WO2009067968A1 - Peptid-antibiotikum aus hydra sowie hierfür codierendes gen - Google Patents

Peptid-antibiotikum aus hydra sowie hierfür codierendes gen Download PDF

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WO2009067968A1
WO2009067968A1 PCT/DE2008/001719 DE2008001719W WO2009067968A1 WO 2009067968 A1 WO2009067968 A1 WO 2009067968A1 DE 2008001719 W DE2008001719 W DE 2008001719W WO 2009067968 A1 WO2009067968 A1 WO 2009067968A1
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seq
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PCT/DE2008/001719
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Thomas C. G. Bosch
Holger Zill
Jens-Michael SCHRÖDER
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Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to an isolated from the freshwater polyp Hydra, an antimicrobial peptide encoding gene, the encoded by this gene antimicrobial peptide and its use for the production of antimicrobially active drugs.
  • antibiotics agents are defined that are produced by microorganisms to inhibit or kill other organisms in their development.
  • Alexander Fleming discovered penicillin and thus the antibiotics in 1928, it was possible to cure many diseases for whose pathogen no active substance had been known.
  • the discovery of penicillin was followed at frequent intervals by sulfonamides, the first broad-spectrum antibiotic tetracycline, streptomycin, chloramphenicol and the macrolide antibiotics, namely erythromycin.
  • sulfonamides the first broad-spectrum antibiotic tetracycline
  • streptomycin streptomycin
  • chloramphenicol chloramphenicol
  • macrolide antibiotics namely erythromycin.
  • AMPs antimicrobial peptides
  • Bacterial and human cell membranes differ greatly in their composition. There are not only a number of different proteins, the type of membrane lipids varies greatly. AMPs are considered an effective alternative to antibiotics because they do not bind to specific membrane receptors, but interact with cell membrane lipids. Since the effect is based on a biophysical principle (interaction of an amphipathic molecule with the anisotropic membrane layer), the AMP are active against a broad spectrum of bacteria.
  • AMPs AMP-like compounds
  • innate defense system As potential drugs AMPs come into question because they are harmless to human cells: human cell membranes are uncharged to the outside and do not interact with the charged AMPs. In the meantime, more than 2,000 antimicrobial peptides from a wide variety of organisms have been identified. However, the previously known broadband AMPs only act at relatively high concentrations.
  • the active concentration is 50-200 ⁇ g / ml (Zasloff, M. Magainins, A class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterizi 1987, Proc Natl. Acad., USA, 84: 5449-5453)
  • Conventional antibiotics generally act in a range of 0 against a specific microorganism , 1 - 1 ⁇ g / ml.
  • the object is achieved by a nucleic acid molecule coding for such an antimicrobial peptide having the features of claim 1.
  • the object is also achieved by a vector, a host cell and the use of the peptide according to the invention according to one of the independent claims.
  • the subclaims represent advantageous embodiments of the invention.
  • the nucleic acid sequence indicated under SEQ ID: NO 1 represents a gene of the freshwater polyp Hydra magnipapillata and encodes an antimicrobial peptide (cDNA sequence with signal sequence see SEQ ID: NO 2, without signal sequence see SEQ ID: NO 4, amino acid sequence see SEQ ID : NO 3 with signal sequence and SEQ ID: NO 5 without signal sequence), which has a particularly advantageous activity against a broad spectrum of pathogenic bacteria including multidrug-resistant Enterobacteriaceae (see Tables 1 to 3). It is clearly superior in its bactericidal effect to the classical antibiotics hitherto used in the clinic as well as the previously known broadband AMPs.
  • the freshwater polyp Hydra is a developmentally old, multicellular organism.
