CN109111489B - 一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法 - Google Patents

一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于动物半乳凝集素‑3糖识别结构域富集糖蛋白的方法。本发明利用的半乳凝集素‑3糖识别结构域来源于动物为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的第37‑176位的蛋白质；A2)将序列表中序列1的第37‑176位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明利用半乳凝集素‑3糖识别结构域及其四聚制备的凝集素亲和柱可以成功富集糖蛋白。

Description

一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法。
背景技术
半乳凝集素(Galectins)是凝集素中一类进化上十分保守的可溶性蛋白质，含有一个或两个长约130个氨基酸组成的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain，CRD)，对β-半乳糖苷及其缀合物具有特异亲和力。迄今为止，已有15个哺乳动物半乳凝集素家族成员被发现，根据其CRD的组成数目可分为含有单一CRD的原型，含有两个CRD的串联重复型，含有一个CRD和一个胶原蛋白样重复结构域的嵌合型。其中，半乳凝集素-3是嵌合型中的唯一成员，普遍存在于动物界，通过非经典途径分泌，在无配体情况下也能保持活性，要求还原性环境。半乳凝集素-3在人类基因组中由单个基因编码，位于14号染色体q21-22位点，在人体主要由激活的巨噬细胞分泌，可与细胞内糖蛋白、细胞外基质和细胞表面分子相互作用，参与细胞黏附、增殖、活化、凋亡等生物学过程。
目前商业途径获得的凝集素大多都是植物凝集素，例如对高甘露糖具有特异亲和力的伴刀豆凝集素(ConA)，对N-乙酰葡萄糖氨及唾液酸具有特异亲和力的麦胚凝集素(WGA)，对半乳糖具有特异亲和力的蓖麻凝集素(RCA120)等。目前，植物凝集素富集方法在线虫、鼠肝、血清、尿液等复杂样品糖蛋白组学研究中已成功应用，但很少有动物凝集素被用于糖蛋白/糖肽富集的相关报道，可能是由于其成本高，重组表达困难，不易保存，亲和力低等原因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何富集糖蛋白。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了凝集素或其聚合物在下述X1)-X4)任一种中的应用：
X1)在富集β-半乳糖或其缀合物中的应用；
X2)在制备富集β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
X3)在检测β-半乳糖或其缀合物中的应用；
X4)在制备检测β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
所述凝集素为m1)或m2)：
m1)动物半乳凝集素；
m2)所述动物半乳凝集素的糖识别结构域。
上述应用中，所述动物可为a1)或a2)：
a1)哺乳动物；
a2)人。
所述凝集素可为半乳凝集素-3。
所述凝集素的聚合物可为所述动物半乳凝集素的四聚体。
上述应用中，所述动物半乳凝集素的糖识别结构域可为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列1的第37-176位的蛋白质；
A2)将序列表中序列1的第37-176位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述糖识别结构域的聚合物可为如下B1)、B2)或B3)：
B1)氨基酸序列是序列2的第37-614位的蛋白质；
B2)将序列表中序列2的第37-614位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)或B1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1的第37-176位或序列2的第37-614位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，为与序列1的第37-176位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。上述B2)中的蛋白质，为与序列2的第37-614位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)和B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列3的第109-528位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3的第109-528位所示的DNA分子编码序列1的第37-176位所示的蛋白质。
上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列4的第109-1842位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列4的第109-1842位所示的DNA分子编码序列2的第37-614位所示的蛋白质。
上述应用中，A3)所述融合蛋白质具体可为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)：
a1)序列表中序列1的第37-191位所示的蛋白质；
a2)序列表中序列1的第37-199位所示的蛋白质；
