JP2002541066A

JP2002541066A - 抗微生物薬／エンドトキシンを中和するポリペプチド

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Publication number: JP2002541066A
Application number: JP2000599777A
Authority: JP
Inventors: デイビッド・エム・マン
Original assignee: エンドゲン・リサーチ・ペーハー・アクチボラゲット
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-12-03
Also published as: DK1151009T3; DE60036456T2; AU758150B2; EP1151009B1; CA2362153C; CA2362153A1; WO2000049040A2; US20030105006A1; EP1151009A2; AU2822600A; US7244706B2; ATE373679T1; DE60036456D1; ES2293892T3; MXPA01007956A; CN1362969A; US6399570B1; WO2000049040A3

Abstract

(57)【要約】ラクトフェリン分子のタンパク質分解性消化によりつくられる６ｋＤａの宿主防御ポリペプチドを開示する。６ｋＤａの宿主防御ポリペプチドは、抗微生物性活性およびエンドトキシン中和活性を有する。また、６ｋＤａの宿主防御ポリペプチドの機能性変異体も開示する。これには６ｋＤａポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の切除体およびこのペプチドの他の修飾体、例えば、活性を保存し増加するアミノ酸置換体が含まれる。本発明の別の態様は、個体における微生物、細菌や真菌の感染による疾患を治療または予防する医療的方法に関する。本発明の他の態様は、６ｋＤａのＬＦポリペプチドおよびその機能性変異体を用いて、患者における抗微生物薬物の医療的作用を増強することである。別の態様において、本発明は、本発明のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体を患者に投与することにより、患者における循環エンドトキシンを中和する方法に関する。本発明の範囲にさらに含まれるのは、本発明のポリペプチドのエンドトキシン中和活性および抗微生物活性を増強する方法である。さらに、患者における６ｋＤａのＬＦフラグメントのインビボ産生をインビボ・プロテアーゼにより増加する方法についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景人類は微生物病原体による感染の絶え間ない危機に曝されているが、大多数は
、種々の抗微生物性タンパク質および小ポリペプチドを利用する迅速な対応を行
うことによってこれらの繰返す猛襲に耐えている。抗微生物性ポリペプチドは原
始的な動物、昆虫および植物でさえも使用しているので、ヒトの先天性免疫系の
この部門は、より遅く作用するクローン系よりも、より基本的な宿主防御機構で
ある（H. G. Boman, J. MarshおよびJ. A. Goode, Eds., Antimicrobial Peptid
es, (John Wiley & Sons Ltd., New York, NY, 1994); Hoffmann et al., Curr.
Opin. Immunol. 8: 8-13 (1996)）。

【０００２】微生物病原体の増殖抑制に加えて、この免疫系は、侵入する微生物により産生
される種々のトキシンも中和する。グラム陰性細菌によって産生される１つの特
有な毒性産物はエンドトキシンである。エンドトキシン（リポ多糖類；ＬＰＳ）
はグラム陰性細菌の外膜の構成成分であり、該細菌が死滅または増殖する場合に
放出される（Rietschel et al., Immunobiology. 187: 169-190 (1993)）。米国
においては、年間、細菌性敗血症の患者が約４００,０００と見積もられ、最終
的に、そのうちの１００,０００が敗血症性ショックで死亡し、これらの症例の
約半分がグラム陰性細菌によって起こされる（Parrillo, J. E., Shock syndrom
es related to sepsis. In Cecil Textbook of Medicine (20th edition), J. C
. BennettおよびF. Plum編 W.B. Sanders Company, Philadelphia. 496-501 (19
96)）。グラム陰性敗血症および敗血症性ショックは、主に、免疫系の細胞、特
にマクロファージによる炎症性サイトカイン類のエンドトキシン誘発過剰産生お
よび放出からもたらされる（Beutler, B.,およびA. Cerami, Annu. Rev. Bioche
m. 57: 505-518 (1988)); Rosenstreich, D. L.およびS. Vogel, Central role
of macrophages in the host response to endotoxin. p. 11-15, D. Schlessin
ger (ed.), Microbiology. American Society for Microbiology. Washington,
D. C. (1980)）。ＴＮＦ−αがエンドトキシンの全身性毒性の主な介在物質であ
る（Beutler, B.およびA. Cerami, Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988);
Heumann et al., J. Endotoxin Res. 3: 87-92 (1996)）。

【０００３】リピドＡはエンドトキシンの毒性部分である（Rietshcel et al., Immunobiol
ogy. 187: 169-190 (1993)）。モノクローナル抗リピドＡ抗体がグラム陰性敗血
症および敗血症性ショックの治療用にテストされたが、多分、それらの中和され
たエンドトキシンへの乏しい結合能（Warren et al., J. Exp. Med. 177: 89-97
(1993)）によるものであるが、それらの臨床的効能は一貫性の有るものとは証
明されていない（Verhoef et al., J. Antimicrob. Chemother. 38: 167-182 '1
996)）。最近の展開には、ポリミキシンＢを模倣している合成抗エンドトキシン
ポリペプチド（Rustici et al., Science 259: 361-365 (1993)）および宿主防
御タンパク質から由来する多くのカチオン性抗エンドトキシンポリペプチドの同
定が包含される。これらには、殺微生物性／浸透性増加タンパク質から由来する
組換え２３ｋＤａフラグメント（Fisher et al., Crit. Care Med. 22: 553-558
(1994)); Marra et al., Crit. Care Med. 22: 559-565 (1994)）、ミツバチ・
メリチンから由来する２８量体ペプチド（Gough et al., Infect. Immun. 64: 4
922-4927 (1996)）、１８ｋＤａカチオン性抗菌タンパク質から由来する３３量
体ペプチド（Larrick et al., Infect. Immun. 63: 1291-1297 (1995)）および
リムルス（Limulus）抗ＬＰＳ因子の結晶構造に基づく合成ポリペプチド（Reid
et al., J. Biol. Chem. 271: 28120-28127 (1996)）が含まれる。

【０００４】ラクトフェリン（ＬＦ）は、もっぱら好中球および筋肉上皮によって合成され
、炎症性刺激によりそれらが活性化されると細胞外に放出される８０ｋＤａの鉄
結合糖タンパク質である（Sanchez et al., Arch. Dis. Child. 67: 657-61 (19
92); P. F. LevayおよびM. Viljoen, Haematologica 80: 252-67 (1995); B. Lo
nnerdalおよびS. Iyer, Annu. Rev. Nutr. 15: 93-110 (1995); R. T. Ellison,
Adv. Exp. Med. Biol. 357: 71-90 (1994)）。その防御の機構はほとんど理解
されていないが、これは哺乳動物宿主の防御タンパク質であると考えられている
。インビボにおいて、ＬＦは抗微生物性予防効果を提供する（Trumpler et al.,
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-3 (1989)）。インビボにおけ
るＬＦ処置によりグラム陰性細菌の発生が低下することが報告されている（Trum
pler et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-313 (1989)）。
インビトロにおいて、鉄をキレートすることにより種々の微生物の増殖が抑制さ
れることが示されている（J. D. OramおよびB. Reither, Biochim. Biophys. Ac
ta 170: 351-65 (1968); A. Bezkorovainy, Adv. Exp. Med. Biol. 135: 139-54
(1981)）。

【０００５】ＬＦは、そのＮ末端に接近した強塩基性領域を含み、リピドＡ（Appelmelk et
al., Infect. Immun. 62: 2628-2632 (1994)）や、大部分の細胞表面および細
胞外マトリックスにおいて生じるグリコサミノグリカン（Mann et al., J. Biol
. Chem. 269: 23661-7 (1994)）を含む種々のアニオン性生物分子と結合する。
ラクトフェリシンＨ（残基１−４７）およびラクトフェリシンＢ（残基１７−４
１）は、各々、ヒトまたはウシＬＦのペプシン分解（pepsinolysis）によって放
出され、天然のタンパク質よりも強力な抗微生物性活性を有しうる（Bellamy et
al., Biochim. Biophys. Acta. 1121: 130-136 (1992)）。残基２８−３４から
なる領域はヒトＬＦおよびラクトフェリシンＨのエンドトキシンとの高親和性結
合に関与していることが報告されている（Elass-Rochard et al., Biochem. J.
312: 839-845 (1995)）。ＬＦおよびラクトフェリシンＢは、ヒトの単球細胞に
おけるエンドトキシン誘発インターロイキン−６応答を抑制することが報告され
ている（Mattsby-Baltzer et al., Pediatr. Res. 40: 257-262 (1996)）。抗菌
活性を示す従前に同定されたＬＦのフラグメントは、ＬＦのペプシン加水分解に
よって単離されたものであった（Tomita et al., (1993) 米国特許5,214,028号
、Tomita et al., (1994) 米国特許5,304,633号、Tomita et al., (1994) 米国
特許5,317,084号、Tomita et al., (1997) 米国特許5,656,591号）。従前の研究は、ヒトＬＦのN末端３３残基が、該タンパク質をグリコサミノグ
リカンのようなアニオン性多糖類との結合を介在する最小の配列であることを確
立した（Mann et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)）。この配列はカ
チオン性頭部（残基１−６）と尾部（残基２８−３３）を含み、これらが結合し
てグリコサミノグリカン結合部位を形成している。しかし、これらの研究は、こ
のポリペプチドが抗微生物性またはエンドトキシン中和化の活性を有することを
示す何の証拠も提供しなかった。

【０００６】発明の概要１の態様において、本発明は、ラクトフェリン分子の蛋白分解的消化により得
られる６ｋＤａの宿主防御ポリペプチドに関する。６ｋＤａの宿主防御ポリペプ
チドは抗微生物活性ならびにエンドトキシン中和化活性を有する。また本発明は
、６ｋＤａの宿主防御ポリペプチドの機能性変異体にも関し、該変異体は６ｋＤ
ａポリペプチドのＮ末端およびＣ末端切除体、ならびにポリペプチドの活性を保
存または増大させるアミノ酸置換体のごとき当該ポリペプチドの他の修飾体を包
含する。

【０００７】もう１つの態様において、本発明は、治療上有効量の抗微生物ポリペプチドま
たはその機能性変異体を個体に投与することを特徴とする、個体の微生物感染か
ら生じる疾病の治療または予防方法に関する。この方法は細菌感染の治療におい
て有用である。またこの方法を用いて、結核またはらい病のごときミコバクテリ
ウムにより引き起こされる感染から生じる疾病を治療することもできる。さらに
この方法は、感染個体において細菌性敗血症を引き起こす細菌感染の治療におい
ても有用である。また、この方法を用いて、真菌感染のごとき他の微生物により
引き起こされる感染を治療することもできる。さらに本発明を用いて、本発明の
ポリペプチドを抗微生物薬とともに投与することにより、患者における抗微生物
薬の治療作用を増強することもできる。

【０００８】もう１つの態様において、本発明は、本発明のエンドトキシン中和化ポリペプ
チドまたはその機能性変異体を患者に投与することによる、患者における循環エ
ンドトキシンの中和方法に関する。本発明に関する類似の使用方法は、エンドト
キシンを本発明のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体と
接触させることによる、産物中のエンドトキシンを中和することを包含する。

【０００９】また、本発明のポリペプチドのエンドトキシン中和化活性および抗微生物活性
を増強するための方法も本発明の範囲内に含まれる。これを、例えば、隣接環境
のイオン強度を調節することによって行うことができる。さらに、インビボ（in
vivo）プロテアーゼにより患者において６ｋＤａのＬＦフラグメントのインビ
ボ産生を増加させる方法も開示される。かかる方法は、ＬＦを蛋白分解に対して
感受性とし、さらにＬＦから６ｋＤａフラグメントを生じさせるプロテアーゼの
活性を増大させることを包含する。

【００１０】図面の簡単な説明図１は、カテプシンＤ（四角）またはペプシン（丸）によりヒトＬＦのＮ末端
から得られ、ヘパリン−精製された６ｋＤａのポリペプチドの用量を変化させる
ことによるＥ．ｃｏｌｉ増殖の阻害を図式的に示す。すべてのポイントは三系の
平均値を示し、標準偏差のバーはシンボルよりも小さい。図２は、５０μＭのＬＦまたはＮ末端２７量体、２６量体、３３量体ＬＦポリ
ペプチドフラグメントの存在下における７時間にわたるＥ．ｃｏｌｉ０１１１
の増殖曲線である。図３は、ＬＦのN末端のアミノ酸配列に対応する、異なる濃度の３３量体また
は２７量体ポリペプチドの存在下における５時間目のＥ．ｃｏｌｉ０１１１の
増殖を図式的に示す。図４は、カテプシンにより得られる６ｋＤａのＬＦポリペプチドフラグメント
の抗微生物活性に対するイオン強度の影響を図式的に示す。図５は、ポリペプチド、６ｋＤａＬＦフラグメント、３３量体、および２７
量体の、リファンピシリンの抗微生物活性を増強する能力を図式的に示す。図６は、示された濃度の６ｋＤａ宿主防御ポリペプチド、３３量体、２７量体
、ＬＦおよびポリミキシンＢの、単離リピドＡのエンドトキシン活性を中和する
能力を図式的に示す。図７は、エンドトキシンにより誘導された単核白血球細胞系ＲＡＷ２６４．
７によるＴＨＦ−α分泌のＬＦ−３３（３３量体）による用量―依存的抑制を図
式的に示す。１０ｎｇ／ｍｌのエンドトキシンを示された濃度のＬＦ−３３とと
もに３７℃で１時間インキュベーションし、ついで、ＲＡＷ２６４．７細胞に
曝露した。データは、典型的な実験における三系の平均値である。図８は、ヒト血清存在下における、エンドトキシンにより誘導されたＲＡＷ
２６４．７細胞によるＴＮＦ−α分泌のＬＦ−３３による用量−依存的抑制を図
式的に示す。１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳを示された濃度のヒト血清
およびＬＦ−３３とともにインキュベーションし、ついで、ＲＡＷ２６４．７
細胞に曝露した。データは、典型的な実験における三系の平均値である。図９は、細菌感染に対する宿主防御における６ｋＤａＬＦのインビボ防御能
をダイヤグラム的に示す。図１０は、ミコバクテリウム(Mycobacteria)であるＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ
ＢＨ１の増殖に対する種々の濃度のＬＦ−３３（３３量体）の抗微生物効果をダ
イヤグラム的に示す。

【００１１】発明の詳細な解説本発明は、ラクトフェリン（ＬＦ）から得られた宿主防御ポリペプチドが、す
でに特徴づけられているＬＦのフラグメントよりも有意に強い抗微生物およびエ
ンドトキシン中和化活性を示すという知見に基づく。また、ＬＦかた得られた宿
主防御ポリペプチドは、微生物増殖を阻害する機構において元のＬＦとは異なる
。ＬＦは、鉄イオンに結合して、この必須イオンを一時的に枯渇させることによ
り作用すると考えられるが、ＬＦから得られた６ｋＤａのポリペプチドは、微生
物の外表面に結合し、細胞膜に損傷を与えて細胞漏出を引き起こすことによって
、鉄イオン非依存的な機構により作用する。６ｋＤａポリペプチドにより示され
る抗微生物活性は、完全長のＬＦにより示される抗微生物活性よりも安定である
（一時的なものではない）。宿主防御ポリペプチドは、カテプシンＤによるＬＦ
の消化によってインビトロ（in vitro）において得られ、さらにおそらくインビ
ボにおいても得られる。生成物である約６ｋＤａのポリペプチドフラグメントは
ＬＦのN末端の４９個のアミノ酸からなり、単一の連続的なアミド結合骨格を形
成するようにアミノ酸が連結されているものである。生理学的条件のｐＨおよび
イオン強度において、本発明のポリペプチドが、すでに同定されているペプシン
消化により得られるＬＦフラグメント（Bellamy et al., Biochimica et Biophy
sica Acta 1121: 130-136 (1992); Tomita et al., (1993) U.S. Patent No. 5,
214,028; Tomita et al., (1994) U.S. Patent No. 5,304,633; Tomita et al.,
(1994) U.S. Patent No. 5,317,084; Tomita et al., (1997) U.S. Patent No.
5,656,591）よりも有意に高い活性を示すことは、特に興味深いことである。ペ
プシンにより得られる１のかかるフラグメント（Ballamy et al., Biochimica e
t Biophysica Acta 1121: 130-136 (1992)）は、それがＬＦのアミノ酸１−４７
を含むという点で、本発明の６ｋＤａのポリペプチドフラグメントと類似してい
る。しかしながら、先行技術のポリペプチドはアミノ酸１１と１２との間にアミ
ド結合を有していない。むしろ、それらのポリペプチドフラグメントは切断点の
いずれの側においてもジスルフィド結合によって結合されている。後で例示説明
のセクション中にて詳述される実験は、本発明のポリペプチドのアミノ酸の単一
の連続的なアミド結合骨格がポリペプチドおよびその機能性変異体に高い活性を
付与することを示すものである。

