CN108753797A - 一种樟芝免疫调节蛋白aca1及其编码基因与应用 - Google Patents

一种樟芝免疫调节蛋白aca1及其编码基因与应用 Download PDF

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李洪波
罗海燕
张树琴
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Abstract

本发明涉及一种樟芝免疫调节蛋白ACA1及其编码基因与应用，本发明提供的基因，是如下（1）‑（3）中的任一种DNA分子：（1）由序列表中序列1所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有免疫调节活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有免疫调节活性蛋白的DNA分子。本发明优化了ACA1的DNA序列，并提供了一种可以制备生物活性ACA1重组蛋白的方法。

Description

一种樟芝免疫调节蛋白ACA1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及利用生物技术领域，具体涉及樟芝免疫调节蛋白ACA1及其编码基因与应用。
背景技术
樟芝（又称为牛樟芝）是台湾特有的具有重要药用价值的真菌，有解毒、抗肿瘤、强化免疫等功效。樟芝已被分离鉴定的活性成分近百种，其中多糖和萜类化合物是其主要活性物质，而对活性蛋白的研究还很少。新发现的樟芝免疫调节蛋白倍受关注。樟芝免疫调节蛋白能活化免疫细胞并有抗肿瘤活性。目前，已从药用和食用真菌中分离到不少真菌免疫调节蛋白。2003年，从樟芝中分离到了三种免疫调节蛋白ACA1、ACA2和ACA3，其中ACA1具有促进巨噬细胞分泌TNF-α、NO及活化淋巴细胞的作用等。由于樟芝本身极度缺乏，利用基因工程表达该蛋白是大量获得该蛋白的唯一途径，但到目前为止，仅仅利用大肠杆菌表达系统实现了重组融合ACA1的表达，而非融合活性重组ACA1蛋白的制备方法尚未建立。
现有技术中将ACA1构建表达载体，然后转化到E. coli BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体或融合有大片段的蛋白。目前，还没有通过改造ACA1的DNA序列且优化ACA1表达纯化方法来高效生产ACA1重组蛋白的方法。利用基因工程技术，大量生产这类蛋白并对其生物活性进行开发，将为整个樟芝及其制品产业的开发提供新的思路和新的产品。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种樟芝免疫调节蛋白ACA1及其编码基因。
本发明提供基因，为编码樟芝免疫调节蛋白ACA1蛋白的基因，为如下（1）-（3）中任一一种的DNA分子：
（1）由序列表中序列1所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有免疫调节活性的蛋白的DNA分子；
（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有免疫调节活性的蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5 M NaPO4和1 mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 MNaPO4和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 M NaPO4和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5 ×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 M NaPO4和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。
其中，序列表中的序列1由354个脱氧核苷酸组成，本序列为成熟樟芝免疫调节蛋白ACA1的全长cDNA读码框，序列１编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白质。
由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。
本发明提供蛋白，是如下（1）或（2）：
（1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有免疫调节活性的由序列2衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由118个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。含有上述基因的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pET28的BamH I和Hind III酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。
本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原始载体优选为pET28载体。
还包括纯化蛋白的步骤：将表达得到的包涵体蛋白用复性液梯度透析复性，将复性后的蛋白再利用镍亲合层析柱纯化，然后用含高浓度咪唑的溶液洗脱，洗脱液再经透析和超滤后得到高纯度的经复性的可溶性重组ACA1蛋白。
根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的复性重组ACA1蛋白也属于本发明的保护范围。
制备蛋白的优选方法具体包括：
S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟樟芝免疫调节蛋白ACA1基因，并连接至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET28/ACA1，将重组载体pET28/ACA1转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET28/ACA1；用热激法将重组载体pET28/ACA1转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Kan抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET28/ACA1的大肠杆菌表达菌株转化子；
S2：包涵体ACA1蛋白的表达与提取：将步骤S1所得的包含有重组载体pET28/ACA1的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的LB液体培养基中培养至OD600为0.5~0.6时，加入浓度为0.1mM的IPTG，于37诱导12小时，然后超声破碎，离心取沉淀，将沉淀蛋白分别利用1 M尿素的缓冲液、2 M尿素的缓冲液和4 M尿素的缓冲液漂洗去除可溶性蛋白，最终将不可溶蛋白利用含8 M尿素的缓冲液（pH 8.0, 50 mM PBS）溶解得到纯化前的包涵体ACA1蛋白；
S3：包涵体ACA1蛋白的纯化：利用镍亲合层析柱对包涵体ACA1蛋白进行纯化，先高速离心，将含8 M尿素的缓冲液（pH 8.0, 50 mM PBS）溶解的包涵体ACA1蛋白上样到镍亲合层析柱，再用含8 M尿素的pH 6.0的PBS溶液漂洗亲合层析柱以去除杂蛋白，最后用含8 M尿素、100 mM甘氨酸的pH 4.5的溶液将目标蛋白洗脱下来，即可得纯度在95%以上的包涵体ACA1；
S4：包涵体ACA1蛋白的复性及纯化：取纯化的包涵体蛋白，利用A 液[4 mol/L 尿素，0.2 mol/L L-精氨酸（Arg），0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH]稀释蛋白至终浓度为100 μg/ml， 2- 8℃梯度透析复性，具体方法如下：A 液→B液（2 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH）→C液（1 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/LGSSG，2 mmol/L GSH）→D 液（0.5 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH）→E液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0），每步透析时长均为12 h，所有操作的温度均在2-8 ℃。透析结束后，4℃、12 000 g、离心30 min，将离心所得的上清加入到经30 ml缓冲液A（20 mmol/L PBSl、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0）平衡的含3 ml Ni+-NTA树脂的30 ml层析柱中，30 mL冰冷的漂洗缓冲液（0.5%Trition X-114、20 mmol/L PBS、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0，漂洗杂蛋白并去除内毒素（Triton X-114可去除内毒素），5 ml洗脱缓冲液(20 mmol/L PBS、100 mmol/LNaCl、400 mmol/L咪唑，pH 8.0）洗脱。
上述蛋白、上述基因或上述重组载体或重组菌也是本发明保护的范围。
本发明提供的技术方案具有以下优点：一是利用pET28载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的大量表达，得到大量不可溶的ACA1包涵体蛋白；二是在本发明的表达系统内，ACA1蛋白经复性后可保持天然构象；三是通过大肠杆菌表达得到的复性ACA1重组蛋白具有生物活性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的pET28/ACA1载体构建示意图；
图2为本发明实施例中含有优化前ACA1的pET28重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
图3为本发明实施例中的含有优化后ACA1的pET28重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
图4为本发明实施例中的纯化前ACA1蛋白和用洗脱缓冲液洗脱的纯化ACA1 包涵体蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
图5为本发明实施例中的ACA1蛋白包涵体蛋白复性后的可溶性蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
图6为本发明实施例中的复性ACA1重组蛋白活性检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET28均购自美国Invritrogen公司。
本发明所用试剂的配方如下：
1）LB液体培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌，室温保存；
2）LB/Amp平板：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，琼脂粉15 g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1 mL浓度为100mg/ml的卡那霉素（Kan），充分混均后倒板，4℃避光保存；
3）LB 培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，高压灭菌后，室温保存；LB液体培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌，室温保存；
4） 50× TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121 g，冰乙酸28.6 mL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0) 50 mL，加蒸馏水定容至500 mL，室温保存；
5）50 mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5 g，加蒸馏水溶解并定容至10 mL，分装后于-20 ℃保存；
6）5×SDS-PAGE上样缓冲液：1 M Tris-HCl （pH 6.8) 1.25 mL，SDS 0.5 g，BPB 25mg，甘油 2.5 mL，加去离子水溶解后定容至5 mL，分装（约500 μL每份）后于室温保存，使用每份加入25 μL β-巯基乙醇混匀；
7）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1 g，甘氨酸 94 g，SDS 5.0 g，加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1 L，室温保存；
8）考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225 mL甲醇、46 mL的冰乙酸、225 mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；
9）考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸 50 mL，甲醇 150mL，去离子水300 mL，充分混合后，室温保存；
10）包涵体洗脱液：8 M 尿素，100 mM甘氨酸，pH 4.0；
11）包涵体漂洗液：8 M 尿素，50 mM PBS，pH 6.0。
实施例一
本实施例提供了一种优化的人工合成的ACA1基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成ACA1的天然DNA，根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成优化后的DNA。优化后的DNA序列与ACA1的天然多核苷酸（GenBank: AY569691.1）相比几乎没有明显的同源性。
将上述优化前后的基因连接到大肠杆菌表达载体pET28中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体分别热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃ 恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET28/ACA1载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET28/ACA1载体构建示意图。
利用含未经优化的天然ACA1基因序列的pET28重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经不同浓度的IPTG在16℃、25℃及37℃下诱导均未检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示。利用含优化后的ACA1基因序列的pET28为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1 mM的IPTG在 16℃、25℃及37℃诱导，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图3所示，ACA1蛋白分子量为13 kDa，pET28载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为5 kDa左右的小片段，因此重组ACA1蛋白分子量大小为18 kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示，37℃诱导可获得最多的ACA1蛋白。
实施例二
本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：
S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟ACA1基因，并连接至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET28/ACA1，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：
（1）用BamH I和Hind III双酶切重组载体，获得目的片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：
载体ACA1/pUC 15 μL
10×H 缓冲液 5μL
BamH I 5U
Hind III 5U
无菌水 至50μL
（2）用BamH I和Hind III双酶切pET28，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：
载体pET28 15 μL
10×H 缓冲液 5μL
BamH I 5U
Hind III 5U
无菌水 至50μL
（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；
（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：
载体pET28片段 1μL
目的片段落 3μL
10× 缓冲液 1μL
T4连接酶 0.5μL
无菌水 至10μL
将重组载体pET28/ACA1转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET28/ACA1并测序验证；用热激法将经验证的重组载体pET28/ACA1转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株BL21中，用含有Kan抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET28/ACA1的大肠杆菌表达菌株转化子。
S2： ACA1蛋白的表达与提取：将包含优化后基因的pET28/ACA1载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.6，然后加入浓度为0.1 mM在37℃诱导12小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300 W，破碎5 s，间隙9 s，循环90次后，离心取沉淀，得到重组的不可溶性蛋白ACA1，将沉淀蛋白分别利用含1 M尿素的缓冲液、2 M尿素的缓冲液及4 M尿素的pH8.0的磷酸盐缓冲液漂洗去除可溶性的杂蛋白蛋白，最终将不可溶蛋白利用含8 M尿素pH8.0的PBS缓冲液溶解得到包涵体重组ACA1蛋白；
S3：包涵体ACA1蛋白的纯化：利用镍亲合层析柱对体ACA1包涵体蛋白进行纯化，8 M尿素pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解得到包涵体重组ACA1蛋白高速离心去除不可溶蛋白后将溶解的蛋白加至经含8 M尿素、pH8.0的PBS平衡的镍亲合层析柱中；先用pH 6.0的含8 M尿素的PBS溶液漂洗亲合层析柱，然后用含8 M尿素和100 mM甘氨酸的pH 4.5的溶液将目标蛋白洗脱下来，即可得纯度在95%以上的包涵体ACA1；
S4：包涵体ACA1蛋白的复性及纯化：取纯化的包涵体蛋白，利用A 液[4 mol/L 尿素，0.2 mol/L L-精氨酸（Arg），0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH]稀释蛋白至终浓度为100 μg/ml， 2- 8℃梯度透析复性，具体方法如下：A 液→B液（2 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH）→C液（1 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/LGSSG，2 mmol/L GSH）→D 液（0.5 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH）→E液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0），每步透析时长均为12 h，所有操作的温度均在2-8 ℃。透析结束后，4℃、12 000 g、离心30 min，将离心所得的上清加入到经30 ml缓冲液A(20 mmol/L PBSl、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)平衡的含3 ml Ni+-NTA树脂的30 ml层析柱中，30 mL冰冷的漂洗缓冲液(0.5%Trition X-114、20 mmol/L PBS、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0，漂洗杂蛋白并去除内毒素（Triton X-114可去除内毒素），5 ml洗脱缓冲液(20 mmol/L PBS、100 mmol/LNaCl、400 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱。
需要说明的是，在步骤S3得到的包涵体蛋白中中加入SDS-PAGE样品缓冲液，并进行SDS-PAGE分析，具体结果如图4所示。图4为本发明实施例中的包含优化后基因的pET28/ACA1载体的大肠杆菌表达得到的包涵体ACA1蛋白纯化后的SDS-PAGE检测结果图。结果显示利用pH 6.0的含8 M尿素的PBS溶液漂洗亲合层析柱再用含8 M尿素和100 mM甘氨酸的pH4.5的溶液洗脱，可以得到纯度达95%的重组蛋白（纯化后），融合蛋白的分子量约为18 kDa，与预期的重组蛋白分子量大小完全吻合。
对于步骤S4，用SDS-PAGE分析复性的结果，结果如图5所示，本发明实施例中的ACA１蛋白经梯度透析后得到了可溶性的ACA1蛋白，且ACA1蛋白重组蛋白具有很高的纯度。
将纯化得到的复性ACA1蛋白进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。
实验方法：小鼠脾脏原代细胞，于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养至细胞密度为106 cell/ml，新鲜RPMI-1640培养基（10%胎牛血清）将细胞稀释至105 cell/ml，按每孔100 μl将细胞接种至96孔板，向各孔中加入去内毒素的不同终浓度的复性rACA1蛋白，于标准条件下培养48小时后加入MTTu并继续培养小时后，离心弃培养液，向各孔中加100 μl的 DMSO，标准操作条件下MTT法测定细胞的增殖情况。
实验结果：终浓度0-40 μg/ml的重组复性ACA1蛋白加入到培养液中，原代脾脏淋巴细胞培养结果如图6所示。MTT法测定结果表明在低于1 μg/ml的条件下，未检测到rACA1具有促进淋巴细胞增殖的作用，当1 μg/ml表达产物加入到培养基中时，经48 h培养表现出促进增殖的效果（*P<0.05），当加入20 μg/ml左右，测得到的吸光值是不加重组蛋白对照的2倍。细胞增殖实验表明，复性的rACA1具有生物活性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 怀化学院
<120> 一种樟芝免疫调节蛋白ACA1及其编码基因与应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> Antrodia camphorate
<400> 1
gtcaacgtga cctacgaccc tttcttcgac aatcctaata attctctttc atacgttgct 60
tgctcagatg gaactaatgg acttcttacc aagggttaca ctactttggg ttcacttcca 120
gattttcctt acattggtgg agcatatgct atcgccggtt ggaactctcc atcctgtgga 180
acctgctggg aattgactta caacaacgtt tctattaata tccttggtac tgacacagct 240
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<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> Antrodia camphorate
<400> 2
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1 5 10 15
Ser Tyr Val Ala Cys Ser Asp Gly Thr Asn Gly Leu Leu Thr Lys Gly
20 25 30
Tyr Thr Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Phe Pro Tyr Ile Gly Gly Ala
35 40 45
Tyr Ala Ile Ala Gly Trp Asn Ser Pro Ser Cys Gly Thr Cys Trp Glu
50 55 60
Leu Thr Tyr Asn Asn Val Ser Ile Asn Ile Leu Gly Thr Asp Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Phe Asn Ile Ala Leu Thr Ala Met Asn Val Leu Thr Asn Asn
85 90 95
Ala Ala Val Asp Leu Gly Glu Val Asp Ala Ala Ala Ile Gln Val Asp
100 105 110
Ser Ser Val Cys Gly Leu
115

Claims (7)

1.一种基因，是如下（1）-（3）中的任一种DNA分子：
（1）由序列表中序列1所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有免疫调节活性蛋白的DNA分子；
（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有免疫调节活性蛋白的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的蛋白。
3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于：是如下（1）或（2）：
（1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有免疫调节活性的序列2所述的蛋白质。
4.含有权利要求1所述基因的重组载体或重组菌；
所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中，得到表达权利要求2或3所述蛋白的重组载体。
5.一种制备权利要求2或3所述的蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原始载体优选为pET28载体。
6.根据权利要求5所述的制备蛋白的载体和菌株制备得到的经复性的可溶性蛋白；
所述ACA1包涵体重组蛋白的复性方法如下：取纯化的包涵体ACA1蛋白10毫克，利用A液[4 mol/L 尿素，0.2 mol/L L-精氨酸（Arg），0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH]稀释蛋白至终浓度为100 μg/ml， 2- 8℃梯度透析复性，具体方法如下：A 液→B液（2 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH）→C液（1 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH）→D 液（0.5 mol/L 尿素，0.2 mol/L Arg，0.2 mmol/LGSSG，2 mmol/L GSH）→E液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0），每步透析时长均为12 h，所有操作的温度均在2-8 ℃；透析结束后，4℃、12 000 g、离心30 min，将离心所得的上清加入到经30 ml缓冲液A（20 mmol/L PBSl、100 mmol/LNaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0）平衡的含3 ml Ni+-NTA树脂的30 ml层析柱中，30 mL冰冷的漂洗缓冲液（0.5% Trition X-114、20 mmol/L PBS、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH 8.0）漂洗杂蛋白并去除内毒素，5 ml洗脱缓冲液（20 mmol/L PBS、100 mmol/LNaCl、400mmol/L咪唑，pH 8.0）洗脱，洗脱的蛋白经透析后超滤浓缩。
7.权利要求2、3或6所述蛋白、权利要求1所述基因或权利要求4所述重组载体或重组菌及活性ACA1重组蛋白在生物及医药领域中的应用。
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