JP7058560B2 - 可溶性インテイン融合タンパク質、及び生体分子を精製する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年11月3日に出願された米国仮特許出願第62/074,494号明細書及び2015年8月24日に出願された米国仮特許出願第62/209,010号明細書の利益を請求する。上記出願の教示内容全体は、参照により本明細書に組み込むものとする。
〔1〕サンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法であって、
a)ポリペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を含有するサンプルを用意するステップ;
b)第2の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップであって、前記第2の融合タンパク質は、前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、前記N-インテインポリペプチドの可溶性を促進するN-インテイン可溶化パートナーとペプチド結合により結合したN-インテインポリペプチドを含むステップ;
c)不活性インテイン複合体を含有するアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ;
d)前記インテイン複合体が活性となり、前記C-インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ;並びに
e)切断された前記標的分子を回収するステップ
を含む方法、
〔2〕前記サンプルが、粗タンパク質調製物である、〔1〕に記載の方法、
〔3〕前記標的分子が、治療標的に対するモノクローナル抗体である、〔1〕又は〔2〕に記載の方法、
〔4〕前記標的分子が、治療標的である、〔1〕又は〔2〕に記載の方法、
〔5〕前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、触媒として不活性のインテイン複合体を形成する条件が、
a)約4~25℃の範囲の温度、及び100mMトリス-HCl、25mM NaCl、0.1mM塩化亜鉛、pH=9を含むバッファー;
b)約4~25℃の温度範囲、及び50mM NaAc、0.5M NaCl、pH=5を含むバッファー;又は
c)約4~25℃の範囲の温度、及び0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、pH=8を含むバッファー
を含む、〔1〕~〔4〕のいずれか1項に記載の方法、
〔6〕前記インテイン複合体の触媒活性を促進する前記条件が、
a)50mMトリス-HCl、pH=7.0、300mM NaCl、1mM EDTAを含むバッファー;
b)0.3M L-アルギニン、5mM EDTA、50mMリン酸バッファー、pH=6.5を含むバッファー;又は
c)0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、50mM DTT、pH=8.0を含むバッファー
を含む、〔1〕~〔5〕のいずれか1項に記載の方法、
〔7〕前記N-インテイン可溶化パートナーが、約15kDa未満の分子量、60未満の脂肪族指数(Aliphatic Index)値、及び-1未満の疎水度大規模平均(Grand Average Hydropathicity)値を有する、〔1〕~〔6〕のいずれか1項に記載の方法、
〔8〕前記N-インテイン可溶化パートナーが、N-インテイン可溶化パートナー138(配列番号15)又はその変異体である、〔1〕~〔7〕のいずれか1項に記載の方法、
〔9〕前記N-インテインポリペプチドが、GP41-1N-インテイン(配列番号1)又はその変異体であり、前記C-インテインポリペプチドが、GP41-1C-インテイン(配列番号9)である、〔1〕~〔8〕のいずれか1項に記載の方法、
〔10〕後の使用のために、前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスをクリーニング、再生又は保存するステップをさらに含む、〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の方法、
〔11〕アフィニティ精製での使用に好適なインテイン複合体のスクリーニング方法であって、
a)ポリペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質と、ペプチド結合によりN-インテイン可溶化パートナーに結合したN-インテインポリペプチドを含む第2の融合タンパク質を、前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、接触させるステップ;並びに
b)インテイン活性を支持する条件下で、前記標的分子が、前記C-インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップであって、切断された前記標的分子の存在が、触媒活性インテイン複合体を示すステップ
を含む方法
に関する。
本開示をさらにわかりやすくするために、初めにいくつかの用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて記載する。別に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
