DE69836500T2

DE69836500T2 - Antifungale und antibakterielle peptide

Info

Publication number: DE69836500T2
Application number: DE69836500T
Authority: DE
Inventors: Donald F. Dover ROBERTS; Peter Newbury SPACCIAPOLI; M. Phillip Bedford FRIDEN; G. Frank Chestnut Hill OPPENHEIM; Tao Newton XU
Original assignee: PERIODONTIX Inc WATERTOWN; Boston University; Periodontix Inc
Current assignee: Boston University; Demegen Inc
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: EP1040120A4; DE69836500D1; EP1040120B1; JP2002508390A; CA2315250A1; US6531573B1; EP1040120A1; WO1999031123A1; AU1725299A

Description

Grundlagen der Erfindung
Die Erfindung betrifft antifungale und antibakterielle Peptide.
Bakterielle und fungale Infektionen sind weit verbreitet und stellen in manchen Fällen lebensbedrohliche Zustände dar, die sonst gesunde Patienten befallen. Bakterielle und fungale Infektionen sind für immungeschwächte Patienten besonders gefährlich. Bei diesen Patienten können systemische fungale Infektionen zum Tod führen, da es wenige sichere und wirksame antifungale Pharmazeutika für eine intravenöse Anwendung gibt. Ähnlich können Infektionen mit verschiedenen Bakterienspecies ernste Krankheitszustände hervorrufen und sogar den Tod verursachen.
Obwohl mehrere antifungale Agenzien (z.B. Clotrimazol, Miconazol, Ketoconazol und Nystatin) und antibakterielle Agenzien (z.B. Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin und Chlorhexidin) gegenwärtig zur Verfügung stehen, sind diese Agenzien nicht immer wirksam. Diese Agenzien können auch zu Wirkstoff-resistenten Organismen führen und können Nebenwirkungen auslösen. Außerdem können sie für eine orale oder systemische Verabreichung ungeeignet sein.
United States Patent US 5486503 (Oppenheim et al.) beschreibt antifungale Histatin-basierte Peptide, die definierten Teilen der Aminosäure-Sequenzen von natürlich vorkommenden Histatinen von Mensch und Makake entsprechen, modifizierte Peptide, diese Peptide exprimierende Expressionsvektoren und Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von fungalen Infektionen. Einige Histadin-basierte Peptide zeigen eine bessere antifungale Aktivität als native, intakte Histatine. Isolierte, natürlich vorkommende Makaken-Histatine und Peptid-Analoga sind ebenfalls beschrieben.
Raj et al. legte in The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, Nr. 7, vom 5. März 1990, Seiten 3898 bis 3905, mit Titel „Salivary Histatin 5: Dependence of Sequence, Chain Length, and Helical Conformation for Candidacidal Activity" die Synthese von Histatin 5 und dessen antifungale Aktivität offen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt im Wesentlichen reine Peptide bereit, bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren einschließlich; wobei die Peptide die Sequenz aufweisen:
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19-R20-R21-R22-R23, wo R1 Asp ist oder fehlt; R2 Ser ist oder fehlt; R3 His ist oder fehlt; R4 Ala ist; R5 Lys, Gln oder Arg ist; R6 Arg, Gln oder Lys ist; R7 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R8 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R9 Gly, Lys oder Arg ist; R10 Tyr ist; R11 His oder Phe ist; R12 Arg, Gln oder Lys ist; R13 Lys, Gln oder Arg ist oder fehlt; R14 Phe ist oder fehlt; R15 His, Phe, Tyr oder Leu ist oder fehlt; R16 Glu ist oder fehlt; R17 Lys ist oder fehlt; R18 His ist oder fehlt; R19 His ist oder fehlt; R20 Ser ist oder fehlt; R21 His ist oder fehlt; R22 Arg ist oder fehlt; und R23 Gly ist oder fehlt; wo Gln nicht gleichzeitig die Positionen R5, R6, R12 und R13 der Aminosäure-Sequenz eines Peptids einnehmen kann.
In bevorzugten Peptiden ist wenigstens einer von R7, R8, R11 und R15 Phe; R9 ist Lys; R11 ist His; oder wenigstens einer von R7, R8 und R15 ist Tyr; oder eine beliebige Kombination dieser Substitutionen liegt im Peptid vor. In anderen bevorzugten Peptiden fehlen R1, R2 und R3; alternativ fehlen R22 und R23; fehlen R20, R21, R22 und R23; oder fehlen R18, R19, R20, R21, R22 und R23.
Die Peptide können Substituenten an jedem Terminus des Peptids gebunden besitzen. Zum Beispiel kann das Peptid eine Acetyl- oder Carbamyl-Addition am N-Terminus und/oder eine Amid-Addition am C-Terminus aufweisen.
Bevorzugte Peptide bestehen aus 13 bis 16 Aminosäuren und bevorzugter bestehen sie aus 13 bis 14 Aminosäuren. Die Erfindung stellt außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Peptide der Erfindung enthalten.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung besitzen potente antibakterielle und antifungale Eigenschaften und die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Behandlung bakterieller und fungaler Infektionen unter Verwendung dieser Peptide bereit.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ansprüchen hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Aminosäure-Sequenz von Histatin 3.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Peptide bereit, bestehend aus 13 bis 20 Aminosäuren; diese Peptide umfassen definierte Teile der Aminosäure-Sequenz des natürlich vorkommenden Proteins Histatin 3 (SEQ ID NR. 1), die in 1 gezeigt ist. Zusätzlich umfassen die Peptide der Erfindung definierte Teile der Aminosäure-Sequenz von Histatin 3 mit Aminosäure-Substitutionen an bestimmten Positionen der Peptide. Diese Peptide sind hier als „Histatin-basierte Peptide" bezeichnet.
Histatine (in der Literatur auch als Histidin-reiche Proteine oder HRPs bezeichnet) sind Speichelproteine, die in der Ohrspeicheldrüse und submandibulären-sublingualen sekretorische Drüsen von Menschen und Altweltaffen produziert werden, und es wird vermutet, dass sie Teil des extraimmunologischen Abwehrsystems der Mundhöhle sind. Die Familie der natürlich vorkommenden humanen Histatine ist eine Gruppe aus zwölf Peptiden mit geringen Molekulargewichten. Die wichtigsten Familienmitglieder, die 70–80% der gesamten Familie ausmachen, sind die Histatine 1, 3 und 5, die 38, 32 beziehungsweise 24 Aminosäure-Reste umfassen.
Herstellung der Peptide
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können folglich aus natürlich vorkommenden Histatin-Quellen stammen; alternativ können sie mit rekombinanten DNA-Verfahren als Expressionsprodukte aus zellulären Quellen erhalten werden. Die Peptide können ebenfalls chemisch synthetisiert werden.
Zum Beispiel kann klonierte DNA, welche die Histatine codiert, wie von T. M. Sabatini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 495–502 (1989) und J. C. Vanderspek et al., Arch. Oral Biol. 35(2): 137–43 (1990) beschrieben, erhalten werden. cDNA, welche die Histatin-basierten Peptide codiert, kann mit rekombinanten DNA-Techniken kloniert werden, zum Beispiel unter Verwendung degenerierter Oligonucleotide, die auf der Aminosäure-Sequenz von Histatin-basierten Peptiden basieren, als Primer für eine Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion.
Alternativ können Oligonucleotide, die Histatine oder Histatin-basierte Peptide codieren, unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Ausstattung chemisch synthetisiert werden. Die Oligonucleotide können dann doppelsträngig gemacht und in Vektoren für eine Amplifikation in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen kloniert werden.
Histatin-basierte Peptide können in verschiedenen Expressionsvektor-/Wirtssystemen, die im Handel erhältlich sind, hergestellt werden oder können gemäß rekombinanten DNA- und Zellkultivierungstechniken erzeugt werden. Die Expressionsvektor-/Wirtssysteme können prokaryotische oder eukaryotische Systeme sein und können Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säuger- und virale Expressionsysteme umfassen. Die Konstruktion von Expressionsvektoren, die Histatin-basierte Peptide codieren, der Transfer der Vektoren in verschiedene Wirtszellen und die Produktion von Peptiden von den transformierten Wirtszellen kann unter Anwendung von gentechnischen Verfahren durchgeführt werden, wie es in Handbüchern, wie J. Sambrook et al., Molecular Cloning (2. Ausgabe 1989) und Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel et al., eds.), beschrieben ist.
