TW202108187A - 塗覆抗微生物肽於生物材料之方法及藉此塗覆之生物材料 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於塗覆抗微生物肽於生物材料之方法及藉此塗覆之生物材料。本文所述之塗覆溶液包含溶解於含有陰離子界面活性劑之緩衝液中的一或多種抗微生物肽(AMP)，其中AMP為兩性及陽離子型。

Description

塗覆抗微生物肽於生物材料之方法及藉此塗覆之生物材料
本發明係關於在生物材料上塗覆抗微生物肽之領域。特定言之，本發明係關於塗覆抗微生物肽於生物材料之方法及藉此塗覆之生物材料。
包括導管、人造心臟瓣膜、假體關節及其他植入物之醫療裝置廣泛用於現代醫學。此類醫療裝置一般用於恢復身體功能及提高生活品質，但與生物材料有關之感染(BAI)仍為一嚴重問題。BAI風險的部分原因可能由於侵入性裝置誘導之局部免疫防禦之功效降低，BAI之另一促成因素為細菌黏附至裝置且形成生物膜，該等細菌可由此侵入植入物周邊組織且引起感染。相較於抑制浮游細菌(planktonic bacteria)所需之抗生素濃度，需要濃度更高的抗生素來抑制或根除生物膜。抗生素治療失效通常導致醫療裝置的移除及需在體內不同位置更換新裝置。
咸信細菌生物膜形成在BAI之發病機制中為主要因素。其藉由細菌黏附於醫療裝置之表面起始，隨後細胞複製且產生由細菌、細菌胞外多醣、蛋白質、細胞外DNA及宿主蛋白組成之細胞外基質。與浮游對應物相比，生物膜中之細菌對抗生素耐受性更大且對人類免疫防禦系統之細胞及分子的敏感性更小。此等代謝非活性及抗生素耐受性細菌甚至能夠在抗生素治療之後增殖，引起BAI復發。
抗微生物肽(AMP)為動物、植物及微生物之先天防禦之效應分子。其呈現針對對抗生素具有抗性之存在於生物膜內之細菌的抗微生物活性。AMP大多為針對細菌、真菌及包膜病毒之呈現廣譜抗微生物活性之兩性及陽離子肽。雖然尚未確認出AMP在細菌上之確切作用標的，但已知細菌膜在AMP處理之後幾分鐘內變成可滲透的，引起細胞死亡。由於作用之快速且非特異性機制，耐藥性之發展極低。
為預防BAI，已開發AMP以塗覆於各種類型之生物材料之表面上。另外，塗層可延長AMP體內半衰期且減少副作用。重要的是，在設計預防策略時，亦需要考慮細菌在植入物上形成生物膜及細菌在植入物周邊組織中定殖兩者。AMP亦可固定於由包括但不限於多醣、蛋白質、肽的均聚物或共聚物構成之水凝膠上，且塗覆於基材上。已知水凝膠在導管之表面上形成水合層以抑制非特異性蛋白質吸附且減少症狀性導管相關泌尿道感染(CAUTI)出現(US 2007/0254006 A1；US 2009/0155335A1。美國專利：US 6635269 B1；US 6835536 B2；US 7282214 B2；US 8414910 B2)。
然而，AMP塗覆於植入物上仍涉及各種挑戰，包括抗微生物活性之損失、非特異性結合、改變之肽定向、AMP濃度不足、非最佳塗覆、pH值敏感性及溶血作用及細胞毒性。
在一個態樣中，本發明提供一種塗覆溶液，其包含溶解於含有陰離子界面活性劑之緩衝液中的一或多種抗微生物肽(AMP)，其中AMP為兩性及陽離子型。在一個實施例中，AMP的量在約0.01% (w/v)至約0.1% (w/v)範圍內。
在另一態樣中，本發明提供一種塗覆材料表面之方法，其包含(i)將一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於陰離子界面活性劑中，及(ii)將所得AMP溶液塗覆至材料表面上以使得AMP附著至表面上。在一個實施例中，AMP的量在約0.01% (w/v)至約0.1% (w/v)範圍內。在一個實施例中，在一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於陰離子界面活性劑中之後，一或多種AMP形成小囊泡樣結構。
在另一態樣中，本發明提供一種塗覆生物材料表面之方法，其包含(i)將一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於含有比0.002% (w/v)低的濃度之陰離子界面活性劑之緩衝液中以形成溶液(a)；(ii)將一定量之含有比0.02% (w/v)高的濃度之陰離子界面活性劑之緩衝液添加至溶液(a)以形成溶液(b)，其中含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量等於含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量；及(iii)將溶液(b)塗覆至材料表面上，使得AMP附著於表面上。在一個實施例中，含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之AMP的量在約0.002% (w/v)至約0.02% (w/v)範圍內。在一些實施例中，含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之AMP的量在0.02% (w/v)至約0.6% (w/v)範圍內。
在另一態樣中，本發明提供一種生物材料，其塗覆有藉由本發明方法製備的一或多種AMP。
在一些實施例中，本文所描述之陰離子界面活性劑包括但不限於十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂醯基肌胺酸鈉(十二烷基肌胺酸鈉(sarkosyl))、1-癸烷磺酸鈉(SDSn)、正辛基硫酸鈉(SOS)及十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)。
在一些實施例中，本文所描述之材料包括但不限於玻璃、合成聚合物(諸如聚矽氧、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚丙烯碳酸酯(PPC)、聚氯乙烯(PVC)或聚胺基甲酸酯(PU))、乳膠及金屬(諸如鋁、不鏽鋼、鈦及基於鈦之合金)。在一些實施例中，材料用於製造醫療儀器/裝置及支撐物。醫療儀器/裝置及支持性填料(supporting stuff)包括但不限於膜、粒子(諸如奈米粒子、微米粒子、珠粒)、纖維(諸如傷口敷料、繃帶、膠布、墊、海綿)、管、框架、板、導管、支架、隱形眼鏡、骨植入物、其他手術、牙科儀器及/或醫療裝置，其利用本文所描述之方法塗覆有AMP。
在一個實施例中，本文所述之AMP為肽衍生抗生素或陽離子AMP。在一些實施例中，本文所述的AMP包括但不限於α-螺旋、β-股及捲曲肽。AMP能夠利用陰離子界面活性劑塗覆於生物材料上。
在一些實施例中，本文所述之抗微生物肽包括但不限於肽衍生抗生素， BMAP-27 (L形式及D形式)：GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (SEQ ID NO:1)， CAME-A12K/K15H：KWKLFKKIGIGKVLHVLTTG-NH2 (SEQ ID NO:2)， T18,19K：KWKLFKKIGIGAVLKVLKKG-NH2 (SEQ ID NO:3)， CAME-V16S：KWKLFKKIGIGAVLKSLTTG-NH2 (SEQ ID NO:4)， CAP18：GLRKRLRKFRNKIKEKLKKIGQKIQGLLPKLAPRTDY (SEQ ID NO:5)， EPI (點帶石斑魚素-1 (epinecidin-1))：GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV (SEQ ID NO:6)， GW-Q6：GIKIAKKAITIAKKIAKIYW (SEQ ID NO:7)， 以西加南(Iseganan)：RGGLCYCRGRFCVCVGR-NH (SEQ ID NO:8)， 蟻蛛素1 (Latarcin 1)：SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGE (SEQ ID NO:9)， NLF20：NLFRKLTHRLFRRNFGYTLR (SEQ ID NO:10)， NRC-12：GWKKWFNRAKKVGKTVGGLAVDHYL-NH2 (SEQ ID NO:11)， 傑克跳蟻素-1 (Pilosulin-1)：GLGSVFGRLARILGRVIPKV-NH2 (SEQ ID NO:12)， 美洲擬鰈素(Pleurocidin)：GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL-NH2 (SEQ ID NO:13)， RR12：RRLIRLILRLLR-NH2 (SEQ ID NO:14)， RRIKA：WLRRIKAWLRRIKA (SEQ ID NO:15)， SAAP159：LKRLYKRVFRLLKRYYRQLRRPVR (SEQ ID NO:16)， SAAP145：LKRLYKRLAKLIKRLYRYLKKPVR (SEQ ID NO:17)， SMAP-29：RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG-NH2 (SEQ ID NO:18)， SMAP-28-3：RGLRRLGRKIVHVVKKYLPTVLRIIRIA-NH2 (SEQ ID NO:19)， SMAP-28-3+2：RGLRRLGRKIVHVVKKYLPTVLRIIRRL-NH2 (SEQ ID NO:20)， TP4-A12,15I：H-FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH (SEQ ID NO:21)， T9F：RFRRLRKKFRKRLKKI-NH2 (SEQ ID NO:22)，及 T9W：RFRRLRKKWRKRLKKI-NH2 (SEQ ID NO:23)。
在一些實施例中，AMP為肽衍生抗生素、選自SEQ ID No: 1至23之肽及其中任何兩者或更多者之混合物。
在一些實施例中，AMP為肽衍生抗生素、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 23之肽或其中任何兩者或更多者之混合物。