【００１２】ＬＦのカテプシンＤ消化により得られる６ｋＤａのポリペプチドフラグメント
のアミノ酸配列は配列番号：２（表１）のアミノ酸１−４９に対応する。化学合
成により得られるこの配列（または後で詳述する機能性に類似の配列）を含むポ
リペプチドも同等の活性を示すので、本発明のポリペプチド、およびその機能的
変異体を当該分野において知られたいずれかの手段により得てもよく、そして／
あるいは単離してもよい。ポリペプチドのアミノ酸が単一の連続したアミド結合
骨格により結合されているかぎり、本発明のポリペプチドの抗微生物およびエン
ドトキシン中和化活性には、内部ジスルフィド結合の存在は不必要である。他の
動物種から単離される宿主防御ポリペプチドのホモログ、およびその機能性変異
体は、ヒトの６ｋＤａＬＦフラグメントと類似の活性を有すると予想され、や
はり本発明により包含される。

【００１３】

【表１】

【００１４】配列および機能性分析は、ＬＦタンパク質の最初の５１残基を包含するポリペ
プチド（Ｃ末端にてＬＦ配列の２個の付加アミノ酸を有する６ｋＤａポリペプチ
ド）が実質的に、６ｋＤａポリペプチドと同一の活性を示すことを示す。このわ
ずかに長いポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２においてアミノ酸１−５
１として記載される。以下の具体例セクションにおいて詳しく記載する実験は、
５１アミノ酸ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸１７個までおよびＮ末端のアミノ
酸３個までは、抗微生物活性およびエンドトキシン中和化活性の両方の活性の完
全な消失を伴わずに排除できることを示す。これに関して、本発明は、Ｃ末端の
アミノ酸を１７個まで欠いておりN末端のアミノ酸を３個まで欠いている配列番
号２のアミノ酸１−５１に対応する配列を有する単離ポリペプチドに関する。

【００１５】理論により縛られることなく、ポリペプチドの２倍活性であるａ）抗微生物活
性およびｂ）エンドトキシン中和化活性は、ポリペプチドの特異的領域と種々の
標的分子との相互作用により引き起こされる。微生物増殖は、微生物膜の種々の
成分と相互作用することにより微生物の細胞エンベロープの膜組織を破壊すると
いう他のデフェンシンと類似のメカニズムにより阻害されると考えられる。微生
物膜は、主として、二重層の外側（例えば、細胞表面）に親水性ホスフェート頭
部が存在しており、二重層の内部に疎水性脂質尾部が埋められているリン脂質の
二重層からつくられている。ポリペプチドは、高含有量の疎水性残基を有するア
ミノ酸鎖により分離された塩基性残基の２つのクラスターを含有する。より疎水
性の鎖により分離された塩基性クラスターの組合せは、本発明のポリペプチドと
、親水性膜表面および二重層内の疎水性脂質尾部との相互作用を可能にする。こ
の相互作用の組合せは、ポリペプチドを膜中に挿入させ、膜を破壊する。脂質二
重層成分と相互作用するポリペプチドの生化学的成分は、エンドトキシン活性を
有し、親水性部分および疎水性部分を含む細菌表面上に位置するリポ多糖類と非
常に類似して相互作用する。エンドトキシンは、細菌表面上に存在する場合、大
きいリポ多糖（ＬＰＳ）分子の成分である。ＬＰＳは、全てのグラム陰性微生物
の外膜の成分である。ＬＰＳの親水性成分（多糖）は、該膜の外表面にあり、疎
水性成分（リピドＡ）は、二重層の内部にある。ＬＰＳ分子のリピドＡ部分は、
ＬＰＳ分子の起炎性またはエンドトキシン部分である。塩基性残基のクラスター
は、ＬＰＳの多糖部分におけるそのリピドＡ尾部の最も曝露された頭部基上の陰
荷電部位に結合し、疎水性介在領域をリピドＡに結合させ、リピドＡを中和する
と考えられる。

【００１６】微生物表面の条件とは異なる条件下では、他のタイプの結合が生じる。以下の
具体例に示される結果は、上記機能性成分を有するが機能性塩基性クラスターを
１個だけ、例えば、ＬＦ−２７を含有し、配列番号６（図１）に記載されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドが、微生物の表面に関しては存在しない（例えば
、食物または医薬品におけるような調製手段により細菌から流れ出るかまたは抽
出される場合の）エンドトキシンに対する有意な中和活性を有することを示す。
かかる環境下では、分子のリピドＡ部分は、さらに曝露され、したがって、エン
ドトキシンは、ポリペプチドにさらに接近可能である。高濃度のポリペプチドで
、または、異常な塩条件下で、または、ＬＰＳが抽出または流出した場合、また
は、外膜中にある間に分解された場合、ポリペプチドの疎水性介在領域は、なお
も、リピドＡを介してＬＰＳへの結合を媒介し、ＬＰＳのリピドＡ部分のエンド
トキシン作用を不活性化することができる。

【００１７】当業者は、これらの相互作用に関与する分子の生化学的特性を保存する６ｋＤ
ａＬＦポリペプチド・フラグメント配列のアミノ酸置換、挿入または欠失が得
られたポリペプチドにおける抗微生物活性およびエンドトキシン中和化活性を保
存することを認識するであろう。かかるアミノ酸置換、挿入または欠失により得
られたポリペプチドは、６ｋＤａＬＦフラグメントの機能性変異体であると考
えられ、したがって、本発明の範囲内に包含される。上記したとおり、ＬＦフラ
グメントの特異的領域は、抗微生物活性およびエンドトキシン中和化活性に関与
している。さらに詳細には、これらの領域は、２つの塩基性クラスターを包含し
ており、１つはN末端に位置しており、他方は、残基２８から３１まで（２８と
３１を含めて）である。さらに、これらの塩基性クラスターと隣接するアミノ酸
配列の相対的な疎水性は、また、ポリペプチドの活性に関与する。下記式は、本
発明の６ｋＤａポリペプチドの重要な成分およびその機能性変異体を定義する：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２−Ｒ２式中、Ｂ_１およびＢ_２は、２−７アミノ酸を含有するアミノ酸のクラスターを表
し、該２−７アミノ酸のうち少なくとも２個は強塩基であり、Ｒ１は、総平均親
水性値（ＧＲＡＶＹ）が少なくとも−０.６０９であり、脂肪族指数が少なくと
も３５.４５である１７ないし２１アミノ酸であり、Ｒ２は、１ないし１７アミ
ノ酸であり、ＧＲＡＶＹ値が少なくとも０.１７４であり、脂肪族指数が少なく
とも９７.１４であり、該ポリペプチドの該アミノ酸は結合して１つの連続した
アミド連鎖骨格を形成する。

【００１８】アミノ酸リシン、アルギニン、ヒスチジン、および側鎖上に陽荷電基を有する
ように合成されたかまたは化学修飾されたいずれかのアミノ酸変異体は、この記
載および以下に記載する本発明の他の定義に関して強塩基性アミノ酸と称される
。

【００１９】脂肪族指数は、下記式に従って算出される：脂肪族指数＝Ｘ（Ａｌａ）＋ａ・
Ｘ（Ｖａｌ）＋ｂ・（Ｘ（Ｉｌｅ）＋Ｘ（Ｌｅｕ））［ここで、Ｘ（Ａｌａ）、
Ｘ（Ｖａｌ）、Ｘ（Ｉｌｅ）およびＸ（Ｌｅｕ）は、アラニン、バリン、イソロ
イシン、およびロイシンのモルパーセント（１００×モル分率）であり、ａおよ
びｂは、アラニンの側鎖に対するバリン側鎖の相対容量（ａ＝２.９）およびＬ
ｅｕ／Ｉｌｅ側鎖の相対容量（ｂ＝３.９）である］。

【００２０】好ましい実施態様において、単離ポリペプチドのＲ１およびＲ２は、各々、１
以下の酸性アミノ酸を有する。アスパラギン酸、グルタミン酸、および側鎖上に
陰荷電基を有するように合成されたかまたは化学修飾されたアミノ酸変異体は、
この記載および以下に記載する本発明の他の定義に関して酸性アミノ酸と称され
る。一の実施態様において、単離ポリペプチドのＲ２は、PVSCIKRDSPIQCIQAIA（
配列番号３）である。別に、Ｒ２は、この配列（配列番号３）のＣ末端切除体で
あってもよい。別の実施態様において、単離ポリペプチドのＢ_１は、GRRRRS（配
列番号４）または該配列における少なくとも２つの連続したＲを保持するその切
除体である。このような切除体により産生されたＢ_１のいくつかの例は、GRR、R
RS、RRR、およびRRである。別の実施態様において、単離ポリペプチドのＢ_２は
、MRKVRG（配列番号５）である。

【００２１】好ましい実施態様において、単離ポリペプチドは、配列番号２に記載されるア
ミノ酸１−５１の配列を有する。別の実施態様において、単離ポリペプチドは、
１６位でのアミノ酸置換を有するこの配列を含んでおり、該置換は、それがある
ポリペプチド領域の相対親水性を減少させ、これにより、この領域の相対疎水性
を増加させる。該分子のこの領域の疎水性の増加は、ポリペプチドの抗微生物活
性およびエンドトキシン中和化活性を高めると考えられる。かかる置換の一例は
１６位での中性荷電アミノ酸置換であり、例えば、グリシンである。中性荷電ア
ミノ酸は、生理学的ｐＨで、ポリペプチドに関して生じる場合、正味の電荷を有
さないアミノ酸と定義される。かかる置換の別の例は、バリンまたはアラニンの
ような非荷電疎水性アミノ酸との置換である。４１位での、上記した置換と同様
の置換が、同様の全体な強化作用を有すると考えられることに注意すべきである
。該ポリペプチドの機能性変異体にて行なわれたこれらのタイプのアミノ酸置換
は、次に、これらの変異体の活性を強化すると考えられる。

【００２２】本発明の別の態様は、６ｋＤａ宿主防御ポリペプチドのＣ末端１７アミノ酸の
排除により得られる３３量体の単離ポリペプチドＬＦ−３３（ここで、該アミノ
酸は結合して１つの連続したアミド連鎖骨格を形成する）が、上記６ｋＤａＬ
Ｆフラグメントと同等の抗微生物活性およびエンドトキシン中和化活性を示すと
いう知見に基づいている。ＬＦ−３３のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に記
載する。

【００２３】ＬＦ−３３およびＬＦ−２７は、それらがグリコサミノグリカンのような陰イ
オン多糖類を結合するポリペプチドとして以前に開示されていた（Mann et al.,
J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)）という事実を考慮して、本発明のポリ
ペプチド・クレームから明確に排除される。しかしながら、ＬＦ−３３およびＬ
Ｆ−２７は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物、融合タンパク質クレーム
、または本発明の方法クレームからは排除されない。

【００２４】６ｋＤａＬＦフラグメントに関して、２塩基性クラスターおよび介在配列の
疎水性を包含する活性に不可欠な分子の生化学的特性を保存するＬＦ−３３ポリ
ペプチド配列のアミノ酸置換、挿入または欠失から生じるポリペプチドは、同じ
メカニズムによって機能し、同様の活性を示すＬＦ−３３の機能性変異体である
。式：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２は、ＬＦ−３３およびその機能性変異体の不可欠な構成要素を定義する（ここに
、Ｂ_１およびＢ_２は上記される）。

【００２５】好ましい具体例において、単離ポリペプチドのＲ１は１個以下の酸性アミノ酸
を有する（酸性アミノ酸は上記される）。１の具体例において、単離ポリペプチ
ドのＢ_１は、ＧＲＲＲＲＳ（配列番号４）またはその末端切除体であり、それは
配列中、少なくとも２つの連続したＲを保持する（例は上記される）。別の具体
例において、単離ポリペプチドのＢ_２は、ＭＲＫＶＲＧ（配列番号５）である。

【００２６】別の具体例において、単離ポリペプチドは、位置１６にアミノ酸置換を有する
配列番号１に列挙されたアミノ酸配列を含み、該置換はそれが位置するポリペプ
チド領域の相対的な親水性を減少させ、それにより、該領域の相対的疎水性を増
加させる。該置換は、ポリペプチドの活性を強化すると予想される。次いで、ポ
リペプチドの他の機能性変異体において生じた同様の置換は、その変異体の活性
を強化すると予想される。かかる置換の例は上記されている。

【００２７】本発明の抗微生物性およびエンドトキシン中和化ポリペプチドは、また、ポリ
ペプチド内の特異的な位置にある特徴的なアミノ酸の存在によって特徴付けるこ
とができる。これらの特異的位置に関して配列番号２のアミノ酸１−５１に類似
するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその機能性フラグメント（２０ア
ミノ酸までがＣ末端から欠失されている）もまた機能性変異体であり、それ自体
、本発明に包含される。より明確には、機能性変異体は、位置２、３、４、５、
２８、２９、３１、３９および４０に塩基性残基、位置７、９、１０、１１、１
２、１７、１８、２０、２１、２３、３２、３５、３７、３８、４４、４６、４
７、４９および５０に疎水性残基、位置１６および４１に酸性残基を有する。上
記のように、抗微生物性ポリペプチドまたは機能性変異体のアミノ酸は、単一の
隣接するアミド結合骨格を形成するように連結される。このような関係において
塩基性残基および酸性残基と呼ばれるアミノ酸は上記で論じられている。本明細
書中におけるこの定義および他の定義または本発明の記載の文脈において、疎水
性残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトフ
ァン、バリン、メチオニンおよびプロリンを包含する。別法では、位置１０、２
０、３７および４６の残基は、ＬＦの野生型アミノ酸配列におけるように、シス
テインであることができる。好ましい具体例において、非特異的な位置での機能
性変異体の残基は、配列番号２に列挙される５１アミノ酸ポリペプチドの対応す
るアミノ酸によって示されるか、またはこれらの残基の保存的置換である。

【００２８】本発明の別の具体例は、位置１６および／または位置４１に中性電荷のアミノ
酸置換を有する上記に直接記載された抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性
変異体である。好ましい具体例において、疎水性側鎖を有する中性電荷アミノ酸
は位置１６および／または位置４１で置換される。上記に論じたように、かかる
類似した置換もまた、それらが生じたいずれかの機能性変異体の活性を強化する
ことが予想される。

【００２９】実験的証拠は、配列番号２のアミノ酸１−５１よりなる抗微生物性ポリペプチ
ドがＮ末端から３個までのアミノ酸を欠失しつつ、有意な活性を維持することを
示す。したがって、抗微生物性ポリペプチドの機能性変異体は、付加的な１−３
個のアミノ酸をＮ末端から欠失した上記の機能性変異体も包含する。

【００３０】本発明の別の態様は、エンドサイトーシス・クリアランス経路によってエンド
トキシンの動物の体内からの迅速なクリアランスを促進する融合タンパク質に関
する。該融合タンパク質は、本発明のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたは
その機能性変異体である第１のポリペプチドと、エンドサイトーシス・クリアラ
ンス経路を介して細胞によって認識およびインターナリゼーションされるポリペ
プチド配列を含む第２のポリペプチドとの融合から生じる。融合タンパク質の第
１の成分に適当なポリペプチドは上記される。好ましい具体例において、融合タ
ンパク質の第１のポリペプチド成分は、配列番号２のアミノ酸１−５１よりなる
。

【００３１】得られる融合タンパク質は、第２のポリペプチド（エンドサイトーシスクリア
ランスフラグメント）に対し第１のポリペプチド（エンドトキシン中和化フラグ
メント）Ｎ末端を有するか、または別法では、第１のポリペプチドに対し第２の
ポリペプチドＮ末端を有する。融合タンパク質は、個々の成分の各活性を保持す
る。いくつかの少ない修飾（例えば、２つのポリペプチドフラグメント間のリン
カー領域）がこれらの機能を保存するために必要とされうる。

【００３２】本発明の他の態様は、本発明のポリペプチドおよびその機能性変異体の使用法
に関する。簡単に言えば、本発明の「ポリペプチド」なる語は、最初の６ｋＤａ
ＬＦポリペプチドフラグメントおよび詳細に上記される全機能性変異体の両方
を包含するために、本明細書において使用される。上記で論じるように、ＬＦ−
３３およびＬＦ−２７は本明細書に記載の方法請求項から除外されない。