Modifizierte Histatin-basierte Peptide können ebenfalls von klonierten DNAs, die mutierte Nucleotidsequenzen enthalten, produziert werden. Histidin-basierte Peptide, die Expressionsvektoren codieren, können infolge eines post-translationalen Processings in einem speziellen Expressionsvektor-/Wirtszellsystem modifiziert werden.
Diese Peptide können durch geringfügige chemische Modifikationen verändert werden, wie durch Addition kleiner Substituenten oder durch Modifizieren einer oder mehrerer kovalenter Bindungen innerhalb oder zwischen den Aminosäure-Resten. Die Substituenten-Gruppen können voluminös sein und können eine oder mehrere natürlichen oder modifizierten Aminosäuren umfassen. Zweckdienliche Modifikationen umfassen die Addition eines Substituenten entweder an den Amino-Terminus, den Carboxyl-Terminus oder an beide Enden des Peptids. Eine Kombination von Additionen an beide Termini ist besonders zweckdienlich. Besonders zweckdienliche Modifikationen umfassen Acetylierung oder Carbamylierung des Amino-Terminus des Peptids, oder Amidierung des Carboxyl-Terminus des Peptids. Diese Veränderungen verringern nicht signifikant die antifungalen oder antibakteriellen Aktivitäten der Peptide und scheinen das Peptid in seiner aktiven Form zu stabilisieren und bei der Prävention eines enzymatischen Abbaus dieser Peptide zu helfen.
Antifungale und antibakterielle Aktivitäten von Histatin-basierten Peptiden
Die antifungale Aktivität der natürlich vorkommenden Histatine, wie auch ihre Hemmwirkung auf mehrere orale Bakterien (wie den kariogenen Streptococcus mutans und das Parodontalpathogen Porphyromonas gingivalis) sind in vitro gezeigt worden. Zusätzlich lässt die Beobachtung, dass Polyhistidin-Peptide den Herpes-simplex-Virus in vitro inaktivieren und dass der gesamte Speichel Inhibitoren des humanen Immunschwächevirus enthält, die Möglichkeit vermuten, dass Histatine eine anti-virale Aktivität besitzen. Diese in vitro Untersuchungen stützen die mögliche klinische Anwendung von Zusammensetzungen, die Histatin-basierte Peptide enthalten, für die Behandlung lokaler und systemischer Candida-Infektionen, oraler bakterieller Erkrankungen, wie Karies und Zahnfleischerkrankungen, systemischer bakterieller Infektionen und viraler Infektionen.
Die antifungalen Aktivitäten der Histatin-basierten Peptide können in Assays durch die Abtötung von Candida albicans Blastokonidien (wie in T. Xu et al., Infect. Immun. 59(8): 2549–2554 (1991) beschrieben) bestimmt werden. Die antibakteriellen Aktivitäten der Histatin-basierten Peptide können in Assays durch die Wachstumshemmung von P. gingivalis gemessen werden. Histatin-basierte Peptide können auch mit der bakteriellen Virulenz interferieren, durch Hemmung der von B. forsythus und P. gingivalis ausgelösten Hämagglutination und durch Hemmung von Proteasen, wie Clostripain; Assays, die diese Hemmaktivitäten messen, sind folglich ebenso beim Messen der antibakteriellen Aktivitäten von Histatin-basierten Peptiden zweckdienlich.
Die antifungalen und antibakteriellen Eigenschaften der Histatin-basierten Peptide sind sowohl eine Funktion der Größe als auch der Aminosäure-Sequenz der jeweiligen Peptide. Peptide mit kürzeren Aminosäure-Sequenzen als die natürlich vorkommenden Histatine können antibakterielle und antifungale Eigenschaften aufweisen, die besser sind als die der natürlich vorkommenden Histatine, insbesondere wenn diese Eigenschaften bezogen auf das Gewicht gemessen werden.
Einige Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen einen Teil der Aminosäure-Sequenz:
Alternativ können die Peptide der vorliegenden Erfindung Teile dieser Sequenz mit Aminosäure-Substitutionen an einer oder mehreren Positionen umfassen. Bevorzugte Peptide umfassen diejenigen, in denen das Glycin an Position 9 durch Lysin oder Arginin ersetzt ist; das Lysin an Position 11 durch Histidin oder Phenylalanin ersetzt ist; ein oder mehrere Histidine an Positionen 7, 8 und 15 durch Phenylalanin, Tyrosin oder Leucin ersetzt ist; ein oder beide Lysine an Position 5 und 13 durch Arginin ersetzt ist; oder ein oder beide Arginine an Position 6 und 12 durch Lysin ersetzt ist. Kombinationen dieser Aminosäure-Substitutionen können ebenso genutzt werden.
Die Aminosäure-Substitutionen ergeben Peptide, die eine verbesserte antifungale Aktivität im Vergleich zu Peptiden zeigen, welche die native Sequenz umfassen. Zum Beispiel kann das Ersetzen von Histidin an Positionen 7, 8 oder 15 durch Phenylalanin, entweder einzeln oder in Kombination, Peptide mit erhöhten antifungalen Aktivitäten im Vergleich zu Peptiden ergeben, welche die native Sequenz umfassen. Ebenso führt das Ersetzen des Glycins an Position 9 durch Lysin oder des Lysins an Position 11 durch Histidin oder Phenylalanin, entweder einzeln oder in Kombination, zu Peptiden mit beachtlich erhöhten fungiziden Aktivitäten im Vergleich zu Peptiden mit der nativen Sequenz. Eine Acylierung oder Carbamylierung des N-Terminus der nativen Sequenz ergibt ebenfalls Peptide mit einer signifikanten antifungalen Aktivität.
Ein zusätzliches Merkmal der gesteuerten Aminosäure-Substitutionen der nativen Sequenz ist, dass bestimmte Arten von Aminosäure-Substitutionen Peptide mit verbesserten Aktivitäten ergeben, z.B. antifungale Aktivitäten bei nicht neutralen pH-Werten. Zum Beispiel führt die Substitution von Histidin an Positionen 7, 8 und 15 durch Phenylalanin zu Peptiden mit einer signifikanten antifungalen Aktivität bei pH 4,0. Peptide mit der nativen Sequenz sind im Wesentlichen ohne antifungale Aktivität bei diesem geringen pH.
Wenigstens einige der antifungalen und antibakteriellen Eigenschaften der Histatin-basierten Peptide dieser Erfindung scheinen auf der Aminosäure-Sequenz Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg zu beruhen. Peptide, welche diese Sequenz enthalten, wie auch Peptide mit einer oder mehreren an verschiedenen Positionen dieser Sequenz substituierten Aminosäuren sind wirksame antifungale und antibakterielle Agenzien. Bevorzugte Peptide umfassen Peptide, enthaltend die Aminosäuren:
Ala-Lys-Arg-Phe-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-Phe;
Ala-Lys-Arg-Phe-Phe-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-Phe-Phe-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-Phe;
Ala-Lys-Arg-His-His-Lys-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-His-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-His-His-Lys-Tyr-His-Arg-Lys-Phe-His;
Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Phe-Arg-Lys-Phe-His; und
Ala-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-Tyr.
Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Peptide sind als antifungale oder antibakterielle Agenzien ebenfalls wirksam.
Therapeutische Anwendungen
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung fungaler Infektionen, insbesondere Candida-Infektionen, wie auch bakterieller Infektionen (z.B. Infektionen mit S. mutans, P. aeruginosa oder P. gingivalis) und viraler Infektionen (z.B. Infektionen mit dem Herpessimplex-Virus oder humanen Immunschwächevirus Typ 1) verwendet sein. Vaginale, urethrale, mukosale, respiratorische, dermale, aurikuläre, orale oder ophthalmische fungale oder bakterielle Infektionen sprechen insbesondere auf eine Therapie mit Histatin-basierten Peptiden an. Mikroben, die für eine Therapie mit Histatin-basierten Peptiden spezifisch geeignet sind, umfassen:

a) Candida albicans;
b) Actinomyces actinomycetemcomitans;
c) Actinomyces viscosus;
d) Bacteroides forsythus;
e) Bacteroides fragilis;
f) Bacteroides gracilis;
g) Bacteroides ureolyticus;
h) Campylobacter concisus;
i) Campylobacter rectus;
j) Campylobacter showae;
k) Campylobacter sputorum;
l) Capnocytophaga gingivalis;
m) Capnocytophaga ochracea;
n) Capnocytophaga sputigena;
o) Clostridium histolyticum;
p) Eikenella corrodens;
q) Eubacterium nodatum;
r) Fusobacterium nucleatum;
s) Fusobacterium periodonticum;
t) Peptostreptococcus micros;
u) Porphyromonas endodontalis;
v) Porphyromonas gingivalis;
w) Prevotella intermedia;
x) Prevotella nigrescens;
y) Propionibacterium acnes;
z) Pseudomonas aeruginosa;
aa) Selenomonas noxia;
bb) Staphylococcus aureus;
cc) Streptococcus constellatus;
dd) Streptococcus gordonii;
ee) Streptococcus intermedius;
ff) Streptococcus mutans;
gg) Streptococcus oralis;
hh) Streptococcus pneumonia;
ii) Streptococcus sanguis;
kk) Treponema denticola;
ll) Treponema pectinovorum;
mm) Treponema socranskii;
nn) Veillonella parvula; und
oo) Wolinella succinogenes.