在一些實施例中，一或兩種AMP用於本文所述之方法或材料。在一個實施例中，AMP對用於本文中所描述之方法或材料中。在一些實施例中，AMP對為肽衍生抗生素與SEQ ID No: 1至23之肽中之任一者的組合。在一些實施例中，肽衍生抗生素包括多黏菌素B、多黏菌素E或健他黴素。在一些實施例中，AMP對為肽衍生抗生素與SEQ ID No: 1至23之肽中之任一者的組合。在一些實施例中，AMP對為多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素中之任一者與SEQ ID No: 1至23之肽中之任一者的組合。在一些實施例中，AMP對為多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素中之任一者與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18之肽中之任一者的組合。在一些實施例中，AMP對為SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:3組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:14組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:15組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:16組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:20組合、SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:16組合或SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:18組合。
在一個態樣中，本發明提供一種抗微生物肽，其選自由以下組成之群：SEQ ID No: 2、3、4、19及20。此等抗微生物肽為具有抗微生物活性之新穎肽。
雖然下文詳細論述本發明之各種實施例之製備及使用，但應瞭解，本發明提供可在廣泛多種特定情形下實施之許多可適用的發明性概念。本文中所論述之特定實施例僅用於說明製造及使用本發明之特定方式且不限定本發明之範疇。
為促進對本發明之理解，下文定義多個術語。本文所定義之術語具有如本發明相關領域之一般技術者通常理解之含義。諸如「一(a)」、「一(an)」及「該」之術語並不意欲僅指單數實體，反而包括可用於說明之特定實例的一般類別。本文中之術語用於描述本發明之特定實施例，但其使用不限定本發明，除了如申請專利範圍中所概述的。
認為細菌生物膜形成在BAI之發病機制中起主要作用。其藉由細菌黏附於醫療裝置之表面起始，隨後細胞複製且產生由細菌、細菌胞外多醣、蛋白質、細胞外DNA及宿主蛋白組成之細胞外基質。與浮游對應物相比，生物膜中之細菌對抗生素耐受性更大且對人類免疫防禦系統之細胞及分子的敏感性更小。此等代謝非活性及抗生素耐受性細菌甚至能夠在抗生素治療之後增殖，其引起BAI復發。
抗微生物肽(AMP)為動物、植物及微生物之先天防禦之效應分子。其呈現針對對抗生素具有抗性且存在於生物膜內之細菌的抗微生物活性。AMP大多為呈現針對細菌、真菌及包膜病毒之廣譜抗微生物活性之兩性及陽離子肽。本文所述的AMP包括但不限於α-螺旋、β-股及捲曲肽。AMP之實例包括但不限於SEQ ID No: 1至23。在AMP中，抗微生物肽SEQ ID NO: 2、3、4、19及20為具有抗微生物活性之新穎肽。AMP之某些實例為SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 23之肽或其中任何兩者或更多者之混合物。
一或多種AMP可用於本發明。某些實例為AMP對。AMP對為肽衍生抗生素與SEQ ID No: 1至23之肽中之任一者的組合。肽衍生抗生素之實例包括但不限於多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素。在一些實施例中，AMP對為多黏菌素B、多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素中之任一者與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18之肽中之任一者的組合。在一些實施例中，AMP對為SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:3組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:14組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:15組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:16組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:20組合、SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:16組合或SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:18組合。
在本發明中，AMP溶解於陰離子界面活性劑中。在一個實施例中，AMP的量在約0.01% (w/v)至約0.1% (w/v)範圍內。乳液中之AMP附著至生物材料表面上。在一個實施例中，在一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於陰離子界面活性劑中之後，一或多種AMP形成小囊泡樣結構。
塗覆本發明之一或多種AMP的某一實例為兩階段塗覆。一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於含有比0.002% (w/v)低的濃度之陰離子界面活性劑的緩衝液中以形成第一溶液(溶液(a))。將所得第一溶液添加至含有比0.02% (w/v)高的濃度之陰離子界面活性劑之緩衝液中至溶液(a)中以形成第二溶液(溶液(b))。含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量等於含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量。隨後，將所得第二溶液塗覆於材料表面上，使得AMP附著於表面上。在一個實施例中，含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之AMP的量在約0.002% (w/v)至約0.02% (w/v)範圍內。在一些實施例中，含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之AMP的量在0.02% (w/v)至約0.6% (w/v)範圍內。
AMP用於塗覆於各種類型的生物材料的表面上。塗層可延長AMP體內半衰期且減少副作用。重要的是，在設計預防策略時，需要考慮細菌在植入物上形成生物膜及細菌在植入物周邊組織中定殖兩者。AMP可塗覆於多種基材上，諸如金屬、陶瓷、聚合物、纖維及惰性材料。適合之金屬材料包括金屬、基於鈦之合金、不鏽鋼及鎳鉻合金。適合之聚合材料包括但不限於聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)及聚胺基甲酸酯(PU)。此等基材可呈以下形式或形成以下之一部分：膜、粒子(奈米粒子、微米粒子、珠粒)、纖維(傷口敷料、繃帶、膠布、墊、海綿)、導管、支架、隱形眼鏡、骨植入物、在體內或與身體接觸使用之其他手術及牙科儀器及/或醫療裝置。
在一個實例中，AMP粒子在人類尿液中保持結合於聚苯乙烯至少14天且在牛血清中保持4天。聚苯乙烯/聚矽氧上之剩餘AMP及尿液/血清中之釋放AMP均為針對大腸桿菌及綠膿桿菌PAO1之殺細菌劑。所塗覆AMP亦對人類尿液中綠膿桿菌27853之生物膜形成具抑制性。
無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可基於本文中之揭示內容最大程度地利用本發明。因此，以下特定實例應理解為僅描述，而不以任何方式限制本發明之其餘部分。實例
材料及方法
塗覆材料
界面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)及十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)分別購自Bio-Rad (Hercules, CA, USA)及Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)。辛基硫酸鈉(SOS)及1-癸烷磺酸鈉(SDSn)購自Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)。基於聚苯乙烯之96孔非組織培養微量盤獲自Corning Inc. (NY, USA)。聚矽氧獲自Momentive Company (Tokyo, Japan)。聚胺基甲酸酯(PU)係由Pacific Hospital Supply Co. (Taipei, Taiwan)友情提供。鈦係受China Steel Corporation (Kaohsiung, Taiwan)之Si-Ron Chen博士惠贈。
包括RR12、RRIKA、SAAP159、SMAP29、SMAP28-3+2、T9W、T18,19K及TP4-A12,15I之抗微生物肽(AMP)的胺基酸序列列於表S1中。其由Kelowna International Scientific Inc. (Taipei, Taiwan)合成，具有95%純度且其分子質量藉由質譜分析驗證。 表S1. 抗微生物肽之胺基酸序列
抗微生物肽 序列 [ 參考 ]
L-BMAP27 GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG-OH
D-BMAP27 GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG-OH (全部呈D形式)
CAME-T18K,T19K KWKLFKKIGIGAVLKVLKKG-NH2