【００３３】本発明の別の態様は、微生物の生育を阻害する方法である。本発明のポリペプ
チドは、種々の環境下での微生物の生育を阻害するために使用できる。例えば、
微生物感染に起因する個体における疾患を治療または予防するために、本発明の
ポリペプチドを医薬的に投与することができる。

【００３４】種々の微生物感染は、上記のポリペプチドを用いる処置によって阻害すること
ができる。例示のセクションにおいて与えられる実施例は、これらのポリペプチ
ドの治療的投与が細菌感染の進行を阻害し、逆転させることができることを示す
。さらなる証拠は、いくつかの真菌感染もまた減少できることを示す。本発明の
抗微生物性ポリペプチドは、微生物の細胞膜を崩壊させることによって微生物の
生育を阻害すると考えられるので、かかる細胞膜を有するいずれの微生物も、該
抗微生物性ポリペプチドによる生育阻害を受ける可能性がある。脂質包膜を有す
るウイルスもまた、本発明のポリペプチドの抗微生物作用を受けやすいかもしれ
ない。

【００３５】好ましい具体例において、微生物感染は細菌感染である。これは、限定するも
のではないが、ミコバクテリウムによって引き起こされる細菌感染を包含する。
ミコバクテリウムは、多くの抗菌剤に対して耐性である。ミコバクテリウムは、
過去最も重要な疾患のうちの２つ、結核および癩病の原因となる。ヒト結核症の
大部分のケースは、ミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tube
rculosis）によって引き起こされるが、かなりの数のケースは、ミコバクテリウ
ム・ボビス（Mycobacterium bovis）によって引き起こされる。細菌、特にミコ
バクテリウムの新規な耐性株の発生および流布は、公衆衛生をますます脅かして
いる。上記の抗微生物性ポリペプチドは、目下、公衆衛生を脅かしている微生物
のこれらの耐性株に罹患している患者の処置に有用である。

【００３６】多くの細菌感染は、感染した個体における細菌性敗血症の原因となる。追随す
る例示のセクションに詳述される結果は、上記のポリペプチドがエンドトキシン
中和化活性も有することを示す。これらの二重活性ポリペプチドの腐敗性細菌感
染に罹患している個体への投与は、感染によって引き起こされる腐敗症および感
染自体の両方を減少させることによって、有意な治療的効果を生じる。

【００３７】治療に適当な個体は、１以上の上記の微生物感染に苦しんでいるか、さもなけ
れば感染しやすいいずれかの動物（哺乳動物またはその他の動物）である。好ま
しい具体例において、該個体はヒトである。別の具体例において、該個体は家畜
動物である。別の具体例において、該動物はショー・アニマルまたは家庭のペッ
トである。

【００３８】ポリペプチドの個体への投与は、全身性または局部性のいずれかであり、主と
して治療される特定の感染によって決定される。全身性投与は、限定するもので
はないが、静脈内投与、吸入および摂取を包含するいくつかの経路によって達成
されることができる。局部性投与は、局所または内部であることができる。かか
る投与は、限定するものではないが、皮下、経皮、皮内および腹膜内投与、吸入
および摂取を包含するいくつかの経路によって達成されることができる。

【００３９】医薬上許容される担体を含む本発明のポリペプチドの処方物を投与することが
しばしば有用である。医薬投与用の可能な処方物は種々の医薬組成物を包含し、
その適切な使用は処置に必要であると思われる投与経路に依存する。局所投与に
有用ないくつかの処方物は、例えば、点眼剤、点耳剤、歯肉適用（例えば、ドロ
ップ、うがい薬、クリームまたはペースト）である。患者治療用の投与方式（例
えば、経路、用量およびクール）は処置しようとする個体（例えば、健康、体重
、代謝）、感染部位、および感染病原体によって変動する。治療方式は、経験的
観察と組み合わせて、類似の治療での処置からの外挿によって開発すべきである
。個体における微生物感染を防止するための本発明のポリペプチドの投与は、上
記の方法に対応する。

【００４０】本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドが他の抗微生物性物質またはその
治療作用を増強する活性も示すという知見に基いている。実施例において詳述す
る実験は、他の微生物物質と本発明の抗微生物性ポリペプチドとの同時投与が相
乗的な抗生物質作用を生じることを示す。これらの結果は、本発明のポリペプチ
ドがリファンピシンまたはイソニアジドの抗生物質活性を有意に増加させること
を示す。理論によって拘束はされないが、これは、本発明のポリペプチドが細菌
膜の完全性を破壊し、この破壊によって個々の細菌内で抗生物質がより高い濃度
になるので起こると考えられる。

【００４１】これらの結果は、本発明のポリペプチドを、種々の抗微生物物質または抗微生
物物質の活性を増強させるために治療的に利用できることを示す。本発明のポリ
ペプチドと抗微生物物質との同時投与によって、より低用量の抗微生物物質での
患者の医療的処置が可能になる。高価な薬物、所望されない副作用を生じる薬物
、またはそうでなければそのインビボにおける短い半減期によってその濃度が有
効であるために必要とされるより低い濃度に迅速に低下する薬物で処置する場合
などの状況では、より低い用量が好ましい。さらに、抗微生物物質または薬物と
の同時投与はまた、より短い治療期間および／または耐性表現型の逆転を可能に
し得る。限定するものではないが、その内部薬物濃度の低下（例えば、減少した
膜透過性または薬物の増加した細胞輸送もしくは代謝での）によって抗微生物物
質薬に耐性となる微生物は、これらのポリペプチドの増強活性に特に感受性であ
ることが予想される。

【００４２】本発明のポリペプチドを使用して、微生物の最外部表面を超えた侵入がその活
性に必要とされるいずれかの抗微生物物質または薬物を増強することができる。
好ましい実施態様において、抗微生物性薬物は抗生物質であり、微生物感染は細
菌感染である。原因因子は抗生物質に感受性の細菌であるか、あるいは抗生物質
増強がない場合に抗生物質に耐性の細菌である。好ましい実施態様において、抗
生物質はリファンピシンまたは構造的に関連する分子である。別の実施態様にお
いて、抗生物質はイソニアジドまたは構造的に関連する分子である。別の実施態
様において、抗微生物性薬物は抗真菌剤であり、感染は真菌感染である。患者は
、罹患性微生物による感染に罹患しているか、罹患の危険性のある、いずれかの
個体（動物、哺乳動物、ヒトなど）を包含する。

【００４３】抗微生物性薬物および本発明の単離ポリペプチドまたは機能性変異体の投与方
式は患者および特定の感染によって変動し、場合に応じて当業者はそれを決定す
ることができる。ポリペプチドの処方物はその例を上記した投与方式に依存する
。

【００４４】本発明の別の態様はエンドトキシンを中和するための上記ポリペプチドの使用
に関する。本発明のポリペプチドはエンドトキシン中和化活性を有し、個体の身
体内の（例えば、血流を循環している）エンドトキシンを中和するために使用す
ることができる。エンドトキシンは、身体に感染した病原体、あるいは身体が曝
露された汚染物質（例えば、エンドトキシンに汚染した血液もしくは他の体液、
組織、または体表面）から生じ得る。本発明のポリペプチドを、上記の微生物感
染患者の処置のための投与と同様に個体に投与する。ポリペプチド投与の治療方
式は場合によって変動し、経験的観察と組み合わせて、類似の医療での処置から
の外挿によって開発することができる。微生物感染の処置について上記したのと
同様の製剤をこの方法においても利用することができる。投与方式および有用な
製剤もまたは、本明細書において上記した。

【００４５】あるいは、患者中のエンドトキシンを、エンドサイトーシスクリアランス経路
を介して細胞によって認識およびインターナライズされるポリペプチド配列から
構成されるポリペプチドと融合されたエンドトキシン中和化活性を有するポリペ
プチドから構成される融合タンパク質の投与によって中和することができる。投
与すべき融合タンパク質は上記で詳細に記載した。

【００４６】本発明のポリペプチドを、医薬および中和（neutraceutical）薬物としてのみ
ならず、体内に摂取されるか、あるいはヒトもしくは他の動物の体表面またはそ
れに由来する液体、器官および細胞に適用されるかまたは接触される、食品およ
び医薬または非医薬産物のようないずれかの産物用の添加物としても使用するこ
とができる。汚染の可能性のある産物からのエンドトキシンの中和および／また
は除去は、エンドトキシンがその産物と直接または間接に接触する生物を害する
可能性がある状況で非常に有益である。

【００４７】産物中でのエンドトキシンの中和および／または微生物増殖の阻害のために、
産物をポリペプチドまたは上記で詳細に記載した機能性変異体と接触させる。産
物とポリペプチドとは、多くの方法で接触させることができる。その方法は、限
定するものではないが、浸漬、噴霧、混合、吸着、ベーパーへの曝露を包含し、
これは特定の産物の特性に依存する。

【００４８】本発明は種々の産物の処理に有用である。生物学的産物（本明細書中、、生物
学的生物またはプロセスに由来する産物と定義する）は特に微生物およびエンド
トキシンでの汚染の危険がある。生物学的産物の例としては、限定するものでは
ないが、食品産物、組織、生細胞、生細胞、血液もしくはその成分およびいずれ
かの他の体液由来の産物、薬物または他の分子調製物が挙げられる。非生物学的
産物（本明細書中、生物学的生物またはプロセスに直接は由来しない産物と定義
する）、例えば、ガラス産物、手術用品、合成薬または他の分子調製物も処理す
ることができる。本発明の有効利用のために、処理しようとする産物はそのよう
にして適用されるポリペプチドの全量のエンドトキシン中和化活性を完全に不活
化する活性を有するべきではない。エンドトキシン汚染または微生物増殖の防止
または阻害が一般に所望されるいずれかの産物に、本発明のポリペプチドを添加
、組合せ、噴霧、接着、被覆、吸着、化学的架橋または注入することができる。
あるいは、本発明のポリペプチドを産物がその上を通過する表面上に固定化して
、産物におけるエンドトキシンの除去または微生物増殖の阻害をすることができ
る。エンドトキシン中和化ポリペプチドで処理され、それを保有する産物をさら
に使用して、それが接触させられる別の産物を処理することができる。

【００４９】本発明の別の態様は、個体におけるＬＦ宿主防御ポリペプチドのインビボ生産
の誘導である。下記実施例に示す証拠は、ＬＦの６ｋＤａ宿主防御ポリペプチド
フラグメントがアスパラギン酸プロテアーゼカテプシンＤでの消化によって産生
されること、およびこの消化に対するＬＦの感受性がポリアニオンへの投与に際
して増加されることを示す。これらの知見は、ポリアニオン（例えば、ヘパリン
、グリコサミノグリカン、核酸またはデキストラン硫酸）の患者への曝露が、カ
テプシンＤまたは関連する酵素によるＬＦ（内因性ＬＦまたは投与したＬＦのい
ずれか）からの６ｋＤａポリペプチドの産生を増加させることを示す。あるいは
、カテプシンＤまたは６ｋＤａポリペプチドのインビボにおける生成に関与する
他のプロテアーゼの全体的な濃度またはタンパク質分解活性の増加も、ポリペプ
チドのインビボにおける産生を増加させる。

【００５０】これもまたＬＦから６ｋＤａフラグメントを切断し得る他のアスパラギン酸プ
ロテアーゼは、限定するものではないが、カテプシンＥ、レニン、およびＨＩＶ
のアスパラギン酸プロテアーゼを包含する。これらのプロテアーゼはｐＨ３．５
〜５で最適に機能する。それゆえ、ＬＦからの６ｋＤａポリペプチドの生成に関
与するプロテアーゼの隣接環境のｐＨをプロテアーゼ活性に至適なレベルに調節
すると、ＬＦからのポリペプチドのインビボにおける産生が増加する。

【００５１】本発明の別の態様は、ＬＦ宿主防御ポリペプチドおよび機能性変異体の隣接環
境のイオン強度の操作による、このポリペプチドの抗微生物活性およびエンドト
キシン中和化活性の増強である。本発明のポリペプチドの活性は隣接環境のイオ
ン強度によって影響され、下生理学的（sub-physiologic）イオン強度が最適で
あるので、ポリペプチドの隣接環境を調節することは活性をもたらす。

【００５２】下記実施例に示す結果は、本発明のポリペプチドが、２００ｍＭＮａＣｌ未
満（最適活性は試験した最低濃度である５０ｍＭＮａＣｌで観察された）のイ
オン強度で微生物の増殖を阻害するように機能することを示す。これらの結果は
、それによって本発明のポリペプチドが、感染性微生物またはエンドトキシンに
、低下したイオン強度の条件下で曝露されるいずれかの処置（例えば、下生理学
的イオン強度溶液中でのまたは感染の近傍の組織液の塩濃度の希釈を引き起こす
いずれかの薬物（例えば、局所作用利尿薬）との組合せでのポリペプチドの投与
によって達成される）がポリペプチド処方物の効力を有意に増加させることを示
す。この線で、ポリペプチドの変異体を、超生理学的（super-physiological）
イオン強度において活性なままであるように設計することができる。例えば、塩
基性残基の一方または両方のクラスター内の正に荷電したアミノ酸の数を増加さ
せることによって、またはポリペプチド内の負に荷電した残基の総数を減少させ
ることによって、変異体ポリペプチドの塩阻害を低減させる。

【００５３】実施例ＬＦからの宿主防御ポリペプチドのインビボ生成ＬＦは、通常、タンパク質分解に抵抗性であり(R. D. Brines and J. H. Broc
k, Biochim. Biophys. Acta 759: 229-35(1983))、炎症中のインビボのプロセッ
シングについてほとんど知られていない。そこで、炎症を起こしたヒト組織を、
小(例えば、＜１２ｋＤａ)ポリペプチドとしてのN末端ドメインの存在について
試験した。成人ヒトＬＦのＮ末端１７残基に特異的な抗体を使用して、深い気管
支咳(deep bronchial cough)を有する個体からの痰および感染したヒト皮から取
得した化膿性滲出物(「膿」)のイムノブロットを探索した。これは、ＬＦのＮ末端
ドメインが、試験したすべての滲出物において低分子量ポリペプチド(Mr-6000-8
000)として存在するとして同定した。サンプル６ｋＤａポリペプチドの標準のそ
れとの免疫染色強度の走査濃度測定の比較によれば、このフラグメントは１−１
０μＭで滲出物中に存在したことを示唆しているN末端ポリペプチドは、歯肉の
プラークまたはヒト唾液中に検出されなかったがN末端ポリペプチドは、ヒト痰
中にも検出された。いくつかの組織サンプルにおいて、Ｎ末端ドメインを含む中
間サイズ(例えば、１０−２０ｋＤａ)のポリペプチドを、少数構成要素として検
出することができた。これは、遊離されたドメインの不完全なプロセッシングの
結果のようである。これらのデータは、炎症性事象中にインビボでＬＦの抗微生
物性ドメインが遊離し、それが組織中で小ポリペプチドとしてインタクトのまま
であることの第１の直接的な証拠を提供している。

【００５４】活性化した白血球はＬＦからＮ末端６ｋＤａドメインを放出するほとんどの微生物感染の証明は、プロフェッショナル(professional)貪食細胞
による浸潤であるから、これらの細胞を、ＬＦから抗微生物性ドメインを遊離す
る能力について試験した。単球および好中球の最初の共生培養を活性化し、好中
球由来のＬＦのプロセッシングについて試験した。ヘパリン結合分子を合わせた
細胞抽出物から単離し、培養遊離物(releasate)を、ＦＭＬＰによって共生培養
し活性化した最初のヒト好中球および単球から取得した。抗ＬＦの末端ポリペプ
チド抗体でのこれらのイムノブロッティングは、タイトな間隔の(tightly space
d)６−８ｋＤａの二重物(doublet)を検出し、活性化した貪食細胞による好中球
由来ＬＦから生成した抗微生物性ドメインに対応していた。活性化の前に、好中
球において免疫反応性ポリペプチドは検出できなかった。このことは、タンパク
質分解遊離が好中球脱顆粒に続いて起こったことを示している。このことは、活
性化した貪食細胞が、ヘパリン結合機能を保持する小ポリペプチドとしてＮ末端
ドメインを遊離することを確認した。同数の好中球から取得したインタクトなＬ
Ｆの比較により、かなりの割合のタンパク質は、活性化した共生培養によってプ
ロセッシングされたことが明らかとなった。対照は、ペプシノリシス(pepsinoly
sis)によって精製したＬＦからの６ｋＤａポリペプチドとして遊離した抗生ドメ
インおよびヒト初乳からのヘパリン−精製したポリペプチドを含んだ。たとえこ
れが非常に高濃度のＬＦ（−５−７ｍｇ／ｍｌ）を含むとしてもN末端ポリペプ
チドは、ヒト初乳に検出されなかった(Sanchez et al., Arch. Dis. Child. 67:
657-61(1992))。このことは、それは自発的に生成されないことを示している。
むしろ、このプロセッシングは、炎症性事象に応答して起こるようである。

