DE60036456T2

DE60036456T2 - Antimikrobiell wirksames oder endotoxin neutralisierendes polypeptid

Info

Publication number: DE60036456T2
Application number: DE60036456T
Authority: DE
Inventors: David M. Gaithersburg MANN
Original assignee: Agennix Inc
Current assignee: Agennix Inc
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: WO2000049040A3; JP2002541066A; US6399570B1; EP1151009A2; US7244706B2; AU2822600A; MXPA01007956A; EP1151009B1; CA2362153C; CA2362153A1; WO2000049040A2; DE60036456D1; ATE373679T1; US20030105006A1; CN1362969A; DK1151009T3; ES2293892T3; AU758150B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Obwohl Menschen sich einem kontinuierlichen Risiko von Infektionen durch mikrobielle Krankheitserreger ausgesetzt sehen, überleben die meisten diese wiederholten Angriffe durch Erzeugen von schnellen Antworten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Proteinen und kleinen Polypeptiden benützen. Dieser Teil des angeborenen Immunsystems stellt einen elementareren Wirtsabwehrmechanismus dar als die langsam wirkenden klonalen Systeme, da antimikrobielle Polypeptide auch durch niedere Tiere, Insekten und selbst Pflanzen eingesetzt werden (H. G. Roman, J. Marsh und J. A. Goode, Herausgeber, Antimicrobial Peptides (John Wiley & Sons Ltd., New York, NY, 1994; Hoffmann et al., Curr. Opin. Immunol. 8: 8-13 (1996)).
Neben dem Inhibieren des Wachstums von mikrobiellen Krankheitserregern neutralisiert das Immunsystem auch eine Vielzahl von durch eindringende Mikroben erzeugten Toxinen. Ein besonders toxisches Produkt, das durch gramnegative Bakterien erzeugt wird, ist Endotoxin. Endotoxin (Lipopolysaccharid; LPS) ist eine konstitutive Komponente der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien und wird freigesetzt, wenn die Bakterien sterben oder sich vermehren (Rietschel et al., Immunobiology 187: 169-190 (1993)). Man schätzt, dass sich in den Vereinigten Staaten jährlich ungefähr 400000 Patienten mit einer bakteriellen Sepsis vorstellen, von denen am Ende 100000 an einem septischen Schock sterben und etwa die Hälfte dieser Fälle durch gramnegative Bakterien verursacht sind (Parrillo, J. E., Shock syndromes related to sepsis, in Cecil Textbook of Medicine (20. Auflage), J. C. Bennett und F. Plum, Herausgeber, W. B. Saunders Company, Philadelphia, 496-501 (1996)). Die gramnegative Sepsis und der septische Schock sind hauptsächlich auf die Endotoxininduzierte übermäßige Produktion und Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen durch Zellen des Immunsystems, insbesondere Makrophagen, zurückzuführen (Beut ler, B. und A. Cerami, Annu. Rev. Biochem., 57: 505-518 (1988) Rosenstreich, D. L. und S. Vogel, Central role of macrophages in the host response to endotoxin, S. 11-15, in D. Schlessinger (Herausgeber), Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980)). TNF-α ist der Hauptvermittler der syntemischen Endotoxin-Toxizität (Beutler, B. und A. Cerami, Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Heumann et al., J. Endotoxin Res. 3: 87-92 (1996)).
Lipid A ist der toxische Anteil des Endotoxins (Rietschel et al., Immunobiology 187: 169-190 (1993)). Monoklonale Anti-Lipid-A-Antikörper wurden hinsichtlich der Behandlung von gramnegativer Sepsis und septischen Schock getestet, deren klinische Wirksamkeit wurde jedoch nicht übereinstimmend gezeigt (Verhoef et al., J. Antimicrob. Chemother. 38: 167-182 (1996)), wahrscheinlich wegen deren ungenügenden Fähigkeit an Endotoxine zu binden und diese zu neutralisieren (Warren et al., J. Exp. Med. 177: 89-97 (1993)). Neuere Entwicklungen umfassen die Identifikation von synthetischen Anti-Endotoxin-Polypeptiden, welche Polymyxin B nachahmen (Rustici et al., Science 259: 361-365 (1993)) und eine Anzahl von kationischen Anti-Endotoxin-Polypeptiden, die sich von Wirtsabwehrproteinen ableiten. Diese umfassen ein vom bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Protein abgeleitetes rekombinantes 23 kDa-Fragment (Fisher et al., Crit. Care Med. 22: 553-558 (1994); Marra et al., Crit. Care Med. 22: 559-565 (1994)), ein von Bienen-Melittin abgeleitetes 28-mer Peptid (Gough et al., Infect. Immun. 64: 4922-4927 (1996)), ein aus einem kationischen antibakteriellen 28 kDa-Protein abgeleitetes 33-mer Peptid (Larrick et al., Infect. Immun. 63: 1291-1297 (1995)) und ein synthetisches Polypeptide, das auf der Kristallstruktur von Limulus-Anti-LPS-Faktor beruht (Reid et al., J. Biol. Chem. 271: 28120-28127 (1996)).
Lactoferrin (LF) ist ein eisenbindendes 80 kDa-Glykoprotein, das ausschließlich durch Neutrophile und Schleimhautepithel synthetisiert und nach deren Aktivierung durch inflammatorische Stimuli extrazellulär freigesetzt wird (Sanchez et al., Arch. Dis. Child. 67: 657-61 (1992); P. F. Levay und M. Viljoen, Haematologica 80: 252-67 (1995); B. Lonnerdal und S. Iyer, Annu. Rev. Nutr. 15: 93-110 (1995); R. T. Ellison, Adv. Exp. Med. Biol. 357: 71-90 (1994)). Man nimmt an, dass es ein Säugetierwirtsabwehrprotein ist, wobei dessen Schutzmechanismus kaum verstanden ist. In vivo-LF führt zu einer antibakteriellen prophylaktischen Wirkung (Trumpler et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-3 (1989)). Es wurde beschrieben, dass die in vivo-LF-Behandlung die Inzidenz von gramnegativer Bacteriämie verringert (Trumpler et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-313 (1989)). Es wurde in vitro gezeigt, dass es das Wachstum einer Vielzahl von Mikroben durch Komplexbildung mit Eisen inhibiert (J. D. Oram und B. Reiter, Biochim. Biophys. Acta 170: 351-65 (1968); A. Bezkorovainy, Adv. Exp. Med. Biol. 135: 139-54 (1981)).
LF enthält eine stark basische Region nahe des N-Terminus und bindet eine Vielzahl von anionischen biologischen Molekülen, einschließlich Lipid A (Appelmelk et al., Infect. Immun. 62: 2628-2632 (1994)) und Glykosaminoglykane, welche auf der Oberfläche der meisten Zellen und in den meisten extrazellulären Matrices vorkommen (Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Lactoferricin H (Reste 1-47) und Lactoferricin B (Reste 17-41) werden durch Pepsinolyse aus humanem bzw. bovinem LF freigesetzt, und können eine wirksamere antibakterielle Aktivität als die nativen Proteine aufweisen (Bellamy et al., Biochim. Biophys. Acta. 1121: 130-136 (1992)). Es wurde beschrieben, dass eine aus den Resten 28-34 bestehende Region zu der hochaffinen Bindung von humanem LF und Lactoferricin H an Endotoxin beiträgt (Elass-Rochard et al., Biochem. J. 312: 839-845 (1995)). Es wurde gezeigt, dass LF und Lactoferricin B die Endotoxin-induzierte Interleukin-6-Antwort in humanen monozytären Zellen inhibieren (Mattsby-Baltzer et al., Pediatr. Res. 40: 257-262 (1996)). Zuvor identifizierte Fragmente von LF, welche eine antimikrobielle Aktivität aufweisen, wurden aus Pepsinhydrolysaten von LF isoliert (Tomita et al., (1993), U.S. Patent Nr. 5,214,028 ; Tomita et al., (1994), U.S. Patent Nr. 5,304,633 , Tomita et al., (1994), U.S. Patent Nr. 5,317,084 ; Tomita et al., (1997), U.S. Patent Nr. 5,656,591 ).
Frühere Studien haben nachgewiesen, dass die N-terminalen 33 Reste von humanem LF die minimale Sequenz darstellt, welche das Binden des Proteins an anionische Polysaccharide, wie Glykosaminoglykane, vermittelt (Mann et al., J. Biol Chem. 269: 23661-7 (1994)). Diese Sequenz enthält einen kationischen Kopf (Reste 1-6) und einen Schwanz (Reste 28-33), welche sich unter Bildung der Glykosaminoglykan-Bindungsstelle vereinigen. Diese Studien haben jedoch keinen Nachweis erbracht, der zeigt, dass dieses Polypeptid eine antimikrobielle oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Hierin ist ein 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptid beschrieben, das durch proteolytischen Verdau des Lactoferrinmoleküls erzeugt wird. Das 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptid weist eine antimikrobielle Aktivität sowie eine Endotoxin neutralisierende Aktivität auf. Ebenfalls hierin beschrieben sind funktionelle Varianten des 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptids, welche N-terminale und C-terminale Trunkierungen des 6 kDa-Polypeptids umfassen, und andere Modifikationen des Polypeptids, wie Aminosäuresubstitutionen, welche die Aktivität des Polypeptids beibehalten oder erhöhen.
Demnach stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid der Formel: B₁-R1-B₂-R2 bereit, wobei (i) B₁ und B₂ für Cluster von Aminosäuren stehen, die 2 bis 7 Aminosäuren enthalten, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind, (ii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren ist und einen Hydrophobizitätswert (grand average of hydropathicity value) von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist, (iii) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA umfasst, (iv) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden, und (v) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid der Formel: B₁-R1-B₂-R2 bereit, worin (i) B₁ und B₂ für Cluster von Aminosäuren stehen, die 2 bis 7 Aminosäuren enthalten, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind, (ii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren ist und einen Hydrophobizitätswert (grand average of hydropathicity value) von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist, (iii) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst, und (iv) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden, wobei das isolierte Polypeptid (a) SEQ ID NO:2 oder (b) ein Fragment von SEQ ID NO:2 umfasst, bei dem bis zu 17 Aminosäuren vom C-Terminus und/oder bis zu 3 Aminosäuren vom N-Terminus fehlen; und wobei das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid der Formel: B₁-R1-6₂-R2 bereit, wobei (i) B₁ die Aminosäuresequenz GRRRRS aufweist, (ii) B₂ für einen Cluster von Aminosäuren steht, der 2 bis 7 Aminosäuren enthält, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind, (iii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren ist und einen Hydrophobizitätswert (grand average of hydropathicity value) von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist, (iv) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst, (v) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden, und (vi) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist. Die Erfindung stellt zudem ein isoliertes Polypeptid der Formel: B₁-R1-B₂-R2 bereit, wobei (i) B₁ für einen Cluster von Aminosäuren steht, der 2 bis 7 Aminosäuren enthält, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind, (ii) B₂ die Aminosäuresequenz MRKVRG aufweist, (iii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren ist und einen Hydrophobizitätswert (grand average of hydropathicity value) von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist, (iv) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst, (v) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden, und (vi) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit, welche aus einer mikrobiellen Infektion resul tiert, eines Individuums bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutischen Menge des antimikrobiellen Polypeptids oder einer funktionellen Variante davon an das Individuum. Dieses Medikament ist geeignet zur Behandlung von bakteriellen Infektionen. Dieses Medikament kann auch verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die aus Infektionen resultieren, die durch ein Mycobacterium verursacht werden, wie Tuberkulose oder Lepra. Dieses Medikament ist auch geeignet zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, die eine bakterielle Sepsis in dem infizierten Individuum verursachen. Dieses Medikament kann auch verwendet werden, um Infektionen zu behandeln, die durch andere Mikroben verursacht werden, wie Pilzinfektionen. Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um die therapeutische Wirkung eines antimikrobiellen Wirkstoffs in einem Patienten zu verstärken, indem das erfindungsgemäße Polypeptid mit dem antimikrobiellen Wirkstoff verabreicht wird.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Endotoxin neutralisierenden Polypeptids oder einer funktionellen Variante davon bei der Herstellung eines Medikaments zum Neutralisieren von zirkulierendem Endotoxin in einem Patienten. Ähnliche Verfahren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen das Neutralisieren von Endotoxin in einem Produkt durch Inkontaktbringen des Endotoxins mit dem erfindungsgemäßen Endotoxin neutralisierenden Polypeptid oder einer funktionellen Variante davon.
Hierin ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Verstärken der Endotoxin neutralisierenden und antimikrobiellen Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids. Dies kann beispielsweise durch Einstellen der Ionenstärke der unmittelbaren Umgebung erfolgen. Zusätzlich sind Verfahren zum Erhöhen der in vivo-Erzeugung des 6 kDa-Fragments in einem Patienten durch in vivo-Proteasen offenbart. Solche Verfahren beinhalten das Empfindlichmachen von LF gegenüber Proteolyse sowie das Erhöhen der Aktivität der Proteasen, welche das 6 kDa-Fragment aus LF erzeugen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist eine diagrammatische Darstellung der Inhibierung des Wachstums von E. coli durch verschiedene Dosen eines Heparin-gereinigten 6 kDa-Polypeptids, das aus dem N-Terminus von humanem LF durch Cathepsin D (Quadrate) oder Pepsin (Kreise) erzeugt wurde. Alle Punkte stellen den Durchschnitt von Dreifachmessungen dar und die Standardabweichungsbalken sind kleiner als die Symbole.
2 ist eine Wachstumskurve von E. coli 0111 in Gegenwart von 50 μM LF oder den N-terminalen 27-mer, 26-mer, 33-mer LF-Polypeptidfragmenten über einen Zeitverlauf von 7 Stunden.
3 ist eine diagrammatische Darstellung des Wachstums von E. coli 0111 nach 5 Stunden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der 33-mer oder 27-mer Polypeptide, welche Aminosäuresequenzen des N-Terminus von LF entsprechen.
4 ist eine diagrammatische Darstellung der Wirkung der Ionenstärke auf die antimikrobielle Aktivität des katheptischen 6 kDa-LF-Polypeptidfragments.
5 ist eine diagrammatische Darstellung der Fähigkeit der Polypeptide, des 6 kDa-LF-Fragments, des 33-Mers und des 27-Mers, die antimikrobielle Aktivität von Rifampicin zu erhöhen.
6 ist eine diagrammatische Darstellung der Fähigkeit der angegebenen Konzentrationen des 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptids, des 33-Mers, des 27-Mers, von LF und Polymyxin B, die Endotoxinaktivität von isoliertem Lipid A zu neutralisieren.
7 ist eine diagrammatische Darstellung der dosisabhängigen Suppression durch LF-33 (dem 33-Mer) der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion durch die mononukleäre leukozytische Zelllinie RAW 264.7. Vor dem Inkontaktbringen mit RAW 264.7 Zeilen wurde Endotoxin bei 10 nm/ml bei 37°C für 1 h mit LF-33 bei den an gegebenen Konzentrationen inkubiert. Die Daten sind die Mittelwerte von Dreifachmessungen in repräsentativen Experimenten.
8 ist eine diagrammatische Darstellung der dosisabhängigen Suppression durch LF-33 der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion durch RAW 264.7 Zellen in Gegenwart von humanem Serum. Vor dem Inkontaktbringen mit RAW 264.7 Zellen wurde E. coli LPS bei 10 ng/ml bei 37°C für 1 h mit humanem Serum und LF-33 bei den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Die Daten sind die Mittelwerte von Dreifachmessungen in repräsentativen Experimenten.
9 ist eine diagrammatische Darstellung des in vivo-Schutzpotentials des 6 kDa-LF-Fragments in der Wirtsabwehr gegen eine bakterielle Infektion.