  • Hydra polyps are characterized by a simple morphological structure: they consist essentially of two cell layers, the ecoderm facing the external environment and the endoderm essentially facing the central gastric space. Since the polyps have no physical barriers (epidermis, cornea, armor, etc.), the thin epithelia of the hydra are apparently exposed to the surrounding aquatic environment and the potentially pathogenic microorganisms contained therein. Nevertheless, hydra polyps populate even microbially contaminated freshwater and show no signs of infection. This circumstance has prompted the inventors to search Hydra for substances, particularly peptides, which provide effective antimicrobial protection for the hydra.
  • the antibacterial peptide according to the invention and the gene coding therefor could be identified by preparing a protein extract from hydra-polyps and by ⁇ PLC fractionation, testing of the fractions for antimicrobial activity and subsequent subfractionation of the respective active fractions up to the individual pure antimicrobial activity. biell active peptides was purified. For the dominant antimicrobial peptide, an eight amino acid peptide fragment could be identified by mass spectrometric analysis. Database analyzes revealed agreement with a group of translated Hydra ESTs (expressed sequence tags) (eg Acc No. CX833582). Subsequent investigations led to the identification of the complete genomic DNA sequence shown under SEQ ID: NO 1 as well as the cDNA sequence shown under SEQ ID: NO 2.
  • the peptide encoded by this sequence has a signal sequence and the directly following actual active peptide. This consists of 60 amino acids and is strongly positively charged (pl 9.05). Among the 60 amino acids are 8 cysteines, which can form disulfide bridges and thus probably contribute to a typical for many antimicrobial peptides (eg defensins) spatially compact structure of the molecule.
  • the active peptide was produced recombinantly in E. coli and the MBC (minimum bactericidal concentration, minimal bactericidal concentration) and the LD90 (lethal dose 90, ie concentration in the 90% of the microorganisms be killed) against a variety of microorganisms tested.
  • the inventive microbial peptide against various gram-negative bacteria eg various E. coli strains, Klebsiella pneumonia, etc.
  • the gram-positive bacterium Bacillus megaterium active eg various E. coli strains, Klebsiella pneumonia, etc.
  • Table 3 that the Hydra-Vepti ⁇ is highly efficacious even against almost all tested multiresistant E. coli and Klebsiella strains.
  • the antimicrobial peptide according to the invention is thus outstandingly suitable as an active ingredient for the production of antimicrobially active medicaments.
  • the topical external peptide of the present invention could be used as an active ingredient in skin creams and in solutions, and thus be used in the treatment of chronic wounds that infect quickly and are often populated with multidrug-resistant bacteria in inpatients.
  • Another area of use would be, for example, the use as an active ingredient in antimicrobial coatings of z. B. medical implants. So comes z.
  • artificial skin from a biopolymer is used in severe burns to treat the enormous loss of the skin. Bacteria adhere very well to this biopolymer, so that infections hinder the healing process.
  • a coating with the antimicrobial peptide according to the invention, which is subsequently released continuously, would solve the problem and thus accelerate the healing process.
  • a vector having a nucleic acid molecule with the nucleotide sequence represented as SEQ ID: NO 1 or SEQ ID: NO 4 or a sequence defined in more detail in claim 1 for the transfection of host cells is also claimed, particularly preferably regulatory elements for expression in Hydra are provided. It goes without saying that this also applies to host cells having such a sequence or such a vector.
  • Hy ⁇ ra polyps were incubated for 24 hours with dilute, sterile-filtered Pseudomonas aeruginosa cultix supernatants and then homogenized.
  • the protein extract was passed through a arineparin-Sepharose affinity column and the proteins bound to it were fractionated by preparative C8-reversed phase (RP) ⁇ PLC.
  • RP preparative C8-reversed phase
  • An antimicrobial plate diffusion assay was used to identify protein fraction containing antimicrobial activity. The most active fractions were further purified to homogeneity via cation exchange HPLC and subsequent C2C18 RP- ⁇ PLC.
  • Electron spray ionization mass spectrometry analyzes revealed a mass of 6994 Da for the dominant peptide.
