CN103948632B - 蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 - Google Patents
蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103948632B CN103948632B CN201410190050.0A CN201410190050A CN103948632B CN 103948632 B CN103948632 B CN 103948632B CN 201410190050 A CN201410190050 A CN 201410190050A CN 103948632 B CN103948632 B CN 103948632B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- liquid
- toad
- raises
- antibacterial peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 11
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003672 processing method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 abstract description 8
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 17
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241001415440 Bufo gargarizans Species 0.000 description 2
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 2
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- -1 hydroxyl cinobufotoxin Chemical compound 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 208000004429 Bacillary Dysentery Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000269420 Bufonidae Species 0.000 description 1
- 241000257161 Calliphoridae Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000202815 Chrysomya megacephala Species 0.000 description 1
- SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N Cinobufagin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@H]5CC[C@H]4[C@@]43O[C@@H]4[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N 0.000 description 1
- SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N Cinobufagin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBCVEPKUYJXQNV-UHFFFAOYSA-N Cinobufotoxin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4CC(OC(=O)CCCCCCC(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 VBCVEPKUYJXQNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001415432 Duttaphrynus melanostictus Species 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000270878 Hyla Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010040550 Shigella infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NWFNSTOSIVLCJA-UHFFFAOYSA-L copper;diacetate;hydrate Chemical compound O.[Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O NWFNSTOSIVLCJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 201000005113 shigellosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及蟾饲五谷虫抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及蟾饲五谷虫抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。
背景技术：
蟾饲五谷虫是以蟾蜍科属中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蛛(B.melanostictus Schneider)等尸体为培养基质，人工培养的丽蝇科昆虫大头金蝇或其近缘昆虫的干燥幼虫。主产于华中、华东地区，我国各地区均有分布，一年四季均可采收。蟾饲五谷虫含蛋白质质量分数为62.70％、脂肪质量分数为11.20％、几丁聚糖质量分数为16％，氨基酸18种，含抗菌肽质量分数为0.264％。另外还含有华蟾蜍毒基和羟基华蟾蜍毒基等成分。
抗菌肽(antibacterial peptides)广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽(Prates MV,Sforca ML,Regis Wc,TheNWR-derived solution structure of a new cationic antimicrobial peptides fromthe skin secretion of the anuran Hyla Punctana[J].J Biol Chem.2004,279(13):13018-13026.) 。抗菌肽广泛存在于动物的免疫细胞(如吞噬细胞)、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中。抗菌肽也被称为生物的第二防御体系，家蝇抗菌肽的产生是由于外界环境的干扰，或者经过免疫诱导等方式，让家蝇体内产生一种免疫小分子即抗菌肽，但是免疫方式操作繁琐，工作量大。
不同的抗菌肽抑菌种类和抑菌效果往往不尽相同，因此可以采用不同的受试菌研究蟾饲五谷虫抗菌肽的抑菌结果，选择抑菌活性较强的受试菌，从而使其更有效地得以利用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及其在制备抑菌剂中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。
其中，蟾饲五谷虫抗菌肽通过如下方法获得：
(1)提取
蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂(0.05mol/L的NaH2PO4 81.7ml与0.05mol/L Na2HPO4 12.3ml，调PH为6)处理，另一份用0.05mol/L乙酸铵溶剂(用乙酸调节PH为5)处理。样品干燥虫体和溶剂比为1：2，用匀浆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为1号和2号。放置过夜的样品，将 1号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤，得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心 30min,除去细胞器杂质等物质，滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的1号澄清滤液。2号样品液仍然采用相同的处理方法。即得到2号澄清样品液。
(2)样品的除脂
以2号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取12h,然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心。离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存。