10 ist eine diagrammatische Darstellung der antimikrobiellen Wirkungen verschiedener Konzentrationen von LF-33 (33-Mer) auf das Wachstum von Mycobacteria, M. smegmatis BH1.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass ein aus Lactoferrin (LF) erzeugtes Wirtsabwehrpolypeptid, eine signifikant stärkere antimikrobielle und Endotoxin neutralisierende Aktivität als früher charakterisierte Fragmente von LF aufweist. Das aus LF erzeugte Wirtsabwehrpolypeptid unterscheidet sich von dem Ausgangs-LF auch in dem Mechanismus, mittels dessen dieses das mikrobielle Wachstum inhibiert. Während man bei LF davon ausgeht, dass dieses durch Binden von Eisenionen und vorübergehende Starvation der Mikroben hinsichtlich dieses benötigten Ion wirkt, wirkt das aus LF erzeugte 6 kDa-Polypeptid durch einen Eisen-unabhängigen Mechanismus durch Binden an die Außenoberfläche der Mikrobe und Schädigen der Zellmembran unter Erzeugung einer Undichtigkeit der Zelle. Die antimikrobielle Aktivität, welche das 6 kDa-Polypeptid zeigt, ist stabiler (nicht transient) als diejenige des Volllängen-LF. Das Wirtsabwehrpolypeptid wird durch in vitro und eventuell in vivo Verdau von LF durch Cathepsin D erzeugt. Das Produkt, ein ungefähr 6 kDa-Polypeptidfragment, besteht aus den N-terminalen 49 Aminosäuren von LF, wobei die Aminosäuren unter Bildung eines einzigen kontinuierlichen Amid-Verknüpfungsrückgrats verbunden sind. Von besonderem Interesse ist, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide signifikant höhere Aktivitäten unter physiologischen pH- und Ionenstärkebedingungen aufweisen als die früher identifizierten LF-Fragmente, die durch Pepsin-Verdau erzeugt wurden (Bellamy LF-Fragmente et al., Biochimica et Biophysica Acta 1121: 130-136 (1992); Tomita et al., (1993), U.S. Patent Nr. 5,214,028 ; Tomita et al., (1994), U.S. Patent Nr. 5,304,633 ; Tomita et al., (1994), U.S. Patent Nr. 5,317,084 ; Tomita et al., (1997), U.S. Patent Nr. 5,656,591 ). Ein solches durch Pepsin erzeugtes Fragment (Bellamy et al., Biochimica et Biophysica Acta 1121: 130-136 (1992)) ist insofern ähnlich zu dem erfindungsgemäßen 6 kDa-Polypeptidfragment, dass dieses aus den Aminosäuren 1-47 von LF besteht. Das Polypeptid des Stands der Technik weist jedoch keine Amidbindung zwischen der Aminosäure 11 und 12 auf. Vielmehr werden die Polypeptidfragmente auf jeder Seite der Spaltstelle durch eine Disulfidbrücke zusammengehalten. Die in dem nachfolgenden Abschnitt mit erläuternden Beispielen ausführlich dargestellten Experimente zeigen, dass das einzelne kontinuierliche Amid-Verknüpfungsrückgrat des erfindungsgemäßen Polypeptids dem Polypeptid und funktionellen Varianten davon eine höhere Aktivität verleiht.
Die Aminosäuresequenz des durch Verdau mit Cathepsin D erzeugten 6 kDa-Polypeptidfragments von LF entspricht den Aminosäuren 1-49 von SEQ ID NO:2 (Tabelle 1). Da durch chemische Synthese erzeugte Polypeptide, die aus dieser Sequenz (oder funktioneller analoger Sequenzen, nachfolgend ausführlicher beschrieben) bestehen, auch vergleichbare Aktivitäten zeigen, kann das erfindungsgemäße Polypeptid und alle funktionellen Varianten davon durch irgendeine im Stand der Technik bekannte Art und Weise erzeugt und/oder isoliert werden. Das Vorkommen von internen Disulfidbindungen ist für die antimikrobielle und Endotoxin neutralisierende Aktivität der hierin beanspruchten Polypeptide nicht erforderlich, solange die Aminosäuren des Polypeptids durch ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungs rückgrat verbunden sind. Homologe der Wirtsabwehrpolypeptide, die aus einer anderen Tierspezies isoliert sind, und deren funktionellen Varianten, weisen voraussichtlich zu dem humanem 6 kDa-LF-Fragment analoge Aktivitäten auf und sind ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Tabelle 1: Sequenz ID-Nummern
Sequenz- und Funktionsanalysen zeigen, dass ein Polypeptid, welches die ersten 51 Reste des LF-Proteins umfasst (das 6 kDa-Polypeptid mit 2 zusätzlichen Aminosäuren der LF-Sequenz am C-Terminus), im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das 6 kDa-Polypeptid zeigt. Die Aminosäuresequenz dieses geringfügig längeren Polypeptids ist in SEQ ID NO:2 als Aminosäuren 1-51 aufgeführt. Experimente, die ausführlich in dem nachfolgenden Abschnitt mit erläuternden Beispielen aufgeführt sind, zeigen, dass bis zu 17 Aminosäuren des C-Terminus und bis zu 3 Aminosäuren des N-Terminus des 51 Aminosäure-Polypeptids ohne vollständigen Aktivitätsverlust sowohl der antimikrobiellen als auch der Endotoxin neutralisierenden Aktivität entfernt werden können. Insofern betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Sequenz, die den Aminosäuren 1-51 der SEQ ID NO:2 entspricht, der bis zu 17 Aminosäuren vom C-Terminus und bis zu 3 Aminosäuren vom N-Terminus fehlen. In bevorzugten Ausführungsformen sind nicht mehr als 5 Reste vom C-Terminus entfernt.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ergibt sich die zweifache Aktivität des Polypeptids, a) antimikrobiell und b) Endotoxin neutralisierend, aus der Wechselwirkung von bestimmten Regionen des Polypeptids mit unterschiedlichen Zielmolekülen. Man glaubt, dass das mikrobielle Wachstum durch einen Mechanismus inhibiert wird, der ähnlich zu anderen Defensinen ist; Stören der Membranorganisation der Zellhülle einer Mikrobe durch Wechselwirken mit verschiedenen Komponenten der mikrobiellen Membran. Mikrobielle Membranen bestehen hauptsächlich aus einem Bilayer von Phospholipiden, wobei die hydrophilen Phosphatköpfe auf der Außenseite des Bilayers vorliegen (z.B. der Zelloberfläche) und die hydrophoben Lipidschwänze in den Innenbereichen des Bilayers verborgen sind. Das Polypeptid enthält zwei Cluster von basischen Resten, die durch eine Abfolge von Aminosäuren getrennt sind, die einen hohen Gehalt an hydrophoben Resten aufweisen. Die Kombination von basischen Clustern, die durch eine hydrophobere Abfolge getrennt ist, ermöglicht es dem erfindungsgemäßen Polypeptid mit der hydrophilen Membranoberfläche sowie mit den hydrophoben Lipidschwänzen innerhalb des Bilayers wechselzuwirken. Diese Kombination von Wechselwirkungen führt zu einer Interkalation des Polypeptids in die Membran, was zu einer Membranzerstörung führt. Die biochemischen Komponenten des Polypeptids, die mit den Lipid-Bilayer-Komponenten Wechselwirken, Wechselwirken sehr ähnlich zu den Lipopolysacchariden, die sich auf der Bakterienoberfläche befinden, Endotoxinaktivität aufweisen und auch einen hydrophilen Bereich und einen hydrophoben Bereich umfassen. Endotoxin ist, falls auf der Bakterienoberfläche vorhanden, eine Komponente eines größeren Lipopolysaccharid(LPS)-Moleküls. LPS ist eine Komponente der äußeren Membran aller gramnegativer Mikroben. Die hydrophile Komponente (Polysaccharid) von LPS befindet sich auf der äußeren Oberfläche der Membran und die hydrophobe Komponente (Lipid A) befindet sich im Innenbereich des Bilayers. Der Lipid-A-Anteil des LPS-Moleküls ist der inflammatorische oder Endotoxinanteil des LPS-Moleküls. Die Cluster von basischen Resten, von denen man annimmt, dass sie an die negativ geladenen Stellen des Polysaccharidanteils von LPS und an die am meisten exponierten Kopfgruppen dessen Lipid A-Schwanzes binden, ermöglicht es der hydrophoben Zwischenregion an das Lipid A zu binden und dieses zu neutralisieren.
Unter Bedingungen, die zu denjenigen an der Mikrobenoberfläche unterschiedlich sind, können andere Bindungstypen auftreten. Die Ergebnisse, die in der nachfolgenden Beschreibung mittels Beispielen dargestellt sind, zeigen, dass ein Polypeptid, welches die oben beschriebenen funktionellen Komponenten aufweist, jedoch nur einen funktionellen basischen Cluster enthält, beispielsweise LF-27, welches die in SEQ ID NO:6 (1) aufgeführte Aminosäuresequenz aufweist, eine erhebliche neutralisierende Aktivität gegenüber nicht mit der Oberfläche der Mikrobe in Zusammenhang stehendem Endotoxin hat (z.B. wenn dieses von Bakterien abgeschert ist oder durch präparative Mittel extrahiert ist, wie in Lebensmitteln oder Pharmazeutika). Unter solchen Umständen ist der Lipid A-Anteil des Moleküls exponierter und folglich ist das Endotoxin zugänglicher für das Polypeptid. Bei hohen Konzentrationen des Polypeptids oder unter ungewöhnlichen Salzbedingungen oder wenn das LPS extrahiert oder abgeschert oder während es nach wie vor in der äußeren Membran vorliegt disorganisiert ist, kann die hydrophobe Zwischenregion des Polypeptids immer noch eine Bindung an LPS über Lipid A vermitteln, was zu einer Inaktivierung der endotoxischen Wirkungen des Lipid A-Anteils von LPS führt.
Ein Fachmann wird erkennen, dass Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen der 6 kDa-LF-Polypeptidfragmentsequenz, welche die biochemischen Eigenschaften des an diesen Wechselwirkungen beteiligten Moleküls bewahren, die antimikrobielle und Endotoxin neutralisierend Aktivität der resultierenden Polypeptide beibehalten. Polypeptide, die aus solchen Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen resultieren, werden als funktionelle Varianten des 6 kDa-LF- Fragments betrachtet und sind als solche ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Wie oben angeführt, sind bestimmte Regionen des LF-Fragments an der antimikrobiellen und Endotoxin neutralisierenden Aktivität beteiligt. Diese Regionen beinhalten insbesondere zwei basische Cluster, wobei sich einer davon am N-Terminus befindet und der andere von Rest 28 bis einschließlich 31 ist. Zusätzlich trägt auch die relative Hydrophobizität der Aminosäuresequenzen, welche diese basischen Cluster flankieren, zu der Aktivität des Polypeptids bei. Die folgende Formel definiert die kritischen Komponenten des erfindungsgemäßen 6 kDa-Polypeptids und dessen funktionelle Varianten: B₁-R1-B₂-R2, wobei B₁ und B₂ für Cluster von Aminosäuren stehen, die 2-7 Aminosäuren enthalten, wobei wenigstens 2 der 2-7 Aminosäuren stark basisch sind, und R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren ist und einen Hydrophobizitätswert (grand average of hydropathicity value; GRAVY) (J. Kyte und Doolite, R. F., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)) von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index (A. Ikai, J. Biochem. 88: 1895-1898 (1980)) von wenigstens 35,45 aufweist, und R2 zwischen 1 und 17 Aminosäuren ist und einen GRAVY-Wert von wenigstens 0,174 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 97,14 aufweist, wobei die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden.
Die Aminosäuren Lysin, Arginin, Histidin und jede Aminosäure-Variante, die so synthetisiert oder chemisch modifiziert wird, dass diese eine positiv geladene Gruppe in ihrer Seitenkette aufweist, werden im Rahmen dieser Beschreibung und anderen unten aufgeführten Definitionen der vorliegenden Erfindung als stark basische Aminosäuren bezeichnet.
Der aliphatische Index wird gemäß der folgenden Formel berechnet: aliphatischer Index = X(Ala) + a·X(Val) + b·(X(Ile) + X(Leu)), wobei X(Ala), X(Val), X(Ile) und X(Leu) Mol-% (100 × Molenbruch) von Alanin, Valin, Isoleucin und Leucin sind. a und b sind die relativen Volumina der Valin-Seitenkette (a = 2,9) und der Leu/Ile-Seitenketten (b = 3,9) zu der Seitenkette von Alanin.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen R1 und R2 des isolierten Polypeptids nicht mehr als jeweils 1 saure Aminosäure auf. Asparaginsäure, Glutaminsäure und eine Aminosäure-Variante, die so synthetisiert oder chemisch modifiziert wird, dass diese eine negativ geladene Gruppe in ihrer Seitenkette aufweist, werden im Rahmen dieser Beschreibung und anderen nachfolgend aufgeführten Definitionen der vorliegenden Erfindung als saure Aminosäuren bezeichnet. In einer Ausführungsform ist R2 des isolierten Polypeptids PVSCIKRDSPIQCIQAIA (SEQ ID NO:3). Alternativ kann R2 eine C-terminale Trunkierung dieser Sequenz (SEQ ID NO:3) sein. In einer anderen Ausführungsform ist B₁ des isolierten Polypeptids GRRRRS (SEQ ID NO:4) oder eine Trunkierung davon, welche wenigstens zwei aufeinander folgende R in der Sequenz beibehält. Einige Beispiele für ein durch eine solche Trunkierung erzeugtes B₁ sind GRR, RRS, RRR und RR. In einer anderen Ausführungsform ist B₂ des isolierten Polypeptids MRKVRG (SEQ ID NO:5).
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das isolierte Polypeptid die Sequenz der in SEQ ID NO:2 aufgelisteten Aminosäuren 1-51 auf. In einer alternativen Ausführungsform umfasst das isolierte Polypeptid diese Sequenz mit einer Aminosäure-Substitution an Position 16, wobei die Substitution die relative Hydrophilie der Polypeptidregion, in der diese liegt, verringert, wodurch die relative Hydrophobizität dieser Region erhöht wird. Es ist wahrscheinlich, dass die Erhöhung der Hydrophobizität dieser Region des Moleküls die antimikrobielle und die Endotoxin neutralisierende Aktivität des Polypeptids verstärkt. Ein Beispiel für eine solche Substitution ist eine Substitution an der Position 16 mit einer neutral geladenen Aminosäure, wie beispielsweise Glycin. Eine neutral geladene Aminosäure ist definiert als Aminosäure, die beim Vorliegen innerhalb eines Polypeptids bei physiologischem pH keine Nettoladung aufweist. Ein anderes Beispiel für eine solche Substitution ist eine Substitution mit einer nicht geladenen hydrophoben Aminosäure, wie Valin oder Alanin. Man beachte, dass ähnliche Substitutionen, wie die gerade beschriebenen, an der Position 41 voraussichtlich die gleiche Gesamtverstärkungswirkung haben. Diese Arten von Aminosäure-Substitutionen, die in funktionellen Varianten des Polypeptids vorgenommen werden, verstärken wiederum voraussichtlich die Aktivität dieser Varianten.
Ein anderer Aspekt beruht auf der Feststellung, dass das isolierte Polypeptid LF-33, ein 33-Mer, das aus der Entfernung der C-terminalen 17 Aminosäuren des 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptids resultiert, wobei die Aminosäuren so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden, eine antimikrobielle und Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist, die gleich zu derjenigen des oben beschriebenen 6 kDa-LF-Fragments ist. Die Aminosäuresequenz von LF-33 ist in SEQ ID NO:1 (Tabelle 1) aufgeführt.
LF-33 und LF-27 sind angesichts der Tatsache, dass diese früher als Polypeptide offenbart wurden, welche anionische Polysaccharide, wie Glykosaminoglykane, binden (Mann et al., 3. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)), gezielt nicht in den Polypeptid-Ansprüchen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Wie beim 6 kDa-LF-Fragment, sind Polypeptide, die aus Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen der LF-33-Polypeptidsequenz resultieren, welche die für die Aktivität kritischen biochemischen Eigenschaften des Moleküls beibehalten, einschließlich der 2 basischen Cluster und der Hydrophobizität der Zwischensequenzen, insofern funktionelle Varianten von LF-33, als dass diese über denselben Mechanismen wirken und ähnliche Aktivitäten aufweisen. Die Formel: B₁-R1-B₂ definiert kritische Komponenten von LF-33 und funktionellen Varianten davon, wobei B₁ und B₂ und R1 wie oben definiert sind.
R1 des isolierten Polypeptids kann nicht mehr als 1 saure Aminosäure aufweisen, wobei die als saure Aminosäuren bezeichneten oben beschrieben sind. B₁ des isolierten Polypeptids kann GRRRRS (SEQ ID NO:4) oder eine Trunkierung davon sein, welche wenigstens zwei aufeinander folgende R in der Sequenz beibehält, Beispiele sind oben angegeben. B₂ des isolierten Polypeptids kann MRKVRG (SEQ ID NO:5) sein.
Das isolierte Polypeptid kann die in SEQ ID NO:1 aufgeführte Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresubstitution an Position 16 umfassen, wobei die Substitution zu einer verringerten relativen Hydrophilie der Polypeptidregion, in welcher diese liegt, führt, wodurch die relative Hydrophobizität dieser Region erhöht wird. Diese Substitution verstärkt voraussichtlich die Aktivität des Polypeptids. Ähnliche Substitutionen, die in anderen funktionellen Varianten des Polypeptids vorgenommen werden, verstärken wiederum voraussichtlich die Aktivität dieser Varianten. Beispiele für solche Substitutionen sind oben angegeben.
