JPH06505010A - 正確にフォールドされた完全なインスリン様成長因子−１の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 正確にフォールドされた完全なインスリン様成長因子−１の精製方法本発明は、 精製方法に関する。特定すれば、本発明は、液体媒体からのインスリン様成長因 子−１ペプチドの精製方法に関する。一つの側面において、本発明は、組換え技 術により生産されたインスリン様成長因子−１ペプチドの精製方法に関する。も う一つの側面において、本発明は、インス１ル様成長因子−１ペプチドをコード するＤＮＡ配列の少なくとも１コピーにより形質転換された酵母細胞により生産 されたインス１ル様成長因子−１ペプチドの精製方法に関する。

発明の背景 インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は、分子量７６４８ドルトンを有する ７０アミノ酸のポリペプチドである。この一本鎖蛋白質は３つの内部鎖ジスルフ ィドブリ、シを有する。これらジスルフィド結合は、多数の水素結合および疎水 性相互作用と共に、上記分子のコン＜クトな３次構造を保持する。し力・しな力 （ら、還元および再酸化に際して、さまざまな様式でリフオールドされ、そして １５ものモノマーの立体構造（ｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔ　１ｏｎ）を形成する［ メンタ゛（Ｍｅｎｇ）ら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、４４３　：１８３　（１９８８）を 参照］。結果として、このペプチドを大量に生産するための企ては、さらなる使 用のために精製しなければならない形態の生成物の複雑な混合物の形５５につな 力（りうる。

インスリン様成長因子−１は不均一なファミリーのペプチドこ属し、（１＜つ力 ・の生物学的特性および化学的特性においてインス１ルと分かち合う力（、抗原 的にインス１ルと異なる。現在役立つ実験的証明によれば、ＩＧＦ−１カ（成長 ホルモンを仲介することにより成長を促進することが示唆される。即ち、骨格成 長のような過程、細胞複製過程および他の成長関連過程はＩＧＩ−ルベルされる 。ＩＧＦ−１の生理学的濃度は、甲状腺疾患、糖尿病および栄養不良のような条 件により影響されることが示されてきた［ブリース（Ｐｒｅｅｃｃ）　、Ｉ−１ ｏｒｍ．Ｂｌｏｏｄ．４：１．０８　（１９８３）を参照］。

ＩＧＦ−１は他の成長因子と共に作用して、例えば、柔らか０組織創傷および間 頂創傷の治癒を速めること［リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉ ｏｄｏｎｔｏｌ．、１６：５４５　（１９８９）およびリンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら 、Ｐｒｏｃ．Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ．Ｓｃ　ｉ．ＵＳＡ．８４　：　７６９６ 　（１９８７）を参照］、および血清を含まない組織培養培地における補乳動物 細胞の成長を高めること［ブライヒ（Ｂｕｒ　ｌｅ　ｉｇｈ）とメンタ（Ｍｅｎ ｇ）　、Ａｍｅ　ｒ　ｉ　ｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ．、４：４８　（１ ９８６）を参照］において作用することも示されてきた。

ＩＧＦ−１の臨床的応用および研究への応用の多くを考慮すれば、ＩＧＦ−１の 容易な供給は医療および生物学の分野において大変に貴重なものとなろう。天然 源からの単離は技術的に難しく、高価であり、そして時間を消費するので、最近 の努力はＩＧＦ−１の生産のための効果的な組換え法の開発に注がれてきた。

メタノール酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）は組換え 体産物の生産のための改良された宿主として最近開発されてきた。組換え体ピキ アパストリス株はリットルあたりグラムの規模で特定の組換え体蛋白質を分泌で きることが示されてきた。さらに、このような株は、バッチまたは連続培養発酵 条件に採用できることが示されてきた。さらに、このような株は、極めて安定な 組換え表現形を有し、そして数オーダ−の発酵スケール以上で所望の組換え発現 産物の高収率を維持することができる。事実、ブリアレイ（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ） ら、１９９０年９月４日に出願の係属中の米国特許出願第５７８，７２８号にお いて、ピキアパストリスがＩＧＦ−１の組換え体生産のための最良の宿主である ことが最近示された。この係属中の出願の全開示は、引用により本明細書の一部 をなす。組換え体により生産されたＩＧＦ−１を高いレベルで含む媒体の有用性 の点から、そのような媒体からｒＧＦ−１を回収および精製するための十分な手 段がめられている。

