CN117355536A - 改进的蛋白质纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质纯化，主要是在色谱领域中。更严格地说，本发明涉及使用包含C‑内含肽标签和N‑内含肽配体的断裂内含肽系统的亲和色谱法，其中N‑内含肽配体提供适合于大规模纯化任何重组目标蛋白质的增加的溶解度。

Description

改进的蛋白质纯化
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化，主要是在色谱领域中。更严格地说，本发明涉及使用包含C-内含肽标签和N-内含肽配体的断裂内含肽系统的亲和色谱法，其中N-内含肽配体具有高溶解度，并且可以适合于大规模蛋白质纯化的高程度固定至固相。
发明背景
内含肽是作为框内插入表达的蛋白质元件，其中断酶序列并催化它们自身的切割和两个侧翼多肽的连接，产生活性蛋白质。一般而言，内含肽以两种不同的方式编码：作为完整的内含肽，中断两个侧翼外显肽序列，或作为断裂内含肽，其中每个外显肽和内含肽的一部分通过两个不同的基因编码。尽管在自然中发现的具有快速动力学特性的断裂内含肽作为生物工程改造和蛋白质纯化工具而具有很大前景，但它们依赖于在内含肽-外显肽接合处的特定氨基酸，严重限制了可与内含肽融合用于亲和纯化和回收天然蛋白质序列的蛋白质。具体而言，来自点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的原型断裂内含肽DNAE显示适合于蛋白质纯化应用的动力学特性。然而，它的活性依赖于在C-外显肽的+2位置处的苯丙氨酸。这种依赖性严重限制和损害了它的一般适用性。
内含肽已被改造以实现生物技术中的若干重要功能，包括作为自切割蛋白质用于重组蛋白质纯化的应用。断裂内含肽在该方面特别具有前景，因为它们可同时提供亲和配体和自切割特性。在蛋白质纯化中，作为纯化对象的目标蛋白质可替代任一外显肽。迄今为止，断裂内含肽的DNAE家族已显示通过C-末端切割蛋白质纯化方法而最具前景。
WO2014/004336描述了与断裂内含肽N-片段和可附接至支持物的断裂内含肽C-片段融合的蛋白质。所述固体支持物可以是颗粒、珠、树脂或载玻片。
WO2014/110393描述了与断裂内含肽C-片段融合的目标蛋白质，所述断裂内含肽C-片段与断裂内含肽N-片段和纯化标签接触。N-片段可通过纯化标签附接至固相，并且论述了用于亲和纯化的方法。
US10 066027描述了一种蛋白质纯化系统和使用所述系统的方法。公开了包含可被固定的N-末端内含肽区段和具有自切割特性并且可附接至目标蛋白质的C-末端内含肽区段的断裂内含肽。所述N-末端内含肽区段提供有敏感性增强基序，这使其对外在条件更加敏感。
US10 308 679描述了包含N-内含肽多肽和N-内含肽增溶伙伴的融合蛋白质，以及包含这样的融合蛋白质的亲和基质。
WO 2018/091424描述了一种用于生产亲和色谱树脂的方法，所述亲和色谱树脂包含氨基-末端(N-末端)的断裂内含肽片段作为亲和配体，所述方法包括以下步骤：a)在细菌细胞(优选大肠杆菌)中作为包涵体中的不溶性蛋白质表达N-末端断裂内含肽片段蛋白质；b)收获所述包涵体；c)溶解所述包涵体和释放表达的蛋白质；d)在固体支持物上结合所述蛋白质；e)再折叠所述蛋白质；f)从固体支持物释放所述蛋白质；和g)作为配体将所述蛋白质固定在色谱树脂上以形成亲和色谱树脂。该程序能够固定2-10mg/ml树脂的配体密度。
如上所述，断裂内含肽已用于使用组合的亲和标签和标签切割机制的蛋白质纯化。然而，这样的系统的效用受到若干因素限制。首先，在预期产物的剪接点具有氨基酸要求，即在C-外显肽的+2位置要求Phe，以导致切割和实现无标签蛋白质的纯化。在N-末端没有无关氨基酸的重组蛋白质生产是高度需要的。第二，蛋白质释放切割必须足够快，以及提供可接受的产率。第三，断裂内含肽N-或C-片段对于其附接至固体支持物具有溶解度要求。第四，迄今没有可用的断裂内含肽系统适合于大规模纯化无标签蛋白质。
一种提高溶解度的方式是通过将溶解度融合标签连接至断裂内含肽(US 10 308679)。用于蛋白质表达和纯化的方法的开发通常通过使用融合标签来促进，所述融合标签提供纯化方案标准化的可能性，简化检测和增加目标蛋白质的溶解度。然而，融合标签可能干扰蛋白质功能和结构。因此，有利的是在使用之前除去融合标签。相对于目标蛋白质而言大的融合标签还导致表达这些融合蛋白质的宿主细胞的代谢负担增加，这是因为额外的能量消耗在融合标签上。
一种增加产生高度不溶性断裂内含肽的效率的不同方法是通过用变性化学试剂溶解蛋白质，接着再折叠过程(美国申请号16/348,534)以重新获得生物活性蛋白质。已尝试理解用于蛋白质再折叠的各种方法的技术方面以及它们的优点和局限性，但通常这样的方法的效率和产率非常难以预测，并且必须通过各蛋白质的经验研究来确定。再折叠方法的常见问题是当在再折叠期间除去或稀释变性化学品时形成蛋白质聚集体。这些聚集体降低该过程中的产率，以及增加在生产过程中随后的纯化步骤期间的复杂性。此外，变性化学品通常是环境的负担，并且需要适当地操作。
发明简述
本发明克服了现有技术内的缺点，并且提供了N-内含肽多肽，其是可溶性的，不需要溶解度融合标签，并且可在环境友好生产过程中以工业规模生产，以供在亲和纯化过程中后续使用。
具体而言，本发明提供了一种增加来自点形念珠藻的原型断裂内含肽DnaE的溶解度的方法，所述断裂内含肽显示适合于蛋白质纯化应用的动力学特性。然而，所述方法不限于来自点形念珠藻的DnaE断裂内含肽，而是还可适用于来自其它物种的同源断裂内含肽。溶解度是指在多肽链中一个或优选地两个氨基酸取代后，相对于在缺少这些氨基酸取代的情况下的可溶性N-内含肽比率，具有在大肠杆菌中表达的更高比率的可溶性N-内含肽的蛋白质。
本发明提供了天然断裂内含肽或衍生自内含肽/断裂内含肽的共有序列的N-内含肽蛋白质变体，其中所述N-内含肽蛋白质变体具有用于增加溶解度的一个或多个突变。
在第一方面，本发明涉及衍生自天然点形念珠藻(Npu)的N-内含肽变体或与其具有至少95％同源性的序列，所述变体或序列包含天然断裂内含肽的至少一个氨基酸取代，其中所述N-内含肽蛋白质变体序列包括至少位置24和/或位置25的突变，如从初始催化半胱氨酸测量的，并且其中与天然N-内含肽蛋白质序列或共有N-内含肽序列相比，所述取代的氨基酸提供在水性缓冲液中增加的溶解度。本发明还包括在位置24具有天然存在的E的内含肽，例如来自Limnorafis robusta的N-内含肽。