Das erfindungsgemäße antimikrobielle und Endotoxin neutralisierende Polypeptid kann auch charakterisiert werden durch das Vorliegen von charakteristischen Aminosäuren an bestimmten Positionen innerhalb des Polypeptids. Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die analog zu den Aminosäuren 1-51 der SEQ ID NO:2 sind und funktionellen Fragmenten davon (in welchen bis zu 20 Aminosäuren von dem C-Terminus entfernt sind) sind im Hinblick auf diese bestimmten Positionen ebenfalls funktionelle Varianten und als solche ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst. Insbesondere weist die funktionelle Variante einen basischen Rest an den Positionen 2, 3, 4, 5, 28, 29, 31, 39 und 40, und einen hydrophoben Rest an den Positionen 7, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 20, 21, 23, 32, 35, 37, 38, 44, 46, 47, 49 und 50, und einen sauren Rest an den Positionen 16 und 41 auf. Wie oben beschrieben sind die Aminosäuren des antimikrobiellen Polypeptids oder der funktionellen Variante so verbunden, dass diese ein einziges kontinuierliches Amid-Verknüpfungsrückgrat bilden. Aminosäuren, die in diesem Zusammenhang als basische Reste und saure Reste bezeichnet werden, sind oben erörtert. Im Rahmen dieser und anderer Defini tionen oder Beschreibungen der vorliegenden Erfindung beinhalten hydrophobe Reste hierin Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Tryptophan, Valin, Methionin und Prolin. Alternativ können die Reste an den Positionen 10, 20, 37 und 46 Cysteine sein, wie in der Wildtyp-Aminosäuresequenz von LF. In bevorzugten Ausführungsformen sind Reste der funktionellen Variante an nicht einzeln angegebenen Positionen durch die entsprechenden Aminosäure des 51 Aminosäure-Polypeptids, welche in SEQ ID NO:2 aufgeführt sind, bestimmt oder sind konservative Substitutionen dieser Reste.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das unmittelbar oben beschriebene antimikrobielle Polypeptid oder die unmittelbar oben beschriebene funktionelle Variante davon, welches bzw. welche eine Substitution an Position 16 und/oder Position 41 mit einer neutral geladenen Aminosäure aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen wird an die Position 16 und/oder Position 41 eine neutral geladene Aminosäure gesetzt. Wie oben erörtert, verstärken solche analoge Substitutionen voraussichtlich auch die Aktivität von irgendwelchen funktionellen Varianten, in welche diese eingeführt werden.
Experimentelle Nachweise zeigen, dass das aus den Aminosäuren 1-51 der SEQ ID NO:2 bestehende antimikrobielle Polypeptid bei einer Deletion von bis zu 3 Aminosäuren vom N-Terminus eine signifikante Aktivität beibehält. Folglich umfassen die funktionellen Varianten des antimikrobiellen Polypeptids auch die oben beschriebenen funktionellen Varianten, bei denen zusätzlich 1-3 Aminosäuren vom N-Terminus entfernt sind.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, welches die schnelle Clearance von Endotoxin aus dem Körper eines Tiers über einen Endozytose-Clearance-Weg fördert. Das Fusionsprotein ergibt sich aus der Fusion eines ersten Polypeptids, welches das Endotoxin neutralisierende Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder eine funktionelle Variante davon ist, mit einem zweiten Polypeptid, das eine Polypeptid-Sequenz umfasst, die von Zellen mittels eines Endozytose- Clearance-Wegs erkannt und internalisiert wird. Geeignete Polypeptide für die erste Komponente des Fusionsproteins sind oben beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die erste Polypeptid-Komponente des Fusionsproteins aus den Aminosäuren 1-51 der SEQ ID NO:2.
Das resultierende Fusionsprotein weist das erste Polypeptid (das Endotoxin neutralisierende Fragment) N-terminal zu dem zweiten Polypeptid (dem Endozytose-Clearance-Fragment) oder, alternativ, das zweite Polypeptid N-terminal zu dem ersten Polypeptid auf. Das Fusionsprotein behält die jeweiligen Aktivitäten der einzelnen Komponenten bei. Einige geringfügige Modifikationen (z.B. eine Linker-Region zwischen den zwei Polypeptidfragmenten) können erforderlich sein, um diese Funktionen beizubehalten.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und funktionellen Varianten davon. Der Kürze halber wird hierin der Ausdruck erfindungsgemäße Polypeptide verwendet, der sowohl das ursprüngliche 6 kDa-LF-Polypeptidfragment wie auch alle oben ausführlich beschriebenen funktionellen Varianten umfasst. Wie oben erörtert, sind LF-33 und LF-27 nicht von den hierin beschriebenen Verfahrensansprüchen ausgeschlossen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Inhibieren des mikrobiellen Wachstums. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können verwendet werden, um das mikrobielle Wachstum unter verschiedenen Verhältnissen zu inhibieren. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide therapeutisch verabreicht werden, um eine Krankheit in einem Individuum, die aus einer mikrobiellen Infektion resultiert, zu behandeln oder zu verhindern.
Eine Vielzahl von mikrobiellen Infektionen kann durch Behandlung mit den oben beschriebenen Polypeptiden verhindert werden. Experimente, die in dem Abschnitt mit erläuternden Beispielen dargestellt sind, zeigen, dass die therapeutische Verabreichung dieser Polypeptide das Fortschreiten einer bakteriellen Infektion inhibieren und diese rückgängig machen kann. Weitere Nachweise zeigen, dass auch einige Pilzinfektionen eingeschränkt werden können. Da man glaubt, dass die erfindungsgemäßen antimikrobiellen Polypeptide das mikrobielle Wachstum durch Zerstören der Zellmembran der Mikrobe inhibieren, ist jede Mikrobe, die eine solche Zellmembran besitzt, potentiell anfällig für eine Wachstumsinhibierung durch die antimikrobiellen Polypeptide. Viren, die eine Lipidhülle enthalten, können auch anfällig sein für die antimikrobiellen Wirkungen der erfindungsgemäßen Polypeptide.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die mikrobielle Infektion eine bakterielle Infektion. Diese umfasst, ohne Einschränkung, bakterielle Infektionen, die durch Mycobakterien verursacht werden. Mycobakterien sind resistent gegenüber vielen antimikrobiellen Wirkstoffen. Mycobakterien verursachen zwei der wichtigsten Krankheiten in der Geschichte, Tuberkulose und Lepra. Die meisten Fälle von humaner Tuberkulose werden durch Mycobacterium tuberculosis verursacht, eine signifikante Anzahl von Fällen werden jedoch durch Mycobacterium bovis verursacht. Die Entwicklung und Verbreitung von neuen resistenten Bakterienstämmen, insbesondere Mycobakterien, stellen zunehmend eine Gesundheitsbedrohung dar. Die oben beschriebenen antimikrobiellen Polypeptide sind zur Behandlung von Patienten geeignet, die an diesen resistenten Mikrobenstämmen, welche gegenwärtig die Gesundheit bedrohen, leiden.
Viele bakterielle Infektionen verursachen eine bakterielle Sepsis im infizierten Individuum. Ergebnisse, die in dem nachfolgenden Abschnitt mit erläuternden Beispielen ausführlich dargestellt sind, zeigen, dass die oben beschriebenen Polypeptide auch eine Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweisen. Die Verabreichung solcher Peptide mit zweifacher Aktivität an ein Individuum, das an einer septischen bakteriellen Infektion leidet, führt durch Verringerung sowohl der durch die Infektion verursachten Sepsis als auch der Infektion selbst zu einer signifikanten therapeutischen Wirkung.
Ein zur Behandlung geeignetes Individuum ist irgendein Tier (ein Säugetier oder ein anderes Tier), das an einer oder mehreren der oben beschriebenen mikrobiellen Infektionen leidet oder sonst anfällig für eine oder mehrere der oben beschriebenen mikrobiellen Infektionen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Individuum ein Mensch. In einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Vieh. In einer anderen Ausführungsform ist das Tier ein Vorführtier oder ein Haustier.
Die Verabreichung des Polypeptids an ein Individuum erfolgt entweder systemisch oder lokal und ist in hohem Maße von der jeweiligen Infektion, die behandelt werden soll, bestimmt. Die systemische Verabreichung kann durch mehrere Wege erfolgen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der intravenösen Verabreichung, der Inhalation und der Ingestion. Die lokal begrenzte Verabreichung kann topisch oder innerlich sein. Eine solche Verabreichung kann durch mehrere Wege erfolgen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der subkutanen, dermalen, intradermalen und intraperitonealen Verabreichung, der Inhalation und der Ingestion.
Es wird oft von Nutzen sein, eine Formulierung der erfindungsgemäßen Polypeptide zu verabreichen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger beinhaltet. Mögliche Formulierungen für die therapeutische Verabreichung umfassen eine Vielzahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen, wobei die geeignete Verwendung derselben vom Verabreichungsweg, der für die Behandlung als erforderlich erachtet wird, abhängen wird. Einige geeignete Formulierungen für die topische Verabreichung sind beispielsweise Augentropfen, Ohrentropfen oder Zahnfleischanwendungen (z.B. Tropfen, Mundwasser, Creme oder Paste). Das Verabreichungsschema (z.B. Weg, Dosis und Verlauf), das für den Patienten therapeutisch ist, wird sich in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Individuum (z.B. Gesundheitszustand, Gewicht, Stoffwechsel), der Infektionsstelle und dem Krankheitserreger der Infektion ändern. Ein therapeutisches Schema sollte durch Extrapolation von der Behandlung mit ähnlichen Therapeutika zusammen mit empirischen Beobachtungen entwickelt werden. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Verhinderung einer mikrobiel len Infektion in einem Individuum läuft parallel zu den oben beschriebenen Verfah ren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf der Feststellung, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide auch eine Aktivität des Verstärkers der therapeutischen Wirkung anderer antimikrobieller Wirkstoffe oder Agenzien aufweist. Experimente, die in dem Abschnitt mit erläuternden Beispielen ausführlich beschrieben sind, zeigen, dass die gleichzeitige Verabreichung von anderen antimikrobiellen Agenzien mit den erfindungsgemäßen antimikrobiellen Polypeptiden eine synergistische antibiotische Wirkung bewirkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide die antibiotische Aktivität von Rifampicin oder Isoniazid signifikant erhöht. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, glaubt man, dass dies auftritt, weil die erfindungsgemäßen Polypeptide die Integrität der Bakterienmembranen zerstören und diese Zerstörung zu einer höheren Konzentration des Antibiotikums innerhalb des einzelnen Bakteriums führt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide therapeutisch verwendet werden können, um die Aktivität verschiedener antimikrobieller Agenzien oder Wirkstoffe zu verstärken. Die gleichzeitige Verabreichung der erfindungsgemäßen Polypeptide mit einem antimikrobiellen Agens ermöglicht die therapeutische Behandlung eines Patienten mit geringeren Dosen des antimikrobiellen Agens. Geringere Dosen sind bevorzugt in Situationen, wie beispielsweise der Behandlung mit einem teuren Wirkstoff oder einem, der unerwünschte Nebenwirkungen erzeugt, oder einem, dessen kurze Halbwertszeit in vivo sonst schnell seine Konzentration unter die für die Wirksamkeit erforderliche verringern würde. Zusätzlich kann die gleichzeitige Verabreichung mit antimikrobiellen Agenzien oder Wirkstoffen auch eine kürzere Therapiedauer und/oder die Aufhebung von resistenten Phänotypen ermöglichen. Ohne Einschränkung ist zu erwarten, dass Mikroben, die durch Verringern der Wirkstoffkonzentration im Innern (z.B. mittels einer verringerten Membranpermeabilität oder einem erhöhten zellulären Export oder Verstoffwechselung des Wirkstoffs) resistent gegenüber einem antimikrobiellen Wirkstoff sind, besonders anfällig gegenüber der Verstärkungsaktivität dieser Polypeptide sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können verwendet werden, um irgendein antimikrobielles Agens oder irgendeinen antimikrobiellen Wirkstoff zu verstärken, bei dem die Aktivität den Eintritt über die äußerste Oberfläche der Mikrobe hinaus bedingt. In bevorzugten Ausführungsformen ist der antimikrobielle Wirkstoff ein Antibiotikum und die mikrobielle Infektion ist eine bakterielle Infektion. Das kausative Agens ist entweder ein Bakterium, das anfällig ist für das Antibiotikum oder alternativ in Abwesenheit einer antibiotischen Verstärkung resistent gegenüber dem Antibiotikum ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antibiotikum Rifampicin oder ein strukturell verwandtes Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist das Antibiotikum Isoniazid oder ein strukturell verwandtes Molekül. In einer anderen Ausführungsform ist der antimikrobielle Wirkstoff ein Antipilzmittel und die Infektion eine Pilzinfektion. Patienten schließen alle Individuen (Tier, Säugetier, Mensch, etc.) ein, welche an einer Infektion durch eine anfällige Mikrobe leidet oder Gefahr läuft, an einer Infektion durch eine anfällige Mikrobe zu erkranken.
Das Verabreichungsschema des antimikrobiellen Wirkstoffs und des isolierten Polypeptids oder der funktionellen Variante der vorliegenden Erfindung variiert mit dem Patienten und der jeweiligen Infektion und kann von einem Fachmann von Fall zu Fall bestimmt werden. Formulierungen des Polypeptids werden von dem Verabreichungsschema abhängen, Beispiele sind oben beschrieben.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen Polypeptide, um Endotoxin zu neutralisieren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide haben eine Endotoxin neutralisierende Aktivität und können verwendet werden, um Endotoxin innerhalb des Körpers eines Individuums (z.B. im Blutkreislauf zirkulierend) zu neutralisieren. Das Endotoxin kann auf einen Krankheitserreger, der den Körper infiziert hat oder alternativ auf eine kontaminierende Substanz zurückgehen, welcher der Körper ausgesetzt wurde (z.B. Endotoxin kontaminiertes Blut oder eine andere Körperflüssigkeit, Gewebe oder Körperoberfläche). Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden dem Individuum auf eine Art und Weise verabreicht, die ähnlich ist zu der oben beschriebenen Verabreichung zur Behandlung eines Patienten mit einer mikrobiellen Infektion. Das therapeutische Verabreichungsschema des Polypeptids wird von Fall zu Fall variieren und kann durch Extrapolation von der Behandlung mit ähnlichen Therapeutika zusammen mit empirischen Beobachtungen entwickelt werden. Ähnliche Formulierungen zu den oben für die Behandlung einer mikrobiellen Infektion beschriebenen können in diesem Verfahren ebenfalls verwendet werden. Verabreichungsschemen und verwendbare Formulierungen sind ebenfalls vorher in diesem Dokument beschrieben.
Alternativ kann ein Endotoxin in einem Patienten neutralisiert werden durch Verabreichung eines Fusionsproteins, bestehend aus einem Polypeptid mit Endotoxin neutralisierender Aktivität, das mit einem Polypeptid fusioniert ist, das aus einer Polypeptidsequenz besteht, die von Zellen mittels eines Endozytose-Clearance-Weges erkannt und internalisiert wird. Das zu verabreichende Fusionsprotein ist ausführlich oben beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können nicht nur als pharmazeutische und neutrazeutische Agenzien sondern auch als Additive für irgendwelche Produkte verwendet werden, wie Lebensmittel und medizinische oder nicht-medizinische Produkte, die in den Körper aufgenommen werden oder auf andere Weise aufgebracht werden auf oder in Berührung gebracht werden mit der Körperoberfläche von Menschen oder anderen Tieren oder Fluiden, Organen und davon abgeleiteten Zellen. Die Neutralisierung und/oder Entfernung von Endotoxin aus potentiell kontaminierten Produkten ist äußerst vorteilhaft in Fällen, in denen das Endotoxin lebende Organismen, die direkt oder indirekt mit diesem Produkt in Kontakt kommen, potentiell schädigen könnte.
Um ein Endotoxin zu neutralisieren und/oder das mikrobielle Wachstum in einem Produkt zu inhibieren, wird das Produkt mit einem oben ausführlich beschriebenen Polypeptid oder einer oben ausführlich beschriebenen funktionellen Variante in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen des Produkts und des Polypeptids kann auf eine Vielzahl von Arten erfolgen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Eintauchen, Sprühen, Mischen, Adsorbieren gegen und Aussetzen gegenüber Dämpfen, und wird von den Eigenschaften des jeweiligen Produkts abhängen.