【００５５】別々に単球および好中球を培養し活性化し、どのタイプの貪食細胞がＮ末端Ｌ
Ｆポリペプチドを遊離することができるか決定した。これらの実験について、単
球を外生的に精製したミルクＬＦ（５０μｇ）で補足した。なぜなら、それらは
内生ＬＦを有しなかったからである。培養培地を細胞を抽出する前に洗浄剤で除
去し、次にヘパリン結合分子を両方のフラクションから別々に分離し、イムノブ
ロッティングした。６ｋＤａの抗微生物性ドメインを、両方の細胞タイプからの
培養培地および細胞抽出物において検出した。これらの結果は、両方の細胞タイ
プがＬＦから抗微生物性ドメインを遊離することのできることを指摘している。
両方の培養において、抗微生物性ドメインが、細胞抽出物のみならず細胞外に検
出された。単球によって生成したほとんどのフラグメントは、可溶性というより
むしろ細胞付随性のままであった。一方、逆のことが好中球に当てはまった。２
個の細胞タイプにおける細胞外および細胞区画の間のこの特異な分布の意義は、
好中球遊離のＬＦが、炎症性部位に到着したときに、好中球由来プロテアーゼに
よって細胞外に、単核の貪食細胞によって細胞内に切断される（後者による内在
化に続いて）というモデルと矛盾しない(Britigan et al., J. Immunol. 147: 4
271-7(1991); Courtoy et al., Lab. Invest. 50: 329-34(1984))。これらの研
究は、プロフェッショナル貪食細胞が、抗微生物性ドメインをＬＦから遊離する
ことができ、したがって、感染した組織において検出されるＮ末端ポリペプチド
を生成する原因となり得ることを示している。

【００５６】リソソームプロテアーゼカテプシンＤによるＬＦ由来の６ｋＤａポリペプチドの
放出プロテアーゼが応答しＮ末端ドメインを放出し得るように確立するため、幾つ
かのプロテアーゼによるＬＦプロセッシングは、炎症または細菌感染に関し、そ
のプロテアーゼには、エラスターゼ、カテプシンＧおよびＤ、マトリクスメタロ
プロテイナーゼが含まれ、およびS. aureus由来の“Ｖ８”プロテアーゼを試験
した。これらの、カテプシンＤのみ、食細胞中に豊富なリソソームプロテアーゼ
(Bever et al., Inflammation 13: 309-16 (1989); Levy et al., Infect. Immu
. 57: 1632-4 (1989))は、小さなヘパリン結合性ポリヌクレオチドとして未処理
Ｎ末端を放出し得た。鉄飽和性または鉄不含有ＬＦの何れかを少量のカテプシン
Ｄ(１／２００^ｔｈ、ｗ：ｗ)に５分ぐらいの短い期間さらすことによりN末端ペ
プチド特異的抗体を用いる免疫ブロット分析による検出可能なＮ末端６ｋＤａポ
リペプチドを生じた。このポリペプチドの蓄積の増加は、カテプシンＤに対しよ
り長期間さらされることになり、ポリペプチドの存在から、安定が維持され、少
なくとも３日間の更なる崩壊に耐性となる。精製６ｋＤａポリペプチドのＮ末端
シーケンシングは、成熟ＬＦ分子中のＧｌｙ−１に相当する単一アミノ末端を示
した。ＭＡＬＤＩマススペクトル分析は、分子質量５７４１Ｄａを示し、Ｇｌｙ
−１から始まりＡｌａ−４９に終わるＬＦポリペプチドで予想される５７４４Ｄ
ａの値に近かった。まとめると、これらの結果から、カテプシンＤは、ポリペプ
チドとしてＬＦのＮ末端ドメインを放出し、他の宿主防御ポリペプチドに生化学
的および構造的に類似する特徴(H.G. Boman, J. Marsh, and J.A. Goode, Eds.,
Antimicrobial Peptides, (John Wiley & Sons Ltd., New York, NY 1994); Ho
ffmann et al., Curr. Opin. Immunol. 8: 8-13(1996); Martin et al., J. Leu
koc, Biol. 58: 128-36 (1995); T. Ganz and R.I. Lehrer, Curr. Opin. Hemat
ol. 4; 53-8 (1997))により、微生物増殖が阻害されると予想される。

【００５７】カテプシンＤによる６ｋＤａＬＦフラグメントの放出におけるｐＨの効果カテプシンＤは、食細胞および他の細胞型のリソソーム中に見られる主要な崩
壊性プロテアーゼである。細胞により飲食されるか、食菌されるタンパク質を切
断し、その後、細胞の低ｐＨリソソームコンパートメントへと送達される。多く
のリソソームプロテアーゼのように、カテプシンＤは、最適化酸性ｐＨ(ｐＨ３
．５)によりタンパク質分解的に作用(Tang, J. and Wong, R.N.S., J. Cell. Bi
ochem. 33: 53-63 (1987))し、典型的なリソソームのそれよりもいくらか低い(p
H４.５−５.０)(Shoji Ohkuma and Brian Poole, Proc. Natl. Acad. Sci. 75:
3327-3331 (1978))。実験は、異なるｐＨでカテプシンによるＬＦ由来６ｋＤａ
ポリペプチドの放出を比較することにより行った。

【００５８】ヒトの母乳から精製したヒトＬＦを、ｐＨ３．５、４．０、４．６、５．０ま
たは７．４のいずれかでカテプシンＤで消化した。消化後、当該サンプルを、非
還元条件下、トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した。次いで、分
画生成物を、６ｋＤａポリペプチドの最初の１７アミノ酸を含むポリペプチドの
みを特異的に認識するウサギポリクローナル血清で免疫ブロットした。当該分析
では、ｐＨ３．５、４．０、４．６または５．０のいずれかでカテプシンＤとイ
ンキュベーションしたＬＦサンプル由来の６ｋＤａポリペプチドとほぼ同じ大き
さの位置に移動したバンドが同定された。しかし、６ｋＤａ生成物は、ｐＨ７．
４インキュベーションからは検出されなかった。これらの結果から、６ｋＤａポ
リペプチドの放出は、生理学的ｐＨより下(sub-physiological)で有意に増加す
ることが示された。

【００５９】ヘパリンへのＬＦの結合により、リソソームｐＨで６ｋＤａフラグメントを放出
するカテプシン能が非常に高まるポリサッカライドの１つの機能は、プロテアーゼによる攻撃に対する耐性をタ
ンパク質に供与することであると考えられている。ＬＦが陰イオン性ポリサッカ
ライドに結合し、この結合は、そのアミノ末端の３３残基を仲介するため(Mann
et al., J. Biol. Chem. 269: 23661-23667 (1994))、実験は、ポリサッカライ
ドヘパリン、カテプシンＤによるタンパク質分解から天然にＬＦを保護し６ｋＤ
ａＬＦポリペプチド放出を減少するモデルポリアニオンのいずれかの決定を行っ
た。

【００６０】ＬＦを、１時間か２４時間のいずれか、１０倍モル過剰のヘパリンの存在下ま
たは非存在下のいずれかにおいてカテプシンＤで消化した。消化の生成物を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる非還元条件下で分画し、プローブとしてＬＦタンパク質の
最初の１７残基に特異的な抗体を使用し免疫ブロット分析した。有意に、より高
い量の６ｋＤａポリペプチドを、ヘパリンの非存在下でインキュベーションした
サンプルに対し、カテプシンＤおよびヘパリンを含むサンプルから検出した。Ｌ
Ｆのインキュベーションの同様の免疫ブロット分析は、カテプシンＤ非存在下ま
たはペプスタチンＡ存在下で行い、カテプシンＤ阻害剤では、６ｋＤａフラグメ
ントを同定し損ねた。これらの対照から、増加した崩壊は、カテプシンＤが原因
であり、ヘパリン製剤中の汚染プロテアーゼが原因ではないことが示された。こ
れらの結果から、カテプシンＤによるＬＦ由来の６ｋＤａポリペプチドの放出は
、ヘパリンのようなポリアニオンの存在下劇的に増加することが示された。この
驚くべき結果は、予想してたものとは逆であった。この結果の説明は、既知でな
いが、カテプシンＤのようなアスパラギン酸プロテアーゼの最適条件を生ずる低
ｐＨ(多くの酸性官能基が原因となる)の微環境を供するポリアニオンに関し得る
。これらの発見から、ＬＦ由来の６ｋＤａフラグメントは、グリコサミノグリカ
ンまたは核酸のようなポリアニオンの存在によりインビボで促進されるようであ
ることが示される。

【００６１】カテプシンＤによって遊離された6 kDa LF フラグメントは、ペプシンによって
遊離された類似フラグメントよりも、より有効な抗微生物性物質である。カテプシンポリペプチドの抗微生物性活性を、臨床分離株、E. coli 0111につ
いて試験した。微生物の増殖を、-1-5μM ポリペプチドの最小抑制濃度(MIC)で
ありそして100 HM で細胞増殖中10,000-倍の減少を超える生理学的イオン強度で
抑制し、ここで生CFU類の数はもとの接種材料の半分以下であった(2.14 x 10⁴か
ら8.8 x 10³ CFU/ml)(図１)。そのため、LFの 6 kDa カテプシンフラグメントは
、少なくとも１２の他の天然抗微生物性ポリペプチド類と同等の効力であり(H.
G. Boman, J. Marsh, and J. A. Goode, Eds., antimicrobial Peptides, (John
Wiley & Sons Ltd., New York, NY, 1994))、そして殺菌剤として作用可能であ
る。カテプシンＤから遊離された抗微生物性フラグメントは、ペプシンから遊離
されたものより、細菌に対して１０倍を超える効き目があり、ここで後記のMIC
は11-33 HMの間であり、ペプシン性のフラグメントについての既報告の18μMの
値とほぼ一致する値である(Bellamy et al., Biochim. Biophys. Acta 1112: 13
0-6 (1992))。100μM ポリペプチドにおいて、ペプシンで処理した倍地中での生
細菌数は、カテプシン性のフラグメントによるものと比べて、1,000倍以上多い(
図１)。この効能の相違の根拠は、6kDa ドメイン中の２つのジスルフィド結合の
間で起こる、別の、本質的なペプシンの開裂に関連するであろう(Mann et al.,
J Biol Chem. 269: 23661-7(1994); Bellamy et al., Biochem Biophys. Acta 1
121: 130-6 (1992))。

【００６２】ＬＦから抗微生物性ポリペプチドを作成するカテプシンＤの有効性は、幾つか
の理由によって有意である。これは、キモシン、レニン、HIV-1 プロテアーゼお
よびペプシンを含む、アスパラギンファミリーのプロテアーゼのメンバーであり
(K. Takahashi, Ed., Aspartic Proteinases: Structure, Function, Biology,
and Biomedical Implications (Plenum Press, New York, 1995))、そしてペプ
シンと類似する構造的特徴およびpH必要性を有するが、一般に全細胞のリソソー
ム区画でみられ、そして専門食細胞に富む点で、カテプシンＤはこれらのプロテ
アーゼと性質が異なる(J. Tang and R. N. S. Wong, J. cell. Biochem. 33: 53
-63 (1987))。カテプシンＤは、細胞外分子として分解可能な活性プロテアーゼ
として、細胞から分泌され、適切な酸性環境下で存在するものとして提供される
(Briozzo et al., Cancer Research 48: 3688-3692 (1988))。さらに、これは炎
症性組織中で豊富であり(S. Bazin and A. Delaunay in Inflammation, Biochem
istry and Drug Interaction, A. Bertelli and J. C. Houck, Eds., (Excerpta
Medica., Amsterdam, 1969), pp 21-28)、そして医薬的に活性な他のポリペプ
チド類の調製において重要であることが知られている(L. M. Greenbaum in prot
eases and Biological Control, E. Reich, D. B. Rifkin and E. Shaw, Eds. (
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1975), pp. 223-228)。このインビ
ボ分布および機能の点から、LFを処理するこの特殊能力と同様に、カテプシンＤ
は、この防御ポリペプチドの炎症反応生成における機能に特徴的に適する。

【００６３】唾液中にLF カテプシンポリペプチドが存在することは、肺の炎症または感染
において重要な機能を有し得ることを提唱している。抗微生物性ポリペプチドは
上皮由来LFの細胞処理手続によって調製することができる所見をひとまとめにし
て考えると、唾液中の存在量は、好中性介在免疫と同様に粘膜免疫において、そ
れに対応するポテンシャルとも一致している。

【００６４】ＬＦの最初の３３アミノ酸に対応するポリペプチドによる細菌増殖阻害先の研究により、ＬＦのＮ末端６ｋＤａポリペプチドフラグメントがグリコサ
ミノグリカン結合部位として機能すること、そしてＬＦのグリコサミノグリカン
（ＧＡＧ）結合活性はポリペプチドのＮ末端の３３アミノ酸の中に含まれること
が示された。この３３量体は、正に荷電した（塩基性の）残基の２つのクラスタ
ーを含み、これらはＧＡＧ相互作用に必須であると考えられている。ラクトフェ
リンの７〜３３アミノ酸に対応する２７量体（これはＬＦ中の塩基性残基の最初
のクラスターを欠くが第２のクラスターは含んでいる）は、ＧＡＧへの弱い結合
のみを示した。ＬＦの１〜２７アミノ酸に対応する２７量体（これは塩基性残基
の第２のクラスターを欠く）もまた、両方の塩基性クラスターを含む３３量体よ
りもＧＡＧへの弱い結合を示した（Mannら、J Biol Chem．269：23661−23667（
1994））。

【００６５】（ペプシン消化から作製した）６ｋＤａのＬＦポリペプチドのＧＡＧ結合活性
に関連する分子領域が本発明の６ｋＤａのポリペプチドの抗微生物活性にも関連
しているかどうかを調べるため、ＬＦのＮ末端アミノ酸に対応する種々の長さの
ポリペプチドを大腸菌０１１１の増殖阻害能力について試験した。一晩培養した
培養物を、７時間のタイムコースにわたり、ＬＦ、ＬＦの１〜３３アミノ酸に対
応する３３量体、ＬＦの７〜３３アミノ酸に対応する２６量体、ＬＦの１〜２７
アミノ酸に対応する２７量体のいずれかの存在下（５０μＭ）で増殖させた。３
３量体は、タイムコース全般にわたり、これらの培養物の増殖を完全に抑制した
。対照的に、ＬＦは一過的な増殖抑制効果のみを有していた（図２）。このこと
は、ＬＦおよび３３量体が異なる機構を介して細菌増殖を抑制することと一致す
る。３３量体ではなくインタクトなＬＦの増殖阻害効果は、タンパク質を鉄で飽
和させることにより破壊することができ、このことはＬＦの主な作用様式が細菌
の鉄飢餓を介するものであることを示唆している。３３量体対ＬＦについての動
力学的データにおける差異は、３３量体がインタクトなタンパク質の中に存在し
ているにもかかわらず３３量体の活性が示され得ないことを示唆する。２６量体
および２７量体が培養物の増殖を阻害し得ないことは、Ｎ末端ＬＦ配列由来のポ
リペプチドの抗微生物機能性のためには、３３量体の末端に塩基性残基の両方の
クラスターを保持することの重要性を強調する。また、これらの結果は、先に報
告したＬＦ中のＧＡＧ結合の原因であるアミノ酸がペプシン由来の６ｋＤａのＬ
Ｆフラグメントについて先に観察された抗微生物活性の原因であり得ることを示
す。

【００６６】２つの塩基性クラスターを伴うポリペプチドと伴わないポリペプチドとの抗微生
物活性用量応答の比較両方の塩基性クラスターを含む上記の３３量体の活性と、１つの塩基性クラス
ターのみを含む上記の２７量体の活性とを比較するため、これら２種のポリペプ
チドの種々の用量での存在下で、大腸菌培養物を５時間、増殖させた。図３に示
されるように、ＧＡＧ結合３３量体は、２〜５μＭの最小阻止濃度（ＭＩＣ）で
細菌の増殖を阻害した。対照的に、２７量体は、（２００μＭもの高い濃度でさ
えも）増殖を阻害しなかった。このデータは、３３量体による細菌増殖の阻害が
塩基性残基のインタクトな第１のクラスターを必要とし、そして阻害が用量依存
性であることを示す。