インテインは、1990年に発見され、これらの分子の天然の生活環において機能するプロテアーゼ及びリガーゼ活性の両方を含む1クラスの自己触媒酵素である。インテイン試薬は、ペプチド基質の切断、連結、及び環状化に有用性を有することが見出されている。1998年、「分断インテイン」と呼ばれる新規クラスのインテインが発見され、この酵素は、N-インテイン及びC-インテイン(相補的ハーフインテイン)と呼ばれる2つの部分として天然に存在する。分断インテインは、多種多様な下等原核生物に見出されている(Zettler J.,et al.,FEBS Letters,553:909-914(2009);Dassa B.,et al.,Biochemistry,46:322-330(2007);Choi J.,et al.,J Mol Biol.556:1093-1106(2006);Caspi,et al.,Mol Microbiol,.50:1569-1577(2003);Liu X.及びYang J.,J Biol Chem.,275:26315-26318(2003);Wu H.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA.5:9226-9231(1998))が、真核生物において分断インテインは一切見出されていない(New England Biolabs(http://tools.neb.com/inbase/list.php)により維持されるインテインデータベースを参照のこと)。いずれもエクステイン配列との連結に関して、極めて高速且つかなり乱交雑である2つの分断インテインが近年明らかにされている。一方のクラスは、Npu DnaEインテイン(Iwai I.,et al.,FEBS Letters 550:1853-1858(2006);Zettler J.,et al.,FEBS Letters,553:909-914(2009))であり、他方のクラスは、メタゲノムデータから同定されたGP41分断インテイン(Carvajal-Vallejos P.,et al.,J.Biol.Chem.287:28686-28696(2012);国際公開第2013045632号パンフレット)である。
N-インテインポリペプチド及びN-インテイン可溶化パートナーを含有する本明細書に記載の融合タンパク質は、中でも、アフィニティクロマトグラフィー用途のためのリガンドとして有用である。従って、本発明は、いくつかの実施形態では、固体支持体に結合した、N-インテインポリペプチド及びN-インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを提供する。
N-インテインポリペプチドとN-インテイン可溶化パートナーを含有する本明細書に記載の融合タンパク質、及びこうした融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスは、中でも、以下に詳しく説明するように、アフィニティ精製、アフィニティ精製での使用に好適な活性分断インテイン複合体のスクリーニング方法、並びにペプチド切断及び連結方法に有用である。
4000+既知エシェリキア属(Escherichia)タンパク質のセットを使用し、以下の基準を用いて、試験のために7つの可溶化パートナー(表2を参照、配列番号11~15、19、20)を選択した:
(1)選択タンパク質は、システイン残基が欠失している;
(2)選択タンパク質は、in silicoで、大腸菌(E.coli)に過剰発現させると、可溶性であると予測された;
(3)選択タンパク質は、11kDa未満の分子量を有した;
(4)選択タンパク質は、in silicoで、分泌されないと予測されたか、又は分泌されないことがわかっていた;
(5)タンパク質相互作用に関する情報が入手可能である場合、選択タンパク質は、多量体ではなく単量体であった;
(6)タンパク質機能に関する情報が入手可能である場合、選択タンパク質は、天然では調節性又は毒性ではなかった、すなわち、主要細胞経路の制御に関与しないか、又はそれら(例えば、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ)を過剰発現する大腸菌(E.coli)の死を引き起こす傾向もなかった;並びに
(7)既知のNMR又はX線結晶構造を有するタンパク質が優先された。
可溶化パートナー候補46、206及び246のコード配列を担持するプラスミド構築物を、NINTΔA_CCのアミノ又はカルボキシ末端アミノ酸のいずれかを介して、NINTΔA_CCのコード配列と融合させた後、DNA2.0からのpJ414のバージョンに挿入した。これらの構築物を、従来の方法を用いて、コンピテントBL21DE3大腸菌(E.coli)細胞に形質転換した後、アンピシリン抵抗性コロニーを単離した。SDSポリアクリルアミド電気泳動(SDS PAGE)を用いて、予想サイズのタンパク質の産生を確認した。
各構築物について発現収率及び可溶性:不溶性比を決定するために、前述の通り培養した同等のバイオマスに対応する増殖培養物のアリコートを4℃、5000gで15分間遠心分離した。培養物上澄みを廃棄した後、50mMトリスpH8、300mM NaCl、0.5%トリトンX-100から構成される可溶化バッファー200uL中に細胞を再懸濁させた。細胞を音波処理(10バースト×3、Branson 250 Sonifier、各シリーズの間に、サンプルを冷却させるための時間を置く)により破砕した。可溶性及び不溶性画分を分離するために、サンプルを16000g及び4℃で10分間遠心分離した。可溶性画分は個別のチューブに取り出し、不溶性画分は、音波処理により200μLの同じ可溶化バッファー中に再懸濁させた(前の音波処理と同じパラメータを用いて)。