  • ESI-MS Electron spray ionization mass spectrometry
  • an 8 amino acid peptide fragment was identified which was consistent with a group of translated Hydra ESTs (expressed sequence tags) in the NCBI gene database (e.g. B. Acc. No. CX833582)
  • Subsequent studies have identified the complete genomic DNA sequence and the cDNA sequence, and the complete peptide (84 amino acids) encoded by this DNA sequence has a signal sequence (24 amino acids) directly This consists of 60 amino acids, 8 of which are cysteines, and is highly positively charged (pl 9,05).
  • the antimicrobial activity of the peptide was determined as previously described (Sahly H. et al., "Burkholderia is highly resistant to human beta-defensin 3.” 2003, AAC, 47: 1739-1741):
  • Test isolates grew in brain heart infusion broth for 2 to 3 hours at 36 +/- 1 ° C, then 3 times in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) with 1% tryptic soy broth (TSB) and adjusted to 10 4 to 10 5 bacteria / ml. Per 100 .mu.l bacterial suspension were mixed with 10 .mu.l solution of the antimicrobial peptide (final concentrations tested: 0.0125 - 100 ug / ml) and incubated at 36 +/- 1 0 C. CFUs ("colony forming units") were determined after 2 h.
  • Organism MBC [ ⁇ mol / L] LD90 [ ⁇ mol / L] gram-negative bacteria
  • Organism MBC [ ⁇ g / ml]
  • LD90 [ ⁇ g / ml]
  • Organism MBC [ ⁇ g / ml]
  • LD90 [ ⁇ g / ml]

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Abstract

Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Nukleinäuremolekül mit der in der SEQ ID:NO 4 dargestellten Nukleotidsequenz, b) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit der in der SEQ ID:NO 5 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, c) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Komplementärstrang an ein Nukleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität codiert, und d) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz von der Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach c) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht.

Description

Peptid- Antibiotikum aus Hydra sowie hierfür codierendes Gen
Die Erfindung betrifft ein aus dem Süßwasserpolypen Hydra isoliertes, ein antimikrobielles Peptid codierendes Gen, das von diesem Gen codierte antimikrobielle Peptid sowie dessen Verwendung zur Herstellung antimikrobiell wirksamer Arzneimittel.
Bakterienstämme, die gegen herkömmliche Antibiotika resistent geworden sind, stellen heute ein globales Gesundheitsproblem mit großen sozialen und ökonomischen Auswirkungen dar. Inzwischen haben sowohl WHO als auch die EU Resolutionen verabschiedet, in denen sie vor diesem Problem warnen. Verschärft tritt dieses in Krankenhäusern auf, da ein großer Teil der dort übertragenen Infektionen durch antibiotikaresistente Bakterien verursacht wird. Große Besorgnis erregt dabei das Auftreten von Krankenhauskeimen, die gegenüber Vancomycin resistent sind, einem Antibiotikum, das üblicherweise als letzter Ausweg eingesetzt wird.
Die durch das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterien zusätzlich verursachten Kosten betragen in den USA 4-5 Milliarden $ / Jahr und dürften in Europa etwa gleich groß sein. Diese alarmierenden Zahlen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, neue Antibiotika zu entwickeln.