組換え体により生産された［ＧＦ−１は、い＼つかの異なる形態の［ＧＦ−１、 即ち、完全で、モノマーの、正確にフォールドされた物質（ここでは真正ＩＧＦ −１とも言う）、並びに、さまざまな異常な形態、例えば、ミスフォールドされ た物Ｗ（即ち、不正確に形成されたジスルフィド結合を有する）、ニックを入れ られた物質（即ち、アミノ酸バックボーンのペプチド結合一つ以上が破壊されて いるが、その結果得られる種の分子量は完全な物質と実質的に同じであり、それ は、二７りを入れられた物質が完全な物質と同じ数のアミノ酸残基を有し、モし てニックを入れられた物質の断片がジスルフィド結合により結ばれているからで ある）、分割された物質（例えば、ペプチド結合一つ以上が破壊されていること により、完全物質と比較して低分子量の２つの断片が生成されるか：または、完 全物質と比較して一つ以上のアミノ酸残基を欠いているペプチド）、マルチマー の形態（即ち、ダイマー、トリマー等であって、２つ以上の異なるＩＧＦ−１モ ノマー鎖間でジスルフィド結合が形成される）等の混合物からしばしばなる。さ まざまな形態のＩＧＦ−１が実質的に同じため、組換え体により生産されたＩＧ Ｆ−１の精製には困難な技術的挑戦が存在する。このような精製が発酵の間に生 産された他のペプチドからＩＧＦ−１を単離することを必要とするのみならず、 単離にはさらに存在しているかもしれないさまざまな形態のＩＧＦ−１を区別す るのに十分選択的であることが要求される。

ブリアレイ（Ｂｒ　ｉｅ　ｒ　Ｉｅｙ）らは、特許協力条約に基づき１９９１年 ９月４日に出願された米国特許出願第５７８．７２８号の一部継続出願であるＰ ＣＴ／ＵＳ９１１０６４５２の、共願の国際出願においても、ニックを入れられ た■ＧＦ−１のような、異常な形態を生しるように、組換え産物を分解すること ができる蛋白質分解活性に欠陥を有するピキアパストリス株による、ＩＧＦ−１ の生産を記載している。ピキアバストリスのプロテアー七による分解に感受性の 、不均質な蛋白質の組換え体発現のための宿主としてのどキアパストリスのプロ テアーゼ欠損株の使用は、１９９１年４月１日に出願の米国特許出願第０　７／ ６　７　８。

９１６号に記載されている。これら係属中の出願の全開示は、引用により本明細 書の一部をなす。蛋白質分解活性を欠ｆｆｉしたＩＧＦ−１生産ピキアパストリ ス株の発酵は、いずれも蛋白質分解活性を欠損したＩＧＦ−１生産ピキアバスト リス株の同様な発酵に比較して、より真正なｉＧＦ−１に対して５０−１００％ の収率、およびニックを入れられたＩＧＦ−１に対して３０％未満の収率であっ た。

蛋白質分解活性を欠ｆｆｉしたピキアバストリス株の培養物からの真正ＩＧＦ− １の精製は、培養物中のわずかな量のニックを入れられたＩＧＦ−１により促進 されるかもしれないが、さまざまな形態のＩＧＦ−１を区別することができる単 離工程はいまだそのような精製を必要とする。

発明の概要 本発明により、我々は、液体培地からのＩＧＦ−１ペプチドの回収および精製の ための効果的な方法を開発した。本発明の方法は、カチオン交換マトリックス材 料と疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス材料との組み合わせによる 連続選択的吸着−脱離工程を含み、そして好ましくはゲル濾過クロマトグラフィ ーを含んでよい。この方法において、粗精ＩＧＦ−１を含む媒体に最初に存在す るさまざまな形態のＩＧＦ−１の存在下で、実質的に精製された、完全な、正確 にフォールドされた、モノマーＩＧＦ（約３　０−５　０％の回収が達成できる 。