全体を通じて切断基質として用いたC-インテイン融合タンパク質CINT_TRXを精製するために、このタンパク質を発現する大腸菌(E.coli)を、50mMトリス-HCl、pH=8.0、300mM NaCl、0.5×Cellytic B(Sigma-Aldrich)、及び20mMイミダゾールを含有するバッファー中に再懸濁させた。30%パルス活性化サイクルで、細胞を氷上で20分間音波処理した(Branson 250 Sonifier)後、4℃、34500gで30分間遠心分離した。His-Trap HP(GE Healthcare)カラムで、製造者の指示に従い、上澄みから可溶性C-インテイン融合タンパク質を精製した。精製C-インテイン融合タンパク質を含有する溶離画分をプールし、2mM DTTの存在下、切断バッファー(50mMトリス-HCl、pH=7.0、300mM NaCl、1mM EDTA、10%(v/v)グリセロール;CB)に対して透析した後、-80℃でアリコート中に保存した。
以前記載されている(Carvajal-Vallejos P.,et al.,J.Biol.Chem.287:28686,2012)通り、in vitro反応を実施した。手短には、精製したN-及びC-融合タンパク質を、対応する試験条件下で個別に、短時間プレインキュベートした。切断反応は、5μMの等モル濃度の切断バッファー中で、相補的N-及びC-インテイン融合タンパク質を混合することによって開始した。本発明に関する実験の場合、切断パートナーは、常にCINT_TRXであった。特定の時間間隔でアリコートを取り出し、8%SDS(w/v)及び20%β-メルカプトエタノール(v/v)を含有するSDS PAGEバッファーの添加により反応を停止した後、5分間沸騰させた。SDS PAGE(Novex,Invitrogen,Carlsbad,USからの4~12%ビス-トリスゲル)により、反応生成物を定量した後、クマシー・ブリリアント・ブルー(Coomassie Brilliant Blue)(Sigma)染色を実施した。Quantity One(BioRad)プログラムを用いて、比重法によりタンパク質バンドの相対強度を決定した。対応する分子量に従って、様々な切断生成物を正規化した。切断生成物とインテインタグ付き前駆体CINT_TRXの比から、タンパク質切断のパーセンテージを計算した。
可溶化パートナー候補のNINTΔA_CC融合物は、全ての可溶化パートナーについて、考えられる配向の両方で(すなわち、NINTΔA_CCのN又はC末端のいずれかに融合させた)作製した。得られる6つの構築物を大腸菌(E.coli)に発現させて、産生されたタンパク質を、前述した通りに、産生総量及び可溶性に関して分析した。さらに、各構築物からのタンパク質を精製し、精製CINT_TRXを基質として用いて、切断の速度を決定した。この分析の結果を図2A及び2Bに示す。NINTΔA_CCのN末端への可溶化パートナーの融合は、試験した全ての構築物について、C末端への可溶化パートナーの融合よりも高い量のタンパク質を大腸菌(E.coli)において産生するが、切断速度を測定すると、この傾向の逆転が見られる。これらの試験を実施中に、様々な分断インテイン系を用いて発表された論文は、可溶化パートナーの位置とN-インテイン及びN-インテイン活性の間の類似の関係を実証したが、これは、融合物が反対の極性で作製されるとき、エクステインドメイン同士の立体障害の可能性が大きくなることを示す、既知の構造情報を参照して説明された(Guan D,Ramirez M,Chen Z.,Biotechnol Bioeng.110:2471,2013)。
天然の供給源から単離したGP41-1N-インテインは、3つのシステイン残基を含有するが、1つは、本発明の親構築物であるNINTΔA_CCを賦与するために、事前に置換されている。NINTΔA_CC内に含まれる、残り2つのシステイン残基は置換のためにターゲティングして、ユニークな反応性システイン残基を、後の固定化又は他の修飾のために可溶化ドメインに導入することができるようにした。
表4に示すアミノ酸置換を含むNINTΔA_CC(配列番号2)に基づく構築物を作製、発現、精製した後、前述した通り、触媒活性について特性決定した。
その触媒活性を低減することなく、N-インテイン融合タンパク質の化学修飾を可能にするために、最終的な修飾の部位は、N-インテインの活性部位から可能な限り離れて除去すべきである。可溶化パートナー138についての構造情報がない場合、適切な手法は、GP41-1N-インテインについて上に記載したように(実施例7を参照)、系統樹解析を実施し、高い可変性を示すタンパク質の領域を決定し、システインの挿入によってこれらを修飾した後、得られる全ての構築物を試験することである。しかしながら、可溶化パートナー138(Protein Databank構想1RYK)について入手可能なNMR溶液構造は存在し、これは図7に示す。タンパク質は、4つのαヘリックスドメインを含み、球状であり、長い非構造コイルを有し、これが、N-インテインのカルボキシ末端との連結(丸で囲んだ領域;N-インテインは示していない)を形成する。黄色のハイライトで示すループ領域GKL及びGYQは、可溶化パートナー138(138_GKL22GCKL(配列番号16)、138_GYQ48GCYQ(配列番号17)、及び138_GYQ48GCGYQ(配列番号18))の新たなバージョン(
GP41-1変異体NINTΔA_TM(配列番号6)のカルボキシル末端に融合した可溶化パートナー138_GYQ48GCGYQ(配列番号18)を含有する可溶性融合タンパク質を、大腸菌(E.coli)においてコード核酸から発現させた後、従来の分離方法を用いて、混入細胞タンパク質から分離する。
本明細書の実施例10に従って調製した、固定化N-インテイン融合タンパク質を含有する樹脂を標準的クロマトグラフィーカラムに充填した後、GP41-1 C-インテインのカルボキシ末端に融合した標的分子チオレドキシンを含む、CINT_TRX融合タンパク質(配列番号10)を含有する粗タンパク質混合物を、固定化N-インテイン融合タンパク質含有のカラムに4~25℃の温度で添加した後、100mMトリス-HCl、25mM NaCl、0.1mM塩化亜鉛、pH=9を含むロードバッファーを用いて、インテイン触媒作用を起こさずに、GP41-1 N-及びC-インテインドメイン同士の強力な相互作用を可能にする。