Als Antibiotika werden Wirkstoffe definiert, die von Mikroorganismen produziert werden um andere Organismen in ihrer Entwicklung zu hemmen oder abzutöten. Als Alexander Flem- ming 1928 das Penicillin und damit die Antibiotika entdeckte, konnte man viele Krankheiten heilen, gegen deren Erreger bislang keine wirksame Substanz bekannt gewesen war. Der Entdeckung des Penicillins folgten in kurzen Abständen die Sulphonamide, das erste Breitband-Antibiotikum Tetracyclin, Streptomycin, Chloramphenicol und die Makrolid- Antibiotika, namentlich Erythromycin. Damit standen in den 60er und 70er Jahren eine Vielzahl wirkungsvoller Antibiotika für praktisch jede bakterielle Infektion zur Verfügung, so dass William H. Stewart, US Surgeon General, 1969 dem amerikanischen Kongress mitteilte: „The time has come to close the book on infectious disease." Der intensive Einsatz der tradi- tionellen Antibiotika hat zunächst zwar zu einer drastischen Abnahme der infektionsbedingten Todesfälle in den Industrienationen geführt, ironischerweise ist der intensive Einsatz von Antibiotika aber auch der primäre Grund für deren zunehmende Wirkungslosigkeit. Überdosierungen und Antibiotikamissbrauch (wie z.B. die grundsätzliche Verwendung von Antibiotika als Futterzusatz) haben es Bakterien daher ermöglicht, widerstandsfähiger und resistent zu werden. Selbst Methicillin und Vancomycin, die erst dann zum Einsatz kommen, wenn die Standardantibiotika ineffektiv geworden sind, verlieren zunehmend an Wirkung, und so wurden in den letzten Jahrzehnten steigende Zahlen an multiresistenten Bakterienstämmen registriert. Da nur wenige neue Antibiotika in den vergangenen Jahren entwickelt wurden, ist zu befürchten, dass in fünf bis zehn Jahren resistente Stämme gegen alle zugelassenen Antibiotika auftreten.
Es fehlen daher neue, wirkungsvolle Antibiotika, gegen die Mikroben keine Resistenzmechanismen entwickeln können. Auf der Suche nach entsprechenden neuen Wirkstoffen sind in den letzten Jahren so genannte antimikrobielle Peptide (AMPs) in das Zentrum des Interesses gerückt. Bakterielle und menschliche Zellmembranen unterscheiden sich stark in ihrer Zusammensetzung. Es gibt nicht nur eine Reihe von unterschiedlichen Proteinen, auch die Art der Membranlipide variiert sehr stark. AMPs gelten als wirkungsvolle Alternative zu Antibiotika, weil sie nicht an spezifische Membranrezeptoren binden, sondern mit den Lipiden der Zellmembranen interagieren. Da die Wirkung auf einem biophysikalischen Prinzip (Wechselwirkung eines amphipathischen Moleküls mit der anisotropen Membranschicht) beruht, sind die AMP gegen ein breites Spektrum von Bakterien aktiv. Der Hauptvorteil der AMPs gegenüber klassischen Antibiotika liegt also darin, dass die Zerstörung der Bakterien durch einen Angriff von außen an die Zellmembran erfolgt. Da es dabei zu keiner Bindung an spezifische Rezeptoren kommt, ist die Bildung resistenter Keime unwahrscheinlich. AMPs werden nicht von Bakterien selber sondern von entwicklungsgeschichtlich höher entwickelten Organismen hergestellt und sind Bestandteil des sog. angeborenen Abwehrsystems. Als potentielle Medikamente kommen AMPs deshalb in Frage, weil sie für menschliche Zellen unschädlich sind: menschliche Zellmembranen sind nach außen hin ungeladen und treten mit den geladenen AMPs nicht in Wechselwirkung. Inzwischen sind mehr als 2000 antimikrobielle Peptide aus den unterschiedlichsten Organismen identifiziert worden. Allerdings wirken die bisher bekannten Breitband- AMPs erst bei relativ hohen Konzentrationen. Beispielsweise beträgt im Fall von Magainin, einem antimikrobiellen Peptid, dass aus der Epidermis von Amphibien isoliert wurde, die aktive Konzentration 50-200 μg/ml (Zasloff, M. „Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterizati- on of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor." 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:5449-5453). Herkömmliche Antibiotika hingegen wirken gegen einen spezifischen Mikroorganismus in der Regel in einem Bereich von 0,1 - 1 μg/ml.