Das vorliegende Verfahren ist zur Behandlung einer Vielzahl von Produkten verwendbar. Biologische Produkte, die hierin als Produkte definiert sind, die von biologischen Organismen oder Verfahren abstammen, sind besonders der Gefahr einer Kontamination mit Mikroorganismen und Endotoxin ausgesetzt. Beispiele für biologische Produkte umfassen, ohne Einschränkung, Nahrungsmittelprodukte, Gewebe, lebende Zellen, von lebenden Zellen abgeleitete Produkte, Blut oder Bestandteile davon, und jede andere Körperflüssigkeit, Wirkstoffe oder andere molekulare Präparate. Nicht-biologische Produkte, die hierin als Produkt definiert sind, das nicht direkt von einem biologischen Organismus oder Verfahren abstammt, wie beispielsweise Glaswaren, Operationsgeräte, synthetische Wirkstoffe oder andere molekulare Präparate, können ebenfalls behandelt werden. Zur wirksamen Verwendung der vorliegenden Erfindung sollte das Produkt, das behandelt werden soll, keine Aktivität besitzen, welche die Endotoxin neutralisierende Aktivität der gesamten angewendeten Polypeptidmenge vollständig inaktiviert. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können gegeben werden zu, assortiert werden zu, gesprüht werden auf, adhäriert werden an, beschichtet werden auf, adsorbiert werden an, chemisch vernetzt werden mit, oder imprägniert werden in irgendwelche Produkte, von denen allgemein erwünscht ist, dass eine Kontamination durch Endotoxin oder proliferierende Mikroorganismen vermieden oder verhindert wird. Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid auf einer Oberfläche, über welche ein Produkt geführt wird, immobilisiert werden, um ein Endotoxin aus dem Produkt zu entfernen oder das mikrobielle Wachstum in dem Produkt zu inhibieren. Ein Produkt, das mit einem Endotoxin neutralisierenden Polypeptid behandelt wird und selbiges beibehält, kann des Weiteren verwendet werden, um ein anderes Produkt, mit welchem es in Kontakt gebracht wird, zu behandeln.
Auch hierin beschrieben ist die Induktion der in vivo-Erzeugung des LF-Wirtsabwehrpolypeptids in einem Individuum. Nachweise, die in dem nachfolgenden Abschnitt mit erläuternden Beispielen dargestellt sind, zeigen, dass das 6 kDa-Wirtsabwehrpolypeptidfragment von LF durch Verdau mit der Asparaginsäure-Protease Cathepsin D erzeugt wird und dass die Empfindlichkeit von LF gegenüber diesem Verdau nach Kontakt mit Polyanionen erhöht ist. Diese Feststellung zeigt, dass die Verabreichung eines Polyanions (z.B. Heparin, Glykosaminoglykane, Nukleinsäuren oder Dextransulfat) an einen Patienten die Erzeugung des 6 kDa-Polypeptids aus LF (entweder endogenes LF oder verabreichtes LF) durch Cathepsin D oder ein verwandtes Enzym ansteigen lassen wird. Alternativ wird auch die Erhöhung der Gesamtkonzentration oder der proteolytischen Aktivität von Cathepsin D oder von anderen Proteasen, die bei der in vivo-Erzeugung des 6 kDa-Polypeptids beteiligt sind, die in vivo-Erzeugung des Polypeptids erhöhen.
Andere Asparaginsäure-Proteasen, welche das 6 kDa-Fragment auch aus LF schneiden können, beinhalten, ohne Einschränkung, Cathepsin E, Renin und die Asparaginsäure-Protease von HIV. Diese Proteasen arbeiten bei einem pH von 3,5-5 optimal. Das Einstellen des pH's der unmittelbaren Umgebung von bei der Erzeugung des 6 kDa-Polypeptids aus LF beteiligten Proteasen auf optimale Werte für die Proteaseaktivität wird daher die in vivo-Erzeugung des Polypeptids aus LF ansteigen lassen.
Ferner ist hierin die Verstärkung der antimikrobiellen Aktivität und der Endotoxin neutralisierenden Aktivität des LF-Wirtsabwehrpolypeptids und der funktionellen Varianten durch Beeinflussung der Ionenstärke der unmittelbaren Umgebung des Polypeptids beschrieben. Da die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Polypeptide durch die Ionenstärke der unmittelbaren Umgebung beeinflusst werden, wobei eine subphysiologische Ionenstärke optimal ist, werden Anpassungen der unmittelbaren Umgebung des Polypeptids die Aktivität beeinflussen.
Die Ergebnisse, die in dem nachfolgenden Abschnitt mit erläuternden Beispielen dargestellt sind, zeigen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide so wirken, dass diese das mikrobielle Wachstum bei einer Ionenstärke von weniger als 200 mM NaCl inhibieren, wobei die optimale Aktivität bei 50 mM NaCl beobachtet wurde (der geringsten getesteten Konzentration). Diese Ergebnisse zeigen, dass irgendeine Behandlung, bei der die erfindungsgemäßen Polypeptide mit einer infektiösen Mikrobe oder einem Endotoxin unter reduzierten Ionenstärkebedingungen in Kontakt gebracht werden, was beispielsweise erreicht wird durch Verabreichen des Polypeptids in Lösungen mit sub-physiologischer Ionenstärke oder in Kombination mit irgendeinem Agens, das eine Verdünnung der Salzkonzentrationen von Gewebeflüssigkeiten in der unmittelbaren Nähe der Infektion bewirkt (wie ein lokal wirkendes Diuretikum), die Wirksamkeit der Polypeptid-Formulierung signifikant erhöht wird. Analog können Polypeptidvarianten entwickelt werden, die bei superphysiologischen Ionenstärken aktiv bleiben. Beispielsweise würde man erwarten, dass durch Erhöhen der Anzahl von positiv geladenen Aminosäuren in einem oder beiden Clustern von basischen Resten oder durch Verringern der Anzahl der negativ geladenen Reste insgesamt in dem Polypeptid die Salzinhibierung der Polypeptidvarianten verringert sein wird.
Beschreibung anhand von Beispielen
In vivo-Erzeugung des Wirtsabwehrpolypeptids aus LF
LF ist ungewöhnlich Proteolyse-resistent (R. D. Brines und J. H. Brock, Biochim. Biophys. Acta 759: 229-35 (1983)) und es ist sehr wenig bekannt über dessen in vivo-Prozessierung während einer Entzündung. Entzündete humane Gewebe wurden deshalb auf das Vorliegen der N-terminalen Domäne als ein kleines (z.B. < 12 kDa) Polypeptid untersucht. Antikörper, die spezifisch für die N-terminalen 17 Reste von reifem humanem LF sind, wurden verwendet, um Immunoblots von Sputum aus einem Individuum mit einem tiefen Bronchialhusten und aus eitrigen Ausscheidungen ("Eiter"), die aus infizierter humaner Haut erhaltenen wurden, zu untersuchen. Dies zeigte auf, dass die N-terminale Domäne von LF als Polypeptid mit geringem Molekulargewicht (Mr ~ 6000-8000) in allen getesteten Ausscheidungen vorliegt. Ein Vergleich mittels Scanning-Densitometrie der Immunofärbungsintensität des 6 kDa-Polypeptids aus der Probe mit derjenigen des Standards deutet darauf hin, dass dieses Fragment in den Ausscheidungen mit 1-10 μM vorlag. Das N-terminale Polypeptid wurde auch in humanem Sputum nachgewiesen, wenngleich es nicht in gingivalem Plaque oder humanem Speichel nachgewiesen wurde. In einigen der Gewebeproben konnten Polypeptide mit einer Zwischengröße (z.B. 10-20 kDa), welche die N-terminale Domäne enthielten, als Nebenkomponenten nachgewiesen werden, die wahrscheinlich aus dem unvollständigen Prozessieren der freigesetzten Domäne herrühren. Diese Daten liefern den ersten direkten Beweis, dass die antimikrobielle Domäne von LF während Entzündungsereignissen in vivo freigesetzt wird und dass diese in dem Gewebe intakt bleibt als kleines Polypeptid.
Aktivierte Leukozyten setzen die N-terminale 6 kDa-Domäne aus LF frei Da ein Kennzeichen der meisten mikrobiellen Infektionen eine Infiltration durch professionelle Phagozyten ist, wurden diese Zellen hinsichtlich der Fähigkeit, die antimikrobielle Domäne aus LF freizusetzen, untersucht. Primäre Co-Kulturen von Monozyten und Neutrophilen wurden aktiviert und hinsichtlich des Prozessierens des von Neutrophilen abgeleiteten LF untersucht. Heparinbindungsmoleküle wurden aus den vereinigten Zellextrakten isoliert und ein Kultur-Releasat wurde aus primären humanen Neutrophilen und Monozyten erhalten, welche co-kultiviert und durch FMLP aktiviert wurden. Durch Immunoblotting derselben mit dem Antikörper gegen das N-terminale LF-Polypeptid wurde eine Doppellinie mit engen Abständen von 6-8 kDa nachgewiesen, welche der antimikrobiellen Domäne entsprach, die durch aktivierte Phagozyten aus von Neutrophilen abgeleitetem LF erzeugt wurde. Vor der Aktivierung konnte kein immunreaktives Polypeptid in den Neutrophilen nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die proteolytische Freisetzung nach der Degranulation von Neutrophilen erfolgt. Dies bestätigte, dass aktivierte Phagozyten die N-terminale Domäne als kleines Polypeptid freisetzen, welches die Heparinbindungs funktion beibehält. Ein Vergleich des intakten LF, das von einer gleichen Anzahl von Neutrophilen erhalten worden war, zeigte, dass ein beträchtlicher Anteil des Proteins durch die aktivierten Co-Kulturen prozessiert wurde. Die Kontrollen beinhalteten die antibiotische Domäne, die als 6 kDa-Polypeptid aus gereinigtem LF durch Pepsinolyse freigesetzt wurde sowie die Heparin-gereinigten Polypeptide aus humanem Colostrum. Das N-terminale Polypeptid wurde in humanem Colostrum nicht nachgewiesen, obwohl dieses sehr hohe Konzentrationen an LF (~ 5-7 mg/ml) enthält (Sanchez et al., Arch. Dis. Child. 67: 657-61 (1992)), was darauf hinweist, dass dieses nicht spontan erzeugt wird. Es ist vielmehr wahrscheinlich, dass dieses Prozessieren als Reaktion auf ein Entzündungsereignis erfolgt.
Monozyten und Neutrophile wurden kultiviert und getrennt aktiviert, um zu bestimmen, welcher Phagozytentyp das N-terminale LF-Polypeptid freisetzen konnte. Für diese Experimente wurden Monozyten mit exogen gereinigtem Milch-LF (50 μg) supplementiert, da diese kein endogenes LF hatten. Das Kulturmedium wurde vor dem Gewinnen der Zellen mit Detergens entfernt und anschließend wurden Heparinbindungsmoleküle getrennt von beiden Fraktionen isoliert und immunogeblottet. Die antimikrobielle 6 kDa-Domäne wurde in den Kulturmedien und den Zellextrakten beider Zelltypen nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass beide Zelltypen zur Freisetzung der antimikrobiellen Domäne aus LF in der Lage sind. In beiden Kulturen wurde die antimikrobielle Domäne extrazellulär sowie im Zellextrakt nachgewiesen. Die meisten der durch die Monozyten erzeugten Fragmente verblieben Zell-assoziiert und nicht etwa löslich, während das Gegenteil der Fall war für die Neutrophilen. Die Bedeutung dieser unterschiedlichen Verteilung zwischen den extrazellulären und zellulären Kompartimenten in den zwei Zelltypen ist konsistent mit einem Modell, in dem das aus Neutrophilen freigesetzte LF extrazellulär durch aus Neutrophilen stammende Proteasen und intrazellulär durch mononukleäre Phagozyten nach dessen Internalisierung durch letztere nach Eintreffen an der Entzündungsstelle gespalten wird (Britigan et al., J. Immunol. 147: 4271-7 (1991); Courtoy et al., Lab. Invest. 50: 329-34 (1984)). Diese Studien zeigen, dass professionelle Phagozyten die antimikrobielle Domäne von LF freisetzen können und folglich verantwortlich sein könnten für das Erzeugen des N-terminalen Polypeptids, das in infizierten Geweben nachgewiesen wird.
Freisetzung eines 6 kDa-Polypeptids aus LF durch die lysosomale Protease Cathepsin D
Um festzustellen, welche Protease(n) für die Freisetzung der N-terminalen Domäne verantwortlich sein könnte(n), wurde die Prozessierung von LF durch mehrere für eine Entzündung oder für mikrobielle Infektionen relevante Proteasen untersucht, einschließlich Elastase, der Cathepsine G und D, einer Matrix-Metalloproteinase und der "V8"-Protease aus S. aureus Von diesen war nur Cathepsin D, eine in Phagozyten häufige lysosomale Protease (Bever et al., Inflammation 13: 309-16 (1989); Levy et al., Infect. Immun. 57: 1632-4 (1989)) in der Lage, den N-Terminus intakt als kleines Heparin bindendes Polypeptid freizusetzen. Das Inkontaktbringen von entweder eisengesättigtem oder eisenfreiem LF selbst gegenüber geringen Mengen von Cathepsin D (1/200, w:w) für eine so kurze Zeitdauer wie 5 Minuten ergab das N-terminale 6 kDa-Polypeptid, das durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung des für das N-terminale Peptid spezifischen Antikörpers nachweisbar war. Eine erhöhte Anhäufung dieses Polypeptids erfolgte bei längerem Aussetzen gegenüber Cathepsin D und das Vorhandensein von Polypeptid blieb für wenigstens drei Tage stabil und resistent gegenüber einem weiteren Abbau. Die N-terminale Sequenzierung des gereinigten 6 kDa-Polypeptids offenbarte einen einzelnen Aminoterminus, der Gly-1 in dem reifen LF-Molekül entsprach. Eine Analyse mittels MALDI-Massenspektrometrie zeigte eine molekulare Masse von 5741 Da, sehr nahe beim Wert von 5744 Da, der für ein LF-Polypeptid erwartet wird, das bei Gly-1 beginnt und mit Ala-49 endet. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Cathepsin D die N-terminale Domäne von LF als Polypeptid freisetzt, von welcher aufgrund dessen biochemischen und strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen Wirtsabwehrpolypeptiden (H. G. Boman, J. Marsh und J. A. Goode, Herausgeber, Antimicrobial Peptides, (John Wiley & Sons Ltd., New York, NY, (1994); Hoffmann et al., Curr. Opin. Immunol. 8: 8-13 (1996); Martin et al., J. Leukoc. Biol. 58: 128-36 (1995); T. Ganz und R. I.
Lehrer, Curr. Opin. Hematol. 4: 53-8 (1997)) erwartet wird, dass diese das mikrobielle Wachstum inhibiert.
Wirkung des pH-Werts auf die Freisetzung des 6 kDa-LF-Fragments durch Cathepsin D
Cathepsin D ist eine bedeutende degradative Protease, die in den Lysosomen von phagozytischen und anderen Zelltypen gefunden wird. Sie schneidet Proteine, welche durch Zellen endozytosiert oder phagozytosiert werden und anschließend zu dem lysosomalen Kompartiment mit tiefem pH der Zelle geliefert werden. Wie viele lysosomale Proteasen ist Cathepsin D mit einem sauren pH-Optimum (~ pH 3,5) proteolytisch aktiv (Tang, J. und Wong, R. N. S., J. Cell. Biochem. 33: 53-63 (1987)), etwas unter demjenigen des typischen Lysosoms (pH ~ 4,5-5,0) (Shoji Ohkuma und Brian Poole, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 3327-3331 (1978)). Experimente wurden durchgeführt, welche die Freisetzung des 6 kDa-Polypeptids aus LF durch Cathepsin D bei unterschiedlichem pH vergleicht.
Aus humaner Milch gereinigtes humanes LF wurde mit Cathepsin D entweder bei pH 3,5, 4,0, 4,6, 5,0 oder 7,4 verdaut. Nach dem Verdau wurden die Proben einer Elektrophorese mittels TRIS-Glycin-SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen unterzogen. Die aufgetrennten Produkte wurden dann immunogeblottet mit einem polyklonalen Kaninchen-Antiserum, welches nur diejenigen Polypeptide spezifisch erkennt, welche die ersten 17 Aminosäuren des 6 kDa-Polypeptids enthalten. Die Analyse identifizierte eine Bande, welche bei ungefähr der gleichen Größe wie das 6 kDa-Polypeptid aus den LF-Proben, welche mit Cathepsin D bei einem pH von entweder 3,5, 4,0, 4,6 oder 5,0 inkubiert worden waren, wanderte. Es wurde jedoch kein 6 kDa-Produkt aus der pH 7,4-Inkubation nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Freisetzung des 6 kDa-Polypeptids bei sub-physiologischem pH signifikant erhöht ist.
Binden von LF an Heparin erhöht in hohem Maße die Fähigkeit von Cathepsin D, das 6 kDa-Fragment bei lysosomalem pH freizusetzen
Man glaubt, dass eine der Funktionen von Polysacchariden darin besteht, Proteine mit einer Widerstandsfähigkeit gegenüber Angriffen durch Proteasen zu versehen. Da LF an anionische Polysaccharide bindet und diese Bindung über dessen aminoterminalen 33 Reste vermittelt ist (Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-23667 (1994)), wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Polysaccharid Heparin, ein natürlich vorkommendes Modell-Polyanion, LF von einer Proteolyse durch Cathepsin D schützt und die Freisetzung des 6 kDa-LF-Polypeptids verringert.
LF wurde mit Cathepsin D bei pH 5 für entweder 1 h oder 24 h entweder in Gegenwart oder Abwesenheit eines 10-fachen molaren Überschusses an Heparin verdaut. Die Produkte des Verdaus wurden unter nicht reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und einer Immunoblot-Analyse unterzogen unter Verwendung eines Antikörpers als Sonde, der spezifisch ist für die ersten 17 Reste des LF-Proteins. Im Vergleich zu den in Abwesenheit von Heparin inkubierten Proben wurden signifikant größere Mengen des 6 kDa-Polypeptids in den Proben nachgewiesen, die Cathepsin D und Heparin enthielten. Eine ähnliche Immunoblot-Analyse von Inkubationen von LF, die in Abwesenheit von Cathepsin D oder in Gegenwart von Pepstatin A, einem Inhibitor von Cathepsin D, durchgeführt wurden, konnten kein 6 kDa-Fragment identifizieren. Diese Kontrollen zeigen, dass der erhöhte Abbau durch Cathepsin D verursacht war und nicht auf einer kontaminierenden Protease in den Heparin-Präparaten beruhte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Freisetzung des 6 kDa-Polypeptids aus LF durch Cathepsin D in Gegenwart eines Polyanions, wie Heparin, drastisch erhöht ist. Dieses überraschende Ergebnis war das Gegenteil von dem, was erwartet wurde. Die Erklärung für dieses Ergebnis ist nicht bekannt, sie könnte jedoch damit zusammenhängen, dass Polyanionen eine Mikroumgebung von tiefem pH bereitstellen (aufgrund deren zahlreichen sauren funktionellen Gruppen), was optimale Bedingungen für Asparaginsäure-Proteasen, wie Cathepsin D, erzeugt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Freisetzung des 6 kDa-Fragments aus LF in vivo voraussichtlich erleichtert ist durch die Gegenwart von Polyanionen, wie Glykosaminoglykanen oder Nukleinsäuren.