优选地，提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是非正电荷氨基酸。在优选的实施方案中，提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是K24E。在另一个实施方案中，提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是R25N。在最优选的实施方案中，N-内含肽包含这两个突变。
本发明涉及点形念珠藻(Npu)的野生型N-内含肽结构域的N-内含肽蛋白质变体，其中野生型Npu N-内含肽结构域包含以下序列：
CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPV AQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFE RELDLMRV(SEQ ID NO 1)(实施例中的构建体A52)，其中所述蛋白质变体包含在位置24中从K到E和在位置25中从R到N的氨基酸取代(实施例中的构建体B97)，以增加在水性缓冲液中的溶解度来使包涵体的形成最小化，其中任选地，一个或多个C(Cys)被突变为非半胱氨酸残基，优选地S(Ser)或A(Ala)。本发明包括的其它构建体在下文的实施例部分中描述。
上文描述的N-内含肽蛋白质变体在水性缓冲液中的溶解度为至少10-40％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置25处的R的单位点突变，优选为N或非正电荷氨基酸；至少46-52％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置24处的K的单位点突变，优选为E或非正电荷氨基酸；和至少76-88％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置24和25处的突变，优选为K24E和R25N或非正电荷氨基酸。
所述N-内含肽变体可偶联至固相，例如膜、纤维、颗粒、珠或芯片，例如天然或合成来源的色谱树脂。
所述固相可任选地提供有嵌入式磁性颗粒。
在可选的实施方案中，所述固相为非扩散受限树脂/纤维材料。
根据本发明，每ml固相，优选地色谱树脂(ml溶胀凝胶)偶联0.2-2μmole/ml N-内含肽。
在第二方面，本发明涉及包含如上所述的N-内含肽和与POI(目标蛋白质)共表达的C-内含肽序列的断裂内含肽系统。C-内含肽用作POI上的标签，以与附接至固相的N-内含肽结合。在结合后，POI从合并的N-内含肽和C-内含肽上切下，并提供无标签POI。C-内含肽变体是断裂内含肽C-内含肽序列或其改造的变体。优选的C-内含肽序列在WO2021/099607A1中提及。
所述POI可以是任何重组蛋白质：要求天然或几乎天然N-末端序列的蛋白质，例如治疗性蛋白质候选物、生物制品、抗体片段、抗体模拟物、酶、重组蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗原(病毒、细菌、酵母、哺乳动物)生产、疫苗生产、细胞表面受体、融合蛋白质。
附图简述
图1显示在使用不同的技术提取后，来自不同构建体的上清液的SDS-PAGE分析。
图2显示在SDS-PAGE分析的密度测量评估后测定的不同构建体的溶解度。对于各构建体分析了来自三种不同的细胞培养物的提取物。条形显示与全细胞裂解物(SDS)相比的平均溶解度，并且误差棒显示标准偏差。
图3显示来自不同的提取物的上清液中的N-内含肽浓度，其通过Biacore CFCA分析测定。对于各构建体分析了来自三种不同的细胞培养物的提取物。条形显示平均浓度，并且误差棒显示标准偏差。
图4显示作为％与通过SDS和加热溶解的N-内含肽的总量相比，使用不同的提取方法来自不同的构建体的提取物的上清液中的N-内含肽比率。
发明详述
定义
如说明书和随附的权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非上下文另外清楚指示。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两种或更多种这样的官能团、烷基或残基等的混合物。
在文本中，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表示这样的范围时，进一步的方面包括从所述一个具体值和/或至所述另一个具体值。类似地，当值表示为约数时，通过使用在前的“约”，将理解所述具体值形成进一步的方面。将进一步理解，各范围的端值均相对于另一个端值而言是显著的，并且独立于所述另一个端值。还理解，本文公开了许多值，并且除了所述值本身之外，本文也公开了作为“约”所述具体值的各个值。
除非另外有相反声明，否则组分的重量百分比(wt.％)基于包括所述组分的制剂或组合物的总重量。
如本文使用的，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可发生或者不发生，并且本说明书包括所述事件或情形发生的情况以及不发生的情况。
如本文使用的，术语“接触”是指以化合物可直接(即通过与靶标本身相互作用)或间接(即通过与靶标的活性所依赖的另一分子、辅因子、因子或蛋白质相互作用)影响靶标的活性的方式，使两个生物实体放置在一起。“接触”也可意指促进两个生物实体(例如肽)共价或其它方式键合的相互作用。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括蛋白质和其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。这些序列按从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列通过三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬酰胺(Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酰胺(Gln,Q)、谷氨酸(Glu,E)、甘氨酸(Gly,G)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、甲硫氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)和缬氨酸(Val,V)。肽包括任何寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白质。肽由连续的氨基酸构成，并且包含天然存在或合成的分子。