Es besteht daher noch immer Bedarf an hochwirksamen antimikrobiellen Peptiden mit einem breiten Wirkungsspektrum, inbesondere gegen multiresistente Mikroorganismen. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein antimikrobielles Peptid bereitzustellen, das diese Anforderungen erfüllt.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein ein derartiges antimikrobielles Peptid codierendes Nuk- leinsäuremolekül mit den Merkmalen von Anspruch 1. Die Aufgabe wird auch durch einen Vektor, eine Wirtszelle und die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids nach einem der nebengeordneten Ansprüche gelöst. Die Unteransprüche stellen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung dar.
Die unter der SEQ ID:NO 1 angegebene Nukleinsäuresequenz stellt ein Gen des Süßwasserpolypen Hydra magnipapillata dar und codiert für ein antimikrobielles Peptid (cDNA- Sequenz mt Signalsequenz siehe SEQ ID:NO 2, ohne Signalsequenz siehe SEQ ID:NO 4; Aminosäuresequenz siehe SEQ ID:NO 3 mit Signalsequenz und SEQ ID:NO 5 ohne Signalsequenz), das eine besonders vorteilhafte Aktivität gegen ein breites Spektrum pathogener Bakterien einschließlich multiresistenter Enterobacteriaceae hat (siehe Tabelle 1 bis 3). Es ist den bislang in der Klinik eingesetzten klassischen Antibiotika sowie den bislang bekannten Breitband-AMPs in seiner bakteriziden Wirkung deutlich überlegen.
Der Süßwasserpolyp Hydra ist ein entwicklungsgeschichtlich alter, vielzelliger Organismus. Hydra-Polypen zeichnen sich durch einen einfachen morphologischen Aufbau aus: sie beste- hen im Wesentlichen aus zwei Zellschichten, dem der äußeren Umgebung zugewandten Ek- toderm und dem im Wesentlichen dem zentralen Gastralraum zugewandten Endoderm. Da die Polypen über keinerlei physikalische Barrieren (Epidermis, Hornhaut, Panzer etc.) verfugen, sind die dünnen Epithelien der Hydra dem umgebenden aquatischen Milieu und den darin enthaltenen potentiell pathogenen Mikroorganismen scheinbar schutzlos ausgesetzt. Trotzdem besiedeln Hydra-Polypen selbst mikrobiell stark belastete Süßgewässer und zeigen dabei keine Anzeichen einer Infektion. Dieser Umstand hat die Erfinder dazu veranlasst, in Hydra nach Substanzen, inbesondere Peptiden zu suchen, die einen wirksamen antimikrobiellen Schutz für die Hydra vermitteln.
Das erfindungsgemäße antibakterielle Peptid und das hierfür codierende Gen konnten identifiziert werden, indem aus Hydra-Polypen ein Proteinextrakt hergestellt und über ΗPLC- Fraktionierung, Testung der Fraktionen auf antimikrobielle Aktivität und anschließende Sub- fraktionierung der jeweiligen aktiven Fraktionen bis hin zu den einzelnen reinen antimikro- biell aktiven Peptiden aufgereinigt wurde. Für das dominierende antimikrobielle Peptid konnte über massenspektrometrische Analysen ein acht Aminosäuren umfassendes Peptid- Fragment identifiziert werden. Datenbankanalysen ergaben eine Übereinstimmung mit einer Gruppe von translatierten Hydra ESTs (expressed sequence tags) (z. B. Acc. No. CX833582). Nachfolgende Untersuchungen führten zur Identifizierung der vollständigen unter der SEQ ID:NO 1 dargestellten genomischen DNA-Sequenz sowie der unter der SEQ ID:NO 2 dargestellten cDNA-Sequenz. Das von dieser Sequenz codierte Peptid weist eine Signalsequenz und das direkt hierauf folgende eigentliche aktive Peptid auf. Dieses besteht aus 60 Aminosäuren und ist stark positiv geladen (pl 9,05). Unter den 60 Aminosäuren sind 8 Cysteine, die Disulfidbrücken ausbilden können und somit vermutlich zu einer für viele antimikrobielle Peptide (z. B. Defensine) typischen räumlich kompakten Struktur des Moleküls beitragen.