gp41-2
CLDLKTQVQTQQGLKDISNIQVGDLVL(配列番号42)
gp41-3
CLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKS(配列番号43)
gp41-4
SYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQNGEVNIKGGLKEGMCLYVKE(配列番号46)
gp41-7
MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNH(配列番号47)
NrdA-1
YVCSRDDTTGFKLICTPDHMIYTKNRGYIMAKYLKEDDELLINEIHLPT(配列番号51)
NrdJ-1
gp41-9
MIMKNRERFITEKILNIEEIDDDLTVDIGMDNEDHYFVANDILTHNT(配列番号54)
IMPDH-2
MKFTLEPITKIDSYEVTAEPVYDIEVENDHSFCVENGFVVHNS(配列番号55)
IMPDH-3
MKFKLVEITSKETFNYSGQ-VHDLTVEDDHSYSI-NNIVVHNS(配列番号56)、
NrdA-3
MLKIEYLEEEIPVYDITVEETHNFFANDILIHNC(配列番号57)、
NrdA-5
MLKIEYLEEEIPVYDITVEGTHNLAYSL(配列番号58)、
NrdA-6
MGIKIRKLEQNRVYDIKVEKIIIFCNNILVHNC(配列番号59)、及び
NrdJ-1
MEAKTYIGKLKSRKIVSNEDTYDIQTSTHNFFANDILVHNS(配列番号60)。
にこれらを使用する方法に関する。
[1]ペプチド結合により結合したN-インテインポリペプチドとN-インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質であって、前記N-インテイン可溶化パートナーが、約15kDa未満の分子量、約60未満の脂肪族指数(Aliphatic Index)値、及び-1未満の疎水度大規模平均(Grand Average Hydropathicity)値を有し、前記可溶化パートナーの非存在下で発現されたN-インテインポリペプチドと比較して前記N-インテインポリペプチドの可溶性を増大する融合タンパク質。
[2]前記N-インテインポリペプチドが、GP41-1N-インテイン(配列番号1)、又はその変異体である、[1]に記載の融合タンパク質。
[3]前記GP41-1N-インテインの変異体が、配列番号1の7位、65位及び89位にシステイン残基以外のアミノ酸を有する、[2]に記載の融合タンパク質。
[4]前記GP41-1N-インテインの変異体が、配列番号1の7位にアラニン、65位にトレオニン残基又はアラニン残基、並びに89位にメチオニン残基、リシン残基又はアスパラギン残基のいずれかを有する、[3]に記載の融合タンパク質。
[5]前記GP41-1N-インテインの変異体が、GP41-1(配列番号1)に対して少なくとも約90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、[2]~[4]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[6]前記N-インテインポリペプチドが、前記融合タンパク質と固体支持体の結合のために用いられるアミノ酸を欠失している、[1]~[5]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[7]前記融合タンパク質と固体支持体の結合のために用いられる前記アミノ酸が、システインである、[6]に記載の融合タンパク質。
[8]前記N-インテインポリペプチドが、配列番号1~8及び29~56から選択される配列を含む、[1]に記載の融合タンパク質。
[9]前記N-インテイン可溶化パートナーが、前記N-インテインポリペプチドのN末端に結合される、[1]~[8]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[10]前記N-インテイン可溶化パートナーが、前記N-インテインポリペプチドのC末端に結合される、[1]~[8]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[11]前記N-インテイン可溶化パートナーが、N-インテイン可溶化パートナー138(配列番号15)、又はその変異体である、[1]~[10]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[12]前記N-インテイン可溶化パートナー138の変異体が、配列番号16、配列番号17、又は配列番号18を含む、[11]に記載の融合タンパク質。
[13]前記融合タンパク質が、産生される前記融合タンパク質の25質量%未満が封入体内に存在する条件下で、大腸菌(E.coli)において産生される、[1]~[12]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[14]前記融合タンパク質が、検出可能な標識を含むように修飾される、[1]~[13]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[15]前記検出可能な標識が、蛍光色素である、[14]に記載の融合タンパク質。