Träger, die für eine Verabreichung pharmazeutischer Agenzien an Vagina, Urethra, Ohr, Mundhöhle, Atmungswege, ophthalmische Region, verschiedene Schleimhautbereiche und Haut geeignet sind, sind bekannt und zum Beispiel in Pollock et al., U.S. Patent Nr. 4.725.576, beschrieben. Zusammensetzungen zur Behandlung einer systemischen Infektion können über verschiedene Wege, wie intravenös oder subdermal, verabreicht werden.
Zusammensetzungen, welche die Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten, können ebenso bei Präventivbehandlungen verwendet werden. Die Zusammensetzungen können Kombinationen Histatin-basierter Peptide enthalten, um die maximale Aktivität gegen sämtliche Entwicklungsformen eines Fungus oder Bakteriums zu erhalten. Die Ionenstärke, das Vorliegen verschiedener ein- und zweiwertiger Ionen und pH der Zusammensetzung können für den Erhalt einer maximalen antifungalen oder antibakteriellen Aktivität der Histatin-basierten Peptide eingestellt werden, wie es in T. Xu et al., Infect. Immun. 59(8): 2549–2554 (1991) beschrieben ist.
Zusätzlich können Expressionsvektoren, die die oben erwähnten Peptide codieren, bei antifungalen und antibakteriellen Behandlungen verwendet werden. Expressionsvektoren können in Zusammensetzungen verabreicht werden, die genetisches Material, das Histatin-basierte Peptide codiert, in Zellen von Patienten einschleusen. Zum Beispiel können auf Retroviren oder Adenoviren basierende rekombinante Expressionsvektoren für eine Infektion von Patienten verwendet werden.
Die oben beschriebenen Expressionsvektoren können in einer bakteriellen Substitutionstherapie Verwendung finden. Die bakterielle Substitutionstherapie kann zur Behandlung einer fungalen oder bakteriellen Infektion in Bereichen des Harntraktes, Reproduktionstraktes, Respirationstraktes und/oder Gastrointestinaltraktes eines Patienten angewandt werden. Die Therapie umfasst: (1) Transformieren eines bestimmten Bakteriums mit DNA, die einen Expressionsvektor umfassen, der ein oben beschriebenes Histatin-basiertes Peptid codiert, wobei dadurch eine transformierte Zelle hergestellt wird; (2) Selektieren der transformierten Zellen, die das von dem Expressionsvektor codierte Peptid exprimieren, wobei dadurch transformierte Zellen erhalten werden, die ein Histatin-basiertes Peptid exprimieren; und (3) Verabreichen der transformierten Zellen, die ein Histatin-basiertes Peptid exprimieren, in einem geeigneten Träger an den infizierten Bereich.
Eine weitere Anwendung einer bakteriellen Substitutionstherapie ist eine Behandlung fungaler oder bakterieller Infektionen der Mundhöhle. Mehrere Species des oralen Bakteriums Streptococcus können als Vehikel für die Expressionsvektoren verwendet werden. Zum Beispiel ist der rekombinante S. lactis bei der oralen Immunisierung von Mäusen gegen ein heterologes Antigen verwendet worden. Andere orale Bakterien, die als Vehikel für Expressionsvektoren verwendet werden können, Plasmide zur Konstruktion von Expressionsvektoren mit der Fähigkeit zur Amplifikation in oralen bakteriellen Wirtszellen, Transformationsverfahren und die Verabreichung von orale Bakterien enthaltenden Zusammensetzungen an Menschen, sind beschrieben worden.
Die pharmazeutische Zusammensetzungen, die bei der Behandlung fungaler, bakterieller und viraler Infektion Verwendung finden und oben diskutiert sind, sind nicht auf den Gebrauch für Menschen beschränkt, sondern können ebenfalls in der Veterinärmedizin angewandt werden.
Hämagglutinationsaktivität von Bakterien und Histatinhemmung dieser Aktivität
Selbst wenn die Beziehung zwischen Hämagglutinationsaktivität und Adhärenz auf Wirtszellen in der oralen Umgebung nicht klar ist, ist im Allgemeinen die Hämagglutinationsaktivität als ein Indikator für die bakterielle Fähigkeit zur Besiedelung anerkannt. Parodontalpathogene müssen an anderen Bakterien und Wirtszellen haften, um ihr schädliches zerstörendes Potenzial auf Parodontalgeweben zu entfalten. Es wird vermutet, dass die Hämagglutination mit der bakteriellen Besiedelung in Verbindung steht.
Die Fähigkeit zum Haften auf Erythrocyten ist von großer Bedeutung für die Wechselwirkungen zwischen Parodontalpathogenen und dem Wirt. Die unmittelbare Nähe dieser Bakterien zu Wirtsgeweben wie auch zu Erythrocyten, die in der Zahnfleischtasche während der Progression der Krankheit schwimmen, weist auf mehrere Wechselbeziehungen dieser Elemente untereinander auf. Zusätzlich benötigen parodontale Mikroorganismen Häm-haltige Produkte zum Überleben und zur Vermehrung; dieser Bedarf erfordert Wechselwirkungen mit Zellen, wie Erythrocyten, die diese Verbindungen reichlich enthalten. Von P. gingivalis ist gezeigt worden, dass es sowohl Hämagglutinine als auch Hämolysin besitzt, die für ein Haften auf Erythrocyten und eine Verwertung von Häm-Verbindungen sorgen.
Es ist gezeigt worden, dass Histatin 5 und Histatin 8 die Hämagglutination von P. gingivalis 381 hemmen. Histatin 5 soll bei einer Konzentration von 5 nmol/ml die Hämagglutination vollständig hemmen. Folglich scheint es, dass Histatine und Histatin-basierte Peptide eine Rolle bei der Hemmung des Wachstums und der schädlichen Aktivität von Bakterien in der Parodontalregion spielen können.
Clostripain-Hemmung mit Histatin-basierten Peptiden
Clostripain ist eine Endopeptidase, die von Clostridium histolyticum synthetisiert wird. Dieses Enzym mit seiner Protein-abbauenden Aktivität kann von Histatin 5 und von Histatin-basierten Peptiden gehemmt werden. Folglich können Histatin-basierte Peptide die bakterielle Funktion durch Hemmen von bakteriellen Enzymen hemmen, die für die Lebensfähigkeit von Bakterien essentiell sind.
BEISPIEL 1 MATERIAL UND METHODEN
A. Isolierung und chemische Synthese Histatin-basierter Peptide
Die Isolierung und Bestimmung der Aminosäure-Sequenz humaner Histatine werden durchgeführt, wie in F. G. Oppenheim et al., J. Biol. Chem. 263(16): 7472–7477 (1988) beschrieben. Die humane Parotissekretion von gesunden Erwachsenen wird mit Hilfe von Zitronenbonbons stimuliert, mit Curby-Cups in eisgekühlten Messzylindern gesammelt, vereinigt, dialysiert und lyophilisiert. Das gesamte Protein im humanen Parotissekret wird einer Fraktionierung auf Bio-Gel P-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) unterzogen, die in 0,05 M Ammoniumformiat-Puffer, pH 4,0, erfolgt. Die mit Histatinen angereicherte Proteinfraktionierung wird weiter unter Verwendung der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer C₁₈-Säule gereinigt. Gereinigte Histatine werden bis zur Trockene eingedampft, in deionisiertem Wasser gelöst, mittels Aminosäure-Analyse quantifiziert, lyophilisiert und bei –20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Histatin-basierte Peptide werden mit dem Festphasenverfahren von B. Merrifield, Science 232:341–47 (1986) synthetisiert. Die Peptide werden mit einem MilliGen/Bioresearch Sam-Two Peptide Synthesizer unter Verwendung von Fmoc-L-Aminosäure-Kits (Millipore, Bedford, MA) synthetisiert und auf einer TSK ODS-i20T C₁₈-Säule (5 μm, 4,6 × 250 mm) mit Umkehrphasen-HPLC (Pharmacia-LKB) gereinigt. Die gereinigten Peptide werden mittels Aminosäure-Analyse auf einem Beckman System 6300 Aminosäure-Analyzer quantifiziert.
B. Abtötung von C. albicans
1) C. albicans Ausgangsstamm
Ein gut beschriebener Stamm von C. albicans (Stamm ATCC 44505, der ursprünglich aus der menschlichen Mundhöhle isoliert wurde) wird in diesem Bioassay verwendet. Kulturen sind bei 4°C auf Sabouraud-Dextrose-Agarplatten (Difco Laboratories, Detroit, MI) bis zum Gebrauch aufbewahrt. Zellen in der stationären Wachstumsphase werden nach 18 Stunden Wachstum bei 30°C auf Sabouraud-Dextrose-Agarplatten erhalten. Die Kolonien werden geerntet und in 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (PPB), pH 7,4, suspendiert.
Um das logarithmische Wachstum zu induzieren, wird ein Aliquot des C. albicans Ausgangsstammes in Sabouraud-Dextrose-Bouillon suspendiert und bei 30°C in einem Wasserbadschüttler inkubiert. Die Wachstumsphase wird durch Entnahme von Aliquots der Kultur in einstündigen Intervallen bestimmt, um die optische Dichte (O.D.) bei 560 nm zu kontrollieren. Die frühe log-Phase wird nach 4 bis 6 Stunden erreicht, was durch eine O.D. von etwa 0,6 angezeigt wird. Die Zellen in der log-Phase werden geerntet und in gleicher Weise in dem Blastokonidien-Abtötungsassay verwendet, wie es für die Zellen der stationären Phase beschrieben ist. Eine Endkonzentration von 10⁵ Zellen/ml (entweder Pilzzellen der stationären oder log-Phase) wird in allen Assays eingesetzt.
(2) Suspensionspuffer
Der in dem Blastosporen-Abtötungsassay eingesetzte Suspensionsstandardpuffer ist 0,01 M PPB, pH 7,4. Ein alternativer Suspensionspuffer, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), pH 7,4, kann ebenfalls eingesetzt werden.
(3) Bioassays
Der folgende Assay wird zur Bewertung der Wirkungen von Histatinen auf die Abtötung von Blastokonidien von C. albicans eingesetzt.