此外，如本文使用的，术语“肽”是指通过肽键或修饰的肽键(例如，肽电子等排体等)彼此连接的氨基酸，并且可含有除了20种基因编码氨基酸之外的修饰氨基酸。肽可通过天然过程，例如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰。修饰可在肽中任何地方发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。相同类型的修饰可在给定的多肽的数个位置以相同或不同的程度存在。此外，给定的肽可具有许多类型的修饰。修饰包括但不限于不同结构域或基序的连键、乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价交联或环化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、二硫键形成、去甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫化和转运-RNA介导的氨基酸添加到蛋白质，例如精氨酸化。(参见Proteins—Structure and MolecularProperties 2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,New York,pp.1-12(1983))。
如本文使用的，“变体”是指保留与原始序列相同或基本上相似的生物活性的分子。变体可来自相同或不同的物种，或者是基于天然或在先分子的合成序列。此外，如本文使用的，“变体”是指具有从母体分子(例如，本文公开的蛋白质或肽)的结构获得的结构的分子，并且所述分子的结构或序列与本文公开的那些足够相似，以致于根据该相似性，本领域技术人员会预期其与母体分子相比显示相同或相似的活性和效用。例如，取代给定的肽中的特定氨基酸可产生具有与母体相似的活性的变体肽。
在本发明的背景中，变体蛋白质中的取代表示为：[原始氨基酸/序列中的位置/取代的氨基酸]。
如本文使用的，术语“目标蛋白质(POI)”包括任何合成或天然存在的蛋白质或肽。该术语因此包括传统上被视为药物、疫苗和生物药品(包括分子，例如蛋白质、肽等)的那些化合物。治疗剂的实例在众所周知的参考文献中描述，例如the Merck Index(第14版)、thePhysicians'Desk Reference(第64版)和The Pharmacological Basis of Therapeutics(第1版)，并且它们包括但不限于药物；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或不适的物质；影响身体的结构或功能的物质，或前药，在它们位于生理环境中之后其变得具有生物活性或更加具有活性。
如本文使用的，“分离的肽”或“纯化的肽”意指肽(或其片段)，其基本上不含在自然中通常与肽缔合的材料，或在人工表达或生产系统中与肽缔合的材料，包括但不限于表达宿主细胞裂解物、生长培养基组分、缓冲液组分、细胞培养上清液或合成的体外翻译系统的组分。本文公开的肽或其片段可例如通过从天然来源(例如，哺乳动物细胞)提取，通过表达编码所述肽的重组核酸(例如，在细胞中或在无细胞翻译系统中)，或通过化学合成所述肽获得。此外，肽片段可通过这些方法中的任何一种，或通过切割全长蛋白质和/或肽获得。
如本文使用的，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
如本文使用的，短语“核酸”是指天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA、RNA还是DNA-RNA杂合体，单链还是双链，有义还是反义，其能够通过Watson-Crick碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可包括核苷酸类似物(例如，BrdU)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。具体而言，核酸可包括但不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。
如本文使用的，“外显肽”是指内含肽-修饰的蛋白质的一部分，其不是内含肽的部分，并且其可在切除内含肽时被剪接或切割。
“内含肽”是指蛋白质中的框内居间序列。内含肽可通过翻译后蛋白质剪接过程催化其自身从蛋白质切下，以得到游离的内含肽和成熟蛋白质。内含肽也可在内含肽N-末端或内含肽C-末端，或内含肽-外显肽两端催化内含肽-外显肽键的切割。如本文使用的，“内含肽”包括微型-内含肽、修饰或突变的内含肽和断裂内含肽。
如本文使用的，术语“断裂内含肽”是指任何内含肽，其中在N-末端内含肽区段和C-末端内含肽区段之间存在一个或多个肽键断裂，使得N-末端和C-末端内含肽区段变成单独的分子，其可非共价再缔合或重新组成具有剪接或切割反应的功能的内含肽。任何催化活性的内含肽或其片段可用于得到断裂内含肽，以供用于本文公开的系统和方法。例如，在一个方面，断裂内含肽可衍生自真核内含肽。在另一个方面，断裂内含肽可衍生自细菌内含肽。在另一个方面，断裂内含肽可衍生自古细菌内含肽。优选地，如此得到的断裂内含肽将仅具有对于催化剪接反应所必需的氨基酸序列。
如本文使用的，“N-末端内含肽区段”或“N-内含肽”是指包含N-末端氨基酸序列的任何内含肽序列，其当与相应的C-末端内含肽区段组合时具有剪接和/或切割反应的功能。N-末端内含肽区段因此还包含当剪接发生时剪接掉的序列。N-末端内含肽区段可包含作为自然存在(天然)的内含肽序列的N-末端部分的修饰的序列。非-内含肽残基也可遗传融合到内含肽区段以提供额外的功能性，例如能够被亲和纯化或共价固定。
如本文使用的，“C-末端内含肽区段”或“C-内含肽”是指包含C-末端氨基酸序列的任何内含肽序列，其当与相应的N-末端内含肽区段组合时具有剪接或切割反应的功能。在一个方面，C-末端内含肽区段包含当剪接发生时剪接掉的序列。在另一个方面，C-末端内含肽区段从与其C-末端融合的肽序列切割。从C-末端内含肽的C-末端切割的序列，在本文称为“目标蛋白质POI”，在下文更详细论述。C-末端内含肽区段可包含作为自然存在(天然)的内含肽序列的C-末端部分的修饰的序列。例如，C末端内含肽区段可包含额外的氨基酸残基和/或突变的残基，只要包括这样的额外和/或突变的残基不致使C-末端内含肽区段没有剪接或切割的功能即可。
共有序列是代表对齐的相关序列的DNA、RNA或蛋白质序列。相关序列的共有序列可以不同的方式定义，但通常通过在各位置处最常见的核苷酸或氨基酸残基定义。
如本文使用的，术语“剪接(splice)”或“剪接(splices)”意指切下多肽的中心部分以形成两个或更多个较小的多肽分子。在一些情况下，剪接还包括将两个或更多个较小多肽融合在一起以形成新的多肽的步骤。剪接也可以指通过断裂内含肽的作用在两个单独的基因产物上编码的两个多肽的连接。
如本文使用的，术语“切割(cleave)”或“切割(cleaves)”意指分开单一多肽以形成两个或更多个较小的多肽分子。在一些情况下，切割通过加入外源性肽链内切酶来介导，这通常称为“蛋白水解性切割”。在其它情况下，切割可通过一个或两个切割的肽序列的固有活性来介导，这通常称为“自切割”。切割也可称为通过加入非蛋白水解性第三肽来诱导的两个多肽的自切割，如在本文所述的断裂内含肽系统的作用中。
术语“融合”意指共价键合。例如，当两个肽彼此共价键合(例如，通过肽键)时，第一肽与第二肽融合。
如本文使用的，“分离的”或“基本上纯的”物质是已经与天然伴随它的组分分开的物质。通常，多肽当它按重量至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％和99％)不含与其天然缔合的其它蛋白质和天然存在的有机分子时，是基本上纯的。
在本文中，“结合(bind)”或“结合(binds)”意指一种分子识别和粘附至样品中的另一种分子，但基本上不识别或粘附至样品中的其它分子。如果一种分子对于另一种分子具有大于约105至106升/摩尔的结合亲和力，则所述一种分子“特异性结合”所述另一种分子。
本文提及的核酸、核苷酸序列、蛋白质或氨基酸序列可分离，纯化，化学合成或通过重组DNA技术产生。所有这些方法是本领域众所周知的。
如本文使用的，在“修饰的内含肽”或“突变的内含肽”中的术语“修饰的”或“突变的”是指当与天然或自然存在的结构比较时，在所提及的核酸或氨基酸序列，例如内含肽中的一种或多种修饰。这样的修饰可以是取代、添加或缺失。修饰可在所提及的结构，例如内含肽的一个或多个氨基酸残基或者一个或多个核苷酸中发生。
如本文使用的，术语“修饰的肽”、“修饰的蛋白质”或“修饰的目标蛋白质”或“修饰的靶标蛋白质”是指已被修饰的蛋白质。
如本文使用的，“可操作地连接”是指在结构中两个或更多个生物分子相对于彼此的缔合，使得可执行生物分子的正常功能。关于核苷酸序列，“可操作地连接”是指在结构中两个或更多个核酸序列通过酶促连接或其它方式相对于彼此的缔合，使得可执行序列的正常功能。例如，编码前序列或分泌性前导序列的核苷酸序列如果作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则可操作地连接至多肽的核苷酸序列；启动子或增强子如果影响编码序列的转录，则可操作地连接至编码序列；以及核糖体结合位点如果经定位以促进编码序列的翻译，则可操作地连接至所述序列。
“序列同源性”可以指其中核酸或蛋白质序列因为具有共同的进化起源而相似的情况。“序列同源性”可表示序列非常相似。序列相似性是可观察到的；同源性可基于所述观察结果。“非常相似”可意指至少70％同一性、同源性或相似性；至少75％同一性、同源性或相似性；至少80％同一性、同源性或相似性；至少85％同一性、同源性或相似性；至少90％同一性、同源性或相似性；例如至少93％或至少95％或甚至至少97％同一性、同源性或相似性。核苷酸序列相似性或同源性或同一性可使用Myers et al.(1988)CABIOS 4:11-17中的并且可在NCBI获得的“Align”程序确定。另外或可选地，氨基酸序列相似性或同一性或同源性可使用Altschul et al.Nucl.Acids Res.25:3389-3402中的并且可在NCBI获得的BlastP程序确定。可选地或另外，术语“相似性”或“同一性”或“同源性”，例如关于核苷酸序列，意图表示两个序列之间的同源性的定量度量。
可选地或另外，关于序列的“相似性”是指具有相同核苷酸的位置数量除以两个序列的较短者中的核苷酸数量，其中两个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726确定。例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长度和4的空位罚分，序列数据(包括比对)的计算机辅助分析和解释可使用市售可得的程序(例如，IntelligeneticsTMSuite,Intelligenetics Inc.CA)方便地执行。当RNA序列被认为与DNA序列是相似的，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性时，在DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等于在RNA序列中的尿嘧啶(U)。以下参考文献也提供了用于比较两种蛋白质的氨基酸残基的相对同一性或同源性或相似性的算法，并且另外或可选地，关于上述内容，所述参考文献可用于确定同源性或同一性或相似性百分比。Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:444-453；Smith et al.(1983)Advances App.Math.2:482-489；Smith etal.(1981)Nuc.Acids Res.11:2205-2220；Feng et al.(1987)J.Molec.Evol.25:351-360；Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153；Thompson et al.(1994)Nuc.Acids Res.22:4673-480；和Devereux et al.(1984)12:387-395。“严格的杂交条件”是本领域众所周知的术语；参见例如，Sambrook,“Molecular Cloning,A Laboratory Manual”，第二版,CSHPress,Cold Spring Harbor,1989；“Nucleic Acid Hybridization,A PracticalApproach”,Hames和Higgins编辑,IRL Press,Oxford,1985；亦参见本文的图2和其描述，其中具有序列比较。
术语“缓冲液”或“缓冲溶液”是指通过其共轭酸碱范围的作用来抵抗pH变化的溶液。
术语“加载缓冲液”或“平衡缓冲液”是指含有一种或多种盐的缓冲液，其与蛋白质制备物混合以将蛋白质制备物加载到柱上。该缓冲液还用于在加载之前平衡柱，以及在加载蛋白质之后洗涤柱。
术语“洗涤缓冲液”在本文中用于指在加载目标蛋白质(例如与C-末端内含肽片段偶联的蛋白质)之后和在洗脱目标蛋白质之前通过柱(例如)的缓冲液。洗涤缓冲液可用于除去一种或多种污染物，而基本上不会洗脱所需的蛋白质。
术语“洗脱缓冲液”是指用于从柱洗脱所需的蛋白质的缓冲液。如本文使用的，术语“溶液”是指缓冲或非缓冲的溶液，包括水。
术语“洗涤”意指使合适的缓冲液通过或经过固体支持物，例如色谱树脂。
术语从固体支持物“洗脱”分子(例如，所需的蛋白质或污染物)意指从这样的材料中移出分子。
术语“污染物”或“杂质”是指除了要纯化的蛋白质之外的任何外来或不想要的分子，特别是生物大分子，例如DNA、RNA或蛋白质，其存在于要纯化的蛋白质的样品中。污染物包括例如，来自表达和/或分泌要纯化的蛋白质的细胞的其它蛋白质。
与蛋白质纯化结合使用的术语“分开”或“分离”是指在包含所需的蛋白质和第二蛋白质或其它污染物或杂质混合物的混合物中将所需的蛋白质从第二蛋白质或其它污染物或杂质混合物分开，使得至少大部分所需的蛋白质分子从包含至少大部分第二蛋白质分子或其它污染物或杂质混合物的混合物部分移出。
术语从包含所需的蛋白质和一种或多种污染物的组合物或溶液“纯化(purify)”或“纯化(purifying)”所需的蛋白质意指通过从组合物或溶液中除去(完全或部分地)至少一种污染物来增加在组合物或溶液中所需的蛋白质的纯度。
N-内含肽蛋白质变体
本发明涉及在单一步骤中使用根据本发明的断裂内含肽系统的亲和色谱法和亲和标签切割机制，所述断裂内含肽系统以广泛的氨基酸耐受性切割，产生无标签的目标蛋白质(POI)作为最终产物。内含肽的两半是亲和配体(N-内含肽)和亲和标签(C-内含肽)，并且它们快速缔合。在色谱树脂上固定一半(N-内含肽)能够从溶液中捕获与POI偶联的另一半(C-内含肽)。在Zn2+离子的存在下，切割反应受到抑制，能够形成稳定的复合物，而杂质被洗掉。在消除杂质后，加入螯合剂或还原剂，并继续切割反应，能够收集POI，而内含肽标签仍然与连接至色谱树脂的同源内含肽非共价结合。
优选地，本发明提供了天然断裂内含肽或衍生自天然内含肽和断裂内含肽的共有序列的N-内含肽蛋白质变体序列，其中与天然序列或共有序列相比，N-内含肽变体通过具有位置24和/或25的突变被修饰以提供增加的溶解度。从作为1号的初始催化半胱氨酸开始，根据与天然断裂内含肽的常规群集比对，计算这些位置。
天然内含肽是本领域已知的。内含肽列表见下表1。所有内含肽具有制成断裂内含肽的潜力，而一些内含肽以断裂形式天然存在。在该表中发现的所有内含肽作为断裂内含肽存在，或者具有制成根据本发明在位置24和/或25处修饰使得与天然序列相比实现溶解度增加的断裂内含肽的潜力。
表1-天然存在的内含肽
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所公开的组合物的断裂内含肽或可用于所公开的方法的断裂内含肽可以是修饰或突变的内含肽。修饰的内含肽可包含对N-末端内含肽区段、C-末端内含肽区段或二者的修饰。修饰可包括在断裂内含肽的任一部分的N-末端或C-末端处的额外氨基酸，或可在断裂内含肽的任一部分内。表2显示氨基酸列表、它们的缩写、极性和电荷。
表2——氨基酸列表
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本发明的N-内含肽可偶联至固相，例如膜、纤维、颗粒、珠或芯片。固相可以是天然或合成来源的色谱树脂，例如天然或合成树脂，优选多糖，例如琼脂糖。固相，例如色谱树脂，可提供有嵌入式磁性颗粒。在另一个实施方案中，固相是非扩散受限树脂/纤维材料。
在该情况下，固相可以由一个或多个聚合物纳米纤维基质，例如电纺聚合物纳米纤维形成。用于本发明的聚合物纳米纤维通常具有10nm至1000nm的平均直径。聚合物纳米纤维的长度不特别受限。聚合物纳米纤维可合适地是单丝纳米纤维，并且可以例如具有圆形、椭圆形或基本上圆形/椭圆形的截面。通常，所述一个或多个聚合物纳米纤维以一个或多个非织造片材的形式提供，各自包含一个或多个聚合物纳米纤维。包含一个或多个聚合物纳米纤维的非织造片材是所述一个或多个聚合物纳米纤维的垫，其中每个纳米纤维基本上随机取向，即它没有被制造使得一个或多个纳米纤维采取特定的模式。非织造片材通常具有1至40g/m2的面积密度。非织造片材通常具有5至120μm的厚度。聚合物应该是适合在色谱方法中用作色谱介质，即吸附剂的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺，例如尼龙、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚砜(例如聚醚砜(PES))、聚己内酯、胶原、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、醋酸琼脂糖、纤维素、醋酸纤维素和其组合。
根据本发明的N-内含肽可以非常高的程度固定在固体支持物上，每ml树脂(溶胀凝胶)偶联0.2-2μmole/ml N-内含肽。
根据本发明的N-内含肽可通过在C-末端包含一个或多个Lys(例如至少两个)的Lys-尾偶联至固相。或者，N-内含肽通过在C-末端的Cys-尾偶联至固相。
C-内含肽蛋白质变体
优选地，本发明还提供了包含断裂内含肽C-内含肽序列或其改造的变体的C-内含肽。
将理解，N-内含肽和C-内含肽的选择可来自相同的野生型断裂内含肽，例如二者均来自Npu，或者N-或C-内含肽任一的变体，或者可选自不同的野生型断裂内含肽或共有断裂内含肽序列，因为已发现，N-片段对于不同的C-片段的亲和力(例如，Npu N-片段或其变体与Ssp C-片段或其变体)仍然保持足够的结合亲和力以供用于所公开的方法。
断裂内含肽系统
优选地，本发明提供了用于亲和纯化目标蛋白质(POI)的断裂内含肽系统，其包含上文所述的N-内含肽和C-内含肽。
优选地，N-内含肽附接至固相，并且C-内含肽与POI共表达并用作亲和纯化POI的标签。反过来也是可能的，即将C-内含肽附接至固相并且使用N-内含肽作为标签，但是前者是优选的。
在一个实施方案中，C-内含肽和额外的标签与POI共表达。额外的标签可以是任何常规的色谱标签，例如IEX标签或亲和标签。
纯化目标蛋白质(POI)的方法
本发明涉及使用根据本发明的断裂内含肽系统来纯化目标蛋白质(POI)的方法，包括将C-内含肽和N-内含肽在中性pH，例如6-8下，以及在二价阳离子(其损害自发切割)的存在下缔合；在二价阳离子的存在下洗涤所述固相；加入螯合剂以允许在C-内含肽和POI之间的自发切割；收集无标签POI。
该方案适合于对Zn不敏感的蛋白质。优势是允许与树脂的长接触时间，以及加入大的样品体积。样品加载可长时间进行，例如达到1.5小时。
根据本发明，在少于4小时切割中实现超过30％产率，优选地50％，最优选地超过80％的POI。
在N-内含肽固定至固相时，本发明能够实现高配体密度。优选地，N-内含肽附接至色谱树脂，例如琼脂糖或任何其它合适的树脂以供蛋白质纯化。根据本发明，可能实现每ml的沉降树脂0.2-2μmole/ml C-内含肽结合的POI的静态结合能力。
亲和标签
本发明还涉及用于纯化目标蛋白质(POI)的方法，包括以下步骤：与根据本发明的C-内含肽和额外的标签一起共表达POI；结合所述额外的标签至在固相上的其结合配偶体；切下POI和C-内含肽；在中性pH下将所述C-内含肽与附接至固相的N-内含肽结合，并从所述POI切下所述结合的C-内含肽和N-内含肽；和在碱性条件，例如0.5M NaOH下再生所述固相。这种双重标签的目的是增加纯度(能够进行两次亲和纯化)、溶解度、可检测性。
亲和标签可以是与蛋白质编码序列在框内克隆的肽或蛋白质序列，其改变了蛋白质的行为。亲和标签可附加到可在从细胞纯化蛋白质的方法中使用的蛋白质的N-或C-末端。表达包含亲和标签的肽的细胞可与信号序列一起在上清液/细胞培养基中表达。表达包含亲和标签的肽的细胞还可经沉淀，裂解，并将细胞裂解物应用到向亲和标签展示配体的柱、树脂或其它固体支持物。亲和标签和任何融合的肽结合至固体支持物，所述固体支持物还可用缓冲液洗涤数次以消除未结合的(污染物)蛋白质。目标蛋白质，如果附接至亲和标签，可通过导致亲和标签从配体解离的缓冲液从固体支持物洗脱，产生纯化的蛋白质，或者可使用可溶性蛋白酶从结合的亲和标签切割。如本文公开的，亲和标签通过活性内含肽复合物中的C-内含肽区段的自切割机制被切割。
亲和的实例包括但不限于，麦芽糖结合蛋白质，其可结合固定的麦芽糖以促进融合的靶标蛋白质的纯化；甲壳质结合蛋白质，其可结合固定的甲壳质；谷胱甘肽S转移酶，其可结合固定的谷胱甘肽；多组氨酸，其可结合固定的螯合金属；FLAG八肽，其可结合固定的抗-FLAG抗体。
亲和标签还可通过各种方法，包括但不限于选择性沉淀、离子交换色谱法、与具有沉淀能力的配体结合、透析(通过改变靶标蛋白质的大小和/或电荷)和其它高度选择性分离方法，用于促进使用所公开的修饰肽来纯化目标蛋白质。
在一些方面，可使用亲和标签，其实际上不结合配体，而是选择性沉淀或用作固定的相应结合结构域的配体。在这些情况下，标签更一般称为纯化标签。例如，ELP标签在特定的盐和温度条件下选择性沉淀，允许融合的肽通过离心纯化。另一个实例是抗体Fc结构域，其用作固定的蛋白质A或蛋白质G-结合结构域的配体。
目标蛋白质
对于所有方案，靶标蛋白质是：任何重组蛋白质，特别是要求天然或几乎天然的N-末端序列的蛋白质，例如治疗性蛋白质候选物、生物制品、抗体片段、抗体模拟物、蛋白质支架、酶、重组蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗原(病毒、细菌、酵母、哺乳动物)生产、疫苗生产、细胞表面受体、融合蛋白质。
本发明现在将结合一些非限制性实施例和附图进行更严密地描述。
实验部分
本发明将结合一些非限制性实施例和附图进行更严密地描述。
在本发明中，评估了以下5种构建体：
表1
构建体培养和表达：
在摇瓶中将起始培养物在100mL LB+neo中按1:100稀释(对于所有5种构建体，一式三份进行)，并在37下孵育直到OD600为0.6-1。一旦目标OD达到，将瓶转移至冷却的孵育箱(22度)中并加入0.5mM IPTG以诱导过夜(准确的说，18h)。将诱导的培养物以5000g(+7度)在50mL离心管中序贯沉淀，并将沉淀物称重。
溶解度测试
将称重的沉淀物(约0.8克)重悬于20倍体积的1x PBS中。对于每种构建体：
1.保留20μL用于SDS-PAGE(全细胞裂解物/WCL)
2.将5mL加入50mL离心管中，和
a.以5000g(6度)离心20min
b.将沉淀重悬于5mL 8M尿素中
c.在室温下不断孵育～1h
d.以20000g在6度下离心20min
e.保留20μL的上清液用于SDS-PAGE(尿素)
f.其余上清液用于Biacore CFCA分析
3.将10mL加入50mL离心管中，和
a.在冰上按时(2秒开/4秒关的脉冲)以30％幅度声处理1min
b.以20000g在6度下离心20min
c.保留20μL的上清液用于SDS-PAGE(超声)
d.其余上清液用于Biacore CFCA分析
4.将500μL加入1.5mL管中，和
a.以5000g在6度下离心20min
b.将沉淀重悬于500μL 1％ NP40缓冲液中
c.在室温下以1200rpm摇动(Mathilda块)孵育40min
d.以12000g在6度下离心20min
e.保留约250μL的上清液
f.保留20μL的上清液用于SDS-PAGE(NP40)
g.其余上清液用于BiaCore CFCA分析
向20μL样品中加入40μL SDS-PAGE缓冲液并在95度下煮沸5min，然后加载样品到15％凝胶。
溶解度通过SDS-PAGE分析样品评估并相应计算：
提取方法密度测定信号/全细胞裂解物(WCL)密度测定信号*100％
图1显示在使用不同的提取技术后代表性的上清液的SDS-PAGE分析。将20μL的上清液与40μL的2x Laemmli样品缓冲液混合，并在95摄氏度下煮沸5分钟，然后加载到15％同质SDS-PAGE凝胶上。在600V下将凝胶电泳1小时50分钟，并通过考马斯染色大约2小时。在广泛脱色后，凝胶使用Amersham AI600成像仪成像。
图2显示在SDS-PAGE分析的密度测定评估后测定的溶解度。对于各构建体分析来自三种不同的细胞培养物的提取物，并且配体条带密度测定使用ImageQuant TL软件测量。溶解度基于下式计算：
密度测定(提取方法X)/密度测定(WCL)*100％＝％溶解度
条形显示与全细胞裂解物相比，不同的提取方法的平均溶解度，并且误差棒显示标准偏差。对于分析的声处理样品，所有构建体显示比A52显著更好的溶解度。与A52样品相比，A53、B97和B82显示显著更高的溶解度。使用A52作为对照样品，通过单因素方差分析以及Dunnet事后检验确定统计学显著性。*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001，****p值<0.0001。
构建体名称 NP40，平均溶解度 声处理，平均溶解度
A52 7.4％ 22.1％
A53 67.6％ 104.7％
B97 37.3％ 92.8％
B82 44.3％ 62.8％
B83 12.4％ 36.6％
尿素提取方法显示与WCL相比没有显著差异，并且不依赖于分析的构建体。
Biacore CFCA分析
使用FLAG表位(DYKDDDDK)作为在构建体的C-末端的检测标签，通过SPR结合分析，进一步分析各种蛋白质提取物的可溶性N-内含肽比率的测定。在Biacore T200仪器中使用小鼠单克隆抗-FLAG M2抗体进行免校准浓度分析(CFCA)。使用胺偶联试剂盒，用抗-FLAG抗体固定传感器芯片CM5系列S。10mM醋酸钠pH 4.0用作固定缓冲液，HBS-EP+pH 7.4作为运行缓冲液，以及甘氨酸-HCl pH 2.5作为再生缓冲液。固定水平为约8000-10000RU。在HBS-EP+运行缓冲液中将来自上述不同提取的上清液样品稀释150-5000倍，然后通过CFCA方法分析。不同的蛋白质构建体的分子量范围为13.5-13.6kDa，并且这用于计算在20℃下的扩散系数(1.13389E-10m2/s)。对于CFCA的默认Biacore方法用作起点来设置最终方法。样品浓度通过使用Biacore T200评估软件测定。
图3显示通过Biacore CFCA分析测定的来自不同提取物的上清液中的N-内含肽浓度。对于各构建体分析来自三种不同细胞培养物的提取物。条形显示平均浓度，并且误差棒显示标准偏差。
使用不同的提取方法，在提取和澄清后的上清液中的N-内含肽浓度用于计算可溶性N-内含肽比率。NP40洗涤剂缓冲液导致从细胞中温和释放可溶性蛋白质。超声处理是一种导致剧烈细胞破坏以释放可溶性蛋白质的机械提取技术。高浓度的尿素是一种导致从细胞中释放包涵体中存在的可溶性蛋白质和不溶性蛋白质的变性提取方法。在SDS样品缓冲液中煮沸细胞沉淀物导致可溶性和不溶性N-内含肽的完全溶解，并且用作表达的N-内含肽总量的参考。与变性方法(尿素和SDS)相比，在用非变性提取方法(NP40和声处理)提取后上清液中的高N-内含肽浓度指示高溶解度。CFCA分析显示A53和B97构建体具有高溶解度，而A52具有非常差的溶解度，图4。
统计学分析显示当使用温和的非变性提取方法时，与未修饰的A52构建体相比，修饰的构建体B82、B83和B97具有显著更高的可溶性。
相应计算通过SPR结合分析评估的溶解度：
提取方法N-内含肽浓度/SDS提取的N-内含肽浓度*100％
结果
十二烷基硫酸钠SDS是一种离子洗涤剂，其通过离子和疏水相互作用结合蛋白质并通过改变其二级和三级结构溶解蛋白质。SDS常规用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离，表征和定量蛋白质。SDS已在这些实施例实验中用作通用蛋白质溶解试剂，用于定量不同提取物中的可溶性和不溶性蛋白质总量，以供通过SDS-PAGE凝胶的密度测定分析和Biacore免校准浓度分析CFCA的后续分离、检测和定量。在SDS溶解的样品提取物中不同构建体的浓度标准化至100％以与使用不同的方法在离心澄清提取物后的上清液中得到的不同蛋白质构建体的浓度比较。
用于仅提取可溶性蛋白质的温和方法是使用非离子洗涤剂NP40。将1％(w/v)的NP40加入到含有150mM氯化钠的Tris-HCl缓冲液pH7.5中并简单通过重悬浮收获的细菌细胞沉淀使用，接着混合1小时。在孵育后，通过离心澄清细胞悬浮液以除去不溶性材料。
超声处理或声处理是一种蛋白质提取方法，其使用来自探头的机械能来碎裂细胞以释放可溶性细胞组分。将细胞重悬于非变性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水PBS pH 7.4中以在释放细胞组分的过程中控制pH。声处理是一种非常有效和可靠的细胞崩解工具，其允许通过声处理参数的完全控制。这确保了关于材料释放和产物纯度的高度选择性。在声处理后，通过上清液澄清裂解物，并且除去不溶性沉淀。
离液盐，例如尿素，可用于从细胞中释放可溶性和不溶性蛋白质。与更可能干扰一些常用的分析方法的SDS洗涤剂相反，尿素与广泛的分析方法相容。尿素通常在8M下使用以确保最大变性条件，并且可溶于水中。将细胞重悬于尿素溶液中，然后混合1小时。然后通过离心澄清提取物以除去不溶性沉淀。
SDS当加热时使蛋白质变性，并给予所有蛋白质强负电荷。SDS按照每2个氨基酸1个SDS分子的比率与蛋白质强烈结合。这使得SDS提取成为一种评估可溶性和不溶性蛋白质总量的非常有效的方法。一般而言，将在pH 6.7-7.5的缓冲溶液中2％(w/v)SDS浓度加入至等体积的来自细胞收获物的细胞悬浮液，接着混合和在95℃加热5分钟。然后将样品冷却至室温，之后进行离心和分析。
图3显示通过使用不同的方法，在提取细胞收获物中的蛋白质后，在上清液中不同N-内含肽构建体的浓度。在提取之前将细胞量和提取体积标准化，使得可直接比较实际浓度。每个条形显示从三种不同的细胞培养物提取细胞获得的某种构建体的平均浓度。误差棒显示标准偏差。如图3可见的，在使用SDS和尿素提取后在上清液中的蛋白质构建体的浓度最高。在不同构建体的浓度之间的相对差异反映了来自不同细胞培养物的不同程度的表达。根据在SDS提取物中的浓度，构建体A52和B97具有最高的总计N-内含肽表达，分别为871和803μg/ml。来自尿素提取物的N-内含肽浓度总体上低于SDS提取物，但遵循大致相同的模式。在来自其中仅发现可溶性蛋白质的声处理和NP40提取物的N-内含肽浓度中可见到感兴趣的发现。A52，一种不包含取代突变K24E或R25N的构建体，具有与其它构建体相比最低浓度的N-内含肽，在NP40提取物中为27.5μg/ml，以及在声处理样品中为37.9μg/ml。包含K24E和R25N取代的构建体B97在NP40提取物中(180.3μg/ml)和在声处理提取物中(662.3μg/ml)具有相对高浓度的可溶性N-内含肽。该差异在图4中更加显著，其中对于各相应构建体和提取方法的N-内含肽浓度与SDS提取各相应构建体后的N-内含肽浓度比较。SDS条形被省略，因为它们全都提供比率1，等于100％。与SDS提取物相比，缺少位置24和25的突变的构建体A52在来自NP40和声处理的提取物中分别仅具有3和4％ N-内含肽。在构建体B83中的单一取代R25N导致相对于SDS提取物的更高比率，对于NP40和声处理提取物分别为11％和25％。在构建体B82中的单一取代K24E导致相对于SDS提取物的更高比率，对于NP40和声处理提取物分别为19％和49％。具有位置24和25的两个氨基酸取代K24E和R25N的构建体B97导致相对于SDS提取物的更高比率，对于NP40和声处理提取物分别为22％和82％。
总之，在上述实验中，根据本发明实现的溶解度范围为：
至少10-40％可溶性N-内含肽，其具有位置25处的R的单位点突变，优选N或非正电荷氨基酸。至少46-52％可溶性N-内含肽，其具有位置24处的K的单位点突变，优选E或非正电荷氨基酸。至少76-88％可溶性N-内含肽，其具有位置24和25处的突变，优选K24E和R25N或非正电荷氨基酸。这些值基于声处理样品的Biacore CFCA数据。
<110> CYTIVA BIOPROCESS R&D AB
<120> 改进的蛋白质纯化
<130> 100001.00164
<140>
<141>
<150> GB 2106771.5
<151> 2021-05-12
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> Nostoc punctiforme
<400> 1
Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Ser
20 25 30
Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp His
35 40 45
Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp Leu Met Arg
85 90 95
Val

Claims (17)

1.一种衍生自野生型点形念珠藻(Nostocpunctiforme)(Npu)的N-内含肽蛋白质变体或与其具有至少95％同源性的序列，所述N-内含肽蛋白质变体或序列包含天然断裂内含肽的至少一个氨基酸取代，其中所述N-内含肽蛋白质变体序列包括至少位置24和/或位置25的突变，如从初始催化半胱氨酸测量的，并且其中与天然N-内含肽蛋白质序列或共有N-内含肽序列相比，所述取代的氨基酸提供在水性缓冲液中增加的溶解度。
2.根据权利要求1所述的N-内含肽蛋白质变体，其中提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是非正电荷氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的N-内含肽蛋白质变体，其中提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是K24E。
4.根据权利要求1、2或3所述的N-内含肽蛋白质变体，其中提供增加的溶解度的所述取代的氨基酸是R25N。
5.点形念珠藻(Npu)的野生型N-内含肽结构域的N-内含肽蛋白质变体，其中所述野生型NpuN-内含肽结构域包含以下序列：
CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPV AQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFE RELDLMRV(SEQ ID NO 1)，其中所述蛋白质变体包含在SEQ ID NO 1的位置24中从K到E和在SEQ ID NO 1的位置25中从R到N的氨基酸取代，以增加在水性缓冲液中的溶解度，并且其中任选地，一个或多个C被突变为非半胱氨酸残基，优选地S或A。
6.根据上述权利要求中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，其中在水性缓冲液中的溶解度为至少10-40％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置25处的R的单位点突变，优选为N或非正电荷氨基酸；至少46-52％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置24处的K的单位点突变，优选为E或非正电荷氨基酸；和至少76-88％可溶性N-内含肽，所述N-内含肽具有位置24和25处的突变，优选为K24E和R25N或非正电荷氨基酸。
7.根据上述权利要求中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，其附接至固相，例如膜、纤维、颗粒、珠或芯片。
8.根据权利要求7所述的N-内含肽蛋白质变体序列，其中所述固相是天然或合成来源的色谱树脂。
9.根据权利要求7或8所述的N-内含肽蛋白质变体，其中所述固相是色谱树脂，例如天然或合成树脂，优选地多糖，例如琼脂糖。
10.根据权利要求9所述的N-内含肽蛋白质变体，其中所述固相提供有嵌入式磁性颗粒。
11.根据权利要求9所述的N-内含肽蛋白质变体，其中所述固相是非扩散受限树脂/纤维材料。
12.根据上述权利要求1-11中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，其中所述N-内含肽在C-末端通过包含一个或多个Lys的Lys-尾偶联至固相。
13.根据上述权利要求1-11中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，其中所述N-内含肽在C-末端通过Cys-尾偶联至固相。
14.根据上述权利要求中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，其中每ml固相，优选地色谱树脂(ml溶胀凝胶)偶联0.2-2μmole/mlN-内含肽。
15.一种断裂内含肽系统，其包含附接至固相的根据上述权利要求中一项或多项所述的N-内含肽蛋白质变体，和与POI(目标蛋白质)共表达的C-内含肽序列，其中所述C-内含肽用作POI上的标签，并且表达的C-内含肽与所述N-内含肽蛋白质变体结合。
16.根据权利要求15所述的断裂内含肽系统，其中所述C-内含肽序列是天然断裂内含肽C-内含肽序列或其改造的变体。
17.根据权利要求15或16所述的断裂内含肽系统，其中所述POI是：要求天然或几乎天然的N-末端序列的蛋白质，例如治疗性蛋白质候选物、生物制品、抗体片段、抗体模拟物、酶、重组蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗原(病毒、细菌、酵母、哺乳动物)生产、疫苗生产、细胞表面受体、融合蛋白质。
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