Das durch Cathepsin D freigesetzte 6 kDa-LF-Fragment ist ein wirksameres antimikrobielles Agens als ein ähnliches durch Pepsin freigesetztes Fragment
Die antimikrobielle Aktivität des katheptischen Polypeptids wurde gegen ein klinisches Isolat, E. coli 0111, gemessen. Das mikrobielle Wachstum wurde bei physiologischer Ionenstärke mit einer minimalen Inhibitorkonzentration (MIC) von ~ 1-5 μM Polypeptid inhibiert und einer mehr als 10000-fachen Verringerung des Zellwachstums bei 100 μM, wobei die Anzahl von lebensfähigen CFUs weniger als die Hälfte des ursprünglichen Inokulums betrug (von 2,14 × 10⁴ auf 8,8 × 10³ CFU/ml) (1). Das katheptische 6 kDa-Fragment von LF ist demzufolge mindestens so wirksam wie zwölf andere natürliche antimikrobielle Polypeptide (H. G. Boman, J. Marsh und J. A. Goode, Herausgeber, Antimicrobial Peptides, (John Wiley & Sons Ltd., New York, NY, (1994)) und kann als bakterizides Agens wirken. Das durch Cathepsin D freigesetzte antimikrobielle Fragment ist ~ 10-fach wirksamer gegen Bakterien als dasjenige, das durch Pepsin freigesetzt wird, da die MIC für letzteres zwischen 11-33 μM war, ein Wert, der gut mit dem für dieses pepsinolytische Fragment früher beschriebenen Wert von 18 μM übereinstimmt (Bellamy et al., Biochim. Biophys. Acta 1121: 130-6 (1992)). Bei 100 μM Polypeptid war die Anzahl von lebensfähigen Bakterien in den Kulturen, die mit dem pepsinolytischen Fragment behandelt wurden, verglichen mit dem kathepsinolytischen Fragment, mehr als 1000-fach größer (1). Der Grund für diesen Unterschied der Wirksamkeit kann mit den zusätzlichen internen Pepsin-Spaltungen zusammenhängen, welche zwischen den zwei Disulfidbrücken der 6 kDa-Domäne erfolgen (Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994); Bellamy et al., Biochim. Biophys. Acta 1121: 130-6 (1992)).
Die Wirksamkeit von Cathepsin D hinsichtlich des Erzeugens des antimikrobiellen Polypeptids aus LF ist aus verschiedenen Gründen bedeutsam. Obwohl es ein Mitglied der Asparaginsäure-Familie von Proteasen ist, die Chymosin, Renin, die HIV-1- Protease und Pepsin umfasst (K. Takahasi, Herausgeber, Aspartic Proteinases: Structure, Funktion, Biology, and Biomedical Implications, (Plenum Press, New York, 1995)), und ähnliche strukturelle Merkmale und pH-Anforderungen verglichen mit Pepsin hat, ist Cathepsin D insofern verschieden von diesen Proteasen, als dass es allgemein im lysosomalen Kompartiment aller Zellen vorkommt und in professionellen Phagozyten häufig vorhanden ist (J. Tang und R. N. S. Wong, J. Cell. Biochem. 33: 53-63 (1987)). Cathepsin D wird auch aus Zellen als aktive Protease sekretiert, die extrazelluläre Moleküle abbauen kann, vorausgesetzt, dass eine ausreichend saure Umgebung vorhanden ist (Briozzo et al., Cancer Research 48: 3688-3692 (1988)). Überdies kommt es häufig in entzündlichem Gewebe vor (S. Bazin und A. Delaunay in Inflammation, Biochemistry and Drug Interaction, A. Bertelli und J. C. Houck, Herausgeber, (Excerpta Medica., Amsterdam, 1969), S. 21-28) und ist dafür bekannt, beim Erzeugen von anderen pharmakologisch aktiven Polypeptiden wichtig zu sein (L. M. Greenbaum, in Proteases and Biological Control, E. Reich, D. B. Rifkin und E. Shaw, Herausgeber, (Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1975), S. 223-228). In Bezug auf dessen in vivo-Verteilung und Funktion sowie dessen besondere Fähigkeit zum Prozessieren von LF ist Cathepsin D folglich ganz besonders geeignet in der Entzündungsantworterzeugung dieses Abwehrpolypeptids mitzuwirken.
Das häufige Vorkommen des katheptischen LF-Polypeptids in Sputum weist darauf hin, dass dieses eine wichtige Funktion während einer Lungenentzündung oder -infektion hat. Zusammen mit der Beobachtung, dass das antimikrobielle Polypeptid nach dem zellulären Prozessieren von LF, das sich von Epithel ableitet, erzeugt werden kann, steht dessen Vorhandensein in Sputum auch im Einklang mit einem Potential desselben, in der Schleimhaut-Immunität sowie der durch Neutrophile vermittelten Immunität mitzuwirken.
Inhibierung des bakteriellen Wachstums durch ein den ersten 33 Aminosäuren von LF entsprechendes Polypeptid
Frühere Studien zeigten, dass das N-terminale 6 kDa-Polypeptidfragment von LF als Glykosaminoglykan-Bindungsstelle dient, und dass die Glykosaminoglykan (GAG)-Bindungsaktivität von LF innerhalb den N-terminalen 33 Aminosäuren des Polypeptids enthalten war. Dieses 33-Mer enthält zwei Cluster von positiv geladenen (basischen) Resten, von denen man annimmt, dass diese für die GAG-Wechselwirkung erforderlich sind. Ein den Aminosäuren 7-33 von Lactoferrin entsprechendes 27-Mer, das den ersten Cluster von basischen Resten in LF nicht aufwies, jedoch den zweiten Cluster enthielt, band GAG nur schwach. Ein den Aminosäuren 1-27 von LF entsprechendes 27-Mer, das den zweiten Cluster von basischen Resten nicht aufwies, zeigte ebenfalls eine schwächere Bindung an GAG als das 33-Mer, das beide basischen Cluster enthielt (Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-23667 (1994)).
Um zu untersuchen, ob Regionen des Moleküls, die an der GAG-Bindungsaktivität des 6 kDa-LF-Polypeptids (erzeugt durch Pepsin-Verdau) beteiligt sind, auch bei der antimikrobiellen Aktivität des erfindungsgemäßen 6 kDa-Polypeptids beteiligt sind, wurden Polypeptide mit verschiedenen Längen, welche der N-terminalen Aminosäuresequenz von LF entsprachen, getestet hinsichtlich der Fähigkeit, das Wachstum von E. coli 0111 zu inhibieren. Übernachtkulturen wurden über einen Zeitverlauf von sieben Stunden in Gegenwart von 50 μM von entweder LF, einem 33-Mer, das den Aminosäuren 1-33 von LF entspricht, einem 26-Mer, das den Aminosäuren 7-33 von LF entspricht und einem 27-Mer, das den Aminosäuren 1-27 von LF entspricht wachsen gelassen. Das 33-Mer supprimierte das Wachstum dieser Kulturen über den gesamten Zeitverlauf vollständig. Im Gegensatz dazu wies LF nur eine vorübergehende das Wachstum supprimierende Wirkung auf (2). Dies stimmt damit überein, dass LF und das 33-Mer das bakterielle Wachstum über unterschiedliche Mechanismen inhibieren. Die Wachstumsinhibierungswirkung von intaktem LF, jedoch nicht des 33-Mers, kann beseitigt werden, indem das Protein mit Eisen gesättigt wird, was darauf hinweist, dass die Hauptwirkungsweise von LF über eine Eisen-Starvation der Bakterien erfolgt. Der Unterschied in den kinetischen Daten für das 33-Mer verglichen mit LF weist darauf hin, dass die Aktivität des 33-Mers nicht in Erscheinung treten kann, während es in dem intakten Protein verbleibt. Das Unver mögen des 26-Mers und des 27-Mers, das Kulturwachstum zu inhibieren, unterstreicht die Bedeutung des Beibehaltens von beiden Clustern von basischen Resten an den Termini des 33-Mers für die antimikrobielle Funktionsfähigkeit von Polypeptiden, die sich von der N-terminalen LF-Sequenz ableiten. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die früher beschriebenen für die GAG-Bindung verantwortlichen Aminosäuren von LF möglicherweise für die antimikrobielle Aktivität verantwortlich sind, die früher für das Pepsin-abgeleitete 6 kDa-LF-Fragment beobachtet wurde.
Antimikrobieller Dosis-Wirkung-Vergleich von Polypeptiden mit und ohne die zwei basischen Cluster
Um die Aktivität des oben beschriebenen 33-Mers, das zwei basische Cluster enthält, und des oben beschriebenen 27-Mers, das nur einen basischen Cluster enthält, zu vergleichen, wurden Kulturen von E. coli für 5 Stunden in Gegenwart verschiedener Dosen der zwei Polypeptide wachsen gelassen. Wie in 3 gezeigt, inhibierte das GAG-bindende 33-Mer das bakterielle Wachstum mit einer minimalen Inhibitorkonzentration (MIC) von ~ 2-5 μM. Im Gegensatz dazu inhibierte das 27-Mer das Wachstum nicht (selbst bei so hohen Konzentrationen wie 200 μM). Diese Daten zeigen, dass die Inhibierung des mikrobiellen Wachstums durch das 33-Mer einen intakten ersten Cluster von basischen Resten erfordert und die Inhibierung dosisabhängig ist.
Wirkung der Ionenstärke auf die antimikrobielle Aktivität des 6 kDa-LF-Polypeptids
Man glaubt, dass ein erster Schritt in der antimikrobiellen Funktion von vielen der natürlich vorkommenden kationischen Wirtsabwehrpolypeptiden das Binden des Polypeptids an die Oberfläche der Mikrobe über schwache elektrostatische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Stellen auf der mikrobiellen Oberfläche umfasst. Im Einklang damit ist die Beobachtung, dass viele dieser Wirtsabwehrpolypeptide unter erhöhten Ionenstärkebedingungen nicht wirksam sind gegen das mikrobielle Ziel, wobei dann der erste Schritt des Bindens inhibiert sein würde. Diese Art von Verminderung der Schutzeigenschaften der Wirtsabwehrpolypeptide kann physiologisch relevant sein für Infektionen, die in bestimmten Geweben stattfinden, wo eine Salzakkumulation erfolgt, wie der normalen Niere oder Blase, oder der Lunge von Patienten mit cystischer Fibrose. Um die Empfindlichkeit der antimikrobiellen Aktivität eines repräsentativen antimikrobiellen LF-Polypeptidfragmente gegenüber ansteigender Ionenstärke zu definieren.
Die Ergebnisse des Experiments, die in der 4 dargestellt sind, zeigen, dass sich die Wachstumsinhibierungsaktivität des 6 kDa-Polypeptids bei ansteigender Ionenstärke verringert, bis diese im Wesentlichen verloren geht, wenn die Konzentration von NaCl auf 50 mM über dem Physiologischen ansteigt (Ionenstärke gleich oder größer als 200 mM NaCl). Umgekehrt ist das Polypeptid bei sub-physiologischen Ionenstärken signifikant wirksamer beim Inhibieren des Bakterienwachstums als dieses bei physiologischen Salzkonzentrationen ist. Die Verringerung der Ionenstärke von 150 mM NaCl auf 50 mM NaCl verringert beispielsweise die Anzahl von lebensfähigen Bakterien nach dem Kontakt 10000-fach.
Diese Ergebnisse sind aus verschiedenen Gründen bedeutsam. Erstens zeigen diese die außerordentliche Empfindlichkeit des repräsentativen antimikrobiellen Polypeptids gegenüber feinen Störungen der Ionenstärke und legen nahe, dass das Polypeptid das mikrobielle Wachstum über einen Mechanismus inhibiert, der eine elektrostatische Wechselwirkung mit irgendeinem bzw. irgendwelchen noch unbekannten mikrobiellen Zielmolekül bzw. mikrobiellen Zielmolekülen, höchst wahrscheinlich LPS, inhibiert. Zweitens unterstreichen diese Ergebnisse die Wahrscheinlichkeit, dass von LF abgeleitete Wirtsabwehrpolypeptide und höchstwahrscheinlich andere endogene Wirtsabwehrpolypeptide der ursprünglichen (Wildtyp)-Sequenz, Patienten mit cystischer Fibrose höchstwahrscheinlich nicht vor Lungeninfektionen schützen werden. Dies ist so, weil beschrieben wurde, dass die Chloridkonzentration der Lungenoberflächenflüssigkeit in diesen Patienten 50-100 mM höher ist als in der normalen Lunge und diese Polypeptide bei dieser Ionenstärke nur eine gering oder gar keine antimikrobielle Aktivität aufweisen.
Das 6 kDa-LF-Polypeptid und das 33-Mer erhöhen die Permeabilität der Bakterienmembran
Die biochemischen und strukturellen Ähnlichkeiten der erfindungsgemäßen Polypeptide zu anderen bekannten antibiotischen Polypeptiden, humanen Defensinen HNP-1 und HNP-2, antimikrobiellem Rinder-Trachealpeptid (TAP), Schweine-Protegrinen und anderen, legen nahe, dass diese Domäne in LF das bakterielle Wachstum durch Beeinträchtigen der Permeabilitätseigenschaften der Bakterienmembranen inhibieren kann. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide, die Wirksamkeit von Rifampicin zu erhöhen, geprüft. Rifampicin ist ein Wirkstoff mit geringem Molekulargewicht (< 1 kDa), der eine geringe Membranpermeabilität aufweist, jedoch nach Eintritt in das Cytosol Bakterienzellen wirksam vergiftet.
Kulturen von E coli wurden sub-optimalen Dosen von Rifampicin in Gegenwart oder Abwesenheit von sub-optimalen Dosen der angegebenen Polypeptide ausgesetzt (5) und 6 Stunden lang inkubiert, an welchem Zeitpunkt die CFU bestimmt wurden. Die Wachstumsinhibierungswirkungen einer sub-optimalen Dosis von Rifampicin waren bei der Verabreichung in Kombination mit einer geringen Dosis der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Polypeptide drastisch erhöht. Die Zugabe einer subaktiven Dosis (5 μM) des 6 kDa-Polypeptids zu Kulturen, die Rifampicin ausgesetzt waren, verringerte beispielsweise die Anzahl von lebensfähigen Bakterien, die sich nach der 6-ständigen Wachstumsdauer ergaben, um mehr als drei Größenordnungen. Während die Negativkontrolle des 27-mer Polypeptids keine signifikante Wirkung auf die antimikrobielle Aktivität von Rifampicin hatte, verstärkte das 33-Mer, wie das 6 kDa-Polypeptid, das Antibiotikum. Die Synergie zwischen dem 33-Mer und Rifampicin ergab ungefähr 1% so viele lebensfähige Bakterien wie die Behandlung mit Rifampicin alleine. Eine ähnliche Verstärkungswirkung wurde unter Verwendung des Antibiotikums Isoniazid beobachtet. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide wenigstens teilweise durch Schädigung der äußeren Hülle von Mikroben wirken.
Diese Ergebnisse zeigen auch die Fähigkeit der Polypeptide, die antimikrobielle Aktivität von anderen antimikrobiellen Agenzien, insbesondere herkömmlichen Antibiotika, zu verstärken. Dies zeigt, dass die Polypeptide verwendet werden können, um bestimmte Arten von Antibiotika-resistenten Mikroben in den Antibiotikaempfindlichen Phänotyp umzuwandeln. Beispielsweise wurden praxistaugliche Konzentrationen eines aufgrund einer entwickelten Resistenz andernfalls unwirksamen Antibiotikums wirksam durch Verabreichung in Kombination mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden.
Neutralisierung von Endotoxin in vitro und in vivo durch ein LF-abgeleitetes Polypeptid
Frühere Studien haben nachgewiesen, dass die N-terminalen 33 Reste von humanem LF die minimale Sequenz darstellen, welche die Bindung des Proteins an Glykosaminoglykane vermittelt (Mann et al., 3. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Diese Sequenz enthält einen kationischen Kopf (Reste 1-6) und einen Schwanz (Reste 28-33), welche sich unter Bildung der Glykosaminoglykan-Bindungsstelle vereinigen. In dieser Studie wurde das Vermögen zur Endotoxin-Neutralisierung eines synthetischen Polypeptids, als LF-33 bezeichnet, das den ersten 33 Resten der sekretierten Form von humanem LF entspricht, bestimmt.
Inhibierung von Endotoxin-induzierter Limulus-Amebozytenlysat-Koagulierunq
Die Peptid-vermittelte Inhibierung der Endotoxin-induzierten Limulus-Amebozytenlysat(LAL)-Koagulierung wurde mit einem empfindlichen LAL-Assay gemessen (Zhang et al., 3. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). Ein Limulus-ELISA ist ein Endotoxin-Assay, der auf der Aktivierung der LAL-Koagulierung durch Endotoxin und dem Nachweis der erzeugten Peptid-C-Immunreaktivität mit einem ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Polypeptid beruht. Gemäß Definition war das Endotoxin neutralisiert, wenn dieses die Fähigkeit zur Aktivierung der LAL-Enzyme verlor. Die 50% Endotoxin neutralisierende Konzentration (ENC₅₀) widerspiegelt die Wirksamkeit eines Anti-Endotoxin-Agens; eine geringe ENC₅₀ zeigt eine hohe Wirksamkeit an. Die Tabelle 2 listet den bestimmten ENC₅₀-Wert für jedes Anti-Endotoxin-Agens gegen Lipid A und vier verschiedene Arten von LPS auf. Die Wirksamkeit jedes Anti-Endotoxin-Agens variierte in Abhängigkeit der Art des Endotoxins. LF-33 war auf einer molaren Basis wirksamer als Polymyxin B beim Neutralisieren aller Formen von getesteten Endotoxinen. Im Gegensatz dazu war LF-27 ungefähr 10-mal weniger wirksam als LF-33 beim Neutralisieren von Lipid A und E. coli LPS und wies keine nachweisbare Aktivität gegen die anderen drei LPS auf. Der einzige Unterschied zwischen der Sequenz von LF-33 und LF-27 besteht darin, dass LF-27 die ersten sechs Reste (GRRRRS) am N-Terminus von LF-33 nicht aufweist.