a. Für das Abtöten im Blastokonidien-Assay können 50 μl Aliquots von Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml), in Suspensionspuffer verdünnt, an Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (COSTAR, Cambridge, MA) 15 Minuten bei Raumtemperatur binden und werden dann mit einem gleichen Volumen eines Histatin-Peptids in Suspensionspuffer 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Kontrollen werden ohne Histatin-Peptid ausgeführt. Nach der Inkubation werden die Platten dreimal mittels Zentrifugation bei 1.000 × g 5 Minuten gewaschen und mit Aliquots von 45°C warmer geschmolzener Sabouraud-Dextrose-Bouillon (Difco), die 2% Agarose enthielt, bedeckt. Die Platte wird dann 8 Stunden bei 30°C inkubiert. Unter derartigen Bedingungen teilen sich lebende Zellen und beginnen Kolonien zu bilden, während tote Zellen als einzelne Zellen verbleiben. Um den Prozentsatz abgetöteter Blastokonidien zu bestimmen werden insgesamt 100 einzelne Zellen und/oder Kolonien unter einem Nikon Umkehrphasenmikroskop bei einer 400-fachen Vergrößerung ausgezählt. Das Ausmaß des Abtötens wird mit Hilfe der Formel: [1 – (Anzahl an Kolonien in der behandelten Probe)/(Anzahl an Kolonien in der Kontrolle)] × 100% berechnet.