[16]前記タンパク質が、大腸菌(Escherichia coli)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、トウモロコシ(Zea maize)、タバコ(Nicotinia tabacum)、ニンジン(Daucus carota)、SF9細胞、CHO細胞、NS0細胞、又はHEK293細胞において発現される、[1]~[15]のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
[17][1]~[16]のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
[18]前記核酸が、発現ベクター中に含まれる、[17]に記載の融合タンパク質。
[19]前記核酸が、プラスミド中に含まれる、[17]に記載の融合タンパク質。
[20][17]、[18]又は[19]に記載の核酸を含む宿主細胞。
[21]大腸菌(E.coli)である、[20]に記載の宿主細胞。
[22]固体支持体に結合された[1]~[16]のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[23]前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、[22]に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[24]前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、[23]に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[25]前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、[22]に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[26]前記固体支持体が、磁気ビーズである、[25]に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[27]前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、[22]~[26]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[28]前記マトリックスが、前記融合タンパク質と固体支持体の間にスペーサ分子をさらに含む、[22]~[27]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[29]前記融合タンパク質が、前記N-インテイン可溶化パートナーの単一部位で前記固体支持体に結合される、[22]~[28]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[30]前記融合タンパク質が、前記N-インテイン可溶化パートナーの2つ以上の部位で前記固体支持体に結合される、[22]~[28]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[31]前記融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドは、前記融合タンパク質が前記固体支持体に結合されているとき、活性を維持する、[22]~[30]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[32]前記融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドは、前記融合タンパク質が前記固体支持体に結合されているとき、前記固体支持体から離れる方向に配向される、[22]~[31]のいずれか1項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。
[33]サンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法であって、
a)ポリペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を含有するサンプルを用意するステップ;
b)第2の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップであって、前記第2の融合タンパク質は、前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、前記N-インテインポリペプチドの可溶性を促進するN-インテイン可溶化パートナーとペプチド結合により結合したN-インテインポリペプチドを含むステップ;
c)不活性インテイン複合体を含有するアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ;
d)前記インテイン複合体が活性となり、前記C-インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ;並びに
e)切断された前記標的分子を回収するステップ
を含む方法。
[34]前記サンプルが、粗タンパク質調製物である、[33]に記載の方法。
[35]前記標的分子が、治療標的に対するモノクローナル抗体である、[33]又は[34]に記載の方法。
[36]前記標的分子が、治療標的である、[33]又は[34]に記載の方法。
[37]前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、触媒として不活性のインテイン複合体を形成する条件が、
a)約4~25℃の範囲の温度、及び100mMトリス-HCl、25mM NaCl、0.1mM塩化亜鉛、pH=9を含むバッファー;
b)約4~25℃の温度範囲、及び50mM NaAc、0.5M NaCl、pH=5を含むバッファー;又は