図面の簡単な説明 図１は、第１の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスからのさまざま なｆＧＦ−１種の溶出プロフィールである。

図２は、第２のカチオン交換マトリックスからのさまざまなＩＧＦ−１種の溶出 プロフィールである。

発明の詳細な説明 一つの側面において、本発明は、モノマーで完全な、正確にフォールドされたイ ンスリン様成長因子−１ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの ｔ′ｉ製方法に関し、該方法は以下の工程よりなる（ａ）上記媒体を十分な量の 第１カチオン交換材料と、上記媒体から少なくとも約９５％の全ｆＧＦ−１を吸 着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ）十分に高いｐＨまたはイオン強度を 有する十分な量の溶媒系と上記カチオン交換材料を接触させて工程（ａ）のＩＧ Ｆ−１含有カチオン交換材料から吸着ＩＧＦ−１を溶出することにより、上記カ チオン交換材料から上ｆｆａ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１を実質的に全部脱離し、 （ｃ）適切な溶媒中で、工程（ｂ）の溶出物のＩＧＦ−１含有画分と十分な量の 第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス材料とを、上記溶出物から 約９５％か９１００％の上記ＩＧＦ−１を吸着するのに十分な条件下で接触させ 、 （ｄ）マトリックスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導 電率を有するバブファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上 記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、 上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全な モノマーの正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上 記マトリックスから異常なＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリックス の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファー系と 上記マトリックスを接触させるが、その際、上記高いｐＨとは、残りの吸着した ＩＧＦ−１を上記マトリックスから実質的にすべて脱離させるのに十分な高さで ある。

その側面の他の観点によれば、本発明は、モノマーで完全な、正確にフォールド されたインスリン様成長因子−１ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペ プチドの精製方法に関し、該方法は以下の工程よりなる・（ａ）上記媒体を十分 な量の第１カチオン交換材料と、上記媒体から少なくとも約９５％の全ＩＧＦ− １を吸着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ）十分に高いｐＨまたはイオン 強度を有する十分な量の溶媒系と上記カチオン交換材料を接触させて工程（ａ） のＩＧＦ−１含有カチオン交換材料から吸着ＩＧＦ−１を溶出することにより、 上記カチオン交換材料から上記ｒＧＦ−１を実質的に全部脱離し、 （ｃ）適切な溶媒中で、工程（ｂ）の溶出物の［ＧＦ−１含有画分と十分な量の 第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス材料とを、上記溶出物から 約９５％から１００％の上記ＩＧＦ−１を吸着するのに十分な条件下で接触させ 、 （ｄ）マトリックスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導 電率を有するバッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上 記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、 上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全な 七ツマ−の正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上 記マトリックスから異常なＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリックス の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファー系と 上記マトリックスを接触させるが、その際、上記高いｐＨとは、残りの吸着した ｒＧＦ−１を上記マトリックスから実質的にすべて脱離させるのに十分な高さで あり、 （ｅ）実質的にすべてのマルチマーの形態のＩＧＦ−１から完全な七ツマ−の正 確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分離するのに効果的な適切なポアサイ ズの、十分な量のゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスに、工程（ｄ）から の溶出物の完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を含む両 分を接触させ、そして （ｆ）十分な量の溶出液で上記ゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスを溶出 させることにより、マルチマーの形態のＩＧＦ−１から完全なモノマーの正確に フォールドされた形態のＩＧＦ−１を分離する。

本発明によれば、モノマーで完全な、正確にフォールドされたインスリン様成長 因子−１ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精製方法を提供 し、該方法は以下の工程よりなる： （ａ）上記媒体を十分な量の第１カチオン交換マトリツクスと、上記媒体から少 なくとも約９５％の全ＩＧＦ−１を吸着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ ）十分に高いｐＨまたはイオン強度を有する十分な量の溶媒系と上記カチオン交 換マトリックスを接触させて工程（ａ）のＩＧＦ−１含有カチオン交換マトリツ クスから吸着ＩＧＦ−１を溶出することにより、上記カチオン交換材料から上記 ＩＧＦ−１を実質的に全部脱離し、（ｃ）適切な溶媒中で、工程（ｂ）の溶出物 の［ＧＦ−１含有画分と、十分な量の、第１疎水性相互作用クロマトグラフィー マトリックスとを、上記溶出物からの上記ＩＧＩＬ約９５％から１００％を吸着 するのに十分な条件下で接触させ、 （ｄ）マトリックスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導 電率を有するバッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上 記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、 上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全な モノマーの正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上 記マトリックスからい（つかの異常なＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マ トリックスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッ ファー系と上記マトリックスを接触させるが、その際、上記高いｐｉ−ｔとは、 残りの吸着したｔＧＦ−１を上記マトリックスから実質的にすべて脱離させるの に十分な高さであり、 （ｅ）高いｐＨを有する上記バッファー系を用いて、主たる形態として完全なモ ノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を含む、工程（ｄ）により溶出され た画分を十分な量の第２カチオン交換マトリツクスに、上記溶出物から約９５％ から１００％の全ＩＧＦ−１を吸着するのに十分な条件下で接触させ、（ｆ）マ トリックスの体積に比較して少なくとも等しい体積の、十分なイオン強度を有す るバッファー系と上記マトリックスを接触させることにより上記第２カチオン交 換マトリツクスから吸着ＩＧＦ−１を溶出して、上記マトリックスから実質的に すべてのＩＧＦ−１ペプチドを別々に脱離し、（ｇ）　（１）上記溶出物からの 全形態のＩＧＦ−１約９５％から１００％を吸着するのに十分な条件下で、十分 な量の第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、または（２）実質 的にすべてのマルチマーの形態のｒＧＦ−１から完全なモノマーの正確にフォー ルドされた形態のＩＧＦ−１を分離するのに効果的な適切なポアサイズの、十分 な量のゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスの何れかと、適切な溶剤系の中 で、工程（ｆ）の溶出物の完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧ Ｆ−１を接触させ、そして（ｈ）（１）工程（ｇ）　（Ｌ）の後、マトリックス の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導電率を有するバッフ ァー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上記第２疎水性相互作 用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、顕著な量の完全なモ ノマーの正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上記 マトリックスから完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１以 外の実質的にすべての形態のＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリック スの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファー系 と上記マトリックスを接触させることにより、残りの吸着ＩＧＦ−１を実質的に すべて上記マトリックスから脱離させるか、または （２）（ｇ）（２）の工程の後、十分な量の溶出バッファーで上記ゲル濾過クロ マトグラフィーマトリックスを溶出することにより上記マルチマー形態の［ＧＦ −１から完全なモノマーの正確に）ｔ−ルドされた形態のＩＧＦ−１を分離する 。

本発明の特定の態様によれば、モノマーで完全な、正確にフォールドされたイン スリン様成長因子−１ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精 製方法を提供するが、その際、ＩＧＦ−１を含む上記媒体は、高細胞密度の酵母 発酵操作による実質的に細胞を含まない発酵媒体であり、そして上記酵母は少な くとも一つのＤＮＡ断片で形質転換されており、該断片は転写の方向に以下の配 列 （ｉ）ピキアパストリスのメタノール感受性（ｒｅｓｐｏｎｓ　１ｖｅ）遺伝子 のプロモーター領域。

（ｉ　ｉ）（ａ）ｌｙｓ−ａｒｇおよび＋ｙＳ−ａｒｇ−（ｇｌｕ−ａｌａ）。

（式中、Ｘは１から約３の整ｅ１）からなる群から選択されるプロセシング部位 を含むすｙ力ロミセスセレビシエのアルファ交配因子（ＡＭＦ）プレープロ配列 、および （ｂ）インスリン様成長因子−１（［ＧＦ−１）ペプチドからなるポリペプチド をコードする配列：および（ｉ　ｉ　ｉ）ピキアバストリス内で機能する転写終 結因子（ｔｅｒｍｉｎａｔ。

「）、 を含むが、その際、上記Ｄ　Ｎ　Ａ配列は上Ｊ［ｌ！ポリペプチドをコードする 配列の転写のために互いに機能的に連結されており、上記方法は以下の工程より なる・（ａ）上記媒体を十分な量のスルフィルプロピル化されたカチオン交換媒 体と接触させるが、その条件は上記媒体から少なくとも約９５％の上記ＩＧＦ− １を吸着させるのに適切な条件であり、その際、上記媒体中の１グラムのＩＧＦ −１あたり少なくとも０．０３リツトルの上記カチオン交換材料を用い、そして 約２℃から約３０℃の範囲の温度で上記接触を実施し、必要であれば、カチオン 交換材料との接触前にＩＧＦ−１含有媒体を低導電性バッファー媒体で希釈して よいが、該バッファーは上記カチオン交換材料を平衡化するのに用いられる媒体 と同じｐＨを有し、 （ｂ）上記ＩＧＦ−１含有カチオン交換材料を、上記カチオン交換材料の少なく とも約２倍の体積の０．０２Ｍ酢酸溶液と接触させ、次に、（１）約５倍の体積 の、０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５） と接触させるか、または（２）約４倍の体積の、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液 （ｐＨ５）と接触させ、次に少なくとも約４倍の体積の、０．０５Ｍ酢酸ナトリ ウム溶Ｍ（ｐＨ５，５）と接触させるか、または（３）約４倍の体積の、０．０ ５Ｍ酢酸ナトリウム溶Ｈ（ｐＨ５，５）と接触させ、次に約４倍の体積の、５０ ｍＭ酢酸ナトリウム中（ｐＨ５，５）の０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液と接触さ せ、そして次に５０ｍＭ酢酸ナトリウム中（ｐＨ５，５）の０．１Ｍ塩化ナトリ ウム溶液との接触させ、 （ｃ）（１）十分な量の、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ酢酸ナトリ ウム溶Ｈ（ｐＨ５，５）と、工程（ｂ）（１）の上記マトリックス材料を接触さ せることにより、工程（ｂ）（１）の上記ｒＧＦ−１含有カチオン交換マトリッ クス材料から吸着［ＧＦ−１を溶出させるか、または（２）上記カチオン交換マ トリックスの約８倍の体積の、ＯＭから０．５Ｍの塩化ナトリウムを５０ｍＭ酢 酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）中に含む直線勾配溶液と、工程（ｂ）　（２） の上記マトリックス材料を接触させることにより、工程（ｂ）（２）の［ＧＦ− １含有カチオン交換マトリツクス材料から吸着［ＧＦ−１を溶出させるか、また は（３）０．３Ｍ塩化ナトリウムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）中に 含む約８倍の体積の溶液と、工程（ｂ）（３）の上記マトリックス材料を接触さ せることにより、工程（ｂ）（３）の上記ＩＧＦ−１含有カチオン交換マトリッ クス材料から吸着ＩＧＦ−１を溶出させ、（ｄ）主たる形態のＩＧＦ−１として 、完全なモノマーの正確にフォールドされた形態の［ＧＦ−１を含む、工程（ｃ ）（１）の溶出物または工程（ｃ）（２）または（ｃ）（３）の溶出物のそれら 部分を、十分な量の緩衝化硫酸アンモニウム含有溶液（ｐＨ約４．０から約７． ０）と接触させることにより、硫酸アンモニウム濃度を約０．２Ｍ以上２Ｍまで にし、そして希釈された溶出物のｐＨを約４．５にし、 （ｅ）工程（ｄ）の生成物を、十分な量の第１疎水性相互作用クロマトグラフィ ーマトリックスと接触させるが、約９５％から１００％の上記ＩＧＦ−１を上記 溶出物から吸着させるのに適した条件下で上記接触を行い、その際、上記第１疎 水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチル置換ポリ（メタクリレー ト）で支持された疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスであり、そし て上記媒体中の１グラムのＩＧＦ−１あたり少なくとも約０．０５リツトルの上 記疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを使用し、そして上記接触が 約２０℃以上２５℃までの範囲で実施され、（ｆ）上記第１疎水性相互作用クロ マトグラフィーマトリックスから吸着ＩＧＦ−１を溶出するが、その際、上記マ トリックスを（１）最初に、実質的に硫酸アンモニウムを含まない溶出物を生成 するのに十分な、大量の、ｐ）ｌ約４．