(4) Statistikanalyse
Die Daten werden durch Berechnen des Mittelwerts und der Standardabweichung von dreifach angesetzten Assays erhalten. Aus der Dosis-Antwort-Beziehung werden die Dosen bestimmt, die eine 50% Abtötung (LD₅₀) bewirken.
C. BAKTERIENWACHSTUMSHEMM- UND ZELLABTÖTUNGSASSAYS
(1) Bakterienstämme und Kultivierungsbedingungen

a. Das bei einer Untersuchung verwendete Bakterium, Porphyromonas gingivalis Stamm A7A1-28, ist ein typischer pathogener Schlüsselorganismus, der mit destruktiven Parodontalerkrankungen assoziiert ist. Die Bakterien werden in angereicherter Todd-Hewitt-Bouillon (ETHB, Difco Lab., Detroit, MI) mehrfach subkultiviert. Die Mikroorganismen werden in denselben 20% und 50% Glycerol haltigen Bouillons bei –20°C beziehungsweise –70°C aufbewahrt. Diese dienen als Ausgangskulturen, von denen alle Präparate abstammen. Arbeitskulturen wurden durch einen wöchentlichen Transfer auf Hirn-Herz-Infusion anaerobe Schafblut-Agarplatten (BHIA, Becton Dickinson and Co., Cockeysville, MD) und Trypton-Soja anaerobe Schafblut-Agarplatten (TSA Becton Dickinson and Co., Cockeysville, MD) gepflegt. Platten werden 3 bis 4 Tage unter strikt anaeroben Bedingungen inkubiert. Für den bakteriostatischen Assay werden die Bakterien von den Platten gesammelt, in die zuvor erwähnte Bouillon überimpft und bei 37°C unter strikt anaeroben Bedingungen 24 bis 48 Stunden angezogen.
b. Zwei andere Bakterienspecies werden in einem Assaysystem für die Bakterienzellabtötung verwendet. Diese Bakterienspecies sind Streptococcus mutans Stamm SJ32 und Pseudomonas aeruginosa ATCC Hinterlegungsnummer 27853. Die Assays werden unter Verwendung flüssiger Übernachtkulturen (Nährbouillon für P. aeruginosa; Todd-Hewitt-Bouillon für S. mutans) von Wachstumsmedien von gefrorenen Ausgangsstämmen dieser Bakterienspecies durchgeführt. In dem Assay werden die Bakterien in Assay-Puffer (10 mM Kaliumphosphat, pH 6,0, mit 20 mM NaCl für P. aeruginosa; und 10 mM Kaliumphosphat, pH 5,2, mit 20 mM NaCl für S. mutans) auf eine Konzentration von 2 × 10⁵ KBE/ml (1 × 10⁹ KBE/OD/ml) verdünnt und mit dem gleichen Volumen (250 μl) Peptid vereint, um 500 μl Inkubationsmischung mit einer Endkonzentration von 10⁵ KBE/ml zu erhalten. Kontrollen bilden Puffer und Bakterien aber ohne Peptid. Nach Inkubation bei 37°C (30 Minuten für P. aeruginosa; und 60 Minuten für S. mutans) werden die Mischungen auf Agarmedien (Nähragar für P. aeruginosa; und Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Glucose für S. mutans) ausplattiert und inkubiert, bis sich Kolonien entwickeln. Die durchschnittliche Koloniezahl wird von mindestens 4 Platten bestimmt und die prozentuale Abtötung wird durch Vergleich der Koloniezahl von den Kontrollkulturen versus Koloniezahl von Peptid-haltigen Assay-Mischungen ermittelt.

(2) Bakteriostatischer Mikroverdünnungsassay
Eine Modifikation des typischen Mikroverdünnungsassays für die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) von antimikrobiellen Agenzien wird genutzt, um die bakteriostatische Aktivität der Peptide zu untersuchen. Ein standardisiertes Inokulum (P. gingivalis) wird einer Verdünnungsreihe von antimikrobiellen Peptiden in einem angereicherten Flüssigmedium ausgesetzt, das für das Wachstum anaerober Bakterien geeignet ist. Der Test ist für eine Durchführung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen angepasst. Es ist gezeigt worden, dass Ergebnisse mit dem Mikroverdünnungsverfahren mit Ergebnissen anderer Bestimmungsverfahren der antimikrobiellen Empfindlichkeit vergleichbar sind, wie das Verdünnungsverfahren, das Agarverdünnungsverfahren und das Bouillon-Blättchen-Elutionsverfahren. In einem typischen Assay wird die Mikrotiterplatte zu mehreren Zeitpunkten nach dem Animpfen auf ein sichtbares Wachstum untersucht. Die hier genutzte Modifikation basiert auf dem spektrophotometrischen Ablesen der Mikrotiterplatten nach Inkubation.
Mikroorganismen von Kulturen, die auf den bereits erwähnten Platten gehalten wurden, werden in 5 ml oben erwähnte Bouillon überimpft und über Nacht bei 37°C unter strikt anaeroben Bedingungen unter ständigem Schütteln auf einem Minischüttler (IKA-Labortechnik, Staufen i. Br., Deutschland) kultiviert. Die Bakterien werden angezogen, bis sie die späte log-Phase erreichen und werden dann in denselben Bouillons auf eine optische Dichte (O.D.) von 0,1 bei 560 nm suspendiert. Die Peptide werden in 0,01 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7, verdünnt. 40 μl Aliquots der Peptidverdünnungen werden zu jeder Vertiefung mit U-Boden einer Mikrotiterplatte (Costar, Cambridge, MA) gegeben, um Endkonzentrationen von 2000, 1000, 500 und 250 μM zu erhalten. 20 μl Bakterieninokulum werden zu den Vertiefungen gegeben. Zum Schluss werden 100 μl geeignete Bouillon zu jeder Vertiefung gegeben. Die optische Dichte der Vertiefungen der Mikrotiterplatte wird mit Hilfe eines auf 550 nm eingestellten Mikroplattenlesers ermittelt und die Platte wird dann unter strikt anaeroben Bedingungen 24 Stunden inkubiert. Kontrollen werden durch Ersetzen der Peptidverdünnungen mit ausschließlich PBS angesetzt. Nach der Inkubation werden die Mischungen in jeder Vertiefung manuell gemischt, um sedimentierte Bakterien zu resuspendieren und die Platte wird dann wieder gelesen. Die Versuche werden zweimal zu jedem Zeitpunkt durchgeführt. Die biologische Aktivität wird gemäß der folgenden Former berechnet: 100 – [[(Fin ODexp – In ODexp)/(Fin ODctr – In ODctr)] × 100]wo:

Fin ODexp: die OD der Versuchsreihe am Versuchsende ist;
In ODexp: die OD der Versuchsreihe zu Versuchsbeginn ist;
Fin ODctr: die OD der Kontrollreihe am Versuchsende ist; und
Fin ODctr: die OD der Kontrollreihe zu Versuchsbeginn ist.

Zusätzlich wird die prozentuale Zunahme der Zeit für das Erreichen des Wachstums der mittleren log-Phase berechnet.
D. HEMMUNG VON HÄMAGGLUTINATIONSASSAYS
(1) Stämme und Wachstumsbedingungen für Hämagglutinationsassays.
Der P. gingivalis Stamm von Abschnitt C (1) wird ebenfalls für die Hämagglutinationsassays verwendet. Die Bakterienwachstums- und Kultivierungsbedingungen sind ebenfalls wie die in Abschnitt C (1) beschriebenen.
(2) Hämagglutinationsassay
Ein klassischer Assay wird für die Bestimmung des Hämagglutinationspotenzials des P. gingivalis Stammes genutzt. Mikroorganismen werden in BFB-Bouillon überimpft und über Nacht, ungefähr 24 Stunden, bei 37°C unter strikt anaeroben Bedingungen unter ständigem Schütteln auf einem Minischüttler (IKA-Labortechnik, Staufen i. Br., Deutschland) kultiviert. Die Bakterien werden mittels 20 Minuten Zentrifugation mit 3.000 rpm bei 4°C geerntet, zweimal in 0,01 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,4, gewaschen und im selben Puffer zu einer optischen Dichte von 1,0 bei 550 nm suspendiert. Erythrocyten sind von einem jungen Mann mit Blutgruppe 0 erhalten. (Es werden keine Unterschiede bei der Hämagglutination in Versuchen mit verschiedenen AB0-Blutgruppen beobachtet). 1 ml Blut wird zu jedem Zeitpunkt entnommen, zweimal in PBS mit 1.000 rpm 10 Minuten bei 4°C gewaschen und im selben Puffer auf eine 2% (v/v) Endkonzentration suspendiert. 50 μl Bakteriensuspension werden für eine Verdünnungsreihe in PBS (doppelte Schritte) in einer Mikrotiterplatte mit 96 U-Boden Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) angesetzt. 50 ml Erythrocytensuspension werden zu jeder Vertiefung gegeben. Kontrollen ohne Bakterien oder Erythrocyten werden ebenfalls angesetzt. Die Mikrotiterplatte wird leicht geschüttelt und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Eine Sichtprüfung vor einem weißen Hintergrund wird für die Bestimmung der Hämagglutination angewandt. Das Ausmaß der Hämagglutination wird als keine (–), mäßige (+/–) oder starke (+) Hämagglutination eingestuft. Erythrocyten in den Kontrollvertiefungen mit PBS präzipitieren in der Mitte der Vertiefung, wohingegen Erythrocyten-Bakterien-Aggregate am Rand des Bodens präzipitieren. Der Hämagglutinationstiter wird als der Reziprokwert der höchsten Verdünnung der Bakteriensuspension ausgedrückt, die eine sichtbare Hämagglutination liefert.
(3) Histatin-Peptid-Hemmung des Hämagglutinationsassays
Die Präparation von Erythrocyten und Bakteriensuspensionen erfolgt auf dieselbe Weise wie für den Hämagglutinationsassay. 50 μl Histatin-Peptid-Lösungen werden in PBS in einer U-Boden Mikrotiterplatte verdünnt, wobei die verschiedenen Konzentrationen doppelt angesetzt werden und 600 nmol/ml die höchste Konzentration ist. Die verwendete Bakterienkonzentration ist normalerweise das Doppelte der minimalen Konzentration, die die stärkste Hämagglutination ergibt. Gleiche Volumina der Bakteriensuspension werden in die Vertiefungen gegeben, die die Histatin-Peptide enthalten. Zuletzt werden 50 μl Erythrocytensuspension in jede Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wird leicht geschüttelt und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Kontrollen werden durch Ersetzen des Peptid-Verdünnungen mit ausschließlich PBS angesetzt. Die Versuche werden wenigstens zweimal durchgeführt. Die geringste Histatin-Peptid-Konzentration ohne eine Hämagglutination wird nach visueller Prüfung bestimmt. Die höchste eingesetzte Histatin-Peptid-Endkonzentration beträgt 100 nmol/ml.
E. CLOSTRIPAIN-ASSAYS
Clostripain von Clostridium histolyticum (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) wird in deionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 1 mg/ml (300 Einheiten/mg) eingestellt und durch Zugabe von 10 mmol/l DTT aktiviert. Um seine hydrolytische Aktivität zu bestimmen wird Clostripain zu 50 nmol/l Hepes-Puffer, pH 7,5, der 80 μmol/l BAPNA (Benzoyl-arginin-p-nitroanilid) enthält, zusammen mit 5,6 μmol/l Histatin-Peptid-Inhibitor gegeben. Als Kontrolle werden Assays durchgeführt, die keinen Histatin-Peptid-Inhibitor enthalten. Die Aktivität wird bei 405 nm unter Verwendung eines Molecular Devices V_max Mikrotiterplatten-Lesers fortlaufend kontrolliert. Die Aktivitäten werden aus den maximalen Geschwindigkeiten der Substrat-Hydrolyse bestimmt. Die Assays werden doppelt ausgeführt und die Mittelwerte auf die Kontrollen normiert. Sequenz Auflistung

