CN117024601A - 一种宣威火腿源抗氧化肽及其制备方法和活性测定方法 - Google Patents

一种宣威火腿源抗氧化肽及其制备方法和活性测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗氧化肽技术领域，尤其是一种宣威火腿源抗氧化肽及其制备方法和活性测定方法，该宣威火腿源抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明使用刚性连接肽和柔性连接肽连接宣威火腿源六肽，能够使肽链增长，使之适用于基因重组表达，同时增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加了表达；其次，刚性连接肽具有α螺旋结构，会使串联后的抗氧化肽容易形成稳定的二级结构，同时可以有效分离活性功能域；柔性连接肽以甘氨酸Gly为主，分子质量较小，保证了多肽骨架构象的自由度，使蛋白拥有充分的空间折叠以获得原有的生物活性，从而使得融合蛋白得到高于亲本蛋白的活性。

Description

一种宣威火腿源抗氧化肽及其制备方法和活性测定方法
技术领域
本发明涉及抗氧化肽技术领域，具体领域为一种宣威火腿源抗氧化肽、制备方法和活性测定方法。
背景技术
在当今社会，人们对健康和长寿的关注越来越高，而抗氧化剂在这一领域引起了广泛的兴趣。氧化应激是一种由于自由基和氧化物质过多积累引起的生物化学失衡状态，可导致脂质氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等。这些氧化过程与多种疾病的发展密切相关，包括心血管疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆和癌症等。近年来随着研究人员对生物活性肽的持续关注，从不同的干腌火腿中分离并鉴定出多种生物活性肽，其具有丰富的氨基酸序列和多种生物功能，如抗氧化、降血压、降脂、降糖等，被认为具有潜在的健康益处。例如Elizabeth Escudero(Escudero,E.,Aristoy,M.-C.,Nishimura,H.,Arihara,K.,&Toldrá,F.(2012).Antihypertensive effect and antioxidant activity of peptidefractions extracted from Spanish dry-cured ham.Meat Science,91(3),306-311.)发现从西班牙干腌火腿中提取的一种分子量不超过1700Da的肽提取物具有降压和抗氧化活性；Chao-Zhi(Zhu,C.Z.,Zhang,W.G.,Kang,Z.L.,Zhou,G.H.,&Xu,X.L.(2014).Stabilityof an antioxidant peptide extracted from Jinhua ham.Meat Science,96(2),783-789)发现从金华火腿中提取和分离的天然肽具有较高的自由基清除活性。这些活性肽分子质量介于400-2000Da范围内，序列长度在5-20个氨基酸之间，这些可用作功能性食品或治疗疾病的药物。CN115260288A公开了一种干腌火腿来源抗氧化肽复合物，包含42个分子量＜3.0kDa的肽段，其中占比最高的三个肽段分别为占比23.56％的生物活性肽1，占比13.64％的生物活性肽2，占比12.98％的生物活性肽3，所述的生物活性肽1的氨基酸序列为：LGEHNIDVLEGNEQFINAAK，所述的生物活性肽2的氨基酸序列为：GHYTEGAELVDSVLDVVR，所述的生物活性肽3的氨基酸序列为：DLVILLYETALLSSGFSLEDPQTHANR。
然而，与大多数抗氧化肽一样，由于从火腿中分离提取多肽产率低，成本高且分离过程耗时，因此很难大规模制备。目前，大多数抗氧化肽仍处于实验室规模的研究阶段，表明通过这种分离提取手段获取抗氧化肽不能满足工业化生产的要求。另外，从火腿中分离的抗氧化肽的序列通常包括5至20个氨基酸，其相对较短并且容易被大肠杆菌表达系统中的蛋白酶或肽酶降解。因此，难以直接表达这些肽。
发明内容
为了解决寡肽直接重组表达过程中难以正常的进行转录和翻译，容易被大肠杆菌表达系统中的蛋白酶或肽酶降解等问题以及提高多肽活性，本发明的第一目的在于提供一种宣威火腿源抗氧化肽。
本发明的第二目的在于提供一种宣威火腿源抗氧化肽的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种宣威火腿源抗氧化肽的活性测定方法。
本发明以宣威火腿肽为原料，通过串联重复表达，运用不同的连接方式将同一肽序列重复连接而形成多肽分子，可以增加其稳定性和生物活性以及产量。本发明通过在大肠杆菌中构建宣威火腿肽基因的表达载体，来实现宣威火腿肽高水平表达。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种宣威火腿源抗氧化肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。其对应的基因序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