(3)样品的浓缩
盐析，是在蛋白质溶液中加入中性盐，破坏蛋白质的水化膜，而达到使蛋白质沉淀的作用，常用的中性盐有氯化钠，硫酸铵，由于硫酸铵在水溶液中溶解度大，且比较容易除去，所以我们采用硫酸铵盐析的方式。
实验中我们以80％的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，防止局部过浓，引起蛋白质变性，1号和2号液均采取这样的方式处理，盐析半个小时。
(4)样品的再溶解
盐析过的1号和2号蛋白液，利用高速离心机，15000r/min离心15min,除去上清液，1号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解，溶解液备用。
(5)样品溶液除菌
在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取1号和2号溶液，过滤膜，得到样品无菌液。
蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。
试验结果表明，蟾饲五谷虫抗菌肽可以用于制备抑菌剂。
附图说明
图1为甲型沙门伤寒杆菌抑菌结果；
图2为志贺杆菌的抑菌结果；
图3为甲型沙门杆菌的抑菌结果；
图4为对照组抑菌结果；
图5为肠炎沙门杆菌的抑菌结果；
图6为金黄色葡萄球菌的抑菌结果；
图7为大肠杆菌的抑菌结果；
图8为枯草杆菌的抑菌结果；
图9为苏云金芽孢杆菌的抑菌结果；
图10为苏云金芽孢杆菌亚型的抑菌结果；
图11为阴沟肠杆菌抑菌结果。
具体实施方式
实施例1：
蟾饲五谷虫抗菌肽的制备:
(1)提取
蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂(0.05mol/L的NaH2PO4 81.7ml与0.05mol/L Na2HPO4 12.3ml，调PH为6)处理，另一份用0.05mol/L乙酸铵溶剂(用乙酸调节PH为5)处理。样品干燥虫体和溶剂比为1：2，用匀浆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为1号和2号。
放置过夜的样品，将1号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤，得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心30min,除去细胞器杂质等物质，滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的1号澄清滤液。2号样品液仍然采用相同的处理方法。即得到2号澄清样品液。
(2)样品的除脂
以2号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取12h,然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心。离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存。
(3)样品的浓缩
盐析，是在蛋白质溶液中加入中性盐，破坏蛋白质的水化膜，而达到使蛋白质沉淀的作用，常用的中性盐有氯化钠，硫酸铵，由于硫酸铵在水溶液中溶解度大，且比较容易除去，所以我们采用硫酸铵盐析的方式。
实验中我们以80％的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，防止局部过浓，引起蛋白质变性，1号和2号液均采取这样的方式处理，盐析半个小时。
(4)样品的再溶解
盐析过的1号和2号蛋白液，利用高速离心机，15000r/min离心15min,除去上清液，1号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解，溶解液备用。
(5)样品溶液除菌
在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取1号和2号溶液，过滤膜，得到样品无菌液。
实施例2：
抑菌试验：
(1)抑菌试验的前处理
抑菌试验所需的培养皿，移液管，三角爬，接种针，琼脂片都需要灭菌，我们设置灭菌锅温度为121.3℃，灭菌30min.
(2)培养基的配置：
配置固体培养基，牛肉膏5g,蛋白胨10g，NaCL5g,琼脂15g,水1000ml,用NaOH调节PH7.0-7.2，配置完的固体培养基倒入250ml锥形瓶中，密封瓶口，放入灭菌锅中和其它仪器一起灭菌。灭菌条件同上。
(3)抗菌肽溶液浓度的测定
采用考马斯亮兰法(Bradofrd法)，蛋白标液:准确称取结晶牛血清白蛋白50mg，用0.9 ％NaCL溶液配成浓度为400ug/mL的溶液。显色液:称取考斯亮兰G250400mg，置于玻璃研钵中，加入0.5mL高氯酸研磨约30分钟后，再加入1.0mL高氯酸，继续充分研磨至完全溶解。加入约194mL水4.5mL高氯酸，混匀，用三角漏斗过滤。以3％的高氯酸溶液将滤液在465nm处的吸光度调至1.3一1.5之间(1cm比色杯)。避光存放显色液。
标准曲线的制作:取6支洁净试管，分别按下表加入试剂，各管混匀后，以蒸馏水作参比，测定各管在波长595nm和波长465nm处吸光度A值。计Ai＝OD595/OD465之值，以Ai’＝Ai一Al为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制蛋白浓度标准曲线。并计算Ai’＝Ai一 Al，于标准曲线上查出对应蛋白浓度。
表1：标准曲线绘制
样品测定：将0.9％NaCL溶液将蛋白稀释到20-40ug/ml.取1.0ml蛋白溶液，加入1.0ml显色液，混匀。参照标准曲线测定方法测定OD595和OD495之值，并计算Ai’＝Ai一Al，于标准曲线上查出对应蛋白浓度。通过标准曲线得到1为3.5ug/ml,2为4.3ug/ml.计算的原来浓度为1为35mg/ml,2为43mg/ml。
实施例3：
采用抑菌圈法，以金黄色葡萄球菌(Staphylococu aureur)，志贺杆菌(Shigellosis)，阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae，苏云金芽孢杆菌(bacilliusthuringiensis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保加利亚型苏云金芽孢杆菌(The Republic of Bulgaria bacilliusthuringiensis)，铜绿假芽孢杆菌(pseudomonas aeruginosa)，甲型伤寒沙门杆菌(paratyphosum A Bacterium)，肠炎沙门杆菌(Salmonella),大肠杆菌(Escherichia coli).为供试菌，以104CFU为单位，测定抑菌结果。结果如图1-11所示。
试验结果可知，蟾饲五谷虫的抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。由于本实验所得到为样品的总提取液，测定的为样品中蛋白质的总浓度，所以抗菌肽的浓度较低，明显地，分离纯化得到的样品会有更明显的抑菌作用。
Claims (1)
1.蟾饲五谷虫抗菌肽在制备抑制甲型伤寒沙门杆菌或肠炎沙门杆菌制剂中的应用，其特征在于，所述的蟾饲五谷虫抗菌肽通过如下方法制备：
(1)提取
蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂处理，所述的磷酸盐缓冲溶液溶剂为：0.05mol/L的NaH2PO4 81.7ml与0.05mol/L Na2HPO412.3ml，调PH为6，另一份用0.05mol/L的用乙酸调节PH为5的乙酸铵溶剂处理；
样品干燥虫体和溶剂比为1：2，用匀浆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为1号和2号；
放置过夜的样品，将1号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤，得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心,除去细胞器杂质物质，滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的1号澄清滤液，2号样品液仍然采用相同的处理方法，即得到2号澄清样品液；
(2)样品的除脂
以1号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取,然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心，离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存；
(3)样品的浓缩
以80％的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，1号澄清滤液除脂后的样品和2号澄清样品液均采取同样的方式处理，盐析半个小时；
(4)样品的再溶解
盐析过的1号和2号蛋白液，利用高速离心机，15000r/min离心,除去上清液，1号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解，溶解液备用；
(5)样品溶液除菌