c)約4~25℃の範囲の温度、及び0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、pH=8を含むバッファー
を含む、[33]~[36]のいずれか1項に記載の方法。
[38]前記インテイン複合体の触媒活性を促進する前記条件が、
a)50mMトリス-HCl、pH=7.0、300mM NaCl、1mM EDTAを含むバッファー;
b)0.3M L-アルギニン、5mM EDTA、50mMリン酸バッファー、pH=6.5を含むバッファー;又は
c)0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、50mM DTT、pH=8.0を含むバッファー
を含む、[33]~[37]のいずれか1項に記載の方法。
[39]前記N-インテイン可溶化パートナーが、約15kDa未満の分子量、60未満の脂肪族指数(Aliphatic Index)値、及び-1未満の疎水度大規模平均(Grand Average Hydropathicity)値を有する、[33]~[38]のいずれか1項に記載の方法。
[40]前記N-インテイン可溶化パートナーが、N-インテイン可溶化パートナー138(配列番号15)又はその変異体である、[33]~[39]のいずれか1項に記載の方法。
[41]前記N-インテインポリペプチドが、GP41-1N-インテイン(配列番号1)又はその変異体であり、前記C-インテインポリペプチドが、GP41-1C-インテイン(配列番号9)である、[33]~[40]のいずれか1項に記載の方法。
[42]後の使用のために、前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスをクリーニング、再生又は保存するステップをさらに含む、[33]~[41]のいずれか1項に記載の方法。
[43]アフィニティ精製での使用に好適なインテイン複合体のスクリーニング方法であって、
a)ポリペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質と、ペプチド結合によりN-インテイン可溶化パートナーに結合したN-インテインポリペプチドを含む第2の融合タンパク質を、前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが前記第2の融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、接触させるステップ;並びに
b)インテイン活性を支持する条件下で、前記標的分子が、前記C-インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップであって、切断された前記標的分子の存在が、触媒活性インテイン複合体を示すステップ
を含む方法。
Claims (24)
- (a)C-インテインポリペプチドを含む第2の融合タンパク質との結合により、活性インテイン複合体を形成することができるN-インテインポリペプチド、並びに(b)ペプチド結合によりN-インテインポリペプチドに結合している、配列番号16、17及び18から選択されるアミノ酸配列を含むN-インテイン可溶化パートナー138の変異体を含む可溶性融合タンパク質であって、前記可溶性融合タンパク質は、前記変異体の単一のシステインで固体支持体に共有結合されている、可溶性融合タンパク質。
- 前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質。
- 前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項1又は2に記載の可溶性融合タンパク質。
- N-インテインポリペプチド並びに配列番号16、17及び18から選択されるアミノ酸配列を含むN-インテイン可溶化パートナー138の変異体を含むマトリックスであって、前記N-インテインポリペプチドと前記変異体は、ペプチド結合により結合しており、前記変異体は、前記変異体の単一のシステインで固体支持体に共有結合されている、マトリックス。
- 前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項4に記載のマトリックス。
- 前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、請求項5に記載のマトリックス。
- 前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項4~6いずれかに記載のマトリックス。
- 前記固体支持体が、磁気ビーズである、請求項7に記載のマトリックス。
- 前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、請求項4~8いずれかに記載のマトリックス。
- a)ペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質;及び
b)N-インテインポリペプチド並びに配列番号16、17及び18から選択されるアミノ酸配列を含むN-インテイン可溶化パートナー138の変異体を含む第2の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス、ここで、前記N-インテインポリペプチドと前記変異体は、ペプチド結合により結合しており、前記変異体は、前記変異体の単一のシステインで固体支持体に共有結合されている、