Um die antimikrobielle Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids zu ermitteln, wurde das aktive Peptid rekombinant in E. coli hergestellt und die MBC (minimal bactericidal concentrati- on, minimale bakterizide Konzentration) sowie die LD90 (lethale Dosis 90, d.h. Konzentration bei der 90% der Mikroorganismen abgetötet werden) gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen getestet. Wie aus den Tabellen 1 und 2 hervorgeht, ist das erfindungsgemäße anti- mikrobielle Peptid gegen verschiedene gram-negative Bakterien (z. B. verschiedene E. coli- Stämme, Klebsiella pneumonia etc.), insbesondere jedoch gegen das gram-positive Bakterium Bacillus megaterium aktiv. Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass das Hydra-Veptiά darüber hinaus sogar gegen fast alle getesteten multiresistenten E. coli- und Klebsiella-Stämme hoch- wirksam ist.
Das erfindungsgemäße antimikrobielle Peptid eignet sich somit hervorragend als Wirkstoff für die Herstellung von antimikrobiell wirksamen Arzneimitteln. Beispielsweise könnte das erfindungsgemäße Peptid für die oberflächliche äußerliche Anwendung als Wirkstoff in Hautcremen und in Lösungen Verwendung finden und somit bei der Behandlung chronischer Wunden eingesetzt werden, die sich schnell infizieren und bei stationären Patienten oft mit multiresistenten Keimen besiedelt werden. Ein weiterer Einsatzbereich wäre beispielsweise der Einsatz als Wirkstoff in antimikrobiellen Beschichtungen von z. B. medizinischen Implantaten. So kommt z. B. bei Schwerstbrandverletzten sog. künstliche Haut aus einem Biopo- lymer zum Einsatz, um den enormen Verlust der Haut zu decken. An dieses Biopolymer haften sich Bakterien sehr gut an, sodass Infektionen den Heilungsprozess behindern. Eine Be- schichtung mit dem erfindungsgemäßen antimikrobiellen Peptid, das anschließend kontinuierlich freigesetzt wird, würde das Problem lösen und damit den Heilungsprozess beschleunigen.
Schließlich wird auch ein Vektor mit einem Nukleinsäuremolekül mit der als SEQ ID:NO 1 oder der als SEQ ID:NO 4 dargestellten Nukleotidsequenz oder einer in Anspruch 1 näher definierten Sequenz zur Transfektion von Wirtszellen beansprucht, wobei besonders bevorzugt regulatorische Elemente für die Expression in Hydra vorgesehen sind. Es versteht sich, dass damit auch Wirtszellen beansprucht werden, die eine derartige Sequenz oder einen derar- tigen Vektor aufweisen.
Die Identifizierung von antimikrobiellen Peptiden in Hydra, die Herstellung des erfindungsgemäßen antimikrobiellem Peptids in E. coli sowie die Durchführung der Tests zur Bestimmung der MBC und der LD90 für die verschiedenen Mikroorganismen werden im Folgenden beschrieben. 1) Identifizierung von antimikrobiellen Peptiden in Hydra:
Um sowohl von Hydra konstitutiv gebildete als auch induzierbare antimikrobielle Peptide (AMPs) zu identifizieren, wurden rund 15000 Hy^ra-Polypen für 24 Stunden mit verdünnten sterilfiltrierten Pseudomonas aeruginosa-Kultixrixberständen inkubiert und anschließend homogenisiert. Der Proteinextrakt wurde über eine Ηeparin-Sepharose-Affinitätssäule geleitet und die hieran gebundenen Proteine über eine präparative C8-reversed phase (RP)- ΗPLC fraktioniert. Über einen antimikrobiellen Plattendiffusionstest (radial diffusion assay) wurden antimikrobielle Aktivität enthaltende Proteinfraktionen identifiziert. Die aktivsten Fraktionen wurden weiter über Kationen- Austausch-ΗPLC und anschließende C2C18-RP-ΗPLC bis zur Homogenität aufgereinigt. Elektronenspray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS)- Analysen ergaben für das dominierende Peptid eine Masse von 6994 Da. Über „peptide- mapping"-Experimente mittels ESI-MS- und MS/MS-Analysen wurde ein 8 Aminosäuren umfassendes Peptid-Fragment identifiziert, das mit einer Gruppe von translatierten Hydra ESTs (expressed sequence tags) in der NCBI-Gendatenbank übereinstimmte (z. B. Acc. No. CX833582). Nachfolgende Untersuchungen führten zur Identifizierung der vollständigen genomischen DNA-Sequenz sowie der cDNA-Sequenz. Das vollständige von dieser DNA- Sequenz codierte Peptid (84 Aminosäuren) weist eine Signalsequenz (24 Aminosäuren) und das direkt hierauf folgende eigentliche aktive Peptid auf. Dieses besteht aus 60 Aminosäuren, von denen 8 Cysteine sind, und ist stark positiv geladen (pl 9,05).