Claims

Ein im Wesentlichen reines Peptid, das aus zwischen 13 und 20 Aminosäuren einschließlich besteht, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz besitzt: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19-R20-R21-R22-R23 worin R1 Asp ist oder fehlt; R2 Ser ist oder fehlt; R3 His ist oder fehlt; R4 Ala ist; R5 Lys, Gln oder Arg ist; R6 Arg, Gln oder Lys ist; R7 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R8 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R9 Gly, Lys oder Arg ist; R10 Tyr ist; R11 His oder Phe ist; R12 Arg, Gln oder Lys ist; R13 Lys, Gln oder Arg ist; R14 Phe ist oder fehlt; R15 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R16 Glu ist oder fehlt; R17 Lys ist oder fehlt; R18 His ist oder fehlt; R19 His ist oder fehlt; R20 Ser ist oder fehlt; R21 His ist oder fehlt; R22 Arg ist oder fehlt; R23 Gly ist oder fehlt; worin Gln nicht gleichzeitig die Positionen R5, R6, R12 und R13 der Aminosäuresequenz einnehmen kann.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin wenigstens einer von R7, R8, R11 und R15 Phe ist.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin R9 Lys ist oder R11 His ist, oder R9 Lys und R11 His ist.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin wenigstens einer von R7, R8 und R15 Tyr ist.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin R1, R2 und R3 fehlen.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin (i) R22 und R23 fehlen oder (ii) R20, R21, R22 und R23 fehlen oder (iii) R18, R19, R20, R21, R22 und R23 fehlen.
Das Peptid nach Anspruch 1, worin das Peptid wenigstens eine Modifikation besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Acetyl- oder Carbamyl-Addition am N-Terminus; und (b) einer Amid-Addition am C-Terminus.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein im Wesentlichen reines Peptid, das aus zwischen 13 und 20 Aminosäuren einschließlich besteht, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz besitzt: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19-R20-R21-R22-R23 worin R1 Asp ist oder fehlt; R2 Ser ist oder fehlt; R3 His ist oder fehlt; R4 Ala ist; R5 Lys, Gln oder Arg ist; R6 Arg, Gln oder Lys ist; R7 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R8 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R9 Gly, Lys oder Arg ist; R10 Tyr ist; R11 His oder Phe ist; R12 Arg, Gln oder Lys ist; R13 Lys, Gln oder Arg ist; R14 Phe ist oder fehlt; R15 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R16 Glu ist oder fehlt; R17 Lys ist oder fehlt; R18 His ist oder fehlt; R19 His ist oder fehlt; R20 Ser ist oder fehlt; R21 His ist oder fehlt; R22 Arg ist oder fehlt; R23 Gly ist oder fehlt; worin Gln nicht gleichzeitig die Positionen R5, R6, R12 und R13 der Aminosäuresequenz einnehmen kann.
Verwendung, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer fungalen oder bakteriellen Infektion in einem Säuger, einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptids, das aus zwischen 13 und 20 Aminosäuren einschließlich besteht, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz besitzt: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19-R20-R21-R22-R23 worin R1 Asp ist oder fehlt; R2 Ser ist oder fehlt; R3 His ist oder fehlt; R4 Ala ist; R5 Lys, Gln oder Arg ist; R6 Arg, Gln oder Lys ist; R7 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R8 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R9 Gly, Lys oder Arg ist; R10 Tyr ist; R11 His oder Phe ist; R12 Arg, Gln oder Lys ist; R13 Lys, Gln oder Arg ist; R14 Phe ist oder fehlt; R15 His, Phe, Tyr oder Leu ist; R16 Glu ist oder fehlt; R17 Lys ist oder fehlt; R18 His ist oder fehlt; R19 His ist oder fehlt; R20 Ser ist oder fehlt; R21 His ist oder fehlt; R22 Arg ist oder fehlt; R23 Gly ist oder fehlt; worin Gln nicht gleichzeitig die Positionen R5, R6, R12 und R13 der Aminosäuresequenz einnehmen kann.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder die Verwendung nach Anspruch 9, worin wenigstens einer von R7, R8, R11 und R15 Phe ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder die Verwendung nach Anspruch 9, worin R7, R8 und R15 Tyr sind.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder die Verwendung nach Anspruch 9, worin das Peptid wenigstens eine Modifikation besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Acetyl- oder Carbamyl-Addition am N-Terminus; und (b) einer Amid-Addition am C-Terminus.
Das Peptid nach Anspruch 2, worin R7, R8 und R15 jeweils Phe ist.
Das Peptid nach Anspruch 4, worin R7, R8 und R15 jeweils Tyr ist.
Die Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 10, worin R7, R8 und R15 jeweils Phe ist.