CAME-A12K,K15H KWKLFKKIGIGKVLHVLTTG-NH2
CAP18 GLRKRLRKFRNKIKEKIKKIGQKIQGLLPKLAPRTDY-OH
點帶石斑魚素-1 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV-OH
GW-Q6 GIKIAKKAITIAKKIAKIYW-OH
NLF20 H-NLFRKLTHRLFRRNFGYTLR-OH
NRC12 H-GWKKWFNRAKKVGKTVGGLAVDHYL-NH2
傑克跳蟻素-1 GLGSVFGRLARILGRVIPKV-NH2
美洲擬鰈素 GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL-NH2
RR12 H-RRLIRLILRLLR-NH2
RRIKA H-WLRRIKAWLRRIKA-OH
SAAP159 LKRLYKRVFRLLKRYYGQLRRPVR-OH
SMAP29 RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG-NH2
SMAP28-3 RGLRRLGRKIVHVVKKYLPTVLRIIRIA-NH2
SMAP28-3+2 RGLRRLGRKIVHVVKKYLPTVLRIIRRL-NH2
T9F RFRRLRKKFRKRLKKI-NH2
T9W RFRRLRKKWRKRLKKI-NH2
TP4(雜交條紋鱸魚素4 (Piscidins 4)) H-FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH
T18,19K KWKLFKKIGIGAVLKVLKKG-NH2
TP4-A12,151 H-FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH
抗微生物肽 序列
RR12
Figure 02_image001
RRIKA
Figure 02_image003
SAAP159
Figure 02_image005
SMAP29
Figure 02_image007
SMAP28-3+2
Figure 02_image009
T9W
Figure 02_image011
T18,19K
Figure 02_image013
TP4-A12,15I
Figure 02_image015
基於聚苯乙烯之96孔非組織培養微量盤獲自Corning Inc. (NY, USA)。蓋板玻璃(圓形，5×0.125 mm)獲自Assistant Company (Sondheim, Germany)。聚矽氧獲自Momentive Company (Tokyo, Japan)。鋁、301號不鏽鋼、乳膠(6×1 mm)及聚丙烯碳酸酯(PPC，6×1 mm)係由Shineteh Instruments Co. (Taipei, Taiwan)友情提供。聚氯乙烯(PVC)及聚胺基甲酸酯(PU)係由Pacific Hospital Supply Co. (Taipei, Taiwan)友情提供。鈦係受China Steel Corporation (Kaohsiung, Taiwan)之Si-Ron Chen博士惠贈。
AMP 塗覆於生物材料盤片上
所有生物材料藉由直徑6.0 mm之打孔器成形為圓形盤片，且置放於96孔基於聚苯乙烯之微量盤中以進行塗覆。將包括AMP及抗生素之抗微生物劑溶解於含有各種濃度之界面活性劑之磷酸鈉緩衝液(10 mM，pH 7.4)中且裝載至含有生物材料盤片之96孔微量盤之各別孔中。將1×界面活性劑(1×SDS或SDBS)定義為溶解於磷酸鹽緩衝液(10 mM磷酸鈉，pH 7.4)中之0.075%%界面活性劑(w/v)。如下文所描述進行及命名各種塗覆方法。
首先，1 步方法 ：將8或24 μg抗微生物劑溶解於60 μl界面活性劑中(在指定濃度下)。將抗微生物劑裝載至含盤片微量盤之各別孔中且保持隔夜以進行塗覆。隨後自微量盤移出溶液且將乾燥微量盤保持在室溫下直至使用為止。
第二，2 步方法 ：將8或24 μg抗微生物劑溶解於30 μl界面活性劑中(如所指示低濃度下)且裝載至含盤片微量盤之各別孔中。將無抗微生物劑之另一30 μl界面活性劑(在較高濃度下)添加至上文所提及之含抗微生物劑溶液中且保持隔夜以進行塗覆。隨後自微量盤移出溶液且將乾燥微量盤保持在室溫下直至使用為止。
第三，PXB-AMP 混合塗覆方法 ：如所指示在較低濃度下，將PXB-AMP混合物(16 μg，各8 μg)溶解於30 μl界面活性劑中。將無抗微生物劑之另一30 μl界面活性劑(在較高濃度下)添加且裝載至如上文所提及置放於微量盤中之盤片上。
利用顯微鏡法及 SDS-PAGE 檢測所塗覆 AMP 之穩定性
所塗覆抗微生物劑之微量盤在人類尿液或10至50% FBS中，於不同時間間隔，以下列兩者分析其型態與穩定性：以配備有TrueChrome IIs相機(Tucsen, China)之Nikon TMS-F相位差倒置式顯微鏡(Tokyo, Japan)進行顯微鏡觀察，以及將其溶解於負載緩衝液(，且在將塗層溶解於SDS加樣緩2% SDS、10%甘油、5% 2-巰基乙醇、0.01%溴酚藍、125 mM Tris-HCl，pH 6.8)中之後利用15% SDS-PAGE分析。在七天尿液培育之後，以SDS/SDBS將AMP塗覆於微量盤於37℃及60℃處理4週，以顯微鏡觀察及SDS-PAGE檢測AMP之熱穩定性利用。以SDS/SDBS將AMP塗覆於微量盤於55℃下環氧乙烷(500 ppm)中滅菌6小時，以SDS-PAGE檢測AMP之穩定性。關於非透明生物材料，諸如聚矽氧、聚胺基甲酸酯及鈦，僅進行SDS-PAGE分析。
利用顯微鏡法及 SDS-PAGE 檢測之所塗覆抗微生物劑之形態及穩定性
所塗覆抗微生物劑在人類尿液或10%胎牛血清(FBS)中之形態及穩定性，在不同時間間隔下，藉由使用配備有TrueChrome IIs相機(Tucsen, China)之Nikon TMS-F相位差倒置式顯微鏡(Tokyo, Japan)顯微觀測進行分析，以及在將抗微生物劑溶解於加樣緩衝液(2% SDS、10%甘油、5% 2-巰基乙醇、0.01%溴酚藍、125 mM Tris-HCl，pH 6.8)中之後利用15%還原SDS-PAGE分析。僅利用15%還原SDS-PAGE分析塗覆於其他基材(諸如聚矽氧及鈦)上之抗微生物劑在尿液或血清中之穩定性。
游離及塗覆 AMP 之抗微生物活性
細菌 . 自人類診所獲得之綠膿桿菌PAO1 (ATCC BAA-47TM)、大腸桿菌K-12 (MG1655)及大腸桿菌(ATCC 23502)在DifcoTM LB培養液/瓊脂(BD, New Jersey, USA)中/上培養。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) (ATCC 6538)在DifcoTM TSB培養液/瓊脂中/上培養。
抑制區 對於大腸桿菌(ATCC 23502)及綠膿桿菌(ATCC 27853)在37℃下在Luria-Bertani培養液中培養細菌且將細菌塗在Luria-Bertani瓊脂上。將金黃色葡萄球菌(ATCC 6538P)培養且塗於胰酶大豆培養液/瓊脂中/上。白色念珠菌(ATCC 14053)在30℃下於YM培養液/瓊脂中/上培養。將與100 μl隔夜培養之細菌混合之5 ml低熔點瓊脂(1%)展佈於1%常規瓊脂盤之上面。將2 μl各種濃度之抗微生物肽點置於含微生物瓊脂盤頂層上且培育隔夜以產生抑制區。
所塗覆抗微生物劑之殺細菌活性 . 將塗覆於置放於96孔微量盤之孔中的聚苯乙烯或聚矽氧盤片表面上之抗微生物劑使用經AS-IRB01-16070批准之方案在100 μl無菌人類尿液中，或在10%胎牛血清(含FBS之RPMI1640)中培育指示時間。每日更換尿液及血清。將100 μl微生物，諸如大腸桿菌K-12 (1.5×106 cfu/ml)、綠膿桿菌PAOI及金黃色葡萄球菌(3×106 cfu/ml)接種至瀝乾盤片/微量盤上且在37℃下培育1.5小時。在塗覆於各別瓊脂盤上之後，測定群落形成單位(cfu)。
所釋放抗微生物劑之殺細菌活性 . 將塗覆有抗微生物劑之盤片/微量盤在160 μl無菌人類尿液中或在10% FBS中培育。每日更換尿液及血清。將50 μl每日更換之尿液或血清與50 μl含有大腸桿菌K-12 (3×105 cfu/ml)或綠膿桿菌PAOI (1.5×105 cfu/ml)之懸浮液混合，且在37℃下培育1.5小時。在塗覆於各別瓊脂盤上之後，測定群落形成單位(cfu)。
最小抑制濃度 (MIC) 及最小殺細菌濃度 (MBC) 為了測定游離AMP之抗微生物效能，將兩倍連續稀釋AMP (10 μl)與90 μl細菌懸浮液(3×105 cfu/ml)混合於各別培養基(LB或TSB)中。隨後將懸浮AMP裝載於96孔微量盤之孔中且在37℃下在100 rpm溫和攪拌下培育隔夜。藉由SpectraMax 190微量盤讀取器在600 nm下量測吸光度。在塗覆於瓊脂盤上之後計數混合物中之剩餘cfu。最小抑制濃度(MIC)定義為保持溶液具有與無細菌之培養基相同的吸光度之最低AMP濃度。最小殺細菌濃度(MBC)定義為能夠殺死99.99%接種微生物之最低AMP濃度(24)。或者，亦測定所塗覆AMP之MIC。簡言之，將經AMP塗覆之聚矽氧盤片浸入200 μl無菌人類尿液中或細胞培養基(RPMI 1640+10% FBS)中隔夜。將在兩倍連續稀釋之後的190 μl釋放之AMP/界面活性劑與10 μl大腸桿菌ATCC 23502以最終濃度3×105 cfu/ml於96孔微量盤中混合，且培育且測定如上文所提及之剩餘cfu。將游離形式AMP以及界面活性劑溶解於200 μl無菌培養基(細胞培養基或人類尿液)中且用作定量對照組。抗微生物活性之效能表示為達到MIC的稀釋倍數，其中無細菌在培養基中生長。進行至少三個獨立實驗以測定該值。
藉由抑制區及最小抑制濃度方法定量所釋放抗微生物劑