【００６７】６ｋＤａのＬＦポリペプチドの抗微生物活性に対するイオン強度の影響天然に存在する多数のカチオン性宿主防御ポリペプチドの抗微生物作用におけ
る第１の段階は、微生物表面の負に荷電した部位との弱い静電相互作用を介した
、微生物の表面へのポリペプチドの結合に関連していると考えられている。この
ことは、これらの宿主防御ポリペプチドの多数が、第１段階の結合が阻害される
ような上昇したイオン強度条件下では、微生物標的に対して作用し得ないという
知見と一致する。このタイプの宿主防御ポリペプチドの防御特性の減弱は、生理
学的には、塩蓄積が生じる特定の組織（正常な腎臓または膀胱、あるいは嚢胞性
線維症を有する患者の肺）で起こる感染に関連している。抗微生物ＬＰポリペプ
チドフラグメントの代表物のイオン強度の上昇に対する抗微生物活性の感受性を
規定した。

【００６８】図４に示すように、実験の結果は、６ｋＤａポリペプチドの増殖阻害活性はイ
オン強度が上昇するに従い減少し、ＮａＣｌ濃度が生理学的な濃度を超える５０
ｍＭまで上昇した場合（イオン強度は２００ｍＭＮａＣｌ以上である）に活性
が本質的には失われることを示している。逆にいうと、生理学的なイオン強度未
満では、ポリペプチドは、生理学的な塩濃度での場合よりも細菌増殖阻害という
点では有意により強力である。例えば、イオン強度を１５０ｍＭＮａＣｌから
５０ｍＭＮａＣｌまで減少させることにより、それに曝した後の生存細菌の数
は約１０，０００分の１に減少する。

【００６９】これらの結果は、いくつかの理由から重要である。第１に、これは代表的な抗
微生物ポリペプチドの、イオン強度における微妙な変動に対する繊細な感受性を
しめし、ポリペプチドがなんらかの（未だ未知の）微生物標的分子（おそらくＬ
ＰＳ）との静電相互作用を必要とする機構を介して微生物増殖を阻害することを
示唆する。第２に、これらの結果は、ＬＦ由来宿主防御ポリペプチドそして本来
の（野生型の）配列のおそらく他の外来性宿主防御ポリペプチドが、嚢胞性線維
症を有する患者を肺感染から防御し得ない可能性を強調する。これは、これらの
患者における肺表面液は、正常な肺の５０〜１００ｍＭ高い塩化物イオン濃度で
あると報告されており、これらのポリペプチドはこのイオン強度では抗微生物活
性がほとんどないか、抗微生物活性がないことの原因である。

【００７０】６ｋＤａのＬＦポリペプチドおよび３３-は細菌膜透過性を上昇させる本発明のポリペプチドの他の公知の抗微生物性ポリペプチド（ヒト防御ＨＮＰ
−１およびＨＮＰ−２、ウシ気管抗微生物性ペプチド（ＴＡＰ）、ブタプロテグ
リン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）および他のもの）に対する生化学的および構造的類
似性は、ＬＦのこのドメインが、細菌膜の透過特性に損傷を与えることにより細
菌増殖を阻害するように働き得ることを示唆した。この仮説を試験するため、本
発明のポリペプチドのリファンピシン効力を上昇させる能力を試験した。リファ
ンピシンは、低い膜透過性を有するが、サイトソル内に侵入した際には有効に細
菌細胞を殺傷する低分子量の薬剤（＜１ｋＤａ）である。

【００７１】大腸菌培養物を、最適用量未満の上記ポリペプチドの存在下または非存在下で
、最適用量未満のリファンピシンに曝し、６時間インキュベートした時点でＣＦ
Ｕを測定した（図５）。最適用量未満のリファンピシンの増殖阻害効果は、低用
量の本発明の抗微生物性ポリペプチドと組み合わせて投与した場合に劇的に上昇
した。例えば、リファンピシンに曝した培養物への活性用量未満の６ｋＤａポリ
ペプチドの添加（５μＭ）は、６時間の増殖期間の後に得られた生存細菌数を、
３桁よりも高い度合いで減少させた。負の対照である２７量体ポリペプチドがリ
ファンピシンの抗微生物活性に対して顕著な効果を有さない一方で、３３量体は
、６ｋＤａポリペプチドと同様に、抗微生物性を強化させた。３３量体とリファ
ンピシンとの協力作用は、リファンピシン処理単独の場合のおよそ１％の生存細
菌を生じた。同様の強化効果は、構成物質であるイソニアジドを用いても観察さ
れた。このことは、本発明のポリペプチドが、少なくとも部分的には微生物の外
膜を傷害することにより機能することを示す。

【００７２】また、これらの結果はポリペプチドの他の抗微生物薬物（特に従来的な抗生物
質）の抗微生物活性を強化する能力を実証する。これは、ポリペプチドが特定の
型の抗生物質耐性微生物を抗生物質感受性表現型に変換するために使用すること
ができることを示している。例えば、進化した抵抗性が原因で、実務上の濃度で
どちらかといえば有効ではない抗生物質を、本発明のポリペプチドと組み合わせ
て投与することにより効き目のあるものとする。

【００７３】ＬＦ由来ポリペプチドによるインビトロおよびインビボでのエンドトキシンの中
和先の研究により、ヒトＬＦのＮ末端３３残基が、グリコサミノグリカンに対す
るタンパク質の結合を媒介する最小配列を表すことが実証された（Mannら、J．B
iol．Chem．269：23661-7（1994））。この配列は、カチオン性のヘッド部（hea
d）（１〜６残基）およびテイル部（tail）（２８〜３３残基）を含み、これら
は結合してグリコサミノグリカン結合部位を形成する。この研究において、ＬＦ
−３３と命名した合成ポリペプチド（これは分泌型ヒトＬＦの最初の３３残基に
対応する）のエンドトキシン中和能力を評価した。

【００７４】エンドトキシン誘発性リムルス遊走細胞溶解凝固の阻害エンドトキシン誘発性リムルス遊走細胞溶解（ＬＡＬ）凝固のペプチド媒介性
阻害を、感受性の高いＬＡＬアッセイを用いて測定した（Zhangら,Ｊ．Clin．Mi
crobiol．32:416〜422（1994））。リムルスＥＬＩＳＡはエンドトキシンによる
ＬＡＬ凝固の活性化、およびポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて
作製したペプチド−Ｃ免疫反応性の測定に基づくエンドトキシンアッセイである
。エンドトキシンは、ＬＡＬ酵素を活性化する能力を失った場合に中和化されて
いると定義した。５０％エンドトキシン中和濃度（ＥＮＣ_５０）は抗エンドトキ
シン剤の有効性を反映する；低いＥＮＣ_５０は高い有効性を示す。表２は、リピ
ドＡおよび４つの異なるタイプのＬＰＳに対する各エンドトキシン剤の測定した
ＥＮＣ_５０値を列挙する。各々の抗エンドトキシン剤の有効性は、エンドトキシ
ンの型に依存して変化した。ＬＦ−３３は、試験したエンドトキシンの全ての型
を中和するモル濃度を基準とすると、ポリミキシンＢよりも強力であった。対照
的に、ＬＦ−２７は、リピドＡおよび大腸菌ＬＰＳを中和する濃度ではＬＦ−３
３のおよそ１０分の１の強度であり、そして他の３つのＬＰＳに対しては検出可
能な活性を有さなかった。ＬＦ−３３の配列とＬＦ−２７の配列とのただ１つの
差異は、ＬＦ−２７がＬＦ−３３のＮ末端の最初の６残基（ＧＲＲＲＲＳ）を欠
いているということである。注目すべきことに、この欠損は、このアッセイにお
けるポリペプチドのエンドトキシン中和能力の劇的な減少を導く。血清タンパク
質のエンドトキシンに対する結合は、このアッセイにおいて、エンドトキシンを
活性化ＬＡＬから妨げることによりエンドトキシン活性を中和する（Emancipato
rら、Infect．Immun．60:596−601（1992））。ヒト血清は、種々の程度のエン
ドトキシン誘発性ＬＡＬ凝固の阻害を示したが、リピドＡに対しては効果を有さ
なかった（表２）。

【００７５】

【表２】

【００７６】ＬＦポリペプチドによる、ＬＰＳのリピドＡ部由来のエンドトキシン活性の中和ＬＰＳ分子のリピドＡ部領域は、ＬＰＳの炎症的な影響、および毒性的な影響
の主な原因である。ＬＰＳが微生物から放出されると、リピドＡ部はより利用さ
れ得る。多数のアミノ末端のＬＰポリペプチドがＬＰＳのリピドＡ部のエンドト
キシン活性を中和する能力を決定するのに、以下のアッセイを行なった。ＬＦ、
ＬＦの６ｋＤａフラグメント、ＬＦ−３３，ＬＦ−２７およびポリミキシンＢを
各々、ＬＡＬアッセイを用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ０１１３由来のリピドＡ（３０
ｎｇ／ｍＬ）のエンドトキシン活性を中和する能力について調べた。これらの実
験の結果を図６に示す。ＬＦはリピドＡを中和する十分な活性を示さないが、６
ｋＤａのＬＦフラグメント、ＬＦ−３３およびＬＦ−２７は、同程度ではあるが
全く同一ではない効能でリピドＡを中和した。これらの各々をポリミキシンＢ（
これは、該分野の標準である）の効能と比較することができた。このことは、Ｌ
Ｆ−２７（これは、１つだけの塩基性アミノ酸を有する）が、ＬＰＳ中の大きく
、バルキーなオリゴ糖部が欠損しているエンドトキシンの形態を中和するのに、
塩基性アミノ酸の２つのクラスターを含有するポリペプチドと同じくらい強力で
あることを示す。２７量体がより容易に利用され得るリピドＡ尾部を中和すると
いうこの観察された能力は、３３量体の末端にある負電荷の残基のクラスターが
、ＬＰＳのオリゴ糖部の負イオン部位またはリピドＡの頭部基と結合するが、２
つのクラスターを架橋している疎水的な介在配列が、リピドＡ領域と結合するの
にであったり、炎症上の活性を中和するのに非常に重要であることを示している
。ＬＦのより小さいフラグメントにおけるエンドトキシン活性は、無傷のＬＦ分
子の場合では、これらの小さなポリペピチドのエンドトキシンを中和する活性が
マスクされることを示している。

【００７７】ＬＦ−３３による、エンドトキシン誘発性ＴＮＦ−α分泌の抑制マクロファージセルラインＲＡＷ２６４．７によるエンドトキシン誘発性ＴＮ
Ｆ−α分泌の抑制についてもまた測定されている（ＫｅｌｌｙらによるＩｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：４４９１−６（１９９１）)。ＲＡＷ２６４．７細
胞は、エンドトキシンに被曝させると、ＴＮＦ−αを分泌する（Ｍ．Ｒ．Ｒｕｆ
ｆおよびＧ．Ｅ．ＧｉｆｆｏｒｄによるＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ２：２３５−２
７２（１９８１））。ＴＮＦ−αの分泌とエンドトキシン濃度との比例関係は、
本研究で使用するリピドＡと多数のＬＰＳに対してエンドトキシンの濃度が２０
ｎｇ／ｍｌより低い場合に観察を行ない、エンドトキシンの濃度が１０ｎｇ／ｍ
Ｌである場合は、ＴＮＦ−α誘発実験の場合に選んだ。ＬＦ−３３の濃度を増加
させながら、それをエンドトキシンと混合することにより、エンドトキシン誘発
性ＴＮＦ−α分泌量の用量に依存する抑制が生じた（図７）。ＬＡＬアッセイの
結果と同様に、ＬＦ−３３の効能はエンドトキシンの種類に応じて変わった。エ
ンドトキシン（１０ｎｇ／ｍＬ）誘発性ＴＭＦ−α分泌の５０％を抑制するのに
必要なＬＦ−３３の濃度は、Ｅ．ＣｏｌｉＬＰＳおよびリピドＡの場合には約
０．０１μＭであり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＬＰＳ場合には０．１μ
Ｍであり、Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
由来のＬＰＳの場合には０．５μＭである。ＬＦ−２７、ポリミキシンＢおよび
ヒト血清がエンドトキシン誘発性ＴＮＦ−α分泌に及ぼす影響について、比較例
として表３に示す。異なるタイプのエンドトキシンによって誘発されるＴＮＦ−
α分泌を抑制する際に、ＬＦ−３３はポリミシンＢよりもわずかに高い効能を示
したが、一方で等モル濃度のＬＦ−２７または１０％ヒト血清は、エンドトキシ
ン誘発性ＴＮＦ−α分泌に対しては全く効果はなかった。

【００７８】表３：ＲＡＷ２６４．７細胞＋による、エンドトキシン誘発性ＴＮＡＦ−α分
泌における抗エンドトキシン性物質による抑制

【表３】 ^＊不対ｔ−検定においてＬＰＳ対照と比較して、片側Ｐ値が＜０．０５である
。＋エンドトキシンを、ＲＡＷ２６４．７細胞に被曝させる前に、表中に示す濃
度の試験物質と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。

【００７９】ＬＦ−３３によるエンドトキシン誘発性ＴＮＦ−α分泌の抑制に対してヒト血清が及ぼす影響より生理学的な条件下で、エンドトキシン誘発性ＴＮＦ−α分泌量の抑制を調
べる目的で、ＬＦ−３３またはポリミキシンＢを、エンドトキシンを加える前に
、ヒト血清に加えた（最終濃度は１０％）。表４に示す通り、血清の影響はＬＦ
−３３の濃度を増加することによって克服することができるにも関わらず、ポリ
ペプチドの抑制効果は１０％ヒト血清の存在下では実質的に減少した（表４およ
び図８）。しかしながら、血清を加える前に、ポリペプチドをエンドトキシンと
５分間、混合するならば、ポリペプチドによるエンドトキシンの中和に対して血
清が及ぼす影響は、非常に減少した（表５)。

【００８０】表４：１０％ヒト血清を含有する培地中での、ＲＡＷ２６４．７細胞による、エ
ンドトキシン誘発性ＴＮＡＦ−α分泌における抗エンドトキシン性ポリペプチド
による抑制

【表４】 ^＊不対ｔ−検定においてＬＰＳ対照と比較して、片側Ｐ値が＜０．０５である
。＋エンドトキシンを、ＲＡＷ２６４．７細胞に被曝させる前に、１０％ヒト血
清を含有する培地中で、表中に示す濃度のポリペプチドと一緒に３７℃で１時間
インキュベートした。

【００８１】表５：１０％ヒト血清を含有する培地中での、ＲＡＷ２６４．７細胞による、エ
ンドトキシン誘発性ＴＮＡＦ−α分泌における抗エンドトキシン性ポリペプチド
による抑制：血清と混合する順序の効果

【表５】 ^＊不対ｔ−検定において対照と比較して、片側Ｐ値が＜０．０５である。 ^＊＊不対ｔ−検定において「１番目が血清」である表示した群と比較して、片
側Ｐ値が＜０．０１である。

【００８２】ガラクトサミンにより感作したマウスモデルにおける、エンドトキシン誘発性の死亡率および血清ＴＮＦ−αレベルに対してＬＦ−３３が及ぼす影響マウスはエンドトキシンに対して典型的に耐性である。しかしながら、エンド
トキシンに対するマウスの感受性は、肝臓に特異的なインヒビターであるガラク
トサミンと一緒に注入することによって、１０００倍よりも大きく増大すること
ができる（Freudenberg M．A．およびC．Galanosによる、Infect．Immun．59：2
110−2115（1991）；GalanosらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA 76：5939−5
943（1979）)。インビボモデルにおけるこの本質的な特徴は、全身放出性のＴＮ
Ｆ−αが、ＴＮＦ−αによって媒介される肝臓細胞の死による肝臓の損傷（これ
は、死亡率を測定することによってスコアすることができる）を引き起こすこと
である。動物当り、Ｅ．ＣｏｌｉＬＰＳの１２５ｎｇを腹膜内注入することに
より、ガラクトサミンによって感作されたマウスにおいてはほとんど１００％の
死亡率が誘発された。表６に示す通り、エンドトキシンによって誘発される死亡
率は、ＬＦ−３３を注入することによって著しく低下した。少量のＬＦ−３３（
動物当り、２．５μｇ）をエンドトキシンと同時に注入した場合には、死亡率は
９３％（１５中、１４が死亡）から６％（１５中、１が死亡）まで低下した。加
えて、エンドトキシンの腹膜内注入（ｉ．ｐ．）の１０分後に、ＬＦ−３３を筋
肉内注入（ｉ．ｖ．）することによっても、死亡率は有意に減少した（表６）。
但し、４０倍より多い量のＬＦ−３３を必要とした。該保護作用は、マウスの血
清ＴＮＦ−αレベルの低下と関連した（表６）。