Bemerkenswerterweise führte diese Deletion zu einem drastischen Verlust des Endo toxin-Neutralisierungsvermögens des Polypeptids in diesem Assay. Das Binden von Serumproteinen an Endotoxin neutralisiert die Endotoxinaktivität in diesem Assay, indem verhindert wird, dass das Endotoxin LAL aktiviert (Emancipator et al., Infect. Immun. 60: 596-601 (1992)). Humanes Serum zeigte variierende Ausmaße der Inhibierung der Endotoxin-induzierten LAL-Koagulierung, wies jedoch keine Wirkung auf Lipid A auf (Tabelle 2). Tabelle 2: Mittels Limulus-ELISA bestimmte 50% Endotoxin neutralisierende Konzentration (ENC₅₀) von Anti-Endotoxin-Agenzien

	ENC₅₀ (Durchschnitt +/– SD, μM oder prozentuale Konzentration) gegen Endotoxin (200 EU/ml)
Agenzien	Lipid A	E. coli LPS	S. abortus LPS	P. aer. LPS	N. min. LPS
LF-33	0,10 +/– 0,017	0,52 +/– 0,078	0,39 +/– 0,054	2,08 +/– 0,37	3,08 +/– 0,44
LF-27	0,63 +/– 0,093	7,45 +/– 1,12	> 300	> 300	> 300
Polymyxin B	0,19 +/– 0,021	1,95 +/– 0,26	18,2 +/– 2,85	3,91 +/– 0,73	> 100
humanes Serum	> 50%	0,03% +/– 0,005%	2,1% +/– 0,29%	0,63% +/– 0,11%	2,52 +/– 0,41