抗微生物劑固定之聚矽氧盤片或微量盤在100 μl人類尿液中或在200 μl 10% FBS中培育。每日更換尿液及血清。置換2 μl之培育尿液或血清(含有釋放/游離SAAP159+PXB)或將其稀釋液點置於含微生物瓊脂盤之頂層上且在37℃下培育隔夜，其後進行生長抑制區之形成之評估。將指定量之混合抗微生物劑用作定量所釋放抗微生物劑之標準。能夠在瓊脂盤上形成可見抑制區之抗微生物劑混合物的量定義為一個抗微生物活性單元。舉例而言，分別在尿液中5 ng PXB+2.5 ng AMP (SAAP159)，且在血清中2.5 ng PXB+1.25 ng SAAP159。或者，為了進行最小抑制濃度(MIC)方法，在96孔微量盤之各別孔中，將190 μl游離抗微生物劑或釋放於血清或尿液(200 μl)中之抗微生物劑與10 μl微生物混合(1至30×105 cfu/ml)且在100 rpm溫和攪拌下培育隔夜。接著藉由SpectraMax 190微量盤讀取器測定在600 nm下之吸光度。測定最小抑制濃度(MIC)，其定義為能夠保持含細菌培養基之吸光度與僅培養基相同的(經稀釋)樣品血清或尿液之濃度。亦測定抗微生物活性之效能，其定義為達成MIC之含抗微生物劑之尿液或血清的稀釋倍數。
所塗覆 AMP 之抗微生物活性
使用經AS-IRB01-16070批准之方案，將塗覆有AMP或用AMP塗覆之聚矽氧盤片改造的96孔微量盤浸沒於100 μl無菌人類尿液中或浸沒於溶解於RPMI1640中之10% FBS中，其中每日更換。將100 μl大腸桿菌ATCC 23502 (2×105 cfu/ml)接種至瀝乾盤片/微量盤上且在37℃下培育三小時，隨後塗覆於瓊脂盤上。
細菌黏附性
藉由2步SDS或SDBS塗覆方法，將成對AMP塗覆於聚矽氧盤片之兩側。在與尿液一起培育之後，將此等盤片浸沒於含有270 μl綠膿桿菌27853 (2×107 cfu/ml)的96孔微量盤中，且在37℃下在150 rpm溫和振盪下培育三小時以使細菌黏附。細菌固定盤片藉由700 μl PBS洗滌三次，且隨後以音波處理兩分鐘以使細菌自盤片分散。在塗覆於瓊脂盤上之後計數溶液中之細菌。無AMP塗覆之聚矽氧盤片充當對照組。在各實驗中進行具有三個盤片之至少三個獨立實驗以測定平均值。
溶血性分析
遵循經IACUC中央研究院(IACUC Academia Sinica)批准之方案(AS-IUCUC-19-01-1277)收集新鮮小鼠血液。將血球球粒化且用含10% FBS之RPMI1640沖洗三次，並再懸浮於相同緩衝液中。隨後將紅血球(1.5×107 個細胞)添加至含有游離雙AMP/界面活性劑或自聚矽氧盤片隔夜釋放之組分之溶液中(200 µl)，且在37℃下培育一小時。將離心之後的上澄液(150 μl)轉移至96孔盤，以藉由SpectraMax 190微量盤讀取器(Molecular Devices, CA, USA)在414 nm下量測釋放之血紅素之吸光度。使用下式計算溶血百分比：溶血%=[(A414樣品 −A414培養基 )/(A4140.1% Triton-X 100 −A414培養基 )]。分別在培養基及0.1% Triton-X 100中測定零及100%溶血。
細胞毒性分析
人類膀胱癌細胞株(NTUB1)由Te-Chang Lee博士(Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taipei, Taiwan)友情提供。胎牛血清(FBS)及RPMI1640購自ThermoFisher Scientific Inc (Waltham, Massachusetts, USA)。在5% CO2 氛圍下，在含有10% FBS、100 U/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之RPMI1640中將NTUB1細胞維持在37℃下之含濕氣培育箱中。將NTUB1細胞以1.5×104 個細胞/100 µl之密度接種在96孔盤之各別孔中24小時。將細胞進一步在200 µl游離抗微生物劑/界面活性劑或隔夜培育之後自聚矽氧盤片釋放之組分中培育。20小時培育之後，向瀝乾孔中添加90 µl之新鮮培養基及10 µl之WST-1試劑(Roche, Basel, Switzerland)且培育2小時，隨後藉由SpectraMax 190微量盤讀取器在450 nm下量測吸光度。使用下式測定細胞毒性百分比：細胞毒性%=[(A450樣品 −A450陽性對照組 )/(A450陰性對照組 −A450陽性對照組 )]。陽性對照組為僅NTUB1細胞，而陰性對照組為無細胞之培養基。
小鼠模型
塗覆聚矽氧管道 取得具有0.3 mm (內徑[i.d.])及0.64 mm(外徑[o.d.])規格之聚矽氧管道，且將此管道之4 mm區段用作小鼠模型中之植入物。藉由兩步方法製備具有成對AMP之聚矽氧管道之塗層，隨後在使用之前切成4 mm區段。自靜脈內導管暫時移除導管之針頭部分，且使用無菌刀自導管之頂端切下4 mm部分。接著將經塗覆或未經塗覆之聚矽氧管道之4 mm區段組裝至原始針頭上。
在小鼠膀胱中植入聚矽氧管道 使用中央研究院批准之方案(AS-IUCUC-19-01-1277)，用含有替來他明(Tiletamine)及唑拉西泮(Zolazepam) (VIRVAC, France)之Zoletil® 麻醉八至10週齡的ICR雌性小鼠。安裝在原始針頭上之經修改24G導管斜邊朝前剛好在恥骨上方以30度角定位。當針小心地插入至膀胱中時，移除針，同時『推動器』略微向內推動。此使短導管區段移置至膀胱之內腔中，使得一旦移除『推動器』，僅有植入之4 mm聚矽氧管道保留在小鼠膀胱內部。在導管植入之後，將100 μl之大腸桿菌23502 (5×109 cfu/ml)或綠膿桿菌27853 (3×109 cfu/ml)注入膀胱內腔中。使用代謝籠每兩天收集尿液且定量活細菌數目。在滴注後第八天處死小鼠。收集留置管道，用200 μl無菌PBS沖洗且浸沒於200 μl新鮮PBS中，隨後在超音波水浴中以50/60 Hz音波處理10分鐘以分散生物膜。在連續稀釋且鋪塗於瓊脂盤上之後測定細菌數目。另外，亦在均質化之後在500 μl PBS中量測膀胱中之細菌定殖。
統計分析
對於所有活體外抗微生物分析，具有標準誤差之平均值係自至少三個獨立實驗測定。為了測定尿液中之細菌生長及小鼠模型中對膀胱及聚矽氧管道之細菌黏附性，針對成對比較進行一系列威爾科克森秩和測試(Wilcoxon rank sum test)以確定對照組未經塗覆之管道與實驗抗微生物劑塗覆之管道之間的量測值中發現之差值的顯著性。將P ＜0.05視為在統計學上顯著的。實例 1 藉由陰離子界面活性劑塗覆抗微生物肽
抗微生物肽SMAP29迅速溶解於水性溶液中，然而若添加陰離子界面活性劑，諸如十二烷基肌胺酸鈉或SDS，則其聚集，從而得到混濁的溶液外觀(資料未示出)。此亦顯示於SDS PAGE中，其中分別在1×Sar或1×SDS的0.075% (w/v)十二烷基肌胺酸鈉或SDS存在下，或在較低界面活性劑濃度下離心之後，指示濃度(8μ g，24 μg/60μ l)之SMAP29肽沈澱至試管底部(圖1A-圖1B)。在1/64×至16× SDBS之較廣濃度範圍下，類似陰離子界面活性劑SDBS中AMP TP4亦沈澱(圖1C)。
在所指示濃度之十二烷基肌胺酸鈉或SDS存在下，SMAP29肽在基於聚苯乙烯之96孔微量盤上形成直徑在1至10 μm範圍內之小囊泡樣結構(「囊泡」)(圖2A、圖2C，頂圖)。為測定此等AMP囊泡在體液中是否穩定，在尿液中三日培育期(每日更換新鮮尿液)之後首先在光學顯微鏡下檢查其形態，且隨後利用SDS-PAGE分析。在三日培育期之後，利用SDS塗覆之SMAP29囊泡保留在微量盤上。然而，藉由十二烷基肌胺酸鈉塗覆之囊泡消失，儘管其具有類似的塗覆效率(圖2B、圖2D)。TP4肽亦利用各別指示濃度之其他陰離子界面活性劑，亦即SDBS、SOS及SDSn有效塗覆於微量盤上。僅利用SDBS塗覆的TP4肽，而非藉由SOS或SDSn塗覆的肽，在一天培育期之後在尿液中穩定(圖2E-圖2F)。
實例 2 利用 SDS 塗覆於生物材料上之抗微生物劑之類型
以顯微鏡觀察，發現利用SDS可將SMAP-29衍生肽(SMAP-28-3，SMAP28-3+2)、SAAP159、TP4及BMAP27之L形式及D形式(分別稱為L-BMAP27及D-BMAP27)成功地塗覆至微量盤上，且在人類尿液中保持穩定至少三天。然而，T9W及脂肽抗生素，諸如多黏菌素B (PXB)，在添加包括SDS之界面活性劑之後立即聚集，但以受測的SDS濃度(1/16×-32×)，無法均勻地分散及塗覆於基材上。
實例 3 AMP 與抗生素之組合塗覆
以兩步塗覆方法改良塗覆效率 由於 高肽濃度下添加界面活性劑之後一些AMP聚集且不能均勻且穩固地附著於微量盤，所以吾人研發出一種兩步塗覆方案以避開該問題。結果呈現，SMAP29肽在第3天及第7天，藉由一步塗覆方法(24 μg於1/8× SDS緩衝液中)之塗覆效率及尿液穩定性比兩步塗覆方法(24 μg於第一1/16× SDS緩衝液中，接著與第二1/2× SDS緩衝液混合)低得多(圖3)。
AMP 與其他抗生素 為了增加抗微生物功效及擴增所塗覆抗微生物劑之抗微生物譜，將AMP與抗生素之組合同時塗覆於同一基材上。藉由2步SDS塗覆方法將SAAP159與多黏菌素B (PXB)或多黏菌素E (PXE)的組合塗覆至微量盤上。如在顯微鏡下所觀測，由PXB-SAAP159及PXE-SAAP159對發揮的囊泡在尿液中穩定超過四天(圖4A)。利用SDS-PAGE分析，發現SAAP159-PXB之個別SAAP159及PXB在尿液中穩定。然而，發現PXE-SAAP159中之PXE在四天尿液處理之後釋出(圖4B)。有趣的是，PXB亦增加SAAP159在尿液中之穩定性，但單獨SAAP159及SAAP159-PXB混合物之塗覆效率類似(圖4C)。亦可將胺基醣苷抗生素健他黴素與T9W、SMAP29及SAAP159中之任一者之組合塗覆於基材上。不幸地，此等組合對尿液處理敏感，因為健他黴素在兩天培育之後釋放至尿液中(圖4D)。
PXB 與其他 AMP 除上文所提及之混合塗覆之PXB-AMP對以外，亦成功地以所指示SDS濃度將以下AMP與PXB組合塗覆至基材上，該等AMP包括RR12、NRC12、美洲擬鰈素、點帶石斑魚素-1、傑克跳蟻素-1、TP4、GW-Q6及RRIKA。此外，SDS-PAGE展示其在尿液中穩定7至14天且在血清中穩定2至3天。
其他界面活性劑 除SDS之外，當用於溶解抗微生物劑時，以下界面活性劑(包括SDBS、十二烷基肌胺酸鈉、SDSn及SOS)亦能夠成功地將PXB+SAAP159及PXB+TP4對塗覆至微量盤上。但僅使用SDBS及十二烷基肌胺酸鈉以及SDS塗覆之彼等對在尿液中保持穩定兩天，而使用SDSn及SOS塗覆之彼等對在相同條件下不穩定(圖5A-圖5B)。
其他生物材料 除聚苯乙烯以外，PXB-SAAP159對亦可成功地塗覆至聚矽氧、玻璃及鋁盤片上。此等抗微生物劑在血清中亦保持穩定兩至三天，如圖6A中所示。此外，PXB-SAAP159對亦成功地塗覆至聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯碳酸酯(PPC)、乳膠、不鏽鋼、鈦及聚胺基甲酸酯(PU)之盤片上，且在10%血清中保持穩定兩至三天(圖6B)。因為聚矽氧廣泛用於醫療裝置，包括中央靜脈導管及泌尿導管中，所以利用SDS-PAGE檢查PXB與AMP (CAME-T18K,T19K、CAME-A12K,K15H、T9W、T9F、RRIKA、NLF20及CAP18)組合在聚矽氧上的塗覆效率及其在血清/尿液中的穩定性。鈦或鈦合金一般亦用於假體裝置中。因此，亦將AMP (CAME-T18K,T19K、CAME-A12K,K15H、T9W、T9F、RRIKA、SMAP29、CAP18及SAAP159)與PXB組合塗覆於鈦盤片上且在血清中保持穩定三至四天。
熱穩定性 為監測可歸因於藉由環氧乙烷進行之醫療裝置之滅菌過程或可在微量盤之運輸期間出現的對經塗覆之PXB-AMP的潛在損壞，在60℃隔夜培育之後檢查塗覆於微量盤上之PXB-SAAP159的穩定性。對於抗微生物劑於水中及尿液中之穩定性持續至少14天且在血清中持續至少三天，未發現顯著變化。此外，在60℃下培育四週之後，亦發現PXB-SAAP159在尿液中保持穩定至少七天。
實例 4 塗覆於聚苯乙烯及聚矽氧上之 AMP-PXB 對的殺細菌活性
塗覆於聚苯乙烯微量盤上之13種AMP-PXB對甚至在14天尿液培育(每日更換新鮮尿液)之後，仍具有針對大腸桿菌之完全殺細菌活性。此等抗微生物劑在三天10%血清培育之後亦展現針對綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌之強力殺細菌活性(表1)。在塗覆於聚矽氧盤片上之AMP-PXB對的情況下，選擇用於測試之七對中之四對甚至在14天尿液培育之後仍具有針對大腸桿菌K-12之完全殺細菌活性(表2)。 表1. 塗覆於聚苯乙烯上之PXB+AMP的殺細菌活性
AMP 界面活性劑SDS (×) 大腸桿菌K-12    綠膿桿菌PAO1    金黃色葡萄球菌
尿液    10%血清
7天 14天    1天 2天 3天    1天 2天 3天
PXB+SMAP29 1/16+1/2 0 0    0 0 1    0 1 8
PXB+SMAP28-3 1/10+1 0 0    0 0 0    0 0 2
PXB+SMAP28-3+2 1/4+1/3 0 0    0 0 0    0 0 3
PXB+BMAP27 1/10+1/2 0 1    0 0 0    0 0 4
PXB+SAAP159 1/16+1 0 0    0 0 0    0 0 0
PXB+TP4 1/16+1 0 0    0 0 0    0 0 0
PXB+RR12 1/8+1 0 0    0 0 0    0 1 1
PXB+NRC12 1/8+1 0 0    0 0 0    1 1 1
PXB+美洲擬鰈素 1/8+1 0 0    0 0 0    0 0 0
PXB+點帶石斑魚素-1 1/8+1 0 0    0 0 0    1 1 1
PXB+傑克跳蟻素-1 1/16+1 0 0    0 0 0    0 1 1
PXB+GW-Q6 1/16+1 0 0    0 0 0    0 0 3
PXB+RRIKA 1/8+1 0 0    0 0 0    0 6 5
值表示與陽性對照組(無AMP-PXB塗覆)中發現之群落形成單位(cfu)相比，剩餘的cfu之百分比(%)。 表2. 塗覆於聚矽氧盤片上之PXB+AMP針對大腸桿菌之殺細菌活性
AMP 界面活性劑 SDS (×) 大腸桿菌K-12
尿液
7天 14天
PXB+SMAP29 1/16+1/2 0 7
PXB+SMAP28-3 1/10+1 0 20
PXB+SMAP28-3+2 1/4+1/3 0 0
PXB+BMAP27 1/10+1/2 0 8
PXB+SAAP159 1/16+1 0 0
PXB+美洲擬鰈素 1/8+1 0 0
PXB+RRIKA 1/8+1 0 0
值表示與陽性對照組(無AMP-PXB塗覆)中發現之群落形成單位(cfu)相比，剩餘的cfu之百分比(%)。
實例 5 在尿液及血清中釋放的 AMP-PXB 對的殺細菌活性
測試取自自八組PXB/AMP對(塗覆於聚苯乙烯上)每日尿液/血清更換期間的尿液及血清樣品之抗微生物活性。藉由計算接種後七及14天接種之微生物之存活率來測定抗微生物活性且其表現為與陽性對照組(無AMP-PXB塗覆)中發現之群落形成單位(cfu)相比，剩餘的cfu之百分比。結果展示一些所塗覆抗微生物劑可隨時間推移不斷地釋放至尿液中且展現針對大腸桿菌之殺細菌活性持續至少八至九天(表3)。此外，此等抗微生物劑亦可釋放至10%血清中且展現針對綠膿桿菌之殺細菌活性持續至少兩至三天(表4)。 表3. 自聚苯乙烯基材釋放至尿液中的PXB+AMP之針對大腸桿菌的殺細菌活性*
AMP 大腸桿菌K-12
第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天
PXB+SMAP29 0 0 0 0 32 100 90 91 100
PXB+SMAP28-3 0 0 0 0 0 0 0 0 22
PXB+SMAP28-3+2 0 0 0 0 26 68 100 90 100
PXB+SAAP159 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PXB+NRC12 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PXB+美洲擬鰈素 0 0 0 0 0 0 1 100 50
PXB+GW-Q6 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PXB+RRIKA 0 0 0 0 0 0 0 0 12
值表示與陽性對照組(無AMP-PXB塗覆)中發現之群落形成單位(cfu)相比，剩餘的cfu之百分比(%)。 *將PXB+AMP塗覆於96孔盤中且與160 µl尿液一起培育。且來自每日更換之尿液的50 µl用於分析。 表4. 自聚苯乙烯基材釋放至血清中的PXB+AMP之針對綠膿桿菌的殺細菌活性*
AMP 綠膿桿菌PAO1
第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
PXB+SMAP29 0 0 36 69 81
PXB+SMAP28-3 0 0 0 77 78
PXB+SMAP28-3+2 0 0 86 100 84
PXB+SAAP159 0 0 0 88 93
PXB+NRC12 0 0 0 61 92
PXB+美洲擬鰈素 0 0 45 55 78
PXB+GW-Q6 0 0 26 69 92
PXB+RRIKA 0 0 0 60 74
值表示與陽性對照組(無AMP-PXB塗覆)中發現之群落形成單位(cfu)相比，剩餘的cfu之百分比(%)。 *將PXB+AMP塗覆於96孔盤中且與160 µl尿液一起培育。且來自每日更換之尿液的50 µl用於分析。
實例 6 藉由抑制區分析定量釋放至尿液及血清中的 AMP-PXB 對
藉由量測形成之抑制區之直徑來半定量自聚矽氧盤片釋放至尿液或10%血清中之PXB/SAAP159的殺細菌活性。簡言之，將獲自每日更換之尿液(100 μl)/血清(200 μl)的2 μl樣品點置於含有大腸桿菌之LB瓊脂盤上。藉由比較由於具有已知量之PXB/SAAP159的抗微生物劑形成之可見抑制區之直徑來測定殺細菌活性。結果展現塗覆於聚矽氧上之SAAP159/PXB對不斷地釋放至尿液中持續至少九天(圖7A)。關於抗微生物劑進入10%血清中之釋放速率，第一個兩小時間隔或第一天為最高的，隨後在下一時間間隔(每2小時或每天)中逐漸降低(圖7B)。同時，抗微生物劑展示前八小時釋放且積聚於血清中。結論為所塗覆SAAP159/PXB日夜不斷地釋放至尿液中，且持續兩天釋放至血清中。
實例 7 塗覆於聚矽氧盤片上之 AMP/PXB 的細胞毒性及溶血性活性
為了鑑別自所塗覆抗微生物劑釋放且負責細胞毒性及溶血性活性之一或多種關鍵組分，檢查抗微生物劑之塗覆中所涉及之個別組分，亦即SDS、PXB及SAAP159。若全部量之SDS (30 μl之1/8×SDS加30 μl之1×SDS)塗覆至基材(直徑為5.8 mm)上且隨後亦完全釋放至血清中，則最大量之SDS將為25 μg。200 μl中25 μg SDS對NTUB1細胞的細胞毒性為99%，而若對於分析採用總量之一半，則此活性降低至35% (圖8)。呈游離形式之抗微生物劑之總量(8 μg SAAP159+16 μg PXB於200 μl中)並未展現任何顯著細胞毒性(圖7)。抗微生物劑與SDS之組合(8 μg SAAP159+16 μg PXB+25 μg SDS於200 μl中)與單獨25 μg SDS相比發揮更高細胞毒性(圖7)。然而，血清(200 µl)中隔夜釋放的組分，包括SAAP159、PXB及SDS展現比單獨游離SDS更低的針對NTUB1膀胱細胞之細胞毒性(圖8)。細胞毒性及溶血性活性之效能藉由連續兩倍稀釋定量且表示為稀釋倍數(圖7)。＜LC10 定義為在隔夜培育之後引起對NTUB1膀胱細胞之細胞毒性小於10%之試劑濃度。舉例而言，在4倍稀釋之後，游離SAAP159/PXB/SDS發揮＜10%細胞毒性(表5)。類似地，亦藉由2倍連續稀釋測定200 µl血清或尿液中之游離或釋放組分之殺細菌活性之效能以用於細菌生長之抑制，測定為最小抑制濃度(MIC)。舉例而言，游離三重組分(SAAP159/PXB/SDS)分別在稀釋512倍及128倍之後在血清及尿液中達到針對大腸桿菌之MIC。所釋放抗微生物劑在血清及尿液中之殺細菌活性之效能分別為128倍及16倍(表5)。 表5. PXB+AMP自聚矽氧盤片釋放的效能且以稀釋倍數(×)表示.
AMP 效能(×)
對NTUB1之細胞毒性*3    RBC之溶血作用    對大腸桿菌之MIC*4
IC50    HC50    血清 尿液
游離形式*1                  
16 μg PXB ＜1    ＜1    512 128
25 μg SDS 1-2    1-2    ＜1 ＜1
SAAP159/PXB ＜1    ＜1    512 128
SMAP29/PXB ＜1    ＜1    256 128
RRIKA/PXB ＜1    ＜1    512 128
                    
PXB/SDS 2-4    1-2    256 128
SAAP159/PXB/SDS 2-4    2-4    512 128
SMAP29/PXB/SDS 2-4    2-4    256 128
RRIKA/PXB/SDS 2-4    2-4    512 128
隔夜自聚矽氧釋放*2               
SAAP159/PXB/SDS 1-2    1-2    128 16
SMAP29/PXB/SDS ＜1    1-2    128 16
RRIKA/PXB/SDS 1-2    1-2    128 16
*1 1×游離抗微生物劑在200 µl中含有8 μg AMP、16 μg PXB及/或25 μg SDS。 *2 所釋放之抗微生物劑獲自血清或尿液(200 µl)，其中抗微生物劑塗覆之聚矽氧盤片浸沒隔夜。*3 NTUB1細胞以1.5×104 個細胞/孔接種 *4 大腸桿菌(ATCC23502)以3×106 cfu/ml接種
實例 8 PXB-AMP 塗覆至聚矽氧管道上以預防小鼠中之泌尿道感染
在細菌滴注之後兩至八天，植入有未經塗覆之聚矽氧管道的小鼠之尿液中的大腸桿菌23502細菌生長保持恆定(平均2-4×105 cfu/ml)，而植入有PXB-SAAP159或PXB-RRIKA塗覆管道之小鼠大腸桿菌之存活率顯著降低(2-6×102 cfu/ml)。在均質化及音波處理之後，分別對黏附於膀胱及聚矽氧管道上之活細菌進行計數。對照組中在第八天處死之後黏附於膀胱上之細菌為5×103 cfu/膀胱，而發現PXB-SAAP159塗覆組及PXB-RRIKA塗覆組中之大腸桿菌分別為58 cfu/膀胱及零cfu。此外，黏附於未經塗覆之聚矽氧管道的細菌量為1.2×104 cfu/管道，而未發現細菌黏附於塗覆有PXB-SAAP159或PXB-RRIKA的管道(圖9)。此等結果展現使用SDS塗覆有PXB-AMP的聚矽氧管道可有效地抑制小鼠尿液中的細菌生長且亦防止細菌黏附於小鼠膀胱及植入的聚矽氧管道。實例 9 利用陰離子界面活性劑之抗微生物肽於聚苯乙烯上之囊泡形成及塗覆
抗微生物肽(AMP) T9W、SAAP159、RRIKA及T18,19K容易地溶解於水性溶液中，然而若以廣泛範圍的濃度添加陰離子界面活性劑(諸如SDS或SDBS)，則其在外觀上變得混濁。其存在於小囊泡樣結構(下文稱為囊泡)中且當利用兩步界面活性劑塗覆方法塗覆時，沈積於直徑在1至10 μm範圍內之基於聚苯乙烯之96孔微量盤上。0.075% (w/v)界面活性劑SDS及SDBS之濃度分別表示為1×SDS及1×SDBS。如圖10A-圖10B頂圖中所示，選擇此等AMP、T9W、SAAP159、RRIKA及T18,19K之囊泡形成之最佳條件。然而，其以不同速率逐漸溶解於人類尿液中。為了測定此等所塗覆AMP在尿液中之塗覆效率及相對穩定性，利用SDS加樣緩衝液溶解基材附著之AMP且利用SDS-PAGE分析。結果展示，利用SDS塗覆之SAAP159在尿液中穩定12天，T9W及T18,19K穩定6天。圖10C中展示利用SDS塗覆之RRIKA之結果。當利用SDBS塗覆時，此等AMP之塗覆效率及尿液穩定性類似於當利用SDS塗覆時之塗覆效率及尿液穩定性(圖10D)。此等結果與使用顯微法觀測到之結果呈良好一致性(圖10A-圖10B)。關於此等AMP在血清中之穩定性，SAAP159及T9W在利用SDS塗覆時穩定一至兩天，同時發現RRIKA及T18,19K不穩定。值得注意的是，當利用SDBS塗覆時，此等AMP相較於利用SDS塗覆之相同AMP在血清中更穩定(圖10E-圖10F)。另外，亦檢查利用SDBS塗覆的另外四種AMP的塗覆效率及血清穩定性。結果展示TP4衍生之肽TP4-A12,15I及RR12在10% FBS中穩定兩天，而SMAP29及其衍生肽SMAP28-3+2僅保持穩定一天(圖17)。實例 2 利用 SDS 及 SDBS 在聚苯乙烯上同時塗覆兩種 AMP
1. 利用 SDS 及十二烷基肌胺酸鈉在微量盤上塗覆 SMAP29 肽 及尿液中之穩定性
如上文所提及之個別AMP展現針對革蘭氏陰性(大腸桿菌23502，綠膿桿菌27853)、革蘭氏陽性(金黃色葡萄球菌)細菌及真菌(白色念珠菌)之不同抗微生物活性，如藉由瓊脂盤上之抑制區分析所測定(圖18)。SMAP29展現針對革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌的廣譜抗微生物活性。RR12抗革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌活性很大。T9W優先殺滅革蘭氏陰性綠膿桿菌27853。關於MIC方法，SMA29及RR12針對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌最有效(表S2)。為了擴寬所塗覆AMP之抗微生物活性譜且可能地增加其在尿液及血清中之塗覆效率及穩定性，吾人以不同組合同時在微量盤上塗覆兩種AMP。利用顯微法檢查此等AMP組合以評價在尿液(0、6、12天) (圖11A-圖11B)或10% FBS (0、2、3天)中培育的成對AMP囊泡之形態。利用SDS-PAGE分析，發現選定的AMP對(T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)有效塗覆且穩定地黏附至基材，即使在用每日更換之新鮮尿液進行12天尿液處理之後。值得注意的是，利用界面活性劑SDBS塗覆於聚苯乙烯微量盤上之T9W+SAAP159、T9W+RRIKA及T9W+T18,19K AMP對之個別AMP的穩定性相對高於利用SDS塗覆之穩定性(圖11C-圖11D)。類似地，利用界面活性劑SDBS塗覆之此等AMP對的個別AMP在10% FBS中具有比利用SDS塗覆之穩定性更高的穩定性(圖11E-圖11F)。另外，另外七種所選AMP對亦利用SDBS塗覆且在顯微鏡下(圖19A-圖19B)以及利用SDS-PAGE分析(圖19C-圖19D)檢查以評價其塗覆效率及穩定性。其中之四種(T9W與TP4-A12,15I、SMAP28-3+2及RR12配對，RR12與SAAP159配對)在10% FBS中保持穩定超過三天。 表S2. 個別AMP針對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌之MIC (μg/ml)及MBC (μg/ml).
AMP 大腸桿菌 23502 ； LB (3.5×105 cfu/ml) 金黃色葡萄球菌； TSB (4×105 cfu/ml)
   MIC MBC MIC MBC
T9W ＞512 ＞512 ＞512 ＞512
SAAP159 64 64 512 ＞512
RRIKA 128 128 64 128
T18,19K 64 64 ＞512 ＞512
RR12 4 4 4 4
TP4-A12,15I 32 32 32 32
SMAP29 4 4 4 4
SMAP28-3+2 4 8 32 32
實例 3 AMP 對塗覆至聚矽氧、聚胺基甲酸酯及鈦上
聚矽氧廣泛用於包括中央靜脈導管及泌尿導管之生物醫學裝置中，因此利用SDS或SDBS將AMP對塗覆至聚矽氧盤片上，且首先在顯微鏡下隨後利用SDS-PAGE分析檢查其在尿液及10% FBS中之塗覆效率及穩定性。在與每日更換之新鮮尿液一起尿液培育12天之後，利用SDS或SDBS塗覆的兩種所選AMP對(T9W+SAAP159、T9W+RRIKA)之個別AMP緊密地結合於基材(圖12A)。此外，利用SDS或SDBS塗覆的此兩種AMP對(T9W+SAAP159、T9W+RRIKA)之個別AMP在10% FBS中穩定三至四天(圖12B)。類似地，其他六種AMP對(T9W+TP4-A12,15I、T9W+SMAP29、T9W+SMAP28-3+2、T9W+RR12、RR12+SMAP29、RR12+SAAP159)在利用SDBS塗覆時亦緊密地結合於10% FBS中之基材持續四天(圖12C)。為了選擇FBS中之最穩定的AMP對，使其進一步經歷30%或50% FBS處理隔夜。T9W+SAAP159、T9W+SMAP28-3+2及T9W+TP4-A12,15I AMP對在FBS中發揮最高穩定性，隨後按降序為RR12+SAAP159、T9W+RRIKA、T9W+RR12、T9W+SMAP29及RR12+SMAP29 (圖13)。除如上文所提及之聚苯乙烯及聚矽氧基材以外，此兩種AMP對(T9W+SAAP159，T9W+RRIKA)亦利用SDBS成功地塗覆於聚胺基甲酸酯(PU)及鈦(Ti)盤片上，且在10% FBS中保持穩定三天(圖14A)或在培育隔夜之後在30%及50% FBS中保持穩定(圖14B)。此兩種基材亦廣泛用於生物醫學裝置中。實例 4 利用 SDS 及 SDBS 塗覆之 AMP 對之殺細菌活性
在用每日更換之新鮮尿液進行12天尿液處理之後，藉由兩步(1/8×+1/2×) SDS緩衝液塗覆於聚苯乙烯微量盤上之所選AMP對(T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)保持針對人類分離株大腸桿菌23502之強殺細菌活性(103 -104 倍降低)，而其殺細菌活性在10% FBS中持續僅一至兩天(表6)。相比之下，藉由兩步(1/8×+1×) SDBS緩衝液塗覆之此等AMP對即使在無尿液處理之情況下亦未發揮殺細菌活性(小於10倍降低)，因為即使在12天尿液處理之後其仍緊密地結合至基材，如圖11C-圖11D中所示。相比之下，其在10% FBS中對大腸桿菌23502的殺細菌活性持續兩天，其比相同AMP對在利用SDS塗覆時之殺細菌活性長。結果與保持於基材上之AMP的量恰好相關(圖11E-圖11F)，表明成對AMP之殺細菌活性由可自基材釋放之AMP的含量引起。 表6. 在尿液或10%血清處理之後塗覆於聚苯乙烯上之成對AMP針對大腸桿菌的殺細菌活性.
AMP 界面活性劑 (×) 大腸桿菌 23502 之細菌生長 (cfu/ml)*1
尿液 含 10% 血清之 RPMI
0天 3天 6天 12天 0天 1天 2天 3天
對照組*2    1.4×107 3.9×107 3.2×107 1.9×107 3.1×107 2.7×107 1.6×107 2.6×107
T9W/SAAP159 SDS (1/8+1/2) 0 0 1.0×102 3.0×103 0 8.7×103 3.9×103 1.0×107
T9W/RRIKA 0 0 1.0×102 2.6×104 0 2.0×102 1.7×105 1.8×107
T9W/SAAP159 SDBS (1/8+1) 2.0×106 n.d. n.d. n.d. 3.1×103 3.9×102 4.0×102 7.0×105
T9W/RRIKA 3.6×106 1.8×103 3.7×104 3.9×104 1.55×106
*1 大腸桿菌ATCC23502以2×105 cfu/ml接種。 *2 無塗覆之微量盤用作對照組。實例 5 細菌黏附之抑制
為了確定此方法在減少臨床中，尤其泌尿道中之生物材料相關感染中的潛在應用，評價細菌對作為人類導管之主要材料之聚矽氧的黏附性。利用SDS或SDBS塗覆之兩種AMP對(T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)，綠膿桿菌27853對聚矽氧盤片之黏附性顯著地降低(100倍降低)，甚至在與每日更換之新鮮尿液一起尿液培育14天之後(表7)。此等結果與保留在聚矽氧盤片上之AMP之量呈良好一致性(圖12A)。 表7. 在尿液處理之後聚矽氧盤片上成對AMP之針對綠膿桿菌27853之抗黏附活性.
AMP 界面活性劑(×) 黏附在聚矽氧盤片上之細菌(cfu/盤片)*
用尿液預處理
0天 3天 7天 10天 14天
對照組    3.5×105 3.5×105 4.1×105 7.9×105 3.5×105
T9W/SAAP159 SDS (1/8+1/2) 7×101 1.3×102 6.7×103 1.8×103 4.8×103
T9W/RRIKA 0 5.1×102 4.2×102 2.3×103 2.6×103
T9W/SAAP159 SDBS (1/8+1) 3.4×102 4.6×102 2.3×103 5.6×102 1.8×103
T9W/RRIKA 3.7×102 2×101 7.4×102 8×101 4.7×103
*1 大腸桿菌ATCC23502以2×105 cfu/ml接種。 *2 無塗覆之微量盤用作對照組。實例 6 塗覆於聚矽氧盤片上之成對 AMP 之細胞毒性、溶血性及殺細菌活性
可塗覆於聚矽氧盤片兩側上且釋放至溶液中之界面活性劑之最大量對於SDS為14 μg且對於SDBS為25 μg/盤片。在200 μl分析培養基中，濃度至多此最大量之SDS及SDBS並未對尿液或10% FBS中之大腸桿菌23502發揮殺細菌活性，且SDS (14 μg)僅展現對人類膀胱細胞(NTUB1)之低細胞毒性及對小鼠紅血球之溶血性活性(圖20a)。類似地，可塗覆至聚矽氧盤片上且釋放至血清/尿液中的所選AMP對(T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)之最大量總共為24 μg，對於各AMP為12 μg及12 μg。此等AMP在血清(對於MIC八倍稀釋)中展現針對大腸桿菌23502之顯著殺細菌活性，但在尿液中無活性。此等AMP亦展現極低細胞毒性及溶血性活性。
對於上文所提及之界面活性劑SDS及可塗覆至聚矽氧盤片兩側上且以游離形式釋放之成對AMP之組合，其發揮在尿液(對於MIC兩倍至四倍稀釋)或血清(對於MIC八倍稀釋)中之顯著殺細菌活性。此等SDS及成對AMP仍展現低細胞毒性(對於IC50 一倍至兩倍稀釋)及溶血性活性(對於IC50 一倍至兩倍稀釋) (圖15A-a,c)。有趣的是，組合之SDBS及成對AMP在血清(對於MIC八倍稀釋)中展現顯著殺細菌活性，但在尿液中無活性(圖15B-a,c)。關於界面活性劑(SDS或SDBS)及隔夜自聚矽氧盤片釋放至血清或尿液中之成對AMP，此等組合僅展現尿液中無殺細菌活性及低細胞毒性及/或溶血性活性。然而，其在血清中發揮顯著殺細菌活性(對於MIC兩倍稀釋) (圖15A-b,d、圖15B-b,d)。
實例 7 在小鼠模型中藉由成對 AMP 預防泌尿道感染
在SDS存在下且植入於膀胱中時，藉由用T9W+SAAP159或T9W+RRIKA塗覆之聚矽氧管道，小鼠尿液中大腸桿菌23502之浮游生長未顯著降低(1-10×105 cfu/ml)。而植入有塗覆有T9W-SAAP159或T9W+RRIKA之聚矽氧管道之組，在界面活性劑SDBS存在下，在細菌滴注之後第八天，大腸桿菌23502之浮游生長分別顯著地減少兩倍及10倍(1-2×103 cfu/ml)。在SDS存在下，在對照組中且亦在塗覆有T9W-SAAP159或T9W-RRIKA之組中，黏附於膀胱上的活細菌之量在第八天無顯著變化(2-12×103 cfu/膀胱)，而在SDBS存在下，塗覆有AMP對之彼等組中大腸桿菌23502之浮游生長顯著降低大約100倍(20 cfu/膀胱)。最重要的是，在SDS存在下，黏附至無塗覆之聚矽氧管道或塗覆有T9W+SAAP159及T9W+RRIKA之彼等聚矽氧管道的細菌量未顯著變化(2-40×103 cfu/管道)，而在SDBS存在下，在塗覆有T9W+SAAP159或T9W+RRIKA之管道上未發現細菌(圖16A-圖16B)。亦在滴注綠膿桿菌27853且植入有在SDBS存在下塗覆有T9W+SAAP159之聚矽氧管道的小鼠中發現尿液中之浮游生長減少及防止細菌黏附至聚矽氧管道(圖16C)。此等結果清楚地表明，在界面活性劑SDBS存在下用AMP對塗覆之聚矽氧管道可有效地抑制小鼠尿液中之細菌生長且防止細菌黏附於小鼠膀胱上及植入之聚矽氧管道上。實例 8 藉由熱或環氧乙烷處理的成對 AMP 之穩定性
為了監測歸因於滅菌或運輸過程的對所塗覆AMP對之潛在損壞，檢查利用SDS或SDBS塗覆之T9W+SAAP159在微量盤上的穩定性。在37℃或60℃下處理四週之後，此等AMP在尿液中之七天穩定性未發現顯著變化(圖12A-圖12B)。類似地，在環氧乙烷處理之後，尿液中利用SDS塗覆之T9W+SAAP159三天之穩定性不改變(圖21C)。此外，當與無處理之情形相比較時，所有加熱及環氧乙烷處理之AMP仍保持針對大腸桿菌23502之殺細菌活性之全部水準。
圖1. 藉由在陰離子界面活性劑存在下離心使抗微生物肽SMAP29沈澱(pull down)。在指定濃度下，將SMAP29肽(24 μg或8 μg)溶解於60 µl十二烷基肌胺酸鈉緩衝液(A)或SDS緩衝液(B)中。將TP4肽溶解於60 µl SDBS緩衝液(C)中。藉由在14,000×g下離心15分鐘來收集肽，且對其進行15% SDS-PAGE，隨後進行考馬斯藍(Coomassie blue)染色。獲取4 μg SMAP29或TP4肽及其等效物用於分析。Sar：十二烷基肌胺酸鈉；SDS：十二烷基硫酸鈉；SDBS：十二烷基苯磺酸鈉。
圖2. 抗微生物肽在各種界面活性劑中之形態及其在尿液中之穩定性。在3天尿液處理之後，在顯微鏡下檢查由十二烷基肌胺酸鈉(A)及SDS (C)誘導之SMAP29囊泡(8 μg或24 μg/60 µl)之形態。利用15% SDS-PAGE測定其在尿液中之穩定性。利用顯微法(E)及SDS-PAGE (F)檢查尿液中由SDSn、SOS及SDBS誘導之TP4囊泡(24 μg/60 µl)之形態及穩定性。SDSn、SOS及SDBS分別表示界面活性劑1-癸烷磺酸鈉、辛基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉。獲取4 μg SMAP29或TP4肽及其等效物用於SDS-PAGE分析。
圖3. 藉由一步及兩步塗覆方法塗覆之SMAP29肽之塗覆效率及尿液穩定性。SMAP29肽(24 μg)分別藉由一步及兩步塗覆方法塗覆於96孔微量盤上。對塗覆且在3天及7天尿液處理之後保留在微量盤上之各別肽進行15% SDS-PAGE。獲取在尿液處理之後的4 μg SMAP29肽及其等效物用於分析。
圖4. 由SDS誘導之AMP-抗生素混合塗覆之囊泡的形態及在尿液中之穩定性。(A-B)在顯微鏡下檢查SAAP159-PXB及SAAP159-PXE囊泡之形態且利用15% SDS-PAGE測定其在尿液中之穩定性。(C)利用SDS-PAGE測定塗覆SAAP159-PXB對及單獨SAAP159之穩定性。藉由2步SDS塗覆方法將PXB、PXE (各16 μg)與SAAP159 (8 μg)混合塗覆於微量盤上。單獨塗覆SAAP159 (24 μg或8 μg)作為對照組。(D)與AMP (T9W、SMAP29及SAAP159)混合塗覆之健他黴素之穩定性及其在尿液中之2天穩定性利用SDS-PAGE分析。PXB及PXE分別表示多黏菌素B及多黏菌素E。
圖5. 利用各種界面活性劑(十二烷基肌胺酸鈉、SDS、SDBS、SDSn及SOS)之PXB與SAAP159 (A)及TP4 (B)之塗覆效率及其在尿液中之穩定性。獲取4 μg AMP及其等效物用於SDS-PAGE分析。SDS：十二烷基硫酸鈉；SDBS：十二烷基苯磺酸鈉；Sar：十二烷基肌胺酸鈉；SDSn：1-癸烷磺酸鈉；SOS：辛基硫酸鈉。
圖6. PXB-AMP對在各種生物材料上的塗覆效率及其在血清中的穩定性。(A)將PXB-SAAP159對塗覆於蓋板玻璃上，及適配於96孔微量盤以及基於聚苯乙烯之微量盤的聚矽氧及鋁之盤片上。(B)PXB-SAAP159對亦塗覆於聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯碳酸酯(PPC)、乳膠、不鏽鋼、鈦及聚胺基甲酸酯(PU)之盤片上。利用SDS-PAGE分析其在血清中之穩定性。獲取4 μg AMP及其等效物用於SDS-PAGE分析。
圖7. 測定自聚矽氧盤片釋放之PXB-SAAP159的抗微生物活性。尿液(A)及血清(B)中之連續稀釋的PXB+SAAP159混合物點置於LB瓊脂盤上。量測經稀釋抗微生物劑(2 µl)發揮之抑制區之直徑(左，頂部)且繪製成標準曲線(右，頂部)。藉由量測抑制區之直徑(底部，左)來測定在不同時間間隔下所釋放抗微生物劑(2 µl)在尿液(A)及血清(B)中之抗微生物活性且由倍數(×)(底部，右)表示。
圖8. 游離及自聚矽氧盤片釋放之抗微生物劑之細胞毒性、溶血性活性及抗微生物活性。(A)將包括16 μg PXB、8 μg SAAP159及25 μg SDS之游離抗微生物劑溶解於200 µl尿液中或含有10% FBS之200 µl RPMI生長培養基中。(B)自血清或尿液收集所釋放抗微生物劑，其中聚矽氧盤片浸沒隔夜(200 µl)。用游離或所釋放抗微生物劑處理之人類膀胱細胞NTUB1 (1.5×104 個細胞/孔)之細胞存活率藉由WST1測定且以百分比表示。用抗微生物劑處理之小鼠紅血球之溶血作用係藉由在414 nm下之吸光度來量測且以百分比表示。抗微生物活性之效能藉由能夠抑制血清或尿液中細菌生長之抗微生物劑之稀釋倍數測定。
圖9. 小鼠泌尿道中之PXB-AMP塗覆之聚矽氧管道的抗微生物活性。使用24G靜脈內導管將聚矽氧管道及大腸桿菌(E. coli ) ATCC23502 (5×109 cfu/ml於100 μl PBS中)植入/滴注至膀胱中。計數在第2天、第4天、第6天及第8天(A-D)在尿液中，第8天(E、F)膀胱及聚矽氧管道中存活/附著大腸桿菌之數目。聚矽氧管道未經塗覆(n=8)，利用SDS分別塗覆有PXB-SAAP159 (n=7)或PXB-RRIKA (n=8)。*指示P≦0.05，**指示P≦0.005，***指示P≦0.0005且n.s.指示無顯著差異。
