilización, según la reivindicación 7, en la
que las bacterias son bacterias Gram positivas.
10. Utilización, según la reivindicación 7, en la
que las bacterias Gram positivas se seleccionan entre el grupo que
consiste en Staphylococcus aureus y Streptococcus
faecalis.
11. Utilización, según la reivindicación 7, en la
que los hongos son Candida albicans.
12. Método para prevenir contaminación bacteriana
Gram negativa de alimentos, que comprende la apli-
cación o mezcla con dichos alimentos de una cantidad antimicrobiana efectiva de fragmentos de polipéptido de los mismos seleccionados del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de número de identificación de se-
cuencia: 5, una secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 6 o combinaciones de los
mismos.
cación o mezcla con dichos alimentos de una cantidad antimicrobiana efectiva de fragmentos de polipéptido de los mismos seleccionados del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de número de identificación de se-
cuencia: 5, una secuencia de aminoácido de número de identificación de secuencia: 6 o combinaciones de los
mismos.
13. Método para la esterilización o para mantener
productos libres de bacterias Gram negativas, que comprende la
aplicación o mezcla con dichos productos de una cantidad
antimicrobiana efectiva de una secuencia de aminoácido de número de
identificación de secuencia: 5 o una secuencia de aminoácido de
número de identificación de secuencia: 6 o combinaciones de las
mismas.
14. Método, según la reivindicación 12 y 13, en
el que las bacterias Gram negativas son seleccionadas entre el
grupo que consiste en Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa.
\newpage
15. Utilización de fragmentos de polipéptido
seleccionados del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido
de número de identificación de secuencia: 5, secuencia de
aminoácido de número de identificación de secuencia: 6 o
combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento antimicrobiano de infecciones bacterianas Gram
negativas.
16. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que las bacterias Gram negativas son seleccionadas entre el
grupo que consiste en Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6145497P | 1997-10-08 | 1997-10-08 | |
| US61454P | 1997-10-08 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES98939367T Expired - Lifetime ES2236931T3 (es) | 1997-10-08 | 1998-08-10 | Peptidos derivados de mamiferos para el tratamiento de infecciones microbianas. |
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