在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取1号再溶解液和2号再溶解液，分别过滤膜，得到样品1号无菌液和2号无菌液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410190050.0A CN103948632B (zh) | 2014-05-07 | 2014-05-07 | 蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410190050.0A CN103948632B (zh) | 2014-05-07 | 2014-05-07 | 蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103948632A CN103948632A (zh) | 2014-07-30 |
| CN103948632B true CN103948632B (zh) | 2018-03-13 |
Family
ID=51326074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410190050.0A Expired - Fee Related CN103948632B (zh) | 2014-05-07 | 2014-05-07 | 蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103948632B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107836602A (zh) * | 2017-12-16 | 2018-03-27 | 李炫颖 | 一种治疗鱼鳃烂病饲料的制备方法 |
| CN108392496B (zh) * | 2018-04-09 | 2020-06-26 | 大连麦琪克生物技术有限公司 | 一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺 |
| CN112322681B (zh) * | 2019-08-01 | 2022-09-09 | 大连麦琪克生物技术有限公司 | 一种中药五谷虫活性肽及其制备方法和用途 |
| CN110354146A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-10-22 | 浙江佰科堂生物科技股份有限公司 | 一种五谷虫组合物及其在润肠通便以及治疗习惯性老年性便秘中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999017786A1 (en) * | 1997-10-08 | 1999-04-15 | Theragem, Inc. | Mammalian-derived peptides for the treatment of microbial infection |
| CN101392020A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-03-25 | 中山大学 | 家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用 |
| CN102091318A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-06-15 | 哈尔滨工业大学 | 蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法 |
-
2014
- 2014-05-07 CN CN201410190050.0A patent/CN103948632B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999017786A1 (en) * | 1997-10-08 | 1999-04-15 | Theragem, Inc. | Mammalian-derived peptides for the treatment of microbial infection |
| CN101392020A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-03-25 | 中山大学 | 家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用 |
| CN102091318A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-06-15 | 哈尔滨工业大学 | 蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 家蝇抗菌肽的分离及对细菌璧膜和DNA的作用;唐亚丽;《中国优秀博士学位论文全文数据库》;20100430(第4期);第17页第2.3.1节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103948632A (zh) | 2014-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103948632B (zh) | 蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途 | |
| CN105586327B (zh) | 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法 | |
| CN100475841C (zh) | 注射用胎盘多肽制备方法 | |
| CN103555810B (zh) | 药品微生物检验双滤膜过滤方法 | |
| CN110105437A (zh) | 分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途 | |
| CN110205355A (zh) | 一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用 | |
| TW202108187A (zh) | 塗覆抗微生物肽於生物材料之方法及藉此塗覆之生物材料 | |
| CN111226986A (zh) | 含养殖环境噬菌体组合物的喷雾消毒剂、其制备方法和应用 | |
| RU2206337C1 (ru) | Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний и способ его получения | |
| CN101759765A (zh) | 一种体外制备抗鸡法氏囊病毒特异性转移因子的制备方法 | |
| CN108434779A (zh) | 一种五倍子提取物的制备方法及应用 | |
| JP6404072B2 (ja) | アカントアメーバの消毒評価方法 | |
| CN112957374A (zh) | 一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法 | |
| CN102908368A (zh) | 一种病毒冻干制剂的制备方法 | |
| JP2022551319A (ja) | ワモンゴキブリの抽出物、製剤、調製方法およびその使用 | |
| CN105779563A (zh) | 榄香烯脂质体注射液半成品中耐热微生物的检验试剂盒以及方法 | |
| CN111888469A (zh) | 一种IgY脂质体喷雾及其制备方法 | |
| CN106480161B (zh) | 一种奶牛乳房炎检测试剂盒 | |
| CN100564519C (zh) | 体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法 | |
| WO2019186579A1 (en) | Plant fractions having anti-pathogenesis properties | |
| CN105112494B (zh) | 一种联合型支原体检测试剂及其制备方法 | |
| CN104257692B (zh) | 一种制备非最终灭菌的无菌四味珍层冰硼滴眼液的检测方法 | |
| RU2255761C1 (ru) | Препарат для лечения мышечных дистоний из токсина культуры clostridium botulinum и способ его получения | |
| CN104173384B (zh) | 一种非最终灭菌的无菌四味珍层冰硼滴眼液及制备方法 | |
| Basir et al. | Antibacterial Activity Test of Moringa Leaf Ethanol Extract Ointment of Moringa oleifera Lamk. on Staphylococcus aureus Bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180313 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |