CN110128549B - 脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents

脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用。脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原包括DGP‑1肽段、白介素15蛋白和DGP‑2肽段，所述DGP‑1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DGP‑2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原用于乳糜泄检测时灵敏度好、特异性高且制备成本低，可以测定血清中的IgG‑DGP抗体，特别是能够用于IgA缺陷患者以及婴幼儿人群中潜在乳糜泄患者的检测。

Description

脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表 达载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及乳糜泻诊断技术领域，特别是涉及一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用。
背景技术
乳糜泻(celiac disease,CD)，又称特发性脂肪泻、成人乳糜泻、非热带口炎性腹泻或麦胶性肠病，是一种遗传易感个体因摄入含麸质蛋白的谷物(小麦、大麦和祼麦)及其制品而诱发的慢性自身免疫性肠病。乳糜泻遗传相关基因研究表明，该疾病与特殊的人类白细胞抗原II型基因密切相关，如定位于染色体6p21上的HLA-DQ2和HLA-DQ8基因。
乳糜泄的诊断方法有基因检测、肠道活检以及血清学检测。基因检测主要用于筛查携带有HLA-DQ2和HLA-DQ8基因型的乳糜泄高危人群，然而受环境影响，只有3％携带这两种基因型的人群会发展成乳糜泄。肠道活检是诊断乳糜泄的黄金标准，世界胃肠病学组织推荐的乳糜泄诊断标准是小肠活检阳性，同时血清学检测阳性可确诊。血清学检测以IgA(免疫球蛋白A)为基础，有已经过时的IgA抗麦胶蛋白抗体(AGA)，以及随后出现的IgA抗肌内膜抗体(anti-EMA)和IgA抗组织转谷氨酰胺酶抗体(anti-tTG)，然而对于IgA缺陷的患者，可能出现血清anti-tTG和anti-EMA假阴性表现。IgG-DGP由于其高敏感性和特异性，可作为选择性IgA缺陷患者最精确的检测手段。特别是在免疫系统尚未发育成熟的婴儿体内，DGP抗体能够比anti-tTG及anti-EMA更早的诊断乳糜泄，高浓度DGP抗体与肠道损伤的严重程度呈正相关。
发明内容
基于此，有必要提供一种灵敏度好、特异性高的可用于乳糜泄诊断的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，包括白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段，所述DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中，还包括六聚组氨酸标签和Flag标签，所述白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段构成融合蛋白，所述六聚组氨酸标签和所述Flag标签分别连接于所述融合蛋白的两端。
在其中一个实施例中，所述六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15蛋白、DGP-2肽段和Flag标签依次通过连接肽连接。
本发明还提供了一种重组抗原表达基因，包括与上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述重组抗原表达基因和表达载体。
在其中一个实施例中，所述表达载体为pET-21a(+)、pET-28a(+)或pET-30a(+)。
本发明还提供了上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、上述重组抗原表达基因或上述重组表达载体在制备用于诊断乳糜泻的产品中的应用。
本发明还提供了一种乳糜泻诊断试剂盒，包括上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
在其中一个实施例中，还包括磁微球，所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原与所述磁微球偶联，所述磁微球带有氨基基团。
本发明还提供了一种上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的制备方法，包括以下步骤：获得与所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列，并进行双酶切和连接以插入到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主进行表达，然后将表达产物分离、纯化，得到所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
本发明的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原选择两个DGP优势表位肽段，即DGP-1肽段和DGP-2肽段，有利于提高检测灵敏度和特异性。进一步地，将DGP-1肽段和DGP-2肽段分别连接在白介素15蛋白的两端，一方面白介素15蛋白属于人体内源性蛋白，不具有免疫原性，从而可有效降低背景噪音，避免出现假阳性的问题；另一方面，白介素15蛋白本身就与乳糜泻的免疫系统反应流程相关，当麸质蛋白降解生成的一些大的肽段透过上皮屏障，进入粘膜固有层，肽段中的谷氨酰胺可被组织转谷氨酰胺酶脱酰胺生成带负电荷的谷氨酸，成为脱酰胺基麦胶蛋白多肽，从而与抗原递呈细胞表面的HLA-DQ2和HLA-DQ8亲和力增加，使肽段更易被抗原递呈细胞识别，激活的反应性CD4+T细胞释放细胞因子IL-15，因此乳糜泻患者血清中的IL-15浓度更高，将IL-15与DGP-1肽段和DGP-2肽段融合更有利于提高检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为实施例1中对脱酰胺基麦胶蛋白定标品进行检测得到的标准曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，包括白介素15蛋白和分别连接于白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段，DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，白介素15蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。可以理解，DGP-1肽段和DGP-2肽段的位置可以相互调换，即DGP-1肽段可以连接于白介素15蛋白的N端或C端。
脱酰胺基麦胶蛋白多肽(DGP)是谷类食物中的醇溶蛋白因富含脯氨酸而在经过酶消化后，未完全水解的原始多肽片段被吸收并经过tTG(组织转谷氨酰胺酶)修饰的多肽，多肽上某些位点的谷氨酰胺残基脱酰胺基变成谷氨酸残基。DGP经过刺激免疫系统，产生了抗DGP的自身抗体。DGP的原始多肽可以来源于α/β型麦胶蛋白，也可以来源于γ型或者ω型麦胶蛋白。IgG-DGP由于其高敏感性和特异性，可作为选择性IgA缺陷患者最精确的检测手段，特别是在免疫系统尚未发育成熟的婴儿体内，DGP抗体能够比anti-tTG及anti-EMA更早的诊断乳糜泄，高浓度DGP抗体与肠道损伤的严重程度呈正相关。
目前，多肽主要依靠化学法和重组表达法合成。化学法即多肽固相合成法(SPPS)，是一种通过化学反应合成预设氨基酸序列的多肽的方法。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体氯甲基聚苯乙烯树脂上。再利用三氟乙酸脱掉氨基的保护基，然后氨基被保护的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺(DCC)活化，再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，以此重复操作，最后脱去保护基团，水解肽链与固相载体之间的酯键，就能在固相载体上生成一个预设的多肽。但是，化学合成出来的多肽因为疏水性强而造成稳定性低，而且丧失多肽的天然构象，导致用于检测抗体时灵敏度低，成本也较高。重组表达法则是将目标肽段，与一些常见的标签如谷胱甘肽S转移酶(Glutathione-S transferase,GST)、麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein,MBP)等融合表达。但是这些重组蛋白上的标签蛋白作为外源蛋白也同样具有免疫原性，当用这些重组蛋白作为抗原检测抗体时，容易导致背景噪音强，甚至出现假阳性的问题。
本发明的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原选择两个DGP优势表位肽段，即DGP-1肽段和DGP-2肽段，有利于提高检测灵敏度和特异性。进一步地，将DGP-1肽段和DGP-2肽段分别连接在白介素15蛋白的两端，一方面白介素15蛋白属于人体内源性蛋白，不具有免疫原性，从而可有效降低背景噪音，避免出现假阳性的问题；另一方面，白介素15蛋白本身就与乳糜泻的免疫系统反应流程相关，当麸质蛋白降解生成的一些大的肽段透过上皮屏障，进入粘膜固有层，肽段中的谷氨酰胺可被组织转谷氨酰胺酶脱酰胺生成带负电荷的谷氨酸，成为脱酰胺基麦胶蛋白多肽，从而与抗原递呈细胞表面的HLA-DQ2和HLA-DQ8亲和力增加，使肽段更易被抗原递呈细胞识别，激活的反应性CD4+T细胞释放细胞因子IL-15，因此乳糜泻患者血清中的IL-15浓度更高，将IL-15与DGP-1肽段和DGP-2肽段融合更有利于提高检测的灵敏度和特异性。
综上所述，本发明提供的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原用于乳糜泄诊断时灵敏度好、特异性高且制备成本低，可以测定血清中的IgG-DGP抗体，特别是能够用于IgA缺陷患者以及婴幼儿人群中潜在乳糜泄患者的诊断，有效地弥补了anti-EMA和anti-tTG的不足，降低了假阳性的风险，非常适用于大规模乳糜泄疾病的筛查。可以理解，上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原既可以应用于IgG-DGP抗体的测定，也可以应用于IgA-DGP抗体的测定。
在一个具体示例中，脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原还包括六聚组氨酸标签和Flag标签，白介素15蛋白和分别连接于白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段构成融合蛋白，六聚组氨酸标签和Flag标签分别连接于融合蛋白的两端。可以理解，六聚组氨酸标签和Flag标签的位置可以调换，只需位于末端即可，例如当DGP-1肽段连接于白介素15蛋白的N端时，六聚组氨酸标签连接于DGP-1肽段的N端，Flag标签连接于DGP-2肽段的C端。六聚组氨酸标签的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。如此，一方面六聚组氨酸标签和Flag标签可便于融合蛋白的分离纯化，另一方面也可以提高融合蛋白的亲水性，从而有助于改善其水溶性和稳定天然构象，提高检测时的灵敏度和稳定性。可以理解，还可根据需要选择其他标签序列。
在一个具体示例中，六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15蛋白、DGP-2肽段和Flag标签依次通过连接肽连接，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。该具体示例的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，可以理解，根据表达载体或宿主的不同，氨基酸序列两端还可能增加额外的氨基酸，例如表达后宿主体内不存在加工修饰过程则起始密码子翻译的甲硫氨酸可被保留。
本发明一实施例的重组抗原表达基因，包括与上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列。可以理解，根据密码子的多样性，对应的核苷酸序列具有多种选择。
在一个具体示例中，重组抗原表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，该核苷酸序列是针对在大肠杆菌中表达的密码子优化后的DNA序列，表达效果较好。可以理解，为方便酶切与表达载体连接，该序列的上游带有Nde I位点，下游带有Hind III位点，在其他具体示例中，可根据所需要的酶切位点调整上下游的核苷酸序列。
本发明一实施例的重组表达载体，包括上述重组抗原表达基因和表达载体。
在一个具体示例中，表达载体为pET-21a(+)、pET-28a(+)或pET-30a(+)。可以理解，表达载体不限于此，例如其他质粒载体或病毒载体，可以根据需要进行选择。
本发明一实施例的上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因或重组表达载体在制备用于诊断乳糜泻的产品中的应用，该用于诊断乳糜泻的产品为乳糜泻诊断试剂盒。
本发明一实施例的乳糜泻诊断试剂盒，包括上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。应用上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的乳糜泻诊断试剂盒，可通过化学发光微粒子免疫分析(Chemiluminesent Microparticle Immuno Assay,CMIA)法测定DGP抗体，且具有灵敏度高、特异性高、重复性好、成本低等优点。
在一个具体示例中，乳糜泻诊断试剂盒还包括磁微球，脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原与磁微球偶联，磁微球带有氨基基团，从而磁微球可通过化学交联法与脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原偶联。
本发明一实施例的上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的制备方法，包括以下步骤：获得与上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列，并通过双酶切和连接插入到表达载体中得到重组表达载体，将重组表达载体转入宿主进行表达，然后将表达产物分离、纯化，得到脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
在一个具体示例中，与上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列可通过基因合成获得，宿主可根据表达载体的类型进行选择，例如大肠杆菌BL21(DE3)菌株等。
下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一、脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的制备
选择DGP优势表位肽段，氨基酸序列分别为SEQ ID No.1(命名为DGP-1肽段)和SEQID No.2(命名为DGP-2肽段)，以及IL-15蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3，六聚组氨酸标签的氨基酸序列为SEQ ID No.4，Flag标签的氨基酸序列为SEQ ID No.5，连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.6。六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15、DGP-2肽段和Flag标签均通过连接肽连接，融合成DGP重组抗原，序列为SEQ ID No.7。DGP重组抗原的DNA通过基因合成(通用生物系统(安徽)有限公司)获得，序列为SEQ ID No.8。该DGP重组抗原的DNA上游带有Nde I位点，下游带有Hind III位点。该DNA经过相应的限制性内切酶酶切，连接到用Nco I和Hind III酶切后的表达载体pET-21a(+)，得到重组质粒pET-21a(+)-DGP。
将该重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑取单克隆菌落接种至20mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜。次日吸取1％体积的过夜培养物至1 L新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600＝0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)于18℃诱导表达20h。4℃、10000g离心3min收集菌体，每升菌液的菌体用冰上预冷的40mL 50mM Tris 8.0/500mM NaCl缓冲液(缓冲液A)悬浮，高压均质机破碎，4℃、12000g离心30min，上清液使用0.22μm滤膜过滤，过镍柱。用10倍柱体积的缓冲液A平衡镍柱，加入上清液，用10倍柱体积的缓冲液A洗去未结合的蛋白，再用10倍柱体积的50mM Tris8.0/500mM NaCl/60mM咪唑缓冲液(缓冲液B)洗去杂蛋白，再用含有60mM～500mM咪唑的缓冲液梯度洗脱目的蛋白，选择纯度达90％的目的蛋白部分，在4℃环境下透析于含有20％甘油的PBS缓冲液中，-20℃保存备用。
二、乳糜泻诊断试剂盒的制备
(1)制备脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原包被的纳米磁珠：
取50mg羧基化的磁微粒(粒径为0.05μm～1μm)悬浮液，磁分离，留沉淀，然后使用20mM，pH 5.5MES缓冲液重悬，加入1mL新鲜制备的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg DGP重组抗原，室温下混悬6h，磁分离，去上清，用含2％BSA的100mM pH 8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到包被好的磁颗粒，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
(2)鼠抗人IgG标记吖啶酯的制备：
取50μL25mg/mL的鼠抗人IgG，加入150μL 0.1M pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用5mL GEDesalting预装柱脱盐处理，先使用TBS平衡层析柱，然后加入反应后的吖啶酯溶液，收集蛋白峰样品保存，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
(3)脱酰胺基麦胶蛋白定标品的制备：
用缓冲液(40mM Tris-Cl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将脱酰胺基麦胶蛋白IgG抗体配制成浓度为0U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、50U/mL、100U/mL，每瓶0.5mL分装冻干，4℃保存备用。
采用化学发光两步间接法对上述脱酰胺基麦胶蛋白定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图1所示。然后测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算上述乳糜泻诊断试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为2.0U/mL。
线性的检测：
对浓度为0U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、50U/mL和100U/mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.9996，另外，该试剂盒对脱酰胺基麦胶蛋白抗体样品检测的线性范围为0U/mL～100U/mL。
精密度测定：
取浓度为20U/mL及100U/mL的两个脱酰胺基麦胶蛋白抗体样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5％。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸和甘油酯，添加质量比按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10％为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标准，可用于临床实验室脱酰胺基麦胶蛋白抗体状况的准确评估。
对比例1
本对比例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于将白介素15替换为SUMO。相应地，制得的试剂盒的灵敏度为2.0U/mL，试剂盒批内及批间差为CV＝4.15％，CV＝16.25％，干扰性不满足NCCLS的文件标准。
对比例2
本对比例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于直接将DGP-1肽段和DGP-2肽段连接，不使用白介素15。相应地，制得的试剂盒的灵敏度为1.8U/mL，试剂盒批内及批间差为CV＝5.4％，CV＝17.36％，干扰性不满足NCCLS的文件标准。
对比例3
本对比例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于将DGP-1肽段替换为另一DGP表位肽段，氨基酸序列如下所示：QPEQPQQSFPEQERPF。相应地，制得的检测试剂盒的灵敏度为2.4U/mL，试剂盒批内及批间差为CV＝3.45％，CV＝17.05％，干扰性不满足NCCLS的文件标准。
实施例2
本实施例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于表达载体选择pET-28a(+)。相应地，制得的检测试剂盒的灵敏度为0.8U/mL，试剂盒批内及批间差为CV＝3.65％、CV＝4.87％，干扰性满足NCCLS的文件标准。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> 脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Glu Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu
1 5
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
His His His His His His
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 7
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
His His His His His His Gly Ser Gly Ser Pro Leu Gln Pro Glu Gln
1 5 10 15
Pro Phe Pro Gly Ser Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys
50 55 60
Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala
65 70 75 80
Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser
85 90 95
Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu
100 105 110
Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His
115 120 125
Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Pro Glu Gln
130 135 140
Leu Pro Gln Phe Glu Glu Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
145 150 155 160
Lys
<210> 8
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catatgcatc atcatcatca ccatggcagt ggtagtccgc tgcagccgga acagccgttt 60
ccgggcagtg gcagcaattg ggttaatgtg attagcgatc tgaaaaagat tgaagatctg 120
attcagagta tgcatattga tgccaccctg tataccgaaa gtgatgttca tccgagctgc 180
aaagtgaccg ccatgaaatg ctttctgctg gaactgcagg ttattagcct ggaaagcggt 240
gacgccagta ttcatgatac cgtggaaaat ctgattattc tggccaataa tagcctgagt 300
agtaatggta atgtgaccga aagcggttgc aaagaatgcg aagaactgga agaaaagaat 360
attaaggaat tcctgcagag ttttgttcat attgttcaga tgtttatcaa caccagcggt 420
agtggcagcc cggaacagct gccgcagttt gaagaaggta gtggcagtga ttataaagat 480
gatgataaat aaaagctt 498

Claims (10)

1.一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，由白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段组成，所述DGP-1肽段连接于所述白介素15蛋白的N端，所述DGP-2肽段连接于所述白介素15蛋白的C端，所述DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述白介素15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原还与六聚组氨酸标签和Flag标签连接，所述白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段构成融合蛋白，所述六聚组氨酸标签和所述Flag标签分别连接于所述融合蛋白的两端。
3.根据权利要求2所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，所述六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15蛋白、DGP-2肽段和Flag标签依次通过连接肽连接。
4.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
5.一种脱酰胺基麦胶蛋白重组表达载体，其特征在于，包括权利要求4所述的核酸分子和表达载体。
6.根据权利要求5所述的脱酰胺基麦胶蛋白重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET-21a(+)、pET-28a(+)或pET-30a(+)。
7.如权利要求1~3中任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5~6中任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白重组表达载体在制备用于诊断乳糜泻的产品中的应用。
8.一种乳糜泻诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
9.根据权利要求8所述的乳糜泻诊断试剂盒，其特征在于，还包括磁微球，所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原与所述磁微球偶联，所述磁微球带有氨基基团。
10.一种权利要求1~3任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获得编码所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的核酸分子，并进行双酶切和连接以插入到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主进行表达，然后将表达产物分离、纯化，得到所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101688865A (zh) * 2007-05-30 2010-03-31 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于特异性检测和吸附腹腔疾病和疱疹样皮炎相关抗体的方法和免疫吸附剂

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9923306D0 (en) * 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
WO2011112792A1 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 IMMCO Diagnostics, Inc. Compositions and methods for determining celiac disease
CN101838327B (zh) * 2010-05-24 2013-09-11 昆山贝瑞康生物科技有限公司 人il-15亚型蛋白及其制备方法和应用
WO2016054038A1 (en) * 2014-09-29 2016-04-07 Immusant, Inc. Use of hla genetic status to assess or select treatment of celiac disease
CN110128549B (zh) * 2019-05-27 2021-07-06 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101688865A (zh) * 2007-05-30 2010-03-31 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于特异性检测和吸附腹腔疾病和疱疹样皮炎相关抗体的方法和免疫吸附剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Adaptive and Innate Immune Responses in Celiac Disease》;Carmen Gianfrani;《Immunology Letters》;20050407;第99卷;第141-145页 *
《Chain A，INTERLEUKIN 15》;NCBI;《Genbank database》;20180514;第1页 *
《Serologic Assay Based on Gliadin-Related Nonapeptides as a Highly Sensitive and Specific Diagnostic Aid in Celiac Disease》;Elke tSchwerz;《Clinical Chemistry》;20041007;第50卷(第12期);第2370-2375页 *

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