Die LF-Polypeptide neutralisieren die Endotoxinaktivität des Lipid A-Anteils von LPS
Die Lipid A-Region des LPS-Moleküls ist hauptsächlich für die entzündlichen und toxischen Wirkungen von LPS verantwortlich. Wenn LPS aus der Mikrobe freigesetzt wird, wird der Lipid A-Anteil zugänglich. Die folgenden Assays wurden durchgeführt, um das Potential verschiedener aminoterminaler LF-Polypeptide zum Neutralisieren der endotoxischen Aktivität des Lipid A-Anteils von LPS zu bestimmen. LF, das 6 kDa-Fragment von LF, LF-33, LF-27 und Polymyxin B wurden jeweils hinsichtlich der Fähigkeit getestet, die Endotoxinaktivität von Lipid A aus E. coli 0113 (30 ng/ml) unter Verwendung eines LAL-Assays zu neutralisieren. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 6 dargestellt. Obwohl LF keine nennenswerte Lipid A neutralisierende Aktivität zeigte, neutralisierten das 6 kDa-LF-Fragment, LF-33 und LF-27 Lipid A mit ähnlichen jedoch nicht identischen Wirkungen, wobei jede derselben mit derjenigen von Polymyxin B, dem Industrie-Standard, vergleichbar war. Dies zeigt, dass LF-27, das nur einen Cluster von basischen Aminosäuren aufweist, so wirksam beim Neutralisieren einer Endotoxinform, die den großen, sperrigen Oligosaccharidanteil von LPS nicht aufweist, ist, wie die Polypeptide, die zwei Cluster von basischen Aminosäuren enthalten. Diese beobachtete Fähigkeit des 27-Mers, den leichter zugänglichen Lipid A-Schwanz zu neutralisieren, weist darauf hin, dass die Cluster von positiv geladenen Resten an den Termini des 33-Mers an die anionischen Stellen im Oligosaccharidanteil von LPS oder an die Kopfgruppe von Lipid A binden, wobei jedoch die hydrophobe Zwischensequenz, welche die zwei Cluster überspannt, von kritischer Bedeutung für das Binden an die Lipid A-Region und das Neutralisieren dessen Entzündungsaktivitäten ist. Die Endotoxinaktivität der kleineren Fragmente von LF zeigt, dass die Endotoxin neutralisierende Aktivität dieser kleinen Polypeptide im Rahmen des intakten LF-Moleküls maskiert ist.
Suppression der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion durch LF-33

Die Suppression von Endotoxin-induzierter TNF-α-Sekretion durch die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 wurde auch gemessen (Kelly et al., Infect. Immun. 59: 4491-6 (1991)). Die RAW 264.7-Zellen sekretieren TNF-α nach Kontakt mit Endotoxin (M. R. Ruff und G. E. Gifford, Lymphokines 2: 235-272 (1981)). Eine lineare Beziehung zwischen der TNF-α-Sekretion und der Endotoxinkonzentration wurde bei Endotoxinkonzentrationen von unter 20 ng/ml für das Lipid A und verschiedene in dieser Studie verwendete LPS beobachtet, und eine Endotoxinkonzentration von 10 ng/ml wurde für die TNF-α induzierenden Experimente ausgewählt. Das Mischen von Endotoxin mit ansteigenden Konzentrationen von LF-33 führte zu einer dosisabhängigen Suppression von Endotoxin-induzierter TNF-α-Sekretion (7). Ähnlich zu den Ergebnissen des LAL-Assays variierte die Wirksamkeit von LF-33 in Abhängigkeit von der Art von Endotoxin. Die LF-33-Konzentration, welche erforderlich ist, um 50% der durch Endotoxin (10 ng/ml) induzierten TNF-α-Sekretion zu supprimieren, betrug ungefähr 0,01 μM für E. coli LPS und Lipid A, 0,1 μM für LPS von P. aeruginosa und 0,5 μM für LPS von S. abortus equi und N. meningitidis Die Wirkungen von LF-27, Polymyxin B und humanem Serum auf die Endotoxin-induzierte TNF-α-Sekretion sind zum Vergleich in der Tabelle 3 gezeigt. LF-33 wies eine geringfügig höhere Wirksamkeit als Polymyxin B im Hinblick auf die Suppression der durch verschiedene Arten von Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion auf, während eine gleiche molare Konzentration von LF-27 oder 10% humanem Serum keine Wirkung auf die Endotoxininduzierte TNF-α-Sekretion hatte. Tabelle 3: Suppression der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion durch RAW 264.7-Zellen durch Anti-Endotoxin-Agenzien +

	Durch Endotoxin (10 ng/ml induzierte TNF-α-Sekretion (Durchschnitt +/– SD, pg/ml)
Agenzien	Lipid A	E. coli LPS	S. abortus LPS	P. aer. LPS	N. min. LPS
Endotoxin-Kontrolle	2386 +/– 269	4928 +/– 896	3969 +/– 443	4813 +/– 571	5658 +/– 770
LF-33 (2,5 μM)	239* +/– 29,6	211* +/– 31,4	886* +/– 149	164* +/– 23,3	1,624* +/– 203
LF-27 (3 μM)	3182 +/– 412	4912 +/– 588	3985 +/– 497	4633 +/– 603	7306 +/– 1008
Polymyxin B (2,5 μM)	537* +/– 77,9	314* +/– 42,6	1115* +/– 181	246* +/– 32,5	2829* +/– 455
humanes Serum (10%)	2663 +/– 337	4817 +/– 964	5726 +/– 1126	4428 +/– 677	8817 +/– 1711

* Einseitiger P-Wert < 0,05 verglichen mit den LPS-Kontrollen in dem ungepaarten t-Test.
+ Endotoxin wurde mit den Test-Agenzien bei den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen bei 37°C für 1 h inkubiert, bevor dieses mit RAW 264.7-Zellen in Kontakt gebracht wurde.

Wirkung von humanem Serum auf die LF-33-Suppression der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion

Um die Suppression der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion unter physiologischeren Bedingungen zu untersuchen, wurden LF-33 oder Polymyxin B vor der Zugabe von Endotoxin zu humanem Serum (Endkonzentration 10%) gegeben. Wie in der Tabelle 4 gezeigt, war die Suppressionswirkung der Polypeptide deutlich schwächer in Gegenwart des 10%-igen humanen Serums, obwohl die Wirkung des Serums durch Erhöhen der Konzentration von LF-33 überwunden werden konnte (Tabelle 4 und 8). Wenn das Polypeptid jedoch 5 min vor der Zugabe des Serums mit Endotoxin gemischt wurde, war die Wirkung des Serums auf die Neutralisierung von Endotoxin durch die Polypeptide stark verringert (Tabelle 5). Tabelle 4: Suppression der Endotoxin-induzierten TNF-α-Sekretion durch RAW 264.7-Zellen in 10% humanes Serum enthaltendem Kulturmedium durch Anti-Endotoxin-Polypeptide

	Durch Endotoxin (10 ng/ml) induzierte TNFα-Sekretion (Durchschnitt +/– SD, pg
Polypeptide	Lipid A	E. coli LPS	S. abortus LPS	P. aer. LPS	N. min. LPS
Endotoxin-Kontrolle	2663 +/– 337	4817 +/– 964	5726 +/– 1126	4428 +/– 677	8817 +/– 1711
Polymyxin B (2,5 μM)	1209* +/– 199	1259* +/– 321	4090 +/– 806	4206 +/– 956	8181 +/– 1032
LF-33 (2,5 μM)	1518* +/– 311	1938 +/– 376	5627 +/– 1037	2776* +/– 478	7998 +/– 976
LF-33 (10 μM)	185* +/– 25,6	369* +/– 67,1	1191* +/– 264	833* +/– 138	6473 +/– 787

* Einseitiger P-Wert < 0,05 verglichen mit der Kontrolle in dem ungepaarten t-Test.
+ Endotoxin wurde mit Polypeptiden bei den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen in 10% humanes Serum enthaltendem Kulturmedium bei 37°C für 1 h inkubiert, bevor dieses mit RAW 264.7-Zellen in Kontakt gebracht wurde.

Polypeptide	Durch Endotoxin (10 ng/ml) induzierte TNF-α-Sekretion (Durchschnitt +/– SD, pg/ml)
	E. coli LPS mischen mit				P. aer. LPS mischen mit
	Polypeptid zuerst	Serum zuerst	Polypeptid zuerst	Serum zuerst
LPS-Kontrolle	4817 +/– 964				4428 +/– 677
LF-33 (2,5 μM)
LF-33 (2,5 μM)	575** +/– 115	1938* +/– 376	610** +/– 160	2776* +/– 478
Polymyxin B (2,5 μM)	525** +/– 130	1259* +/– 321	883** +/– 261	4206 +/– 956

* Einseitiger P-Wert < 0,05 verglichen mit der Kontrolle in dem ungepaarten t-Test.
** Einseitiger P-Wert < 0,01 verglichen mit der als "Serum zuerst" bezeichneten Gruppe in dem ungepaarten t-Test.

Wirkung von LF-33 auf die Endotoxin-induzierte Letalität und den TNF-α- Serumspiegel in einem Galaktosamin-sensibilisierten Maus-Modell

Mäuse sind üblicherweise gegenüber Endotoxin resistent. Die Empfindlichkeit von Mäusen gegenüber Endotoxin kann jedoch mehr als 1000-fach erhöht werden durch die Co-Injektion mit dem leberspezifischen Inhibitor Galaktosamin (Freudenberg M. A. und C. Galanos, Infect. Immun. 59: 2110-2115 (1991); Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5939-5943 (1979)). Ein wesentliches Merkmal dieses in vivo-Modells besteht darin, dass systemisch freigesetztes TNF-α aufgrund eines durch TNF-α vermittelten Leberzelltods zu einer Leberschädigung führt, welche durch Messen der Letalitätsrate bewertet werden kann. Die intraperitoneale Injektion von 125 ng E. coli LPS pro Tier führte zu einer nahezu 100%-igen Letalität in den Galactosamin sensibilisierten Mäusen. Wie in Tabelle 6 gezeigt, war die Endotoxin-induzierte Letalität durch Injizieren von LF-33 drastisch verringert. Geringe Mengen von LF-33 (2,5 μg pro Tier) reduzierte bei gleichzeitiger Injektion von Endotoxin die Letalität von 93% (14 Todesfälle von 15) auf 6% (1 Todesfall von 15). Zusätzlich verringerte LF-33 die Letalität auch signifikant, wenn dieses 10 min nach der intraperitonealen (i.p.) Injektion von Endotoxin intravenös (i.v.) injiziert wurde (Tabelle 6), obwohl eine 40-fach größere Menge an LF-33 erforderlich war. Der Schutz korrelierte mit der Verringerung des Maus-TNF-α-Serumspiegels (Tabelle 6). Tabelle 6: Schutz von Tieren vor der LPS-Letalität durch LF-33 in dem Galaktosaminsensibilisierten Maus-Modell

Dosis der i.p.-Injektion pro Maus*	Letalität (Todesfälle/ Gesamtzahl)	TNF-α-Serumspiegel (Durchschnitt +/– SD, pg/ml)
(1) LPS 5 ng	1/5	nicht bestimmt
(2) LPS 25 ng	3/5	nicht bestimmt
(3) LPS 125 ng	14/15	5801 +/– 3120
(4) LPS 125 ng gemischt mit 2,5 μg LF-33	1/15**	885*** +/– 657
(5) LPS 125 ng + 20 μg LF-33 (i.v.)	5/5	4611 +/– 1897
(6) LPS 125 ng + 100 μg LF-33 (i.v.)	3/15**	1125*** +/– 1166

* In den Gruppen (1) bis (4) wurden alle Materialien i.p. injiziert, während in den Gruppen (5) und (6) LPS und Galaktosamin (15 mg pro Maus) i.p. injiziert wurden, LF-33 jedoch 10 min nach der LPS-Injektion i.v. injiziert wurde. Der Mausstamm war NIH/Swiss mit einem Gewicht zwischen 20 und 22 Gramm pro Maus. Das Gesamtvolumen für die i.p.- und i.v.-Injektion pro Maus betrug 0,5 ml bzw. 0,2 ml.
** Einseitiger P-Wert < 0,01 verglichen mit Gruppe (3) in dem Fisher's-Exact-Test.
*** Einseitiger P-Wert < 0,01 verglichen mit Gruppe (3) in dem ungepaarten t-Test.

Wirkung des katheptischen 6 kDa-LF-Fragments auf die bakteriämische Letalität in dem Galaktosamin-sensibilisierten, leukopenischen Maus-Modell
Das endgültige Schutzvermögen des 6 kDa-LF-Polypeptids in einer Wirtsabwehr gegen eine bakterielle Infektion wurde durch eine Untersuchung in einem akuten, Galaktosamin-sensibilisierten, leukopenischen Maus-Modellsystem bestimmt (Bucklin et al., J. Infect. Dis. 174: 1249-1254 (1996)). In diesem Modell wurden Mäuse leukopenisch gemacht, um deren endogene Wirtsabwehrsysteme zu supprimieren und anschließend gegenüber den Wirkungen von gramnegativen Endotoxinen durch eine Galaktosamin-Behandlung sensibilisiert, während eine letale intraperitoneale Dosis von E coli injiziert wurde. Die in der 9 dargestellten Daten zeigen, dass die gleichzeitige Injektion des katheptischen 6 kDa-Fragments von humanem LF (100 μM, i.p.) die Überlebensrate von infizierten Tieren drastisch von 10% in unbehandelten Tieren auf 70% in Polypeptid-behandelten Tieren erhöhte (einseitiger P-Wert < 0,01 unter Verwendung des Fisher's-Exact-Test). Diese Rettung vor der Letalität zeigt in dramatischer Weise das Schutzpotential des Polypeptids in vivo und ist wahrscheinlich auf dessen kombinierten antimikrobiellen und Anti-Endotoxin-Eigenschaften zurückzuführen. Dieses Ergebnis zeigt, dass das Polypeptid einen erheblichen Nutzen als Therapeutikum hat.
Antimycobakterielle Aktivität der antimikrobiellen Polypeptide
Bakterien der Gattung Mycobacteria umfassen M. tuberculosis, M. smegmatis, M. leprae, M. bovis und andere. Diese Mikroben sind für zwei der gefürchtetesten Krankheiten in der Menschheitsgeschichte verantwortlich: Tuberkulose und Lepra. Mycobakterien haben eine ungewöhnlich dicke Zellwand mit einer komplexen chemischen Zusammensetzung, die einen hohen Lipidgehalt aufweist, welche diesen Mikroben einzigartige Eigenschaften verleiht, insbesondere eine erhebliche Resistenz gegenüber vielen Typen von Antibiotika. Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die LF-abgeleiteten Polypeptide das Wachstum von Mycobakterien inhibieren können. Kulturen von M. smegmatis mit gleicher Dichte wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von LF-33 (50 μM Endkonzentration) für 16 Stunden wachsen gelassen und die resultierenden lebensfähigen Zellen wurden bestimmt. Die in Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse zeigen eine mittlere Abtötung von 94% in Gegenwart von LF-33. In einem ergänzenden Experiment wurden Kulturen von M. smegmatis in Gegenwart von entweder 10, 20, 30, 40, 50 oder 100 μM LF-33 wachsen gelassen, wonach die resultierenden lebensfähigen Zellen bestimmt wurden. Die in der 10 dargestellten Ergebnisse zeigen eine dosisabhängige Inhibierung des mycobakteriellen Wachstums durch das LF-33-Polypeptid. Das 33-Mer zeigt einen anti-mycobakteriellen MIC-Wert von nicht mehr als 10 μM und verursacht bei einer Konzentration von 50 μM eine Abtötung von ungefähr 94%.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein repräsentatives Mitglied der antimikrobiellen LF-Polypeptide, das 33-Mer, das Wachstum von Mycobakterien inhibiert. Obwohl diese Experimente mit der schneller wachsenden M. smegmatis BH1-Art durchgeführt wurde, wurden ähnliche Ergebnisse auch mit dem H37Ra-Stamm von M. tuberculosis erzielt. Die unvorhersehbare Inhibierung von Mycobakterien durch LF-33 ist angesichts der ungewöhnlich wachsartigen Eigenschaften und der Eigenschaft geringen Durchlässigkeit der Zellmembran dieser Mikroben überraschend. Tabelle 7: Anti-mycobakterielle Aktivität von LF-33