を含む、分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。 - 前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項10に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、請求項11に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項10~12いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 前記固体支持体が、磁気ビーズである、請求項13に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、請求項10~14いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスが、前記第2の融合タンパク質と固体支持体の間にスペーサ分子をさらに含む、請求項11~15いずれかに記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステム。
- 請求項10に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステムを使用してサンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法であって、
a)ペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を含有するサンプルを提供するステップ;
b)前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、N-インテインポリペプチドを含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップ;
c)不活性インテイン複合体を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ;
d)前記インテイン複合体が活性となり、前記C-インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ;及び
e)切断された標的分子を回収するステップ
を含む、方法。 - 請求項10に記載の分断インテイン系アフィニティクロマトグラフィーシステムを使用して標的分子を精製する方法であって、
a)ペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を含有するサンプルを提供するステップ;
b)前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、N-インテインポリペプチドを含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと前記サンプルを接触させるステップ;
c)不活性インテイン複合体を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ;
d)前記インテイン複合体が活性となり、前記C-インテインポリペプチドから前記標的分子を切断する条件に、前記インテイン複合体を曝露するステップ;及び
e)切断された標的分子を回収するステップ
を含む、方法。 - 前記第1の融合タンパク質中の前記C-インテインポリペプチドが、もう1つの融合タンパク質中の前記N-インテインポリペプチドと選択的に結合して、触媒として不活性のインテイン複合体を形成する条件が、
a)約4~25℃の範囲の温度、及び100mMトリス-HCl、25mM NaCl、0.1mM塩化亜鉛、pH=9を含むバッファー;
b)約4~25℃の範囲の温度、及び50mM NaAc、0.5M NaCl、pH=5を含むバッファー;又は
c)約4~25℃の範囲の温度、及び0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、pH=8を含むバッファー
を含む、請求項17又は18に記載の方法。 - 前記インテイン複合体の触媒活性を促進する条件が、
a)50mMトリス-HCl、pH=7.0、300mM NaCl、1mM EDTAを含むバッファー;
b)0.3M L-アルギニン、5mM EDTA、50mMリン酸バッファー、pH=6.5を含むバッファー;又は
c)0.5M NaCl、10mMトリス-HCl、50mM DTT、pH=8.0を含むバッファー
を含む、請求項17~19いずれかに記載の方法。 - 前記N-インテインポリペプチドが、GP41-1N-インテイン(配列番号1)、又は配列番号2~8から選択されるアミノ酸配列を含むその変異体であり、前記C-インテインポリペプチドが、GP41-1C-インテイン(配列番号9)である、請求項17~20いずれかに記載の方法。
- 前記標的分子が、治療標的に対するモノクローナル抗体であるか、又は前記標的分子が、治療標的である、請求項17~21いずれかに記載の方法。
- 後の使用のために、前記アフィニティクロマトグラフィーマトリックスをクリーニング、再生又は保存するステップをさらに含む、請求項17~22いずれかに記載の方法。
- アフィニティ精製での使用に好適なインテイン複合体のスクリーニング方法であって、
a)第1の融合タンパク質中のC-インテインポリペプチドがN-インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、ペプチド結合により標的分子に結合したC-インテインポリペプチドを含む第1の融合タンパク質と、請求項1に記載された可溶性融合タンパク質又は請求項4に記載されたマトリックスを接触させるステップ;及び
b)インテイン活性を支持する条件下で、前記標的分子が、前記C-インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップ、ここで、切断された標的分子の存在が、触媒活性インテイン複合体を示す、
を含む、方法。
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