一种宣威火腿源抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据宣威火腿肽NPPKFD的氨基酸序列，运用刚性连接肽(EAAAK)2或柔性连接肽(GGGGS)2对宣威火腿肽NPPKFD进行六倍体的连接，得到目的基因；所述宣威火腿肽、刚性连接肽及柔性连接肽的序列如SEQ ID NO：9-11所示，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示；
(2)用限制性内切酶Nde I和Xho I将目的基因与原核表达质粒pET-28a(+)进行双酶切，通过DNA连接酶相连接，制得原核重组表达载体pET-28a(+)-G6、pET-28a(+)-R6；
(3)原核重组表达载体经过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建重组工程菌株BL21(DE3)-pET-28a(+)-G6、BL21(DE3)-pET-28a(+)-R6；
(4)菌落PCR验证重组表达载体转化成功；
(5)诱导表达工程菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-G6、BL21(DE3)-pET-28a(+)-R6表达带有His标签的串联重组多肽；
(6)表达的带His标签的融合蛋白用镍离子亲和层析柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，杂蛋白因不特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；
(7)用RP-HPLC进行纯度检测，得到高纯度串联重组的抗氧化肽。
(8)蛋白浓度测定：使用Bradford法测定蛋白浓度，检测595nm处的吸光度值，并根据标准曲线(y＝0.6361x+0.477，R 2＝0.9923)计算样品的总蛋白浓度。
本发明使用的刚性连接肽(EAAAK)2具有α螺旋结构，会使串联后的抗氧化肽容易形成稳定的二级结构，同时可以有效分离活性功能域，从而使得融合蛋白得到高于亲本蛋白的活性。
本发明使用的柔性连接肽(GGGGS)2以甘氨酸Gly为主，分子质量较小，能最大程度的保证了多肽骨架构象的自由度，使蛋白拥有充分的空间折叠以获得原有的生物活性。
本发明使用pET-28a(+)质粒中含有两个His标签，His标签是一段具有6个组氨酸残基的多肽序列，便于后续的蛋白质纯化和定位。
本发明宣威火腿源抗氧化肽的制备方法中，菌落PCR使用的引物为：
XHP-G6上游引物：5’-TGAATCCGCCGAAATTCGACGAAG-3’，下游引物：5’-TCTTTCGCAGCCGCTTCATCG-3’；
XHP-R6上游引物：5’-CATATGAATCCGCCGAAATTCG-3’，下游引物：5’-CTCGAGATCGAATTTTGGCGG-3’；序列如SEQ ID NO：5-8所示。
本发明宣威火腿源抗氧化肽的制备方法中，诱导表达多肽的发酵条件为：异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，在37℃以220r/min培养8h。
本发明所述宣威火腿源抗氧化肽的活性测定方法：包括羟基自由基清除法和DPPH自由基清除法。羟基自由基(·OH)是一种高度活性的氧自由基，在体内可以引发氧化应激反应，导致细胞损伤和疾病的发生。因此，测定抗氧化物质对羟基自由基的清除能力可以间接评估其抗氧化活性。DPPH自由基清除法通过测定样品对2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基的清除能力来评估其抗氧化能力。DPPH溶液呈紫色，具有吸收最大峰，当与抗氧化物质反应后会褪色，通过分光光度计测定溶液的吸收变化来计算清除率。
其中，所述羟基自由基清除法具体为，将1mL重组多肽样品与1mL硫酸亚铁和1mL过氧化氢混合；在37°保持10min后，将溶液与1mL水杨酸混合；对照组使用蒸馏水代替样品溶液；孵育30分钟后，在510nm处测量吸光度；
羟基自由基清除活性按下式计算:
其中，Ai：样品的吸光度；
A0：空白对照组的吸光度。
其中，所述DPPH自由基清除法具体为，称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液；分别取2mL不同浓度1mg/mL的重组多肽溶液，加入2mL DPP H溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min；取上清液于517nm处测吸光值；用Vc作为阳性对照；样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH清除率＝1-(A1-A2)/A0*100％