Experiment Unbehandelt 50 μM LF-33

CFU/ml CFU/ml (% abgetötet)

1 40000 780 (98%)

2 31500 3,000 (90%)

3 21000 1000 (95%)

Durchschnitt (94%)
Verfahren der Erfindung
Immunoreagenzien. Antikörper gegen den N-Terminus von humanem LF wurden aus Kaninchen erhalten, die mit einer mehrfach antigenen Polypeptidform (J. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409-5413 (1988)) der ersten siebzehn Reste der reifen Form von humanem LF immunisiert worden waren. Diese Sequenz enthält den ersten von zwei Clustern von basischen Aminosäuren, welche für die Bindung von LF an anionische Polysaccharide, wie Heparin, gleichzeitig erforderlich sind (Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Diese Antikörper immunoblotten intaktes LF und Fragmente, welche dessen N-Terminus enthalten, haben jedoch keine Kreuzreaktivität mit irgendeinem anderen getesteten Polypeptid, einschließlich humanem Transferrin oder davon abgeleiteten proteolytischen Fragmenten. Die Antikörper wurden für das Immunoblotten als Antiserum verwendet, das 1:3000 in gepufferter Salzlösung, enthaltend 1% Albumin als Träger und Membranblockierungsagens, verdünnt war. Der sekundäre Antikörper war ein alkalische Phosphotase-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG von Kirkegaard & Perry Laborstories und es wurde das BCIP/NBT-Nachweissystem verwendet (E. Harlow und D. Lane, Herausgeber, Antibodies: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Kap. 12).
Immunoblotten. Standardprozeduren wurden für die Gelelektrophorese und das Immunoblotten verwendet (E. Harlow und D. Lane, Herausgeber, Antibodies: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).
Probenvorbereitung. Abgelaufenes gefrorenes humanes Colostrum wurde von einer lokalen Muttermilchbank erhalten. Alle anderen Körperflüssigkeitsproben wurden vom Gewebeentnahmezentrum des Health Sciences Zentrums der University of Virginia oder von freiwilligen Spendern im Labor erhalten. Proben von Hautausscheidungen ("Eiter") aus Eiterbeulen, gingivalen Plaque-Ausschabungen, Speichel und ausgehustetem Sputum wurden in sterilen Microfuge-Röhrchen gesammelt und mit SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend, 1 μg/ml Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin A zur Inhibierung von Proteasen, auf 1X gebracht. Der Probenpuffer enthielt 0,1 SDS und +/– 5% β-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel. Diese wurden sofort gekocht und bis zur Trennung auf 5-20% linearen Gradientenpolyacrylamidgelen bei –80°C gelagert. Das Volumen der pro Gelspur geladenen ursprünglichen Gewebeflüssigkeit bemaß sich, abhängig von der Probe, auf 5-20 ml. Aufgetrennte Polypeptide wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen (Millipore Corp.) in einem Transferpuffer transferiert, der empirisch ermittelt wurde, so dass dieser einen optimalen Transfer von kleinen kationischen Polypeptiden erlaubt. Der elektrophoretische Transfer erfolgte für 2 h bei konstanten 150 Volt in 30% Methanol, enthaltend 0,01 SDS, 25 mM TRIS-Base und 192 mM Glycin, in einem Hoeffer TE-22-Minitransferapparat. Ponceau S wurde verwendet, um die gesamten auf die Membran transferierten Proteine vor dem Fotografieren und Immunofärben reversibel anzufärben. Scanning-Densitometrie der immunogefärbten Banden erfolgte unter Verwendung eines Hewlet Packard ScanJet IIcx/T-Laserscanners und des Programms von N.I.H zur densitometrischen Bildanalyse.
Zellisolierung. Primäre Kulturen von Phagozyten wurden zunächst durch das Ficoll(Organon Teknika Corp.)-Dichtegradientenverfahren (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W. Strober, Herausgeber, Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons, New York, NY, 1991), Kap. 7) aus humanem peripherem Blut isoliert. Kontaminierende rote Blutzellen wurden durch differentielle Sedimentation in Dextran T-500, 0,9% Salz aus der Neutrophilenfraktion entfernt, gefolgt von einer hypotonischen Lyse. Die Monozyten wurden weiter von den Lymphozyten durch eine Gegenstrom-Zentrifugations-Elutriation in einem Beckman J2-21M-Zentrifugen-Elutriator (Beckman Instruments), wie beschrieben (ibid), isoliert. Alle Zellexperimente wurden innerhalb von 30 min nach dem Isolieren der frischen Phagozyten begonnen. Für die Phagozyten-Cokultur-Experimente wurden aus der gleichen Bluteinheit isolierte Monozyten und Neutrophile wieder vereinigt und die vereinigte Mischung in zwei Hälften aufgeteilt, wobei eine derselben als voraktivierte Kontrolle unmittelbar in Lysepuffer lysiert wurde; TRIS-gepufferte Salzlösung, enthaltend 1% Triton X-100 und einen Protease-Inhibitor-Cocktail. Die übrigen Zel len wurden nach Aktivierung mit 2 mM fMet-Leu-Phe (Sigma Chemicals) für 5 h bei 37°C in serumfreiem RPMI-Medium co-kultiviert (Life Sciences, Gaithersburg, MD). Die aktivierten Co-Kulturen wurden dann in Lysepuffer lysiert und das Detergenslysat mit dem überlagernden Kulturmedium bei der Aufbereitung für eine Heparinreinigung von LF-Fragmenten vereinigt. Die Heparin bindenden Polypeptide in den aktivierten und voraktivierten Co-Kulturlysaten wurden nach dem Klarmachen der Lysate durch Zentrifugation im Batch-Modus durch Heparinchromatographie isoliert. Die Polypeptide, die von der Heparin-Sepharose bei 750 mM NaCl eluierten, wurden dann unter reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt und wie oben beschrieben immunogeblottet. Für die Experimente, in denen Neutrophile und Monozyten getrennt voneinander untersucht wurden, wurde jede Kultur nach der Aktivierung für 3 h inkubiert und die Monozyten-Kulturen wurden mit 50 mg gereinigtem humanem Milch-LF supplementiert, da diese kein endogenes LF aufwiesen. Das Kulturmedium wurde dann vor dem Lysieren der Zellen mit dem oben beschriebenen 1% Triton X-100 enthaltenden Puffer entfernt und die Heparin bindenden Moleküle wurden getrennt voneinander aus den Kulturmedien und Zellextrakten isoliert.
Reinigung von LF aus humanem Colostrum und proteolytische Freisetzung der antimikrobiellen Domäne in vitro. Gefrorenes Colostrum wurde bei 37°C aufgetaut und mittels Zentrifugation für 40 min bei 10000 × g bei 4°C entfettet. Die darunterliegende Magermilch wurde ein zweites Mal entfettet und anschließend durch Inkubieren für 40 min bei 40°C in Molke umgewandelt, gefolgt von einer Ansäuerung mit HCl auf pH 4,7. Das Koagulum wurde durch Zentrifugation bei 4°C für 40 min bei 10000 × g entfernt und die Überstandsmolke vor der Fraktionierung durch Ionenaustauschchromatographie zur Isolation von LF mit 4 Volumen von TRIS-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, verdünnt. Nach Binden des LF in der verdünnten Molke an CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) wurde die Säule gründlich mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und die gebundenen Proteine mit einem Ionenstärkegradienten von 0,15-1,0 M NaCl im gleichen Waschpuffer eluiert. LF eluiert typischerweise als einzelner Peak bei ungefähr 550 mM NaCl, der in der SDS-PAGE-Analyse und der N-terminalen Aminosäuresequenzierung homogen war. Der LF-Peak wurde durch Speed Vac-Zentrifugation vierfach konzentriert und dann bei 4°C ausgiebig gegen 50 mM NaCl unter Verwendung von 30000 MWCO-Schlauchmaterial (Spectrum) dialysiert. Vor dem Verdau mit Cathepsin D aus Rindermilz (Sigma) wurde das dialysierte LF auf 150 mM NaCl und 50 mM Natriumacetat, pH 3,5, gebracht, und anschließend für 36 h bei 37°C mit einem 1:200 (w:w) Verhältnis von Cathepsin D zu LF vollständig verdaut. Die LF-Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 280 nm (unter Verwendung von E280nm1cm 0,1% = 1,0402) bestimmt. Für die Zeitablauf-Verdau-Experimente wurden Proben, die 20 mg des ursprünglichen LF entsprachen, an den verschiedenen angegebenen Zeitpunkten entnommen, mit 1 mg/ml Pepstatin A behandelt und in SDS-PAGE-Probenpuffer zur Beendigung der Proteolyse gekocht, und am Ende des Zeitverlaufs bis zur Elektrophorese gefroren gelagert. Um das antimikrobielle Fragment in großen Mengen herzustellen, wurde der 36 h LF-Verdau anschließend über eine Pepstatin A-Agarose-Säule (Sigma) gegeben, um jedwedes aktives Cathepsin D zu entfernen (L. B. Larsen und T. E. Petersen, in Aspartic Proteinases: Structure, Function, Biology, and Biomedical Implications, K. Takaahashi, Herausgeber, (Plenum Press, New York, 1995), S. 279-283) und die Durchflussfraktion wurde mit 1 mg/ml Pepstatin A behandelt, um jedwede Restaktivität von Cathepsin D zu inhibieren. Der Durchfluss wurde dann bei der Aufbereitung für die Heparin-Reinigung mit Natriumbicarbonat, NaOH und NaCl auf physiologischen pH und physiologische Ionenstärke verdünnt und mit Ferrochlorid auf 1 mM gebracht, um jedwede Spurenkonzentrationen von möglicherweise vorhandenem unverdautem LF (jedoch durch SDS-PAGE oder Immunoblotten nicht nachweisbar) mit Eisen zu sättigen. Das antimikrobielle Polypeptid wurde dann an Heparin-Sepharose (Pharmacia) gebunden und nach ausgiebigen Waschen der Säule mit Phosphat-gepufferter Salzlösung mit einem Gradienten von 150 mM bis 1 M NaCl eluiert. Das gereinigte Polypeptid wurde vor dem vollständigen Trocknen und dem Lagern bei –80°C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die Erzeugung des entsprechenden Fragments durch Pepsinolyse erfolgte im Wesentlichen wie beim Verdau mit Cathepsin, außer dass der Verdau für 4 h bei 37°C in 50 mM Glycin, pH 3,0, mit einem 3:100 (w:w) Verhältnis von Pepsin:LF durchgeführt wurde.
LF-Verdau mit Cathepsin D und Heparin. LF (10 μg) wurde, wie oben beschrieben, bei pH 5 für die angegebenen Zeiten mit Cathepsin D verdaut, entweder in Abwesenheit oder Gegenwart eines zehnfachen molaren Überschusses von Heparin (Schweine-Schleimhaut-Heparin, MW ~ 7-15 kDa, von Sigma Fine Chemicals).
Massenspektrometrie. MALDI-Massenspektrometrie (W. T. Moore, Methods Enzymol. 289: 520-42 (1997)) wurde mit dem Heparin-gereinigten katheptischen 6 kD-Fragment durch die Protein- und Kohlenhydrat-Struktureinrichtung der medizinischen Fakultät der Universität von Michigan oder durch das amerikanische Rote Kreuz durchgeführt.
Antimikrobieller Assay für LF-Polypeptide. Kulturen von E. coli 0111 (American Type Culture Collection #43887) wurden bei 37°C in 1% Bactopepton (BP) (Difco) in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (dPBS) (Mediatech) unter Belüftung durch Schütteln (225 U/min) wachsen gelassen. Übernachtkulturen wurden 8000-fach in 2X konzentriertem BP/dPBS verdünnt und mit einem gleichen Volumen an sterilem Endotoxin-freiem destilliertem Wasser, das Reihenverdünnungen des zu testenden Polypeptids enthielt, gemischt. Das Assay-Endvolumen betrug 300 ml in einem 12 mm × 75 mm Polypropylen-Röhrchen (Falcon) mit einer letzten Verdünnung der Übernachtkulturen von 1:16000, um ein ursprüngliches Inokulum von ~ 1-2 × 10⁴ CFU/ml zu erhalten. Das endgültige Assay-Medium war physiologisch bezüglich der Ionenstärke, 1% Bactopepton in 1 × Dulbeccos's Phosphat-gepufferter Salzlösung. Kulturen wurden, wie oben beschrieben, für 6 h bei 37°C unter Belüftung wachsen gelassen und anschließend die Zelldichte durch Messen der CFU/ml für jedes Assay-Kulturröhrchen bestimmt. Reihenverdünnungen jedes Assay-Röhrchens wurden auf Luria-Kulturmedium-Bactoagar plattiert und vor dem Zählen der Kolonien für 24 h bei 37°C inkubiert. Alle Assays erfolgten als Dreifachansatz und die Standardabweichung wurde für jede Konzentration des Inhibitors berechnet. Die Kulturdichte am Beginn und Ende der 6-ständigen Wachstumszeitdauer wurde auch von drei Kulturen, welche frei von irgendwelchen Polypeptidinhibitoren waren, bestimmt.
Unbehandelte Kulturen wuchsen unter diesen Assay-Bedingungen in 6 h üblicherweise auf 1-2 × 10⁸ CFU/ml.
Zeitverlauf des Wachstums von E. coli in Gegenwart der LF-Polypeptide. E. coli-Zellen, das klinische Stammisolat 0111, wurden von ATCC erhalten. Kulturen wurden routinemäßig über Nacht bei 37°C unter Belüftung durch Schütteln bei 220 U/min in 1% BP/PBS (1% Bactopepton (von Difco Laborstories, Detroit, MI), hergerichtet auf physiologische Ionenstärke in Phosphat-gepufferter Salzlösung, "PB5" (Mediatech Inc., Herndon, VA), bei pH 7,4 wachsen gelassen. Die Übernachtkulturen wurden 1:20 in 1% BP/PBS, enthaltend die angegebenen Polypeptide bei 50 μM, verdünnt und für die angegebenen Zeiten inkubiert. Das Kulturwachstum wurde spektrophotometrisch durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm zu jedem angegebenen Zeitpunkt verfolgt.
Dosiswirkung von E. coli 0111-Zellen in Gegenwart von LF-Polypeptiden. E. coli wurden, wie oben beschrieben, für 5 h in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des 33-mers oder des abgeleiteten 27-mer Polypeptids kultiviert. Die Inhibierung des Kulturwachstums wurde, wie zuvor beschrieben, spektophotometrisch bestimmt.
Verstärkung von Rifampicin durch LF-Polypeptide. E. coli 011l wurden, wie oben beschrieben, über Nacht wachsen gelassen. Übernachtkulturen wurde dann 1:16000 in 1% BP/PBS, enthaltend, wie angegeben, 0,9 μg/ml Rifampicin (Sigma-Aldrich Fine Chemicals) und 5 μM LF-Polypeptide, verdünnt. Die Kontrollkulturen waren diejenigen, die keinem Polypeptid ausgesetzt wurden. Die verdünnten Kulturen wurden dann bei 37°C für 6 h unter Belüftung durch Schütteln inkubiert. Die Anzahl von lebensfähigen Bakterien wurde dann bestimmt durch Verdünnungsplattieren von Proben jeder Gruppe und nachfolgendes Zählen der Kolonien-bildenden Einheiten (CFU). Alle Werte stellen den Mittelwert von unabhängigen Doppelexperimenten dar.
Antimycobakterielle Analyse von LF-33. Mycobakterielle Kulturen, M. smegmatis BH1, wurden zunächst bis zur log-Phase in 7H9-Kulturmedium (Amcerican Type Culture Collection, Kulturmedium 1507, supplementiertes Middlebrook 7H9-Kulturmedium) wachsen gelassen, bevor die Kulturdichte durch spektrophotometrische Mittel bestimmt wurde (optische Dichte bei 600 nm, wobei O.D. 0,23 = 10⁸ Zellen). Die Kulturen wurden dann auf 2 × 10⁴ CFU/ml mit 7H9-Kulturmedium verdünnt und 570 μl verdünnter Zellen (~ 10⁴ CFU) wurden dann mit 30 μl einer konzentrierten Stammlösung des LF-33-Polypeptids gemischt, so dass die Endkonzentration des Polypeptids in dem Kulturmedium wie angegeben war (50 μM für Tabelle 7, und unterschiedlich für 10). Die Kulturen wurden dann für 16 h bei 37°C inkubiert, wobei nach dieser Zeitdauer 50 μl entnommen wurden und in Reihenverdünnungen auf 7H9-Agarose-Platten plattiert wurden, um die Anzahl von lebensfähigen Zellen durch das herkömmliche Kolonienplattierungsverfahren zu bestimmen.
Untersuchung der Wirkung der Ionenstärke auf die antimikrobielle Aktivität.
E. coli wurde, wie zuvor beschrieben, über Nacht kultiviert. Übernachtkulturen wurden dann 1:16000 in 1% BP verdünnt, welches mit 4 mM Natriumbicarbonat gepuffert und mit unterschiedlichen Konzentrationen an Natriumchlorid von 50 μM bis 1 M supplementiert war. Die Polypeptid-behandelten Kulturen erhielten auch 25 μM des 6 kDa-LF-Polypeptids, während die Kontrollkulturen bei jeder Salzkonzentration kein Polypeptid erhielten. Nach 6 h Wachstum bei 37°C unter Belüftung wurde die Anzahl von lebensfähigen Bakterien durch Verdünnungsplattieren von Proben jeder Gruppe und nachfolgendes Zählen der CFU bestimmt. Um die Wirkungen des Salzes alleine auf das Kulturwachstum zu kontrollieren, wurde das Verhältnis von CFU in Polypeptid-behandelten Kulturen zu demjenigen in unbehandelten Kontrollkulturen, die in der gleichen Salzkonzentration, jedoch ohne irgendeine Polypeptid-Behandlung, wachsen gelassen wurden, für jede untersuchte Salzkonzentration berechnet. Diese Werte wurden dann normalisiert bezogen auf das Verhältnis, das für CFUs gemessen bei 50 μM, der niedrigsten untersuchten Salzkonzentration, berechnet wurde, und auf der Y-Achse gegen ansteigende Salzkonzentrationen auf der X-Achse grafisch aufgetragen. Folglich zeigt die Y-Achse die Wachstumsinhibierungswirkung des 6 kDa-Polypeptids bei jeder der untersuchten Konzentration von NaCl, bezogen auf dessen antimikrobielle Aktivität bei 50 μM NaCl. Die Einfügung zeigt eine semi-logarithmische grafi sche Darstellung der Ergebnisse für sub-physiologische Ionenstärkebedingungen (z.B. < 150 mM NaCl).
Polypeptide. Die 33-mer und 27-mer Polypeptide wurden durch konventionelle Fmoc(N-(9-Fluorenyl)methoxycarbonyl)-Chemie, wie an anderer Stelle beschrieben (Mann et al., 3. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)), synthetisiert. Das 33-mer Polypeptid (GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGP), das den ersten 33 Resten des N-Terminus von humanem Lactoferrin entspricht, wird als LF-33 bezeichnet (MW 4004). Das 27-mer Polypeptid, LF-27 (MW 3276) entspricht LF-33, dem die N-terminalen 6 Reste fehlen. Das Phe 26-Mer, das die Reste Gly-1 bis Met-27 ausmacht, wurde durch Abspaltung der letzten 6 Reste des 33-Mers durch Standard-Cyanogenbromid-Spaltung, welche Polypeptide C-terminal zu Methionin-Resten spaltet, erzeugt. Polymyxin B (MW 1066, Sigma, St. Louis, MO), ein Anti-Endotoxin-Polypeptid (Cooperstock, M. S., Antimicrob. Agents Chemother. 6: 422-425 (1974)) wird in dieser Studie durchwegs als Referenz verwendet.
LPS. Kontrollstandard-Endotoxine von Escherichia coli 0113:H10 und Salmonella abortus equi (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hole, MA) wiesen eine Wirksamkeit von 10 Entdotoxin-Einheiten (EU) pro ng auf. LPS (Reinheit > 99%) von Neisseria meningitidis wurde von dem Gruppe B-Stamm #6275 hergestellt und dessen Wirksamkeit war 25 EU/ng. Lipid A von E. coli K12 (List Biological Laborstories, Inc., Campbell, CA) wies eine Wirksamkeit von 8,6 EU/ng auf. Die Wirksamkeit des LPS von Pseudomonas aeruginosa (Sigma) war 0,12 EU/ng. Die Wirksamkeit der obigen Endotoxine wurde mittels des Limulus-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA, 43) gegenüber dem US Pharmacopeia-Standard Endotoxin EC-5 bestimmt.
Limulus-ELISA zum Bestimmen der 50% Endotoxin-neutralisierenden Konzentration (ENC₅₀) von Anti-Endotoxin-Agenzien.
Kurz gesagt wurden 25 μl Endotoxinlösung (200 EU/ml) mit einem gleichen Volumen der Testmaterialien in einer Reihe von Zweifach-Verdünnungen in 0,15 M NaCl in einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte (Nunc A/S, Roskilde, Dänemark) gemischt, und für 1 h bei 37°C in einem Trockenluftinkubator inkubiert. Die Reaktionsmischungen wurden 1000-fach mit Endotoxin-freiem Wasser verdünnt. Die Endotoxi-naktivität wurde dann unter Verwendung des Limulus-ELISA quantifiziert (Zhang et al., J. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). Im Limulus-ELISA aktivierte das Endotoxin die LAL-Koagulation bei Konzentrationen von weniger als einem pg oder 0,01 Endotoxin-Einheiten (EU) pro ml (Zhang et al., J. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). Die hohe Empfindlichkeit des Assays ermöglichte es, sehr geringe Endotoxi-naktivitätsniveaus nachzuweisen. Nach der Inkubation des Endotoxins mit den Testmaterialien wurde eine 1000-fache Verdünnung vorgenommen, um jede mögliche Wirkung der Testmaterialien auf das LAL-Enzymsystem auszuschließen. Weder das Serum noch eines dieser Materialien störte nach einer 1000-fachen Verdünnung deren höchsten in dieser Studie verwendeten Konzentrationen die enzymatische Kaskade des LAL-Assays selbst. Für jeden Assay wurde die LAL-Endotoxin-Reaktion bei der optimalen Bedingung durchgeführt, mit einer linearen Beziehung zwischen der Konzentration von Endotoxin und der optischen Dichte bei 490 nm (OD₄₉₀). Eine sigmoide Kurve wurde üblicherweise zwischen OD₄₉₀ und der logarithmischen Konzentration eines Anti-Endotoxin-Agens erhalten. Die Konzentration, die dem Mittelpunkt der Kurve entsprach, wurde als ENC₅₀ bezeichnet.
Endotoxin-induzierte TNF-α-Sekretion durch RAW 264.7 Zellen.
Die Maus-Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und wie früher beschrieben aufrechterhalten (Jeremy, B., Immunol. Today 16: 417-419 (1995)). Die Konzentration von Endotoxin in allen Puffern und Medien wurde so kontrolliert, dass diese unter 0,1 EU/ml war. Das folgende Protokoll wurde im Wesentlichen früher beschrieben und wurde hier mit geringfügigen Modifikationen verwendet (Kelly et al., Infect. Immun. 59: 4491-5 (1991)). In jedes Well einer 96-Well-Gewebekulturplatte wurden 150 μl RAW 264.7-Zellen mit 10⁶ Zellen pro ml DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD), supplementiert mit 10% hitzebehandeltem fötalem Rinderserum (Life Technologies), 25 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure; pH 7,3), Penicillin (60 U/ml) und Streptomycin (60 μg/ml), gegeben. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C in einem 6% CO₂-Inkubator wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 3 Wechseln von Endotoxin freier Hank's gepufferter Salzlösung (HBSS, Life Technologies), supplementiert mit 25 mM HEPES (pH 7,3), gewaschen. Das Kontroll-Endotoxin (10 ng/ml) und die Testmaterialien wurden in HBSS-HEPES angesetzt. Nach Inkubation in einem 37°C Wasserbad für 1 h wurden 0,2 ml dieser Lösungen in einem Dreifachansatz zu jedem Well gegeben und für 6 h bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden dann vor der Messung der TNF-α-Aktivität gesammelt und bei –70°C gelagert. Die Kontrollen umfassten HBSS-HEPES und die Testmaterialien in Abwesenheit des Endotoxins. Die TNF-α-Aktivität des Mediums und der Testmaterialien war unter 160 pg/ml. Das in einigen Experimenten verwendete humane Serum war ein Pool von normalen Spendern.
Bestimmung der TNF-Aktivität. Die TNF-α-Aktivität im Kulturüberstand wurde anhand dessen Zytotoxizität für die Zellen der Maus-Fibrosarkom-Zelllinie WEHI 164 (ATCC) bestimmt. Bei dieser Zelllinie wurde festgestellt, dass diese viermal empfindlicher gegenüber TNF-α ist als die herkömmlich verwendeten L929-Fibroblastenzellen, und die Empfindlichkeit wurde durch Aufnahme von Actinomycin D (Life Technologies) in das Medium weiter 5-fach erhöht (M. R. Ruff und G. E. Gifford, Lymphokines 2: 235-272 (1981)). In diesem Assay korrelierte die Konzentration von aktivem TNF-α mit dem auf den Kontakt mit TNF-α zurückzuführenden Zelltod. Der Zelltod wurde kolorimetrisch mit dem MTT-Farbstoff (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Vitalverfahren gemessen (Mosmann, T., J. Immunol. Methods 65: 55-63 (1983)). Die Spezifität des Assays wurde durch Verwendung des Kaninchen-Anti-Maus-TNF-α-Antikörpers (Genzyme, Inc., MA) überprüft. Der Antikörper in einer 1:100-fachen Verdünnung beseitigt vollständig die Zytotoxizität in dem Kulturüberstand der RAW 264.7-Zelle, die durch Endotoxin stimuliert wurde, und in den Maus-Seren, die 1 h nach der intraperitonealen Injektion von Endotoxin gesammelt wurden.
Kurz gesagt, wurden in die 96-Well-Gewebekulturplatten 100 μl WEHI164-Zellen (5 × 10⁴ Zellen) in RPMI-1640-Medium (Life Technologies), enthaltend 10% hitzebehandeltes fötales Rinderserum, 25 mM HEPES (pH 7,3), Penicillin (60 U/ml), Streptomycin (60 μg/ml) und Actinomycin D (4 μg, ml), gegeben. Nach einer 2-ständigen Inkubation bei 37°C in einem 6% CO₂-Inkubator wurden 10 μl zweifach reihenverdünnter Proben (Kulturüberstände) oder Standards (rekombinantes Maus-TNF-α, Genzyme) zu jedem Well gegeben und für 20 h inkubiert. Anschließend wurde die Zelllebensfähigkeit durch Zugabe von 10 μl MTT (Thiazolyl-blau, Sigma)-Stammlösung (5 mg/ml in Salzlösung) zu jedem Well bestimmt, und die Inkubation wurde für 6 h fortgesetzt. 180 μl Säure-Isopropanol (enthaltend 40 mM HCl) wurden zugegeben, um die erzeugten dunkelblauen Kristalle aufzulösen. Die Platte wurde bei 570 nm mit einer Referenz von 630 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät ausgelesen. Die Menge von TNF-α, welche zu einer Abtötung von 50% der zugegebenen Zellen führte, wurde als eine Einheit definiert, unter den vorliegenden Bedingungen äquivalent zu ungefähr 15 pg rekombinantes TNF-α. Eine Standardkurve wurde durch Inkubieren von bekannten Mengen des rekombinanten TNF-α mit den WEHI-Zellen erhalten.
Um irgendeine potentielle Zytotoxizität von LF-33 auszuschließen, wurde die obige Prozedur verwendet, außer, dass die WEHI164-Zellen durch RAW 264.7-Zellen ersetzt wurden und die Konzentration von in jedes Well zugegebenen Zellen 1,5 × 105 Zellen pro 150 μl Medium betrug, um die Bedingung in dem Stimulations-Experiment nachzuahmen. Bei der höchsten in dieser Studie verwendeten Konzentration von LF-33 (10 μM) wurde keine Zytotoxizität gegenüber RAW 264.7-Zellen nachgewiesen.
Galaktosamin-sensibilisiertes Maus-Modell. Die i.p. Injektion von 125 ng E. coli LPS zusammen mit 15 mg Galactosaminhydrochlorid (Sigma) in 0,5 ml 0,15 M NaCl führte zu einer beinahe 100%-igen Letalität in 8 bis 10 Wochen alten weiblichen NIH/Swiss-Mäusen (Körpergewicht 20-25 g/Maus). Das LF-33 wurde entweder i.v. durch die Schwanzvenen 10 min nach der i.p. Injektion der LPS-Galaktosamin-Mischung injiziert oder i.p. co-injiziert mit LPS und Galaktosamin. Die Letalität wurde für 72 h nach der Injektion beobachtet. In Experimenten, welche die Messung des TNF-α-Serumspiegels umfassen, wurden Blutproben in Serumtrennröhrchen (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) 60-90 min nach der Injektion gesammelt, und die Seren wurden nach Zentrifugieren erhalten. Der TNF-α-Serumspiegel wurde durch den oben beschriebenen Zytotoxizitätsassay gemessen. Der TNF-α-Peak-Serumspiegel wurde zwischen 60 und 90 min nach der i.p. Injektion von LPS beobachtet.
Statistik. Alle Endotoxin- und TNF-α-Messungen wurden in jedem Experiment dreifach durchgeführt. Wenigstens zwei unabhängige Experimente wurden für jedes Datenelement durchgeführt. Die Werte sind als Mittelwert +/– SD angegeben, und wurden unter Verwendung des Student's t-Tests verglichen. Die Letalität wird unter Verwendung des Fisher's Exact-Test verglichen.
Erzeugung des Galaktosamin-sensibilisierten, leukopenischen Maus-Modellsystems.
CF-1-Mäuse wurden immunsupprimiert durch eine Cyclophosphamid-Behandlung drei Tage bevor diese Galaktosamin-sensibilisiert wurden für die letalen Wirkungen einer Injektion mit einer LD₉₀-Dosis von E. coli 0111 (Bucklin et al., J. Infect. Dis. 174: 1249-1254 (1996)). Unter diesen Bedingungen waren die zirkulierenden Leukozyten um 85% reduziert und die LD₉₀ wurde zu 5 × 10³ CFU E. coli bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes Polypeptid mit der Formel: B₁-R1-B₂-R2, wobei: (i) B₁ und B₂ für Cluster von Aminosäuren stehen, die von 2 bis 7 Aminosäuren enthalten, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind; (ii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren sind und einen GRAVY(grand average of hydropathicity)-Wert von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist; (iii) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA umfasst; (iv) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amidverknüpfungsrückgrat bilden; und (v) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid mit der Formel: B₁-R1-B₂-R2, wobei: (i) B₁ und 82 für Cluster von Aminosäuren stehen, die von 2 bis 7 Aminosäuren enthalten, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind; (ii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren sind und einen GRAVY(grand average of hydropathicity)-Wert von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist; (iii) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst; und (iv) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amidverknüpfungsrückgrat bilden; wobei das isolierte Polypeptid umfasst: (a) SEQ ID NO:2; oder (b) ein Fragment von SEQ ID NO:2, dem bis zu 17 Aminosäuren von dem C-Terminus fehlen und/oder dem bis zu 3 Aminosäuren von dem N-Terminus fehlen; und wobei das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 2, bei welchem Glutamat 16 von SEQ ID NO:2 durch eine mit neutraler Ladung oder eine hydrophobe Aminosäure substituiert ist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 3, bei welchem Glutamat 16 von SEQ ID NO:2 durch Glycin, Valin oder Alanin substituiert ist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei B₁ die Aminosäuresequenz GRRRRS oder ein Fragment von dieser, das RR umfasst, aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei B₂ die Aminosäuresequenz MRKVRG aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid mit der Formel: B₁-R1-B₂-R2, wobei: (i) B₁ die Aminosäuresequenz GRRRRS aufweist, (ii) B₂ für einen Cluster von Aminosäuren steht, der von 2 bis 7 Aminosäuren enthält, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind; (iii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren sind und einen GRAVY(grand average of hydropathicity)-Wert von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist; (iv) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst; (v) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amidverknüpfungsrückgrat bilden; und (vi) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid mit der Formel: B₁-R1-B₂-R2, wobei: (i) B₁ für einen Cluster von Aminosäuren steht, der von 2 bis 7 Aminosäuren enthält, wobei wenigstens 2 der 2 bis 7 Aminosäuren stark basisch sind; (ii) B₂ die Aminosäuresequenz MRKVRG aufweist; (iii) R1 zwischen 17 und 21 Aminosäuren sind und einen GRAVY(grand average of hydropathicity)-Wert von wenigstens –0,609 und einen Wert des aliphatischen Index von wenigstens 35,45 aufweist; (iv) R2 PVSCIKRDSPIQCIQAIA oder eine C-terminale Trunkierung davon umfasst; (v) die Aminosäuren des Polypeptids so verbunden sind, dass diese ein einziges kontinuierliches Amidverknüpfungsrückgrat bilden; und (vi) das Polypeptid antimikrobielle Aktivität und/oder Endotoxin neutralisierende Aktivität aufweist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches weiterhin eine Sequenz umfasst, die erkannt und durch Zellen über einen Endozytose-Clearance-Weg internalisiert wird.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Polypeptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des mikrobiellen Wachstums und/oder Neutralisierung von Endotoxin.
Verwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit, die aus einer mikrobiellen Infektion resultiert.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Mikroben Bakterien, Pilze oder Mykobakterien sind.
Verwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des mikrobiellen Wachstums in einem Patienten, wobei dem Patienten ebenfalls ein anderes antimikrobielles Mittel verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das andere mikrobielle Mittel Rifampicin oder Isoniazid ist.
Ein Verfahren zur Neutralisierung von Endotoxin und/oder Hemmung des mikrobiellen Wachstums in einem Produkt in vitro, welches das Inkontaktbringen des Produkts mit einem Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.