圖10. 利用SDS或SDBS塗覆之AMP於聚苯乙烯上之塗覆效率及穩定性。AMP (T9W、SAAP159、RRIKA及T18,19K)利用SDS (A、C、E)及SDBS (B、D、F)塗覆於聚苯乙烯96孔微量盤上。(A、B)在尿液存在下所塗覆AMP之形態。(C-F)所塗覆AMP於尿液(C-D)或10%胎牛血清(E、F)中之穩定性。獲取保留於孔中之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖11. 利用SDS或SDBS塗覆之成對AMP於聚苯乙烯上之塗覆效率及穩定性。(A-B)：在尿液存在下，利用SDS (A)及SDBS (B)塗覆之成對AMP (T9W+SAAP159、T9W+RRIKA及T9W+T18,19K)之形態。(C-F)以上成對AMP在尿液(C、D)及10%胎牛血清(E、F)中之穩定性。獲取保留於孔中之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖12. 在尿液及血清存在下利用SDS或SDBS塗覆於聚矽氧盤片上之成對AMP之穩定性。(A-B)在尿液(A)及10%胎牛血清(B)存在下利用SDS及SDBS塗覆的成對AMP (T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)之穩定性。(C)在10%胎牛血清處理存在下如所指示之其他成對AMP之穩定性。獲取保留於聚矽氧盤片上之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖13. 血清中利用SDBS塗覆於聚矽氧盤片上之成對AMP之穩定性。如所指示之成對AMP利用SDBS塗覆於聚矽氧盤片上且與30%及50%胎牛血清一起培育隔夜。獲取保留於盤片上之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖14. 塗覆於不同材料上之血清中AMP對之塗覆效率及穩定性。利用SDBS將AMP對(T9W+SAAP159及T9W+RRIKA)塗覆於聚矽氧、聚胺基甲酸酯及鈦盤片上，且利用15% SDS-PAGE分析其在10%胎牛血清(A)或30%及50%胎牛血清(B)中之穩定性。獲取4 μg AMP及其等效物用於SDS-PAGE分析。PU及Ti分別表示聚胺基甲酸酯及鈦。
圖15. 所塗覆及釋放之界面活性劑及成對AMP之細胞毒性、溶血性及殺細菌活性。A. 將可塗覆且自聚矽氧盤片釋放之SDS (14 μg)及AMP對(各12 μg)之最大量用於分析。B. 將SDBS (25 μg)及AMP對(各12 μg)之最大量用於分析。a及c分別呈現用於塗覆之界面活性劑及T9W+SAAP159或T9W+RRIKA之總組分。b及d呈現200 μl尿液或10% FBS中隔夜所釋放組分。以1.5×104 個細胞/孔接種NTUB1細胞用於細胞毒性分析。以1.5×107 個細胞/孔接種小鼠紅血球用於溶血性分析。以3×105 cfu/ml接種大腸桿菌23502用於尿液及10% FBS中之殺細菌分析。
圖16. 在小鼠模型中藉由成對AMP預防泌尿道感染。將塗覆有T9W+SAAP159 (A、C)或T9W+RRIKA (B)之聚矽氧管道植入已使用24G靜脈內導管滴注有100 μl大腸桿菌ATCC23502 (5×109 cfu/ml，對於(A)及(B))及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ) 27853 (3×109 cfu/ml，對於(C))之膀胱中。計數在第2天、第4天、第6天及第8天收集之尿液中的活大腸桿菌及綠膿桿菌細胞(a-d)及在第8天處死之後黏附於膀胱(e)及聚矽氧管道(f)之細菌。*指示P≦0.05，**指示P≦0.005，***指示P≦0.0005且n.s.指示無顯著差異。
圖17. 利用SDBS塗覆於聚苯乙烯上之AMP之塗覆效率及穩定性。(A). 在10%胎牛血清存在下利用SDBS塗覆於聚苯乙烯96孔微量盤上的AMP (TP4-A12,15I、SMAP29、SMAP28-3+2及RR12)之形態。(B)利用SDS-PAGE分析之以上AMP之穩定性。獲取保留於孔中之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖18. 在大腸桿菌(ATCC 23502)、綠膿桿菌27853、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌(Candida albicans )上之AMP之抑制區。指定劑量之2 μl AMP (T9W、SAAP159、RRIKA、T18,19K、RR12 TP4-A12,15I、SMAP29及SMAP28-3+2)點置於含微生物瓊脂盤上。
圖19. 利用SDBS塗覆於聚苯乙烯上之成對AMP之塗覆效率及穩定性。(A-B)在血清存在下藉由1/2×+1× SDBS塗覆之指示AMP對之形態。(C-D)上文所指示之AMP對在10%胎牛血清中的穩定性獲取保留於孔中之4 μg AMP及其等效物用於利用15% SDS-PAGE分析。
圖20. 界面活性劑及成對AMP之細胞毒性、溶血性及殺細菌活性。在200 μl尿液或10% FBS中，將可塗覆且自聚矽氧盤片釋放的圖A之SDS (14 μg)、圖B之SDBS (25 μg)及圖C及圖D之AMP對(各12 μg)的最大量用於分析。以1.5×104 個細胞/孔接種NTUB1細胞用於細胞毒性分析。以1.5×107 個細胞/孔接種小鼠紅血球用於溶血性分析。以3×105 cfu/ml接種大腸桿菌23502用於尿液及10% FBS中之殺細菌分析。
圖21. 熱或環氧乙烷處理後，尿液中成對AMP之穩定性。利用SDS (A)或SDBS (B)塗覆於聚苯乙烯微量盤上之T9W+SAAP159對保持在室溫、37℃及60℃下4週，且利用15% SDS-PAGE分析其在尿液中之穩定性。或者，利用SDS塗覆之微量盤上的T9W/SAAP159藉由環氧乙烷(C)滅菌，且利用SDS-PAGE分析其在尿液中之穩定性。獲取保留於孔中之4 μg AMP及其等效物用於分析。EO表示環氧乙烷。

Claims (21)

  1. 一種塗覆溶液，其包含溶解於含有陰離子界面活性劑之緩衝液中的一或多種抗微生物肽(AMP)，其中AMP為兩性及陽離子型。
  2. 一種塗覆材料表面之方法，其包含(i)將一或多種抗微生物肽溶解於陰離子界面活性劑中，及(ii)將所得AMP溶液塗覆於該材料之該表面上，使得該AMP附著於該表面上。
  3. 一種塗覆生物材料表面之方法，其包含(i)將一或多種抗微生物肽(AMP)溶解於含有比0.002% (w/v)低的濃度之陰離子界面活性劑之緩衝液中以形成溶液(a)；(ii)將一定量之含有比0.02% (w/v)高的濃度之陰離子界面活性劑之緩衝液添加至該溶液(a)以形成溶液(b)，其中含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量等於含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液之量；及(iii)將該溶液(b)塗覆至該材料之該表面上，使得該AMP附著於該表面上。
  4. 如請求項3之方法，其中含有低濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之該AMP的量在約0.002% (w/v)至約0.02% (w/v)範圍內，且含有高濃度陰離子界面活性劑之緩衝液中之該AMP的量在0.02% (w/v)至約0.6% (w/v)範圍內。
  5. 一種生物材料，其塗覆有一或多種利用如請求項2或3之方法製備的AMP。
  6. 如請求項2或3之方法，其中該陰離子界面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂醯基肌胺酸鈉(十二烷基肌胺酸鈉(sarkosyl))、1-癸烷磺酸鈉(SDSn)、正辛基硫酸鈉(SOS)或十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)。
  7. 如請求項2或3之方法，其中該陰離子界面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂醯基肌胺酸鈉(十二烷基肌胺酸鈉)或十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)。
  8. 如請求項1之塗覆溶液或如請求項2或3之方法，其中該AMP的量在約0.01% (w/v)至約0.1% (w/v)範圍內。
  9. 如請求項1之塗覆溶液或如請求項2或3之方法，其中該材料為玻璃、合成聚合物(諸如聚矽氧、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚丙烯碳酸酯(PPC)、聚氯乙烯(PVC)、聚胺基甲酸酯(PU))、乳膠或金屬(諸如鋁、不鏽鋼、鈦及基於鈦之合金)。
  10. 如請求項1之塗覆溶液、如請求項2或3之方法或如請求項4之生物材料，其中該材料用於製造醫療儀器/裝置或支持性填料(supporting stuff)。
  11. 如請求項10之醫療儀器/裝置或支持性填料，其為膜、粒子、纖維、管、框架、板、導管、支架、隱形眼鏡、骨植入物、其他手術、牙科儀器或醫療裝置。
  12. 如請求項1之塗覆溶液、如請求項2或3之方法或如請求項4之生物材料，其中該AMP為肽衍生抗生素、α-螺旋、β-股或捲曲肽。
  13. 如請求項1之塗覆溶液、如請求項2或3之方法或如請求項4之生物材料，其中該AMP為選自SEQ ID No: 1至23之肽或其中任何兩者或更多者之混合物。
  14. 如請求項1之塗覆溶液、如請求項2或3之方法或如請求項4之生物材料，其中該AMP為SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 23之肽或其中任何兩者或更多者之混合物。
  15. 如請求項1之塗覆溶液、如請求項2或3之方法或如請求項5之生物材料，其中使用AMP對，其中該AMP對為肽衍生抗生素與SEQ ID No: 1至23之肽中之任一者的組合。
  16. 如請求項15之塗覆溶液、方法或生物材料，其中該AMP對為多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素中之任一者與SEQ ID No: 1至23之該等肽中之任一者的組合。
  17. 如請求項14之塗覆溶液、方法或生物材料，其中該AMP對為多黏菌素B、多黏菌素E及健他黴素中之任一者與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18之肽中之任一者的組合。
  18. 如請求項12之塗覆溶液、方法或生物材料，其中該AMP對為SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:3組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:14組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:15組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:16組合、SEQ ID NO:23與SEQ ID NO:20組合、SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:16組合或SEQ ID NO:14與SEQ ID NO:18組合。
  19. 如請求項5之生物材料或如請求項11之醫療儀器/裝置或支持性填料，其具有抗微生物活性。
  20. 如請求項5之生物材料或如請求項11之醫療儀器/裝置或支持性填料，其抑制革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌。
  21. 一種抗微生物肽，其選自由以下組成之群：SEQ ID No: 2、3、4、19及20。
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