A0-2mL无水乙醇+2mL DPPH溶液的吸光值；
A1-2mL样品液+2mL DPPH溶液的吸光值；
A2-2mL样品溶液+2mL无水乙醇的吸光值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用刚性连接肽(EAAAK)2、柔性连接肽(GGGGS)2连接宣威火腿源六肽，能够使肽链增长，使之适用于基因重组表达，同时增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加了表达；其次，刚性连接肽具有α螺旋结构，它的使用会使串联后的抗氧化肽容易形成稳定的二级结构，同时可以有效分离活性功能域；柔性连接肽以甘氨酸Gly为主，分子质量较小，能最大程度的保证了多肽骨架构象的自由度，使蛋白拥有充分的空间折叠以获得原有的生物活性，从而使得融合蛋白得到高于亲本蛋白的活性。
本发明利用pET-28a(+)上较小的His标签用于亲和层析纯化，分离纯化蛋白纯度高，专一性强，提高纯化效率和减小了多肽的分离难度。
本发明由于所用大肠杆菌表达系统具有表达背景清楚，表达水平高、操作简单、培养周期短、抗污染能力强。其次，大肠杆菌生长用培养基原料价格低廉，易于大规模生产获得大量的抗氧化活性肽物质，在成本上相对于传统的酶解方法有着经济节约。
本发明制备方法操作简单，可以快速构建重组串联抗氧化肽融合基因原核表达的工程菌株，通过实例证明串联后抗氧化肽的羟基自由基清除能力较为改造前提高了约3倍，这为后期小分子活性肽的在保健食品领域中的应用打下基础。
通过本发明的研究可以进一步为探索宣威火腿肽的生物学功能和营养价值提供新的数据和证据，为生物技术产业的发展与创新做出贡献。
附图说明
图1分别是XHP-G6(左图)、XHP-R6(右图)限制酶电泳图；M：DNA标准分子量；泳道1：原始质粒电泳；泳道2：NdeI/XhoI酶切后片段分子量。
图2为琼脂糖电泳图；泳道M：DNA标准分子量；泳道1-2分别是XHP-G6、XHP-R6、目的基因分子量。
图3为SDS-PAGE电泳图；泳道M：蛋白Marker。泳道1-2分别为XHP-G6、XHP-R6重组蛋白。
图4为SDS-PAGE电泳图；泳道M：蛋白Marker。泳道1-2分别为XHP-G6、XHP-R6纯化后蛋白。
图5(a)和图5(b)为XHP-G6、XHP-R6的RP-HPLC图。
图6(a)和图6(b)为抗氧化活性分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组宣威火腿源抗氧化肽基因设计以及原核表达的方法
(1)串联设计宣威火腿源抗氧化肽序列
该方法构建了一个包含NPPKFD序列的设计，使NPPKFD肽序得以延长，适用于基因重组表达，具体操作为：运用刚性连接肽(EAAAK)2、柔性连接肽(GGGGS)2分别对NPPKFD进行六倍体的连接，因此，设计肽段的新氨基酸序列最终为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
(2)构建出串联抗氧化肽目的基因
根据串联抗氧化肽的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性运用计算机软件Primer Premier 5.0设计出与串联抗氧化肽氨基酸序列对应的mRNA序列。运用刚性连接肽串联设计的基因序列如SEQ ID NO:3所示。运用柔性连接肽串联设计的基因序列如SEQ IDNO:4所示。
为了在大肠杆菌中更好地表达蛋白质，优化了86个氨基酸的蛋白质序列。调整密码子使用偏好以适合靶宿主的最高表达谱，CAI(密码子适应指数)分别升级至0.87、0.9。(0.8-1.0的CAI被认为是高表达的好值)。将平均GC含量分别调节至55.07％、64.86％，并除去不利的峰。去除原始序列中的重复区域以避免mRNA中的茎环结构并促进合成过程。修饰不需要的基序，包括用于亚克隆的限制性酶切位点和负顺式作用位点。对整个序列进行微调以提高翻译效率并延长mRNA的半衰期。将优化后的基因序列交由上海生工生物有限公司合成。
(3)构建基因表达载体
在活性肽两端加入的酶切位点分别为限制性内切酶Nde I和Xho I，将pET-28a(+)经过Nde I和Xho I双酶切后，如电泳图图1所示，通过DNA连接酶将目的基因克隆至p ET-28a(+)质粒，构建重组表达质粒，取少量重组质粒pET-28a(+)-G6与大肠杆菌BL21(D E3)感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；冰浴完后，42℃热激90s，立即插入冰中冷却1-2min。
向其中加入900微升LB液体培养基，轻轻混匀，37℃下震荡培养1h，使菌体充分复苏；取适量菌液涂在LB固体培养基(含100mg/L卡那霉素)筛选阳性质粒，37℃倒置培养一夜，确认培养菌落，经DNA测序验证重组质粒构建正确。
LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g。使用固体培养基时添加20.0g琼脂粉。
(4)菌落PCR验证
从培养过夜的筛选平板上用灭菌10微升枪头挑取单克隆菌落置入含有10μL灭菌ddH2O的PCR管中，菌落PCR验证体系。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃30s、55℃30s、72℃40s共35个扩增循环，72℃延伸10min。PCR反应结束后进行核酸电泳。XHP-G6的上游引物为：5’-TGAATCCGCCGAAATTCGACGAAG-3’，下游引物为5’-TCTTTCGCAGCCGCTTCATCG-3’；XHP-R6的上游引物为5’-CATATGAATCCGCCGAAATTCG-3’，下游引物为5’-CTCGAG ATCGAATTTTGGCGG-3’。如SEQID NO：5-8所示。电泳图如图2所示。
表1菌落PCR验证体系
(5)大肠杆菌重组菌株的诱导表达
将挑取经过PCR验证的重组菌株接种到3ml含有抗性的LB培养液中，37℃，220rp m培养12小时制的种子液，将种子液按照1％的比例接种到含有100mlLB液体培养基中扩大培养，并同时加入卡那霉素至工作浓度为100μg/ml。当菌液OD600nm为0.6时，异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，在37℃以220r/min培养8h。将诱导完成的菌液5000r/min离心10min弃上清液，收集细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，混合均匀后于冰水浴中超声破碎，超声破碎条件为250W，超声3s，间歇5s，15min。此时即为全菌蛋白，菌液呈澄清透亮。将超声破碎的菌液12000r/min离心15min，上清液即为上清蛋白，分离上清和沉淀，将获得的全菌液、上清、沉淀样品分别进行SDS-PAGE分析，确定融合蛋白的表达情况。
SDS-PAGE分析：将平/凹玻璃板取出进行清洗、晾置，用固定器将玻璃板固定在制胶器上。进行分离胶的配制，各组分加入后，用移液枪吹打混匀，沿玻璃板缝隙贴壁加入，用蒸馏水液封并压平胶面，室温放置待液面出现明显分界线后，将蒸馏水倒掉，完成分离胶的配制。配制上层浓缩胶，各组分加入混匀后，沿间隙加入上层胶，插入梳子，室温放置待上层胶凝固。聚合后将两块胶短板朝内安装上槽，组装内槽固定架。将整套固定装置放到电泳槽中，添加电泳缓冲液(电泳缓冲液配方：Tris缓冲液(25mM，pH 8.3)、甘氨酸(190mM)、SDS(0.1％))，拔出梳子，在胶泳道中添加5微升标准蛋白与样品，若有多余加样孔，加上上样缓冲液，接通电源，起始电压80V,约30分钟，进入浓缩胶后电压改为120V，待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部，切断电源(约2-3小时)。
样品处理：取大肠杆菌菌体破碎液及离心后的上清与上样缓冲液混合，沉淀中加入40微升PBS缓冲液再加10微升5xSDS上样缓冲液，取40微升离心后的上清和10微升5x SDS上样缓冲液混合，沸水浴煮沸5min，12000rpm离心5min后取上清，取5微升样品进行蛋白电泳。电泳结束后，取出玻璃板，小心撬开玻璃板割弃浓缩胶，从制胶板上将凝胶剥下，放入去离子水中，水洗凝胶，将蛋白胶放置在染色盒中，使用考马斯亮蓝R-250染色2h。染色后将胶放入脱色液中进行扩散脱色至背景板蓝色褪淡，见到条带后使用凝胶成像仪进行拍照记录。SDS-PAGE电泳图如图3所示。
实施例2重组串联抗氧化肽的纯化
取5mL的Ni-IDA预装柱，将存储缓冲液通过重力流出。用两倍柱体积的Wash Buffer(20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，5mM咪唑，pH 8.0)平衡柱子，使用0.5～1mL/min流速，使Buffer缓慢排出树脂。将上清液过0.45μm的微孔滤膜后加入柱子上，收集流穿液到离心管中，然后用两倍柱体积的Wash Buffer清洗柱子并收集流穿液，最后用两倍柱体积的Elution Buffer(20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，每次的洗脱液分别储存，直到洗脱液在280nm处吸光度接近基线。将收集后的洗脱液进行SDS-PAGE、RP-HPLC分析纯度。SD S-PAGE电泳图如图4所示，RP-HPLC图如图5(a)和图5(b)所示。
RP-HPLC条件：使用Acquity(沃茨Inc.)。HPLC系统配备反相BEH C18分析柱(1.7μm，2.1×100mm，沃茨Inc.)
流动相：A相为超纯水(0.1％三氟乙酸)，B相为乙腈(0.1％三氟乙酸)，流速0.8mL/min；进样体积：8μL；柱温：30℃；紫外检测波长：220nm。
蛋白质浓度的测量：使用Bradford法测定蛋白浓度，检测595nm处的吸光度值，并根据标准曲线(y＝0.6361x+0.477，R2＝0.9923)计算样品的总蛋白浓度，经过换算总蛋白浓度可达到11.95mg/L。
实施例3宣威火腿源串联抗氧化肽的活性验证
(1)DPPH自由基清除活性的测定
称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度1mg/mL的重组多肽溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH清除率＝1-(A1-A2)/A0*100％
A0-2mL无水乙醇+2mL DPPH溶液的吸光值:
A1-2mL样品液+2mL DPPH溶液的吸光值
A2-2mL样品溶液+2mL无水乙醇的吸光值。
(2)羟基自由基清除活性的测定
将1mL重组多肽样品与1mL硫酸亚铁(9mmol/L)和1mL过氧化氢(10mmol/L)混合。在37°保持10min后，将溶液与1mL水杨酸(9mmol/L)混合。对照组使用蒸馏水代替样品溶液。孵育30分钟后，在510nm处测量吸光度。
羟基自由基清除活性按下式计算：
其中，Ai：样品的吸光度；
A0：空白对照组的吸光度。
结果表明：本发明利用刚性连接肽串联制备的抗氧化肽的羟基自由基、DPPH自由基清除能力分别为79.46％、57.25％；本发明利用柔性连接肽串联制备的抗氧化肽的羟基自由基、DPPH自由基清除能力分别为87.42％、68.05％。本发明中制备的多肽抗氧化能力分别比从宣威火腿中分离提取的多肽分别提高了约3倍。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种宣威火腿源抗氧化肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的宣威火腿源抗氧化肽，其特征在于：其对应的基因序列如SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求1或2所述的宣威火腿源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据宣威火腿肽的氨基酸序列，运用刚性连接肽或柔性连接肽对宣威火腿肽进行六倍体的连接，得到目的基因；所述宣威火腿肽、刚性连接肽及柔性连接肽的序列如SEQ IDNO：9-11所示，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示；
(2)用限制性内切酶Nde I和Xho I将目的基因与原核表达质粒pET-28a(+)进行双酶切，通过DNA连接酶相连接，制得原核重组表达载体pET-28a(+)-G6、pET-28a(+)-R6；
(3)原核重组表达载体经过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建重组工程菌株BL21(DE3)-pET-28a(+)-G6、BL21(DE3)-pET-28a(+)-R6；
(4)菌落PCR验证重组表达载体转化成功；
(5)诱导表达工程菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-G6、BL21(DE3)-pET-28a(+)-R6表达带有His标签的串联重组多肽；
(6)表达的带His标签的融合蛋白用镍离子亲和层析柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，杂蛋白因无特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；
(7)用RP-HPLC进行纯度检测，得到高纯度串联重组的抗氧化肽。
4.根据权利要求3所述的宣威火腿源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)菌落PCR使用的引物为：
XHP-G6上游引物：5’-TGAATCCGCCGAAATTCGACGAAG-3’，下游引物：5’-TCTTTCGCAGCCGCTTCATCG-3’；
XHP-R6上游引物：5’-CATATGAATCCGCCGAAATTCG-3’，下游引物：5’-CTCGAGATCGAATTTTGGCGG-3’；序列如SEQ ID NO：5-8所示。
5.根据权利要求4所述的宣威火腿源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：诱导表达多肽的发酵条件为：异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，在37℃以220r/min培养8h。
6.权利要求1或2所述宣威火腿源抗氧化肽的活性测定方法，其特征在于：包括羟基自由基清除法和DPPH自由基清除法。
7.根据权利要求6所述的宣威火腿源抗氧化肽的活性测定方法，其特征在于：所述羟基自由基清除法具体为，将1mL重组多肽样品与1mL硫酸亚铁和1mL过氧化氢混合；在37°保持10min后，将溶液与1mL水杨酸混合；对照组使用蒸馏水代替样品溶液；孵育30分钟后，在510nm处测量吸光度；
羟基自由基清除活性按下式计算:
其中，Ai：样品的吸光度；
A0：空白对照组的吸光度。
8.根据权利要求7所述的宣威火腿源抗氧化肽的活性测定方法，其特征在于：所述DPPH自由基清除法具体为，称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液；分别取2mL不同浓度1mg/mL的重组多肽溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min；取上清液于517nm处测吸光值；用Vc作为阳性对照；样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH清除率＝1-(A1-A2)/A0*100％
A0-2mL无水乙醇+2mL DPPH溶液的吸光值；
A1-2mL样品液+2mL DPPH溶液的吸光值；
A2-2mL样品溶液+2mL无水乙醇的吸光值。
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