【００８３】表６：ガラクトサミンによって感作されたマウスモデルにおける、ＬＰＳによる
死亡率から、ＬＦ−３３によって動物を保護する作用

【表６】 ^＊群（１）〜（４）の場合には、全物質をｉ．ｐ．注入した。一方、群（５）
および（６）の場合には、ＬＰＳおよびガラクトサミン（マウス当り、１５ｍｇ
）をｉ．ｐ．注入するが、ＬＦ−３３をＬＰＳ注入の１０分後にｉ．ｖ．注入し
た。マウスの系統はＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓ（マウス当りの重量は２０〜２２ｇであ
る）。マウス当りのｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．の全量はそれぞれ、０．５ｍＬおよ
び０．２ｍｌであった。 ^＊＊フィッシャー精密試験において群（３）と比較して、片側Ｐ値が＜０．０
１である。 ^＊＊＊不対ｔ−検定において群（３）と比較して、片側Ｐ値が＜０．０１であ
る。

【００８４】ガラクトサミン感受性化白血球減少症マウスモデルにおける菌血症致死に対するＬＦ６ｋＤａカセプシンフラグメントの作用細菌感染に対する宿主防御におけるＬＦ６ｋＤａポリペプチドの最大保護ポテ
ンシャルを、急性ガラクトサミン感受性化白血球減少症マウスモデル系において
試験することによって測定した（Bucklin et al．，J．Infect．Dis．174：1249
−1254（1996））。このモデルでは、マウスを白血球減少症にし、内因性宿主防
御系を抑制し、次いでガラクトサミン処理によってグラム陰性エンドトキシンの
作用に対して感受性にし、致死腹腔内用量の大腸菌を注射した。データ（図９に
示す）はヒトＬＦの６ｋＤａカテプシンフラグメント（１００μＭｉ.ｐ.）を
同時に注射すると、感染動物の生存率が、非処理動物における１０％からポリペ
プチド処理された動物における７０％に劇的に増加することを示している（Fish
erのExact試験を用いてone tailed Ｐ値＜０．０１）。致死からのこの救済はイ
ンビボにおけるポリペプチドの保護ポテンシャルを説明するものであり、これは
その組み合わされた抗微生物性および抗エンドトキシン性によるものである可能
性がある。この結果はこのポリペプチドが治療物質としての有意な有用性を有す
ることを示す。

【００８５】抗微生物ポリペプチドの抗放線菌活性放線菌（ミコバクテリア）属の細菌には、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ
．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｂｏｖｉｓおよび他のものが含
まれる。これらの微生物は人類史上最も恐れられている疾患のうち２つ；結核お
よびハンセン病の原因である。放線菌は通常、脂質含量に富む複雑な化学組成を
有する厚い細胞壁を有し、これがこれらの微生物に独特な性質、特に多くのタイ
プの抗生物質に対する有意な耐性を付与している。ＬＦ派生ポリペプチドが放線
菌の生育を阻害するかどうかを測定する実験をおこなった。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔ
ｉｓの等密度の培養を、ＬＦ−３３（５０μＭ最終濃度）の存在または不存在下
で１６時間生育させ、得られた生存細胞を測定した。結果（表７に示す）はＬＦ
−３３の存在により平均９４％の殺生を示した。補足的実験では、Ｍ．ｓｍｅｇ
ｍａｔｉｓの培養を、１０、２０、３０、４０、５０または１００μＭのいず
れかのＬＦ−３３の存在下で生育させた後、得られたせ生存細胞を測定した。結
果（図１０に示す）はＬＦ−３３ポリペプチドによる用量依存の放線菌生育阻害
を示した。この３３量体は１０μＭまでの抗放線菌ＭＩＣ値を示し、５０μＭの
濃度で約９４％の殺生を示した。

【００８６】これらの実験は、抗微生物ＬＦポリペプチドの代表的メンバーである、この３
３量体が放線菌の生育を阻害することを示す。これらの実験は生育の速いＭ．ｓ
ｍｅｇｍａｔｉｓＢＨ１種を用いて行ったが、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
のＨ３７Ｒａ株を用いても同様の結果が得られた。ＬＦ−３３による放線菌の予
測不能な阻害は、これらの微生物の普通でない蝋質性、低浸透性を考慮すると驚
くべきことである。表７：ＬＦ−３３の抗放線菌活性

【表７】

【００８７】本発明の方法免疫試薬ヒトＬＦのＮ末端に対する抗体は、成熟型ヒトＬＦの最初の１７残基の多重抗
原性ポリペプチド型（a multiple antigenic polypeptide form, Ｊ．Ｔａｍ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５４０９−５４１３（１
９８８））で免疫化したウサギから作成した。この配列は、塩基性アミノ酸の２
個のクラスターのうちの一番目を含み、これは同時にＬＦが、ヘパリンのような
アニオン性多糖類と結合するのに必要とされる（Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３６６１−７（１９９４））。こ
れらの抗体は、そのＮ末端を含むが、ヒトトランスフェリンまたはそのタンパク
質分解フラグメントを含むいずれの他の試験ポリペプチドとも交差反応していな
い無傷のＬＦおよびフラグメントを免疫ブロットする。この抗体を、担体として
の１％アルブミンおよび膜ブロッキング物質を含む緩衝化塩水中で１：３，００
０希釈された抗血清として免疫ブロッティング用に用いた。二次抗体は、Kirkeg
aard ＆ Perry Laboratoriesのアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ウ
サギＩｇＧであり、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出系を用いたE． Harlow and D. Lane，
Eds． Antibodies：A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor， NY（1988）），chap． 12）。

【００８８】免疫ブロッティングゲル電気泳動および免疫ブロッティングに関しては標準的手法にしたがった（
E． Harlow and D. Lane， Eds． Antibodies：A Laboratory Manual （Cold Sp
ring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY（1988））。

【００８９】サンプル調製古い（Outdated）凍結ヒト初乳（colostrum）をｌｏｃａｌｍｏｔｈｅｒ’ｓ
ｍｉｌｋｂａｎｋから得た。すべての他の体液サンプルは、ｔｈｅＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙｏｆＶｉｒｇｉｎｉａＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅｓＣ
ｅｎｔｅｒのＴｉｓｓｕｅＰｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒまたは研究
室のボランティアドナーから得た。フルンケル由来の皮膚の滲出物（“ｐｕｓ”
）、歯肉プラークをかき取ったもの、唾液および喀痰サンプルは滅菌ミクロチュ
ーブに集め、プロテアーゼを阻害するための１μｇ／ｍＬロイペプチン、アプ
ロチニンおよびペプスタチンＡを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで１
×にした。サンプルバッファーは０．１％ＳＤＳおよび＋／−５％β−メルカプ
トエタノール（還元剤として）を含むものであった。これらを直ちにボイルし、
５〜２０％直線状濃度勾配ポリアクリルアミドゲルで分離するまで−８０℃で保
存した。ゲルのレーンごとにロードされた元の組織液の量はサンプルに応じて５
〜２０ｍＬであった。分離されたポリペプチドを、小さいカチオン性ポリペプチ
ドを最適に移動させるように経験的に決定されたトランスファーバッファー中、
電気泳動によってニトロセルロース膜（Millipore Corp.）に移した。Hoeffer
ＴＥ−２２ミニトランスファー装置において、０．０１％ＳＤＳ、２５ｍＭト
リス塩基および１９２ｍＭグリシンを含む３０％メタノール中、一定電圧１５０
ボルトで２時間、電気泳動によるトランスファーを行った。膜にトランスファー
されたトータルタンパク質を、Ponceau S を用いて可逆的に染色した後、写真撮
影および免疫染色を行った。Hewlet Packard ScanJet IIcx／Ｔレーザースキ
ャナーおよびイメージデンシトメトリー分析プログラム（The N．I．H．）を用
いて、免疫染色されたバンドの走査型デンシトメトリーを行った。

【００９０】細胞の単離まずＦｉｃｏｌｌ（Organon Teknika Corp．）密度勾配法（J. E．Coligan，
A． M．Kruisbeek，D．H．Margulies，E．M．Shevach and W．Strober，Eds．
Current Protocols in Immunology （John Wiley ＆ Sons，New York，NY 1991
），chap．7）によって貪食細胞の初期カルチャーを末梢ヒト血液から単離した
。混入赤血球をデキストランＴ−５００、０．９％食塩水中でディファレンシャ
ル沈降した後、低張溶解させ、好中球フラクションから除去した。Beckman Ｊ２
−２１Ｍ遠心エルトリエーター（centrifugal elutriator, Beckman Instrum
ents）において記載のように対向流遠心エルトリエーション（countercurrent c
entrifugal elutriation）を行い、リンパ球から単球をさらに単離した。すべて
の細胞実験は新たな貪食細胞の単離から３０分以内に開始した。貪食細胞の同時
培養実験では、同一ユニットの血液から単離された単球および好中球を再び組み
合わせ、プール化混合物を半分ずつ２つに分け、その一方を、溶解バッファー（
１％ Triton Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤の反応混液を含むトリス緩衝
化塩水）中のプレ活性化対照として直ちに溶解した。残りの細胞を、血清を含ま
ないＲＰＭＩ培地（Life Sciences，Gaithersburg，MD）中、３７℃で５時間同
時培養し、次いで２ｍＭｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Sigma Chemicals）で活
性化した。次いで活性化された同時培養を溶解バッファー中で溶解し、界面活性
ライセートを、ＬＦフラグメントのヘパリン精製用調製物中で重層培養培地と組
み合わせた。活性化およびプレ活性化同時培養ライセート中のヘパリン結合ポリ
ペプチドを、ヘパリンクロマトグラフィー、その後の遠心によるライセートの清
澄によってバッチモードで単離した。次いで７５０ｍＭＮａＣｌによってヘパ
リン−セファロースから溶出したポリペプチドを還元条件下で電気泳動し、上記
のように免疫ブロットした。好中球および単球を別々に試験した実験では、各培
養を３時間インキュベートした後、活性化し、単球培養は内因性ＬＦを有さない
ので、これに精製ヒトミルクＬＦ５０ｍｇを補った。次いでこの培養培地を取り
出した後、細胞を、上記バッファーを含む１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解
し、培養培地および細胞抽出物から別々にヘパリン結合分子を単離した。

【００９１】ヒト初乳由来ＬＦの精製およびその抗微生物ドメインのタンパク質分解による単体分離(インビトロ) 凍結した初乳を３７℃で解凍し、４℃で１０,０００×ｇ、４０分間、遠心分
離することで脱脂した。内在するスキムミルクを二度脱脂した後、４０℃で４０
分間インキュベートし、続いてＨＣ１でｐＨ４.７に酸性化することで乳清に変
換した。そのクロットを４℃、１０,０００×ｇ、４０分間、遠心分離すること
で除去し、その上清乳清をトリス緩衝塩水ｐＨ７.４、４容量で希釈し、ＬＦを
単離するためにイオン交換クロマトグラフィーによって分画した。希釈した乳清
中のＬＦをＣＭ−Sepharose Fast Flow（Pharmacia）に固定した後、そのカラム
をリン酸緩衝塩水で徹底的に洗浄し、固定タンパク質を同じ洗浄バッファー中の
０.１５−１.０ＭＮａＣｌのイオン強度勾配で溶出した。典型的にＬＦは、お
よそ５５０ｍＭＮａＣｌで単一ピークとして溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析お
よびＮ末端アミノ酸配列決定によって均一であった。そのＬＦピークをSpeed Va
c遠心分離で４倍に濃縮した後、３０，０００ＭＷＣＯチュービング(Spectrum)
を使用し、４℃で５０ｍＭＮａＣｌに対して徹底的に透析した。ウシ脾臓カテ
プシンＤ(Sigma)で消化する前に、その透析したＬＦを１５０ｍＭＮａＣｌおよ
び５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３.５に移した後、カテプシンＤ対ＬＦの割合
１：２００(ｗ：ｗ)で、３６時間、３７℃で、消化を完了させた。ＬＦ濃度を分
光学的に２８０ｎｍ(Ｅ２８０nmlcm ０.１％＝１.０４０２を使用）で決定した
。経時的消化実験に関しては、元のＬＦ２０ｍｇ相当量の試料を、様々な指定の
時間に取り出し、ペプサチン(pepsatin)Ａ１mg／mLで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅサンプルバッファーで中で煮沸し、タンパク質分解を終了させ、経時実験が終
了し、電気泳動するまで凍結させて保存した。大量に抗微生物フラグメントを調
製するために、３６時間のＬＦ消化物を、ペプスタチンＡ−アガロースカラム(S
igma)に通し、全ての活性カテプシンＤを除去し(L.B.LarsenおよびT.E.Petersen
in Aspartic Proteinases: Structure, Function, Biology,およびBiomedical
Implications,K. Takaahashi, Ed., (Plenum Press, New York, 1995) pp. 279
−283)、貫流分画をペプスタチンＡ１ｍｇ／ｍＬで処理し、残留する全てのカ
テプシンＤ活性を阻害した。その後、その貫流物をへパリン精製用の調製物中の
炭酸水素ナトリウム、ＮａＯＨおよびＮａＣｌで生理的ｐＨおよびイオン強度に
希釈し、１ｍＭ塩化第1鉄にし、存在するかもしれない(しかし、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥまたは免疫ブロット法では検知されない)微小レベルの未消化ＬＦを鉄で飽
和させた。その後、抗微生物性ポリペプチドをへパリンセファロース(heparin S
epharose)(Pharmacia)に固定し、１５０ｍＭから１Ｍ濃度勾配ＮａＣｌで溶出し
、続いてリン酸緩衝塩水で過度にカラム洗浄した。その精製したポリペプチドを
蒸留水に対して透析した後、完全に脱水し、−８０℃で保存した。ペプシン分解
による対応フラグメントの生成は、この消化は５０ｍＭグリシン、ｐＨ３.０中
、３７℃で４時間行い、ペプシン：ＬＦの割合(ｗ：ｗ)が３：１００であること
を除いて、本質的にカテプシン消化に従って行なった。

【００９２】カテプシンＤおよびへパリンを用いたＬＦ消化ＬＦ(１０μｇ)を、１０倍モル過剰のへパリン(ブタ粘膜へパリン、ＭＷ〜７
−１５ｋＤａ Sigma Fine Chemicals）の不存在または存在下で、指定時間の間
、上記のように、ｐＨ５においてカテプシンＤで消化した。

【００９３】質量分析法ＭＡＬＤＩ質量分析(W. T. Moore, Methods Enzymol 289: 520−42(1997))は、t
he University of Michigan Medical Schoolのthe Protein and Carbohydrate S
tructure Facility，Ann Arbor，MI，またはthe American Red Crossによって、
へパリン精製した６ｋＤａカテプシンフラグメントに対して行なわれた。

【００９４】ＬＦポリペプチドに対する抗微生物アッセイ E.coli ０１１１(American Type Culture Collection ＃43887)の培養は、通
気および攪拌(225rpm)しながらダルベッコの(Dulbecco's) リン酸緩衝塩水(ｄＰ
ＢＳ)(Mediatech)中の１％バクトペプトン(ＢＰ)(Difco)中３７℃で行なった。
オーバーナイト培養液を２倍濃縮ＢＰ/ｄＰＢＳで８０００倍に希釈し、試験す
るためのポリペプチドの連続的な希釈液を含む等容量の滅菌内毒素不含蒸留水と
混合した。最終的なアッセイ容量は、オーバーナイト培養液の最終希釈液１：１
６,０００を含む１２ｍｍ×７５ｍｍポリプロピレンチューブ (Falcon）中の３
００ｍＬであり、原物の種菌〜１−２×１０^４ＣＦＵ／ｍｌを産出した。その最
終アッセイ培地は生理イオン強度、１×ダルベッコの(Dulbecco's) リン酸緩衝
塩水中の１％バクトペプトンであった。培養を上記のように通気しながら３７℃
で６時間生育させた後、セル濃度をそれぞれのアッセイ培養チューブに関してＣ
ＦＵ／ｍｌを測定することで決定した。それぞれのアッセイチューブの連続希釈
液をLuria Broth バクトアガーにまき、３７℃で２４時間インキュベートし、コ
ロニーを計数した。全てのアッセイを３回行ない、それぞれの阻害剤の濃度に関
して標準偏差を計算した。初期培養濃度および６時間培養期間終わりの培養濃度
も全てのポリペプチド阻害剤を含まない３回培養から決定した。非処理の培養は
典型的には、これらのアッセイ条件下、６時間で１−２×１０^８ＣＦＵ／ｍｌに
生育した。