a3)序列表中序列1的第1-176位所示的蛋白质；
a4)序列表中序列1的第1-191位所示的蛋白质；
a5)序列表中序列1所示的蛋白质；
B3)所述融合蛋白质具体可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)：
b1)序列表中序列2的第37-629位所示的蛋白质；
b2)序列表中序列2的第37-637位所示的蛋白质；
b3)序列表中序列2的第1-614位所示的蛋白质；
b4)序列表中序列2的第1-629位所示的蛋白质；
b5)序列表中序列2所示的蛋白质。
本发明还提供了所述凝集素的生物素标记物，或所述凝集素的聚合物的生物素标记物，或与所述凝集素相关的生物材料，或与所述凝集素的聚合物相关的生物材料在下述X1)-X4)任一种中的应用：
X1)在富集β-半乳糖或其缀合物中的应用；
X2)在制备富集β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
X3)在检测β-半乳糖或其缀合物中的应用；
X4)在制备检测β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
所述与所述凝集素相关的生物材料为下述C1)至C5)中的任一种：
C1)编码所述凝集素的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因细胞系；
所述与所述凝集素的聚合物相关的生物材料为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码所述凝集素的聚合物的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因细胞系。
上述应用中，C1)所述核酸分子可为如下c1)-c8)中的任一种：
c1)编码序列是序列表中序列3的第109-528位的cDNA分子或DNA分子；
c2)编码序列是序列表中序列3的第109-573位的cDNA分子或DNA分子；
c3)编码序列是序列表中序列3的第109-600位的cDNA分子或DNA分子；
c4)编码序列是序列表中序列3的第1-528位的cDNA分子或DNA分子；
c5)编码序列是序列表中序列3的第1-573位的cDNA分子或DNA分子；
c6)序列表中序列3所示的DNA分子；
c7)与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述凝集素的cDNA分子或DNA分子；
c8)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述凝集素的cDNA分子或DNA分子；
D1)所述核酸分子可为如下d1)-d8)中的任一种：
d1)编码序列是序列表中序列4的第109-1842位的cDNA分子或DNA分子；
d2)编码序列是序列表中序列4的第109-1887位的cDNA分子或DNA分子；
d3)编码序列是序列表中序列4的第109-1914位的cDNA分子或DNA分子；
d4)编码序列是序列表中序列4的第1-1842位的cDNA分子或DNA分子；
d5)编码序列是序列表中序列4的第1-1887位的cDNA分子或DNA分子；
d6)序列表中序列4所示的DNA分子；
d7)与d1)或d2)或d3)或d4)或d5)或d6)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述凝集素的聚合物的cDNA分子或DNA分子；
d8)在严格条件下与d1)或d2)或d3)或d4)或d5)或d6)或d7)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述凝集素的聚合物的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述凝集素或其聚合物的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述凝集素或其聚合物的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述凝集素或其聚合物且具有所述凝集素或其聚合物的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述凝集素或所述凝集素的聚合物的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，C2)所述的含有编码所述凝集素的核酸分子的表达盒(凝集素基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述凝集素的DNA，该DNA不但可包括启动所述凝集素基因转录的启动子，还可包括终止所述凝集素基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
D2)所述的含有编码所述凝集素的聚合物的核酸分子的表达盒(凝集素的聚合物基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述凝集素的聚合物的DNA，该DNA不但可包括启动所述凝集素的聚合物基因转录的启动子，还可包括终止所述凝集素的聚合物基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述凝集素基因表达盒或所述凝集素的聚合物基因表达盒的重组载体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a(+)载体。
所述重组载体具体可为pET28a-Gal3C或pET28a-Tetra-Gal3C。所述pET28a-Gal3C为将pET-28a(+)载体的EcoR I和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3的第109-573位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pET28a-Gal3C含有序列表中序列3所示的DNA片段，能表达序列表中序列1所示的蛋白质。
所述pET28a-Tetra-Gal3C为将pET-28a(+)载体的EcoR I和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第109-1887位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pET28a-Tetra-Gal3C含有序列表中序列4所示的DNA片段，能表达序列表中序列2所示的蛋白质。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌。
所述重组微生物可为将所述pET28a-Gal3C或所述pET28a-Tetra-Gal3C导入所述微生物中得到的重组微生物。
上述应用中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
本发明还提供了β-半乳糖或其缀合物的富集产品，所述产品含有所述凝集素或其聚合物，或利用生物素标记所述凝集素或其聚合物得到的生物素标记物。
所述产品可由所述生物素标记物与亲和层析分离介质结合得到，所述亲和层析分离介质含有链霉亲和素。
所述亲和层析分离介质可通过将链霉亲和素键合在琼脂糖凝胶微球上得到。
所述亲和层析分离介质具体可为Thermo Scientific产品，货号为Prod#20359。
本发明还提供了下述Y1)或Y2)或Y3)的方法：
Y1)β-半乳糖或其缀合物的富集方法，包括：利用所述凝集素或其聚合物，或所述产品富集β-半乳糖或其缀合物，完成所述β-半乳糖或其缀合物的富集；
Y2)β-半乳糖或其缀合物的检测方法，包括：利用所述凝集素或其聚合物，或所述产品检测β-半乳糖或其缀合物，实现所述β-半乳糖或其缀合物的检测；
Y3)所述凝集素或其聚合物的制备方法，包括：将所述凝集素或其聚合物的编码基因导入生物细胞中，得到表达所述凝集素或其聚合物的重组细胞，使所述重组细胞中所述凝集素或其聚合物的编码基因表达，得到所述凝集素或其聚合物。
上述方法中，利用所述产品富集β-半乳糖或其缀合物可包括：将样品加至所述产品中，然后利用洗脱液洗脱，收集洗脱后的液体，即得到β-半乳糖或其缀合物的富集产物。
所述洗脱液可为尿素溶液。所述尿素溶液可为由水和尿素组成的溶液。所述尿素溶液中尿素的浓度可为8M。
上述方法中，所述生物细胞可为动物细胞或微生物。所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌。所述重组细胞可为将所述pET28a-Gal3C或所述pET28a-Tetra-Gal3C导入所述生物细胞中得到的重组细胞。
本发明中，所述β-半乳糖的缀合物可为由β-半乳糖与蛋白质形成的糖蛋白。
本发明制备了含有一个糖识别结构域及其四重串联重复CRD的生物素化的截短型且非磷酸化的重组人半乳凝集素-3，并对其分子量、纯度、生物素化、糖蛋白结合特征等进行了分析，然后将其固定到链霉亲和素琼脂糖小珠上，制作成凝集素亲和柱，并应用于糖蛋白的富集。该方法表达的重组人半乳凝集素-3不仅为人半乳凝集素-3的生物学功能研究提供了实验材料，同时为糖蛋白富集提供了一种新的研究工具，有助于疾病生物标志物和治疗靶标的发现。
另外，目前动物凝集素富集糖蛋白组的研究中的主要难点在于：1)采用异源表达制备动物凝集素，得到的产品是不溶性的，活性会受到很大的影响；2)异源表达制备的动物凝集素，其修饰水平往往跟其天然水平不一致，导致其结构与天然的动物凝集素存在差异。本发明中成功地解决了这两个问题，制备的重组人半乳凝集素-3，可溶性非常好，且蛋白序列上没有其他修饰，在表达菌株内自然折叠可以得到有活性的重组蛋白；四重化的凝集素，具备更强的结合能力。本发明与植物凝集素的富集糖蛋白不同，利用本发明的重组人半乳凝集素-3富集糖蛋白是具备特异性的，可以特异富集半乳凝集素-3，能够与半乳凝集素-3的功能产生多方面的联系。
附图说明
图1为pET28a-Gal3C和pET28a-Tetra-Gal3C的图谱。
图2为Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C的SDS-PAGE和免疫印迹分析。Gal3C表示Bio-Gal3C；Tetra-Gal3C表示Bio-Tetra-Gal3C。
图3为凝集素亲和柱富集糖蛋白能力的分析结果。A图为六种标准蛋白的SDS-PAGE结果。B图为六种标准蛋白在利用Bio-Gal3C作为“一抗”的免疫印迹结果。C图为六种标准蛋白在利用Bio-Tetra-Gal3C作为“一抗”的免疫印迹结果。D图为Gal3C凝集素亲和柱富集糖蛋白的检测结果。E图为Tetra-Gal3C凝集素亲和柱富集糖蛋白的检测结果。D和E中，泳道M为F、AF、RB、Mb和T溶液等体积的混合液，泳道E为洗脱液，泳道UB为洗涤液；泳道CM为链霉素亲和琼脂糖凝胶材料。F图为Gal3C凝集素亲和柱单独富集F、AF、RB和T溶液中的糖蛋白的检测结果，泳道E均为洗脱液，泳道F、AF、RB和T分别为F、AF、RB和T溶液。
图4为Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C以及凝集素亲和柱富集糖蛋白流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pBirA质粒是文献(Alex S.Powlesland et al.，A novelmechanism for LSECtin binding to Ebola virus surface glycoprotein throughtruncated glycans，J Biol Chem.2008January 4；283(1):593–602.)中的质粒birA，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1：人半乳凝集素糖识别结构域及其四聚体的制备
本实施例制备了人半乳凝集素糖识别结构域及其四聚体的融合蛋白，人半乳凝集素糖识别结构域及其四聚体的氨基酸序列分别为序列表中序列1的第37-176位和序列2的第37-614位。
1、DNA分子合成
合成人半乳凝集素糖识别结构域及其四聚体的融合蛋白的编码基因。
人半乳凝集素糖识别结构域的融合蛋白的编码基因为序列表中序列3的第109-573位所示的DNA分子，序列3的第109-528位编码序列表中序列1的第37-176位所示的人半乳凝集素糖识别结构域，序列3的第529-573位编码序列表中序列1的第177-191位所示的Avi-tag。
人半乳凝集素糖识别结构域四聚体的融合蛋白的编码基因为序列表中序列4的第109-1887位所示的DNA分子，序列4的第109-1842位编码序列表中序列2的第37-614位所示的人半乳凝集素糖识别结构域四聚体，序列4第1843-1887位编码序列表中序列2的第615-629位所示的Avi-tag。
2、重组载体的构建
将pET-28a(+)载体的EcoR I和XhoI识别序列间的DNA片段替换为人半乳凝集素糖识别结构域的融合蛋白的编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28a-Gal3C。pET28a-Gal3C含有序列表中序列3所示的DNA片段，能表达序列表中序列1所示的蛋白质，载体图谱如图1所示。
其中，序列3的第1-108位为pET-28a(+)载体上的序列，编码序列1的第1-36位；序列3的第109-528位为人半乳凝集素糖识别结构域的DNA序列，编码序列1的第37-176位所示的人半乳凝集素糖识别结构域；序列3的第529-573位为Avi-tag的DNA序列，编码序列1的第177-191位所示的Avi-tag；序列3的第574-600位为pET-28a(+)载体上的序列，编码序列1的第192-199位。
将pET-28a(+)载体的EcoR I和XhoI识别序列间的DNA片段替换为人半乳凝集素糖识别结构域四聚体的融合蛋白的编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28a-Tetra-Gal3C。pET28a-Tetra-Gal3C含有序列表中序列4所示的DNA片段，能表达序列表中序列2所示的蛋白质，载体图谱如图1所示。
其中，序列4的第1-108位为pET-28a(+)载体上的序列，编码序列2的第1-36位；序列4的第109-1842位为人半乳凝集素糖识别结构域的DNA序列，编码序列2的第37-614位所示的人半乳凝集素糖识别结构域；序列4的第1843-1887位为Avi-tag的DNA序列，编码序列2的第615-629位所示的Avi-tag；序列4的第1888-1914位为pET-28a(+)载体上的序列，编码序列2的第630-637位。
3、重组菌的构建
取-80℃冻存的BL21(DE3)化学转化感受态细胞(康为世纪生物科技有限公司)各100μL置于冰上融化，将1μg重组载体pET28a-Gal3C和pET28a-Tetra-Gal3C分别与1μgpBirA质粒加入到BL21(DE3)化学转化感受态细胞中，轻柔震荡，然后置冰上30分钟。将感受态细胞迅速放置于42℃水浴90秒，然后置冰上90秒，最后向离心管中加入1ml无菌的LB培养基，37℃，160rpm震荡培养1小时。在室温下8000rpm离心1分钟，去上清，将沉淀菌体用100μL的LB培养基重悬，然后涂布相应的抗性平板。通过卡那青霉素与氯霉素的双重抗性筛选平板来选择得到含有pET28a-Gal3C与pBirA质粒的重组菌(记为BL21-Gal3C/BirA)以及含有pET28a-Tetra-Gal3C与pBirA质粒的重组菌(记为BL21-Tetra-Gal3C/BirA)。
其中，pBirA质粒可以在IPTG的诱导下表达BirA蛋白，BirA蛋白可以在Avi-tag的赖氨酸残基上添加一个生物素分子。
4、蛋白表达与纯化
将BL21-Gal3C/BirA和BL21-Tetra-Gal3C/BirA分别按照如下步骤进行目的蛋白的表达与纯化：
1)蛋白表达：将菌株接种于含有50μg/ml卡那青霉素，34μg/ml氯霉素的无菌LB培养基中，37℃，220rpm恒温摇床震荡培养过夜。取2ml菌液转接到200ml含相同抗生素的新鲜LB培养基中，37℃，160rpm恒温摇床振荡培养1.5小时，使培养液的OD 600值达到0.6，向培养液中加入在培养液中终浓度为0.1mM的IPTG及终浓度为10μg/ml的生物素，然后30℃，120rpm恒温摇床震荡培养8小时，诱导Gal3C和Tetra-Gal3C重组蛋白的表达和生物素化，培养结束将得到的培养液离心，收集菌体。
2)破菌：向菌体中加入20mL的4℃预冷的结合缓冲液(该缓冲液的溶剂为25mM的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度为500mM NaCl，1g/100ml cocktail蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，S8820)，pH 7.8)，重悬菌体，得到菌体悬液，将菌体悬液置于冰浴中超声破菌(超声条件为：200W；开2s，关2s，99次，重复4次)，超声结束得到超声产物；将超声产物于10000g下离心30min，收集上清液，即得到蛋白提取液。
3)利用镍柱纯化目的蛋白：用20mL的结合缓冲液活化Ni-NTA-Agarose一次。将蛋白提取液重复过3遍柱子，让目的蛋白结合到镍柱上。之后用20mL的结合缓冲液(该缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM tris和500mM NaCl，pH 8.0)洗镍柱1次，洗去非特异性结合蛋白。然后用40mL的洗涤缓冲液(该缓冲液的溶剂为25mM的Tris-HCl，溶质及其浓度为500mM的NaCl,pH 6.0)洗镍柱1次。而后用50mL的40mM咪唑溶液(该溶液为向上述结合缓冲液中添加咪唑得到的溶液，该溶液中咪唑的含量为40mM咪唑，pH 6.0)洗镍柱2次。然后再用40mL的80mM咪唑溶液(该溶液为向上述结合缓冲液中添加咪唑得到的溶液，该溶液中咪唑的含量为80mM咪唑，pH 6.0)洗镍柱1次。最后用10mL的250mM咪唑溶液(该溶液为向上述结合缓冲液中添加咪唑得到的溶液，该溶液中咪唑的含量为250mM咪唑，pH 6.0)过镍柱洗脱蛋白，得到蛋白洗脱液。
4)透析：透析袋用水洗干净后用透析夹夹住底部，加入蛋白洗脱液后，用透析夹封口，置于含1L透析液(该透析液为将50mL的10×PBS(pH7.8)、400mL水及50mL甘油混合得到的溶液)的烧杯中，用保鲜膜封口后置于4℃冰箱，打开磁力搅拌器搅拌过夜(约12h)，重复此步骤一次，得到纯化的目的蛋白，即纯化的生物素标记的人半乳凝集素糖识别结构域融合蛋白(记为Bio-Gal3C)及纯化的生物素标记的人半乳凝集素糖识别结构域四聚体融合蛋白(记为Bio-Tetra-Gal3C)。
对得到的Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C进行测序，结果显示，Bio-Gal3C的氨基酸序列为序列表中序列1，分子量约22.5KD，Bio-Tetra-Gal3C的氨基酸序列为序列表中序列2，分子量约71.1KD。
对得到的Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C进行SDS-PAGE和免疫印迹分析，利用BSA作为对照，结果如图2所示。图2中A图为SDS-PAGE结果，显示得到的Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C的纯度高达95％以上，且蛋白实际分子量与理论分子量接近，表明蛋白表达与纯化成功。图2中B图为免疫印迹分析结果，所用抗体为链霉亲和素-HRP(康为世纪生物科技有限公司，CW0116)，结果显示，目的蛋白均成功被生物素标记。
按照上文1)-4)的步骤，在步骤1)中不添加生物素，其他步骤均不变，进行目的蛋白的表达、纯化和透析，得到纯化后的未被生物素标记的目的蛋白，记为Gal3C与Tetra-Gal3C。对得到的Gal3C与Tetra-Gal3C进行测序，结果显示，Gal3C的氨基酸序列为序列表中序列1，Tetra-Gal3C的氨基酸序列为序列表中序列2。
实施例2：利用实施例1的Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C富集糖蛋白
利用实施例1的Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C富集糖蛋白，所用标准蛋白为：牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)，胎球蛋白A(F)(Sigma)，去唾液酸的胎球蛋白A(AF)(Sigma)，核糖核酸酶B(RB)(Sigma)，马心肌红蛋白(Mb)(Sigma)，牛转铁蛋白(T)(Sigma)。其中，F、AF、RB和T是N-糖蛋白(即蛋白N端连接有β-半乳糖)，BSA和Mb是非糖蛋白。
将各标准蛋白分别利用PBS溶解，分别得到六种浓度均为1μg/uL的蛋白溶液；将6种标准蛋白进行SDS-PAGE分析，如图3中A所示，结果显示蛋白纯度都在90％以上，BSA与F和AF的分子量接近。
一、免疫印迹分析Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C糖蛋白的亲和力
将六种标准蛋白转印到PVDF膜上，然后与Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C(作为“一抗”)孵育，孵育结束后，利用PBS洗涤PVDF膜，然后将PVDF膜与链霉亲和素-HRP孵育，最后用DAB或ECL试剂盒显色。Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C均能结合N-糖蛋白F、AF、RB和T，而不与非糖蛋白BSA和Mb结合，表明Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C作为“一抗”检测糖蛋白的灵敏度高，且具有糖蛋白特异性结合能力。Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C的结果如图3中B和C所示。
二、两种凝集素亲和柱富集糖蛋白能力的检测
1、凝集素亲和柱的制备
(1)加200μL的链霉亲和素琼脂糖小球(Thermo Scientific,Prod#20359，即将链霉亲和素(Streptavidin)键合在琼脂糖凝胶微球上形成的亲和层析分离介质)到旋转柱(Thermo Scientific)中，用200μL 4℃预冷的PBS平衡柱子2次。
(2)步骤(1)完成后，向柱子中加入500μg的实施例1的Bio-Gal3C或Bio-Tetra-Gal3C，4℃旋转孵育1小时固定Bio-Gal3C或Bio-Tetra-Gal3C，然后用注射器推压收集未结合于链霉亲和素琼脂糖小球上的Bio-Gal3C或Bio-Tetra-Gal3C，然后用PBS洗柱2次，即得到凝集素亲和柱，将利用Bio-Gal3C和Bio-Tetra-Gal3C得到的凝集素亲和柱分别记为Gal3C凝集素亲和柱和Tetra-Gal3C凝集素亲和柱。
如图4所示，Gal3C只含有一个糖识别结构域，Tetra-Gal3C则通过聚甘氨酸接头连接了四个糖识别结构域。通过与链霉亲和素琼脂糖小球混合孵育，由于生物素环形结构中的咪唑酮环能与链霉亲和素发生共价结合，致使Bio-Gal3C与Bio-Tetra-Gal3C能高亲和力和高特异性地固定于链霉亲和素琼脂糖小球上，从而制作成凝集素亲和柱，并可应用于糖蛋白的亲和富集。
2、糖蛋白的富集
(1)所用待测溶液为：F、AF、RB、Mb和T溶液等体积的混合液，F溶液，AF溶液，RB溶液和T溶液；
(2)将200μL待测溶液加至步骤1得到的凝集素亲和柱中，4℃旋转孵育过夜；将F、AF、RB、T和Mb的溶液等体积混合，得到待测溶液；
(3)步骤(2)完成后，将凝集素亲和柱置于冰上自然沉淀，利用注射器推压收集未结合蛋白，然后利用400μL的PBS过柱洗涤非特异性结合蛋白，收集洗涤液；
(4)步骤(3)完成后，向凝集素亲和素中添加100μL的8M尿素溶液(该溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为8M尿素)，37℃旋转孵育30min洗脱糖蛋白，用注射器推压收集洗脱液，重复洗脱一次，洗脱液包含富集的糖蛋白。
(5)两种凝集素亲和柱富集糖蛋白的能力分析：利用SDS-PAGE分析各待测溶液的洗脱液和洗涤液中的蛋白。
结果如图3中D和E所示，5种标准蛋白混合液(F、AF、RB、Mb和T混合液)能够在SDS-PAGE上清楚地区分成5个条带，经过凝集素亲和柱富集之后，洗脱液中含有F、AF、RB和T(四条条带)，且AF的含量最高，表明两种凝集素亲和柱均具有糖蛋白特异结合能力，并且偏好性结合AF。而洗涤液中包含五种蛋白(五条条带)，这是因为每种蛋白的糖基化修饰程度并不相同，未发生修饰或者弱结合的蛋白都被洗涤出来。
此外，利用两种凝集素亲和柱分别单独富集F溶液、AF溶液、RB溶液和T溶液中的糖蛋白，发现，两种凝集素亲和柱也均能很好的富集这四种糖蛋白，Gal3C凝集素亲和柱单独富集F、AF、RB和T溶液中的糖蛋白的检测结果如图3中F所示。
这些结果都表明步骤1的两种凝集素亲和柱能特异性地结合糖蛋白，因而能用于糖蛋白富集。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院、北京蛋白质组研究中心
<120> 一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Ala Gly Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu
35 40 45
Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val
50 55 60
Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp
65 70 75 80
Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val
85 90 95
Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg
100 105 110
Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val
115 120 125
Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu
130 135 140
Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu
145 150 155 160
Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile
165 170 175
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu
180 185 190
Glu His His His His His His
195
<210> 2
<211> 637
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Ala Gly Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu
35 40 45
Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val
50 55 60
Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp
65 70 75 80
Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val
85 90 95
Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg
100 105 110
Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val
115 120 125
Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu
130 135 140
Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu
145 150 155 160
Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu
180 185 190
Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly
195 200 205
Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly
210 215 220
Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg
225 230 235 240
Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu
245 250 255
Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile
260 265 270
Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala
275 280 285
His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser
290 295 300
Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr
305 310 315 320
Met Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Pro Leu Ile Val Pro Tyr
325 330 335
Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile Thr Ile
340 345 350
Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp Phe Gln
355 360 365
Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn Glu Asn
370 375 380
Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn Trp Gly
385 390 395 400
Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys Pro Phe
405 410 415
Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala Val Asn
420 425 430
Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu Asn Glu
435 440 445
Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser Ala Ser
450 455 460
Tyr Thr Met Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Pro Leu Ile Val
465 470 475 480
Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile
485 490 495
Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp
500 505 510
Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn
515 520 525
Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn
530 535 540
Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys
545 550 555 560
Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala
565 570 575
Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu
580 585 590
Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser
595 600 605
Ala Ser Tyr Thr Met Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
610 615 620
Ile Glu Trp His Glu Leu Glu His His His His His His
625 630 635
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcgc tgggccactg 120
attgtgcctt ataacctgcc tttgcctggg ggagtggtgc ctcgcatgct gataacaatt 180
ctgggcacgg tgaagcccaa tgcaaacaga attgctttag atttccaaag agggaatgat 240
gttgccttcc actttaaccc acgcttcaat gagaacaaca ggagagtcat tgtttgcaat 300
acaaagctgg ataataactg gggaagggaa gaaagacagt cggttttccc atttgaaagt 360
gggaaaccat tcaaaataca agtactggtt gaacctgacc acttcaaggt tgcagtgaat 420
gatgctcact tgttgcagta caatcatcgg gttaaaaaac tcaatgaaat cagcaaactg 480
ggaatttctg gtgacataga cctcaccagt gcttcatata caatgatagg cctgaacgac 540
atctttgaag cccagaaaat tgaatggcat gaactcgagc accaccacca ccaccactga 600
<210> 4
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcgc cggccctctg 120
atcgttccgt acaacttacc gttaccgggt ggtgtggtgc cgcgcatgtt aatcaccatc 180
ctgggcacag tgaagccgaa cgcaaaccgc attgcactgg acttccaacg tggtaatgac 240
gtggcctttc acttcaaccc gcgcttcaat gaaaataatc gccgtgtgat cgtgtgcaat 300
accaaactgg acaacaactg gggtcgcgaa gaacgccaaa gcgtgtttcc gttcgaaagt 360
ggcaaaccgt ttaaaatcca ggttctggtg gagccggatc acttcaaggt ggccgtgaat 420
gacgcccatc tgctgcagta caaccaccgc gttaaaaagt taaatgagat cagcaaatta 480
ggcatcagcg gcgatattga tctgaccagc gccagctaca ccatgattgg cggtggtggt 540
ggtggcgccg gtccgttaat cgttccgtat aacttaccgc tgccgggtgg tgtggtgcct 600
cgtatgctga tcaccatcct gggtacagtt aaaccgaatg ccaatcgcat cgccttagac 660
ttccaacgcg gtaacgatgt ggccttccat ttcaacccgc gtttcaacga gaacaaccgc 720
cgtgtgattg tgtgtaatac caagctggat aacaactggg gccgtgagga gcgtcaaagt 780
gtgttcccgt ttgagagtgg caagccgttc aagatccaag tgctggtgga gcctgaccat 840
tttaaagttg ccgtgaacga cgcccacctg ttacaataca accatcgtgt gaagaagtta 900
aatgaaatta gtaaactggg catcagcggc gatatcgacc tgaccagtgc cagctatacc 960
atgattggtg gcggtggtgg tggtgccggt ccgctgattg tgccgtacaa tttacctctg 1020
cctggtggcg tggtgccgcg tatgctgatc accattctgg gcacagtgaa gcctaatgcc 1080
aaccgcatcg ccttagactt tcaacgcggc aacgacgtgg catttcactt caatccgcgc 1140
tttaacgaga ataaccgccg cgtgatcgtt tgcaacacca aactggacaa taattggggt 1200
cgcgaagagc gccagagcgt gttcccgttc gagagcggca aaccgttcaa aatccaagtg 1260
ctggtggaac cggatcactt caaggttgcc gtgaatgatg cacacctgct gcaatacaac 1320
catcgcgtta agaagctgaa cgaaatcagc aagctgggca tcagcggcga cattgatctg 1380
acaagcgcaa gttacaccat gatcggtggc ggtggtggtg gtgcaggtcc gttaattgtg 1440
ccgtataacc tgcctctgcc tggcggtgtt gttccgcgta tgctgatcac catcctgggt 1500
accgttaagc cgaacgccaa tcgtatcgcc ctggattttc agcgcggtaa cgatgtggcc 1560
tttcacttta atccgcgttt taatgaaaac aatcgccgcg tgatcgtttg taacacaaag 1620
ctggacaata attggggtcg cgaggaacgt cagagcgttt tccctttcga gagtggcaag 1680
ccgttcaaaa tccaggtgct ggtggagccg gaccatttca aagtggccgt gaatgacgca 1740
cacctgctgc agtacaatca ccgtgtgaaa aagctgaatg aaatcagcaa actgggcatc 1800
agcggtgaca ttgacctgac cagcgcaagt tatacaatga tcggcctgaa cgacatcttt 1860
gaagcccaga aaattgaatg gcatgaactc gagcaccacc accaccacca ctga 1914

Claims (1)

1.人半乳凝集素糖识别结构域或其四聚体在下述X1）或X2）中的应用：
X1）在制备富集β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
X2）在制备检测β-半乳糖或其缀合物产品中的应用；
所述人半乳凝集素糖识别结构域为序列表中序列1所示的蛋白质；
所述四聚体为序列表中序列2所示的蛋白质；
所述缀合物为由β-半乳糖与蛋白质形成的糖蛋白。
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