2) Herstellung des antimikrobiellen Peptids in E. coli:
Der bakterielle Expressionsvektor pET-32a(+), der für ein aus Thioredoxin, einem Histidin- Tag, einer Enterokinase Schnittstelle und dem reifen antimikrobiellen Peptid bestehendes Fu- sionsprotein kodiert, wurde in E. coli BL21pLys transformiert. Proteinexpression wurde in Flüssigkulturen durch IPTG induziert bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5. Nach 4 h wurden die Zellen geerntet, lysiert und die Fraktion mit dem unlöslichen Protein („inclusion bodies") wurde durch Zentrifugieren isoliert. Die isolierten „inclusion bodies" wurden gewaschen, in 6 M Guanidinium-Hydrochlorid Tris, pH=8,0 aufgelöst und mit Ni-Agarose unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt. Das aufgereinigte antimikrobielle Fusionspeptid wurde dann durch Dialyse (5OmM Tris, pH=8,0) renaturiert und mit Enterokinase verdaut. Die letzte Aufreinigung erfolgte durch Kationen-Austauschchromatographie gefolgt von RP- HPLC (C18-Säule, Vydac) mit einem linearen Acetonitrilgradienten.
3) Durchführung der Tests zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
Die antimikrobielle Aktivität des Peptids wurde wie bereits beschrieben bestimmt (Sahly H. et al., „Burkholderia is highly resistant to human beta-defensin 3." 2003, AAC, 47:1739- 1741):
Test-Isolate wuchsen 2 bis 3 h in „brain heart infusion broth" bei 36 +/- 1 °C, wurden dann 3- mal in 10 mM Natrium Phosphat Puffer (pH 7,4) mit 1% „tryptic soy broth" (TSB) gewaschen und eingestellt auf 104 bis 105 Bakterien/ml. Je 100 μl Bakteriensuspension wurden mit 10 μl Lösung des antimikrobiellen Peptids versetzt (getestete Endkonzentrationen: 0,0125 - 100 μg/ml) und bei 36 +/- 1 0C inkubiert. CFUs („colony forming units" = „koloniebildende Einheiten") wurden nach 2 h bestimmt. Als Negativkontrolle dienten Bakteriensuspensionen, die mit 10 μl Phosphat Puffer/l % TSB statt Peptid-Lösung versetzt wurden. Die Ergebnisse werden entweder als LD90 oder als MBC angegeben. Um die antimikrobielle Aktivität durch den Radialdifusionstest zu bestimmen, wurde die Wachstumsinhibition von E. coli XL blue wie beschrieben gemessen.
Tabelle 1
Organismus MBC [μmol/l] LD90 [μmol/l] gram-negative Bakterien:
E. coli ATCC 11775 0,447 0,447
E. coli ATCC35218 0,447 0,223
E coli D31 7,149 0,447
Kleb, pneumoniae ATCC13883 0,447 0,447
P. aeruginosa ATCC10145 >14,3 >14,3 gram-positive Bakterien:
B. megaterium ATCC14581 0,223 0,143 E. faecalis ATCC29212 14,3 0,894
S. aureus ATCC12600 >14,3 14,3 S. epidermidis ATCC 14990 >14,3 >14,3 S. hominis ATCC27844 >14,3 3,574 S. pneumoniae ATCC33400 >14,3 >14,3
Pilze
C. albicans ATCC10231 >14,3 >14,3 C. albicans ATCC24433 >14,3 >14,3 C. glabrata ATCC90030 >14,3 >14,3
Tabelle 2
Organismus MBC [μg/ml] LD90 [μg/ml]
E. coli ATCC25922 6,25 1,56 E. coli ATCC11775 6,25 3,125 Citrobacter freundii NCTC9750 50 6,25 Citrobacter freundii UR 1776/03 6,25 1,56 Kleb, pneumoniae ATCC13883 6,25 3,125 Kleb, oxytoca ATCC13182 6,25 3,125 Salmonella typhimurium ATCC13211 6,25 1 ,56 Salmonella typhimurium 10003630 6,25 3,125 Salmonella typhimurium 10003442 6,25 3,125 Eb. chloacae ATCC13047 12,5 3,125 Eb. chloacae Va12270/03 6,25 3,125 Yers. enterocoli NCTC11174 3,125 1 ,56 Yers. enterocoli NCTC11176 6,25 1 ,56 Tabelle 3
Organismus MBC [μg/ml] LD90 [μg/ml]
E. coli ESBL Co 80 3,125 3,125 E coli ESBL Co 82 3,125 1 ,56 E. coli ESBL Co 83 6,25 3,125 E. coli ESBL Co 84 6,25 1,56 E coli ESBL Co 85 6,25 1 ,56 Kleb, oxytoca ESBL 2 6,25 1 ,56 Kleb, oxytoca ESBL 3 6,25 3,125 Kleb. pneum. ESBL 8 25 6,25 Kleb, pneum. ESBL 11 12,5 3,125 Kleb. pneum. ESBL 20 6,25 3,125 K/eb. oxytoca ESBL 23 6,25 3,125 Kleb, oxytoca ESBL 24 6,25 3,125

Claims

ANSPRUCHE
1. Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Nukleinsäuremolekül mit der in der SEQ ID:NO 4 dargestellten Nukleo- tidsequenz, b) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit der in der SEQ ID:NO 5 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, c) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Komplementärstrang an ein Nukleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität codiert, und d) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz von der Nukleotidse- quenz eines Nukleinsäuremoleküls nach c) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht.
2. Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Nukleinsäuremolekül mit der in der SEQ ID:NO 1 dargestellten Nukleotidsequenz, b) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit der in der SEQ ID:NO 3 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, c) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Komplementärstrang an ein Nukleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und ein Polypeptid mit antimiki-obieller Aktivität codiert, und d) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz von der Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach c) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht.
3. Vektor, gekennzeichnet durch ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül mit regulatorischen Elementen für die Expression in Hydra kombiniert ist.
5. Wirtszelle, gekennzeichnet durch eine Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz nach Anspruch 1.
6. Wirtszelle, gekennzeichnet durch den Vektor nach Anspruch 3.
7. Peptid, gekennzeichnet durch die unter SEQ ID:NO 5 dargestellte Aminosäurese- quenz.
8. Verwendung eines Peptids mit der unter SEQ ID:NO 5 dargestellten Aminosäurese- quenz für die Herstellung eines Antibiotikums zur Behandlung mikrobieller Infektionen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum ein gegen gram-negative und gram-positive Bakterien wirkendes Antibiotikum ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum gegen Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocoli, Enterobacter cloa- cae, Bacillus megaterium verwendet wird.
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