【００９５】ＬＦポリペプチド存在下でのＥ.ｃｏｌｉ生育の時間的経過Ｅ.ｃｏｌｉセル、臨床分離株０１１１をＡＴＣＣから獲得した。慣例どおり
、１％ＢＰ／ＰＢＳ（リン酸緩衝塩水“ＰＢＳ”（Mediatech Inc.，Herndon，
VA）中で生理イオン強度に調製した１％バクトペプトン（Difco Laboratorie
s，Detroit，ＭＩ））、ｐＨ７.４中、攪拌（シェイク）(２２０rpm)することで
通気しながら培養を３７℃、オーバーナイトで生育させた。オーバーナイト培養
液を５０μＭの指定のポリペプチドを含む１％ＢＰ/ＰＢＳ中、１：２０希釈し
、指定の時間、インキュベートした。培養の生育を分光測定により、それぞれの
指定時点で６００ｎｍでの光学密度を測定することによって監視した。

【００９６】ＬＦポリペプチド存在下でのＥ.coli ０１１１セルの用量応答Ｅ.coliを、様々な濃度のポリペプチド３３量体または関連した２７量体の存
在下で５時間、上記のように培養した。培養の生育の阻害を前に記載のように分
光測定で決定した。

【００９７】ＬＦポリペプチドによるリファンピシンの増強Ｅ.coli ０１１１を上記のようにオーバーナイトで生育させた。その後、オー
バーナイト培養液を記載のように、０.９μｇ／ｍｌリファンピシン（Sigma−A
ldrich Fine chemicals）および５μＭＬＦポリペプチドを含む１％ＢＰ／Ｐ
ＢＳ中で１：１６，０００希釈した。対照培養はいずれのポリペプチドにも暴露
されていないものであった。その後、その希釈した培養液を攪拌することで通気
しながら、３７℃で６時間インキュベートした。その後、生存するバクテリアの
数を、各群由来の試料を希釈してプレートにまき、その後コロニー形成単位(Ｃ
ＦＵ)を計数することで決定した。すべての値は、独立した２回の実験の平均で
表す。

【００９８】ＬＦ−３３の抗ミコバクテリア分析ミコバクテリアの培養液、Ｍ. smegmatis ＢＨ１を７Ｈ９ブロス（American
Type Culture Collection Culture Medium １５０７， Supplemented
Middlebrook ７Ｈ９ Broth）中、対数増殖期まで初期培養し、培養液濃度を分
光測定法（６００ｎｍでの光学密度，Ｏ.Ｄ.０.２３＝１０^８セル）で決定した
。その後、培養液を７Ｈ９ブロスで２×１０^４ＣＦＵ／ｍｌに希釈した後、希釈
した細胞群(〜１０^４ＣＦＵ)５７０μｌをＬＦ−３３ポリペプチドの濃縮した保
存溶液３０μｌと混合し、培養培地中のポリペプチドの最終濃度を指定の通りに
した(表７に関しては５０μＭ、図１０に関しては可変)。その後、培養液を３７
℃で１６時間インキュベートした後、５０μｌを取り出し、連続希釈して７Ｈ９
アガロースプレート上にまき、従来のコロニー平板分離法（colony plating met
hod）によって生存細胞数を決定した。

【００９９】抗微生物活性におけるイオン強度効果の決定前記と同様にして微生物を一夜培養した。次いで、４ｍＭの重炭酸ナトリウム
で緩衝し、５０μＭ〜１Ｍの種々の濃度の塩化ナトリウムを補足した１％ＢＰに
て、一夜培養物を１：１６０００に希釈した。またポリペプチド処理した培養物
には２５μＭの６ｋＤａのＬＦポリペプチドを加えたが、同じ塩濃度の対照培養
物には、ポリペプチドを加えなかった。通気しながら６時間成長した後、各グル
ープからのサンプルを希釈平板培養し、続いてＣＦＵを計数することによって、
生存能力のある細菌の数を決定した。培養物の成長における塩単独の効果を対照
するために、同じ塩濃度で成長させるが、どのようなポリペプチド処理もしてい
ない非処理培養物に対するポリペプチド処理した培養物のＣＦＵの比率を、試験
した各塩濃度について計算した。次いで、試験したなかで最も低い塩濃度である
５０μＭで測定したＣＦＵについて計算した比率に対し、これらの値を標準化し
、Ｙ軸にプロットし、塩濃度の増加をＸ軸にプロットした。したがって、Ｙ軸は
、５０μＭのＮａＣｌにおける抗微生物活性に相対する、試験したＮａＣｌの各
濃度における６ｋＤａのポリペプチドの成長阻害効果を示す。図は、サブ生理学
的イオン強度条件（＜１５０ｍＭのＮａＣｌなど）についての結果の半対数プロ
ットを示す。

【０１００】ポリペプチド他文献[Mannら、J.Biol.Chem.、269：23661-7（1994）]に記載された慣例のＦ
ｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学によって３３量体
および２２量体のポリペプチドを合成した。ヒトラクトフェリンのＮ末端の第１
の３３残基に対応する３３量体のポリペプチド（ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＣＡＶＳＱ
ＰＥＡＴＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰ）をＬＦ−３３（分子量４００４）と
して設計する。２７量体ポリペプチド、ＬＦ−２７（分子量３２７６）は、対応
するＬＦ−３３のＮ末端から６残基を欠いたものである。Ｃ末端をメチオニンま
で切断する標準的臭化シアノゲン切断によって、Ｇｌｙ−１からＭｅｔ−２７残
基を表すＰｈｅ２６量体を作成した。本実験と比較する対象としてポリミキシン
Ｂ（分子量１０６６、シグマ、セントルイス、ＭＯ）、抗エンドトキシンポリペ
プチド（Cooperstock,M.S.、Antimicrob.Agents Chemother.、６：４２２−４２
５（１９７４））を用いた。

【０１０１】ＬＰＳ大腸菌由来の対照標準エンドトキシン（アソシエイツ・オブ・ケープ・コッド
・インコーポレイテッド、ウッズ・ホール、ＭＡ）は、ｎｇ当たり１０エンドト
キシンユニット（ＥＵ）の能力を持っていた。Neisseria meningitidis由来のＬ
ＰＳ（＞９９％純度）をＢグループの菌株＃６２７５から調製したが、その能力
は２５ＥＵ／ｎｇであった。大腸菌Ｋ１２由来のリピドＡ（リスト・バイオロジ
カル・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド、キャンベル、ＣＡ）の能力は、
８．６ＥＵ／ｎｇであった。Pseudomonas aeruginosa由来のＬＰＳ（シグマ）の
能力は、０．１２ＥＵ／ｎｇであった。上記エンドトキシンの能力は、リムルス
(limulus)酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ、４３）により、米国薬局
方参照標準エンドトキシンＥＣ−５と比較して決定した。

【０１０２】抗エンドトキシン剤の５０％エンドトキシン中和濃度（ＥＮＣ_５０）の決定のためのリムルスＥＬＩＳＡ簡単にまとめると、２５μlのエンドトキシン溶液（２００ＥＵ／ｍｌ）を、
０．１５ＭのＮａＣｌにて一連の２倍希釈を行った等体積の試験材料と、９６ウ
ェルの組織培養プレート（ヌンク・アクチセル・スカベット、ロスキルデ、デン
マーク）にて混合し、乾燥気流インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベ
ートした。エンドトキシンフリーの水で反応混合物を１０００倍に希釈した。次
いで、エンドトキシン活性をリムルスＥＬＩＳＡによって定量した[Zhangら、J.
Clin.Microbiol.、３２：４１６−４２２（１９９４）]。リムルスＥＬＩＳＡに
おいて、エンドトキシンは、１ｐｇまたは０．０１エンドトキシンユニット（Ｅ
Ｕ）／ｍｌ以下の濃度でＬＡＬ凝固を活性化した[Zhangら、J.Clin.Microbiol.
、32：416−422（1994）]。アッセイの感受性が高いことにより、非常に低濃度
のエンドトキシン活性を検出することができた。試験材料とエンドトキシンをイ
ンキュベートした後、１０００倍希釈を行って、ＬＡＬ酵素系における試験材料
の能力を終結させた。実験に用いたそれらの最高濃度から１０００倍希釈した後
、血清もこれらの材料のいずれも、ＬＡＬアッセイ自体の酵素カスケードを妨害
しなかった。各アッセイについて、エンドトキシン濃度と４９０ｎｍにおける光
学密度（ＯＤ_４９０）が直線関係にある最適条件下でＬＡＬ−エンドトキシン反
応を行った。ＯＤ_４９０と抗エンドトキシン性物質の対数濃度の間には、通例、
Ｓ字曲線が得られた。該曲線の中点に対応する濃度をＥＮＣ_５０と名づけた。

【０１０３】ＲＡＷ２６４．７細胞によるエンドトキシン誘発性ＴＮＦ−α分泌マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７をアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ）から入手し、先行文献の記
載にしたがって維持した[Jeremy,B.、Immunol.Today、16：417−419（1995）]。
すべての緩衝液および培地中のエンドトキシンの濃度は、０．１ＥＵ／ｍｌ以下
に対照した。以下のプロトコルは本質的に先行文献に記載されたものであり、わ
ずかな変更を加えてここに使用した[Kellyら、Infect.Immun.、59：4491−6(199
1）]。９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに、１０％加熱処理ウシ胎児血清
（ライフ・テクノロジーズ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸；ｐＨ７．３）、ペニシリン（６０
Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（６０μｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥＭ１
ｍｌ当たり細胞１０^６個という濃度のＲＡＷ２６４．７細胞を１５０μlずつ植
えた。６％ＣＯ_２のインキュベーターで３７℃にて一夜インキュベートした後、
培地を吸引し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳを補足したエンドトキシンフリーのハンク
スの平衡塩類溶液（ｐＨ７．３）（ＨＢＳＳ、ライフ・テクノロジーズ）で３回
細胞を洗浄した。対照エンドトキシン（１０ｎｇ／ｍｌ）および試験材料をＨＢ
ＳＳ−ＨＥＰＥＳ中で調製した。３７℃の水浴にて１時間インキュベートした後
、各ウェルにこれらの溶液０．２ｍｌを３回加え、３７℃にて６時間インキュベ
ートした。次いで、上清を集め、ＴＮＦ−αの活性を測定するまで−７０℃にて
貯蔵する。対照はＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳおよび試験材料のみを含み、エンドトキ
シンを含まなかった。培地および試験材料のＴＮＦ−α活性は１６０ｐｇ／ｍｌ
以下であった。幾つかの実験に用いたヒト血清は、正常なドナーからのプールで
あった。

【０１０４】ＴＮＦ活性の測定培養上清中のＴＮＦ−α活性をマウス線維肉腫細胞株ＷＥＨＩ１６４細胞(
ＡＴＣＣ)の細胞毒性に基づいて測定した。この細胞株は、通常用いられるＬ９
２９線維芽細胞よりＴＮＦ−αに対して４倍感受性が高く、培地中へのアクチノ
マイシンＤ(Life Technologies)含有によりさらに５倍に増大することが観察さ
れている(M.R. RuffおよびG.E. Gifford, Lymphokines 2: 235-272(1981))。こ
の試験において、活性ＴＮＦ−αの濃度は、ＴＮＦ−αに対する暴露によって起
る細胞死と相関関係にあった。細胞死は生菌染色ＭＴＴ法(３−(４,５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)法(Mosm
ann, T., J. Immunol. Methods 65: 55-63(1983))により、比色定量により測定
した。この試験の特異性はウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体(Genzyme, Inc., MA)
を用いることによって立証された。１：１００の希釈のこの抗体は、エンドトキ
シンによって刺激されたＲＡＷ２６４.７細胞の培養上清中およびエンドトキシ
ンの腹腔内注射１時間後に採取されたマウス血清内の細胞毒性を完全に除去した
。

【０１０５】要約すれば、９６−ウエル組織培養プレートに、１０％加熱処理牡牛胎児血清
、２５mM ＨＥＰＥＳ(pＨ７.３)、ペニシリン(６０U/ml)、ストレプトマイシン
(６０μg/ml)およびアクチノマイシンＤ(４μg/ml)を含有するＲＰＭＩ−１６４
０培地(Life Technologies)中ＷＥＨＩ１６４細胞１００μl (５×１０⁴細胞)
を播種した。３７℃にて６％ＣＯ₂インキュベーター中で２時間インキュベート
した後、１０μlの２倍連続希釈試料(培養上清)または標準品(ネズミ組換えＴＮ
Ｆ−α、Genzyme)を各ウエルに添加し、２０時間インキュベートした。ついで、
細胞の生存をＭＴＴ(Thiazolyl blue, Sigma)貯蔵液(生理食塩水中5mg/ml)１０
μlを各ウエルに添加して確認し、インキュベートを６時間継続させた。酸性−
イソプロパノール(４０mM ＨＣl含有)１８０μlを添加して生成した暗青色の結
晶を溶解させた。マイクロプレートリーダーで基準の６３０nmとともに５７０nm
にてプレートを読み取った。播種細胞の５０％死滅に至るＴＮＦ−αの量を１ユ
ニットと定義し、この条件下では組換えＴＮＦ−α約１５pgに等しい。標準曲線
をＷＥＨＩ細胞とともに組換えＴＮＦ−αの既知量をインキュベートすることに
よって得た。

【０１０６】ＬＦ−３３の潜在的な細胞毒性を除くため、上記の方法は、ＷＥＨＩ１６４
細胞をＲＡＷ２６４.７細胞に置換え、各ウエルに播種された細胞の濃度を培地
１５０μl当たり１.５×１０⁵細胞にした以外は刺激実験の条件を模倣して行な
った。この研究に用いられたＬＦ−３３(１０μM)の最も高い濃度で、ＲＡＷ２
６４.７細胞に対する細胞毒性は検出されなかった。

【０１０７】ガラクトサミン−増感マウスモデル０.１５MＮaＣl０.５ml中Ｅ.coli ＬＰＳ１２５ngおよびガラクトサミン塩
酸塩(Sigma)１５mgの腹腔内注射により８〜１０週令雌マウスＮＩＨ／スイス(体
重２０−２５g／匹)にほぼ１００％の死亡率をもたらした。ＬＦ−３３はいずれ
も尾静脈から、ＬＰＳ−ガラクトサミン混合物の腹腔内注射１０分後に注射する
か、またはＬＰＳおよびガラクトサミンとともに腹腔内に同時注射した。死亡率
を注射７２時間後観察した。ＴＮＦ−α血清濃度の測定に関する実験では、血液
試料を血清分離管(Becton Dickinson, Rutherford, NJ)内に注射６０−９０分後
採取し、遠心分離後血清を得た。ＴＮＦ−α血清濃度は上記の細胞毒性試験によ
って測定した。ＴＮＦ−αの最高血清濃度は、ＬＰＳの腹腔内注射後６０−９０
分後に観察した。

【０１０８】統計すべてのエンドトキシンおよびＴＮＦ−α測定は各実験においてトリプ
リケートで行なった。各データにつき少なくとも２つの独立した実験を行なった
。測定値は平均値＋/−ＳＤとして示し、独立スチューデントｔ検定を用いて比
較した。死亡率はフィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。

【０１０９】ガラクトサミン−増感、白血球減少症マウスモデル系の産生ＣＦ−１マウス
を、Ｅ.coli ０１１１のＬＤ₉₀投与量による注射の致死効果に対するガラクト
サミン−増感の３日前にシクロホスファミド処置によって免疫無防備状態にした
(Bucklinら、J. Infect. Dis. 174: 1249-1254(1996))。これらの条件下、循環
白血球は８５％減少し、ＬＤ₉₀は５×１０³ＣＦＵＥ.coliであると確認された
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、カテプシンＤ（四角）またはペプシン（丸）によりヒト
ＬＦのN末端から得られ、ヘパリン−精製された６ｋＤａのポリペプチドの用量
を変化させることによるＥ．ｃｏｌｉ増殖の阻害を図式的に示す。すべてのポイ
ントは三系の平均値を示し、標準偏差のバーはシンボルよりも小さい。

【図２】図２は、５０μＭのＬＦまたはN末端２７量体、２６量体、３３
量体ＬＦポリペプチドフラグメントの存在下における７時間にわたるＥ．ｃｏｌ
ｉ０１１１の増殖曲線である。

【図３】図３は、ＬＦのN末端のアミノ酸配列に対応する、異なる濃度の
３３量体または２７量体ポリペプチドの存在下における５時間目のＥ．ｃｏｌｉ
０１１１の増殖を図式的に示す。

【図４】図４は、カテプシンにより得られる６ｋＤａのＬＦポリペプチド
フラグメントの抗微生物活性に対するイオン強度の影響を図式的に示す。

【図５】図５は、ポリペプチド、６ｋＤａＬＦフラグメント、３３量体
、および２７量体の、リファンピシリンの抗微生物活性を増強する能力を図式的
に示す。

【図６】図６は、示された濃度の６ｋＤａ宿主防御ポリペプチド、３３量
体、２７量体、ＬＦおよびポリミキシンＢの、単離リピドＡのエンドトキシン活
性を中和する能力を図式的に示す。

【図７】図７は、エンドトキシンにより誘導された単核白血球細胞系ＲＡ
Ｗ２６４．７によるＴＨＦ−α分泌のＬＦ−３３（３３量体）による用量―依
存的抑制を図式的に示す。１０ｎｇ／ｍｌのエンドトキシンを示された濃度のＬ
Ｆ−３３とともに３７℃で１時間インキュベーションし、ついで、ＲＡＷ２６
４．７細胞に曝露した。データは、典型的な実験における三系の平均値である。

【図８】図８は、ヒト血清存在下における、エンドトキシンにより誘導さ
れたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−α分泌のＬＦ−３３による用量−依
存的抑制を図式的に示す。１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＬＰＳを示された濃
度のヒト血清およびＬＦ−３３とともにインキュベーションし、ついで、ＲＡＷ
２６４．７細胞に曝露した。データは、典型的な実験における三系の平均値で
ある。

【図９】図９は、細菌感染に対する宿主防御における６ｋＤａＬＦのイ
ンビボ防御能をダイヤグラム的に示す。

【図１０】図１０は、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａであるＭ．ｓｍｅｇｍａ
ｔｉｓＢＨ１の増殖に対する種々の濃度のＬＦ−３３（３３量体）の抗微生物
効果をダイヤグラム的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/496 Ａ６１Ｋ 31/496 ４Ｃ０８６ 38/00 Ａ６１Ｐ 31/00 ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 31/00 31/04 31/04 31/06 31/06 31/08 31/08 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＤＣ１２Ｎ 5/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B018 MD20 ME09 4B021 MC01 MK23 4B035 LC09 LK19 LP21 LP25 4B065 AA87X AA90Y BA30 BD39 CA24 CA41 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA03 CA62 DC50 MA02 NA14 ZB351 ZB352 4C086 AA01 AA02 BC17 CB22 MA01 MA02 MA04 MA07 NA05 ZB35 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 EA01 EA20 FA70 GA30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２−Ｒ２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、Ｒ２は少なくとも-０.１７４の総平均親水性値および少なくと
も９７.１４の脂肪族係数を有する１から１７のアミノ酸であり、ポリペプチド
のアミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成する）。
【請求項２】Ｒ２がＰＶＳＣＩＫＲＤＳＰＩＱＣＩＱＡＩＡである、請求
項１の単離ポリペプチド。
【請求項３】Ｂ１がＧＲＲＲＳおよび少なくともＲＲを保持するその末端
切除体である、請求項１の単離ポリペプチド。
【請求項４】Ｂ２がＭＲＫＶＲＧである、請求項１の単離ポリペプチド。
【請求項５】配列番号２を含む、請求項１の単離ポリペプチド。
【請求項６】グルタメート１６の代わりに置換された中性電荷アミノ酸を
有する、請求項５の単離ポリペプチド。
【請求項７】グルタメート１６の代わりに置換されたグリシンを有する、
請求項６の単離ポリペプチド。
【請求項８】グルタメート１６の代わりに置換された疎水性アミノ酸を有
する、請求項５の単離ポリペプチド。
【請求項９】グルタメート１６の代わりに置換されたバリンを有する、請
求項８の単離ポリペプチド。
【請求項１０】グルタメート１６の代わりに置換されたアラニンを有する
、請求項８の単離ポリペプチド。
【請求項１１】下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨
格を形成し、配列番号１のポリペプチドが特異的に除外されている）。
【請求項１２】Ｂ１がＧＲＲＲＳおよび少なくともＲＲを保持するその末
端切除体である、請求項１１の単離ポリペプチド。
【請求項１３】Ｂ２がＭＲＫＶＲＧである、請求項１１の単離ポリペプチ
ド。
【請求項１４】グルタメート１６の代わりに置換された中性電荷アミノ酸
を有する、請求項１１の単離ポリペプチド。
【請求項１５】グルタメート１６の代わりに置換されたグリシンを有する
、請求項１４の単離ポリペプチド。
【請求項１６】グルタメート１６の代わりに置換された疎水性アミノ酸を
有する配列番号１を含む、請求項５の単離ポリペプチド。
【請求項１７】グルタメート１６の代わりに置換されたバリンを有する、
請求項１６の単離ポリペプチド。
【請求項１８】グルタメート１６の代わりに置換されたアラニンを有する
、請求項１６の単離ポリペプチド。
【請求項１９】抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体であって
、配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のアミノ酸を切
除されたフラグメントを含み抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体の
アミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成し、機能性変異体は位置
２、３、４、５、２８、２９、３１、３９、４０の塩基性残基；位置７、９、１
０、１１、１２、１７、１８、２０、２１、２３、３２、３５、３７、３８、４
４、４６、４７、４９、５０の疎水性残基；位置１６、４１の酸性残基の存在に
より特徴つけられ、配列番号１のポリペプチドが特異的に除外されている抗微生
物性ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２０】中性電荷アミノ酸置換を位置１６および/または位置４１
で有する、請求項１９の抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２１】中性電荷アミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、請求項２
０の抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２２】２以下のアミノ酸がＮ末端から切除されている、請求項１
９の抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２３】エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異
体であって、配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のア
ミノ酸を切除されたフラグメントを含み抗微生物性ポリペプチドまたはその機能
性変異体のアミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成し、機能性変
異体は位置２、３、４、５、２８、２９、３１、３９、４０の塩基性残基；位置
７、９、１０、１１、１２、１７、１８、２０、２１、２３、３２、３５、３７
、３８、４４、４６、４７、４９、５０の疎水性残基；位置１６、４１の酸性残
基の存在により特徴つけられ、配列番号１のポリペプチドが特異的に除外されて
いる、エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２４】中性電荷アミノ酸置換を位置１６および/または位置４１
で有する、請求項２３のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変
異体。
【請求項２５】中性電荷アミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、請求項２
４のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体。。
【請求項２６】２以下のアミノ酸がＮ末端から切除されている、請求項２
３のエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体。
【請求項２７】第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの融合により得ら
れる融合タンパク質であって、第１ポリペプチドはエンドトキシン中和化ポリペ
プチドまたはその機能性変異体であり、エンドトキシン中和化ポリペプチドは配
列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のアミノ酸を切除さ
れたフラグメントを含み抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体のアミ
ノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成し、機能性変異体は位置２、
３、４、５、２８、２９、３１、３９、４０の塩基性残基；位置７、９、１０、
１１、１２、１７、１８、２０、２１、２３、３２、３５、３７、３８、４４、
４６、４７、４９、５０の疎水性残基；位置１６、４１の酸性残基の存在により
特徴つけられ；第２ポリペプチドは細胞によりエンドサイトーシス・クレアラン
ス経路を経て認識され取り込まれるタンパク質ドメインを含む、融合タンパク質
。
【請求項２８】エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異
体が配列番号２のＮ末端から切除されている２以下のアミノ酸を有する、請求項
２７の融合タンパク質。
【請求項２９】エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異
体が電荷中和化アミノ酸置換を位置１６および/または位置４１に有する、請求
項２７の融合タンパク質。
【請求項３０】個体の微生物感染による疾患を治療または予防する医療方
法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のアミノ酸を
切除され，かつそのＮ末端から２以下のアミノ酸を切除されたフラグメントを含
む抗微生物性ポリペプチドまたはその抗微生物性ポリペプチドの機能性変異体を
準備し、なお抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体のアミノ酸は結合
して単一の連続的アミド結合骨格を形成している、ｂ）個体に抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異体の医療量を投与する
、ことを含む医療方法。
【請求項３１】微生物感染が細菌感染である、請求項３０の医療方法。
【請求項３２】細菌感染が個体において細菌性敗血症を起こす、請求項３
０の医療方法。
【請求項３３】抗微生物性ポリペプチドがエンドトキシン中和化ポリペプチ
ドとしても機能する、請求項３２の医療方法。
【請求項３４】微生物感染がミコバクテリウムにより起こされる、請求項
３１の医療方法。
【請求項３５】疾患が結核またはらい病である、請求項３４の医療方法。
【請求項３６】微生物感染が真菌感染である、請求項３０の医療方法。
【請求項３７】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸である）を含む、請求項３０の医療方法。
【請求項３８】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２−Ｒ２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、Ｒ２は少なくとも-０.１７４の総平均親水性値および少なくと
も９７.１４の脂肪族係数を有する１から１７のアミノ酸である）を含む、請求項３０の医療方法。
【請求項３９】機能性変異体が位置２、３、４、５、２８、２９、３１、
３９、４０の塩基性残基；位置７、９、１０、１１、１２、１７、１８、２０、
２１、２３、３２、３５、３７、３８、４４、４６、４７、４９、５０の疎水性
残基；位置１６、４１の酸性残基の存在により特徴つけられる、請求項３０の医
療方法。
【請求項４０】患者における抗微生物性薬物の医療作用を強化する方法で
あって、ａ）抗微生物性薬物と、配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２
０以下のアミノ酸を切除され，かつそのＮ末端から２以下のアミノ酸を切除され
たフラグメントを含む単離ポリペプチドまたはその機能性変異体とを準備し、な
お、単離ポリペプチドまたはその機能性変異体のアミノ酸は結合して単一の連続
的アミド結合骨格を形成している、ｂ）患者に、ａ）工程の抗微生物性薬物および単離ポリペプチドまたはその機能
性変異体の医療量を投与する、ことを含む方法。
【請求項４１】抗微生物性薬物が抗生物質である、請求項４０の方法。
【請求項４２】抗生物質がリファンピシンまたはその誘導体である、請求
項４１の方法。
【請求項４３】抗生物質がイソニアチドまたはその誘導体である、請求項
４１の方法。
【請求項４４】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸である）を含む、請求項４０の方法。
【請求項４５】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２−Ｒ２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、Ｒ２は少なくとも-０.１７４の総平均親水性値および少なくと
も９７.１４の脂肪族係数を有する１から１７のアミノ酸である）を含む、請求項４０の方法。
【請求項４６】機能性変異体が位置２、３、４、５、２８、２９、３１、
３９、４０の塩基性残基；位置７、９、１０、１１、１２、１７、１８、２０、
２１、２３、３２、３５、３７、３８、４４、４６、４７、４９、５０の疎水性
残基；位置１６、４１の酸性残基の存在により特徴つけられる、請求項４０の方
法。
【請求項４７】産物においてエンドトキシンを中和する方法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のアミノ酸を
切除され，かつそのＮ末端から２までのアミノ酸を切除されたフラグメントを含
む単離されたエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体を準備
し、なお、エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異体のアミノ
酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成している、ｂ）産物を、単離されたエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変
異体に接触せしめる、ことを含む方法。
【請求項４８】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸である）を含む、請求項４７の方法。
【請求項４９】機能性変異体が下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２−Ｒ２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、Ｒ２は少なくとも-０.１７４の総平均親水性値および少なくと
も９７.１４の脂肪族係数を有する１から１７のアミノ酸である）を含む、請求項４７の方法。
【請求項５０】機能性変異体が位置２、３、４、５、２８、２９、３１、
３９、４０の塩基性残基；位置７、９、１０、１１、１２、１７、１８、２０、
２１、２３、３２、３５、３７、３８、４４、４６、４７、４９、５０の疎水性
残基；位置１６、４１の酸性残基の存在により特徴つけられる、請求項４７の方
法。
【請求項５１】産物が薬物である、請求項４７の方法。
【請求項５２】産物が生物学的産物である、請求項４７の方法。
【請求項５３】生物学的産物が食品産物である、請求項５２の方法。
【請求項５４】生物学的産物が生きている細胞を含む、請求項５２の方法
。
【請求項５５】生物学的産物が生きている細胞から誘導される、請求項５
２の方法。
【請求項５６】生物学的産物が薬物である、請求項５２の方法。
【請求項５７】患者における循環エンドトキシンを中和する医療方法であ
って、ａ）第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの融合により得られる融合タンパク
質を準備し、第１ポリペプチドはエンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその
機能性変異体であり、エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異
体は配列番号２のアミノ酸１−５１またはそのＣ末端から２０以下のアミノ酸を
切除されたフラグメントを含み、抗微生物性ポリペプチドまたはその機能性変異
体のアミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨格を形成し、機能性変異体は
位置２、３、４、５、２８、２９、３１、３９、４０の塩基性残基；位置７、９
、１０、１１、１２、１７、１８、２０、２１、２３、３２、３５、３７、３８
、４４、４６、４７、４９、５０の疎水性残基；位置１６、４１の酸性残基の存
在により特徴つけられ；第２ポリペプチドは細胞によりエンドサイトーシス・ク
レアランス経路を経て認識され取り込まれるタンパク質ドメインを含む、ｂ）患者に、工程ａ）の融合タンパク質の医療量を投与する、ことを含む医療方法。
【請求項５８】エンドトキシン中和化ポリペプチドまたはその機能性変異
体が電荷中和化アミノ酸置換を位置１６および/または位置４１に有する、請求
項５７の融合タンパク質。
【請求項５９】ラクトフェリン（ＬＦ）からの６ｋＤａ宿主防衛ポリペプ
チドのインビボ産生を、ＬＦのプロテアーゼ活性に対する感受性を増加すること
により、増す方法。
【請求項６０】プロテアーゼがアスパラギン酸プロテアーゼである、請求
項５９の方法。
【請求項６１】アスパラギン酸プロテアーゼがカテプシンＤである、請求
項６０の方法。
【請求項６２】ＬＦの感受性がＬＦのポリアニオンとの接触を経て増加さ
れる、請求項５９の方法。
【請求項６３】ラクトフェリン（ＬＦ）からの６ｋＤａ宿主防衛ポリペプ
チドのインビボ産生を、インビボプロテアーゼ活性を増加することにより、増す
方法。
【請求項６４】プロテアーゼがアスパラギン酸プロテアーゼである、請求
項６３の方法。
【請求項６５】プロテアーゼ活性を、プロテアーゼ隣接環境のｐＨを３.
５から５.０の間に調節することにより増加さす、請求項６４の方法。
【請求項６６】ＬＦ宿主防衛ポリペプチドまたはその機能性変異体のエン
ドトキシン中和化活性および抗微生物性活性を、ポリペプチド隣接環境を生理的
または準生理的イオン強度の範囲にある状態に調節することにより強化する方法
。
【請求項６７】ポリペプチド隣接環境を２００ｍＭのＮａＣｌ以下のイオ
ン強度に調節する、請求項６６の方法。
【請求項６８】ポリペプチド隣接環境を１５０ｍＭのＮａＣｌ以下のイオ
ン強度に調節する、請求項６７の方法。
【請求項６９】ポリペプチド隣接環境を５０ｍＭのＮａＣｌ以下のイオン
強度に調節する、請求項６８の方法。
【請求項７０】エンドトキシンを、配列番号６のアミノ酸１−２７を含む
ポリペプチドまたはその機能性変異体に接触せしめることを含む、エンドトキシ
ンを中和する方法。
【請求項７１】エンドトキシン中和化ポリペプチドが塩基性残基の１つの
機能性クラスターのみを含有する、請求項４７の医療方法。
【請求項７２】下記式の単離ポリペプチド：Ｂ_１−Ｒ１−Ｂ_２ (式中、Ｂ_１およびＢ_２は少なくとも２の強い塩基性アミノ酸を含む２−７のア
ミノ酸を含有するアミノ酸クラスターを示し、Ｒ１は少なくとも-０.６０９の総
平均親水性値および少なくとも３５.４５の脂肪族係数を有する１７から２１の
アミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸は結合して単一の連続的アミド結合骨
格を形成し、ポリペプチドは医薬上許容される担体とともに哺乳動物への投与の
ために製剤されている）。