５、または好ましくは最初のｐＨが５． ０で最終的なｐＨが約４．　０の直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、そして（ ２）好ましくはｐＨ約４．０の緩衝溶液と接触させ、次に、（３）（ｉ）上記溶 出液のｐＨを約６．５〜約７，５に上昇させるのに十分な、大量の、最初のｐ） （が約４．　０〜約４．５の、実質的に硫酸アンモニウムを含まない直線塩濃度 勾配緩衝溶液、または（１１）大量の、ｐＨ約６．５から約７．５の緩衝溶液と 接触させるが、その際、工程（ｒ）（２）の後に工程（ｆ）（３）（ｉｉ）を実 施することが好ましく、（ｇ）必要に応じて、工程（ｆ）（３）（ｉ）で得られ た溶出画分の少なくとも一部を実質的に十分な量の上記第１疎水性相互作用クロ マトグラフィーマトリックスと接触させるが、上記溶出物から残りのＩＧＦ−１ の約９５％以上１００％を吸着させるのに適した条件で該接触を実施し、その際 、上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチル置換疎水性 相互作用クロマトグラフィーマトリックスであり、上記媒体中のＩＧＦ−１のダ ラムあたり少なくとも約０゜０５リツトルの上記第１疎水性相互作用クロマトグ ラフィーマトリックスを用い、そして上記接触を約２０℃から約２５°Ｃの範囲 で実施し、（ｈ）任意の工程（ｇ）を実施したならば、上記第１疎水性相互作用 クロマトグラフィーマトリックスから吸着したＩＧＦ−１を溶出するが、その際 、上記マトリックスを、 （１）最初に、実質的に硫酸アンモニウムを含まない溶出物を生成するのに十分 な、大量の、ｐＨ約４，５、または好ましくは最初のｐＨが５．０で最終的なｐ ｉ−１が約４．０の直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、そして（２）好ましく はｐＨ約４．０の緩衝溶液と接触させ、次に、（３）（ｉ）上記溶出液のｐｉ（ を約６，５〜約７，５に上昇させるのに十分な、大量の、最初のｐＨが約４．０ 〜約４．５の、実質的に硫酸アンモニウムを含まない直線塩濃度勾配緩衝溶液、 または（肖）大量の、ｐＨ約６．５から約７．５の緩衝溶液と接触させ、 （１）主要な形態として完全なモノマーの正確にフォールドされたｒＧＦ−１を 含む、工程（ｆ）（３）（ｉ）または工程（ｆ）（３）（ｉ　ｉ）の溶出部分、 または必要であれば、工程（ｆ）（３ン　（ｉ）と工程（ｈ）（３）（ｉ）また は（ｈ）（３）（肖）の溶出物の混合物を接触させるが、その際、上記接触を十 分な量の第２カチオン交換マトリツクス材料で実施し、上記溶出物からＩＧＦ− ■の約９５％以上ＬＯＯ％を吸着させるのに適した条件で該接触を実施し、その 際、上記第２カチオン交換マトリツクス材料が、スルフィルメチル化またはスル フィルプロピル化されたマトリックスであり、上３２媒体中のＩＧＦ−１のダラ ムあたり少なくとも約０．０５リツトルの上記マトリックスを用い、そして上記 接触を約２０℃から約２５℃の範囲で実施し、（ｊ）ＩＧＦ−１含有カチオン交 換マトリツクス材料を、上記カチオン交換マトリックス材料の体積あたり少なく とも１から５倍の体積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，５）、および 好ましくは、１〜５倍の体積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）と 接触させ、（ｋ）マトリックスの体積に比較して少なくとも５倍の体積の塩化ナ トリウム勾配溶液と上記マトリックス材料を接触させることにより上記第２カチ オン交換マトリツクス材料から吸着ＩＧＦ−１を溶出するが、その際、上記勾配 溶液は上記第１溶剤系と第２溶剤系からなる直線勾配溶液であり、上記第１溶剤 系は０゜０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）からなり、そして上記第２溶 剤系は０゜０５Ｍ酢酸ナトリウム１０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５，５）がら なり、（１）工程（ｋ）の後に、 （１）工程（ｋ）の溶出物のうち完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧ Ｆ−１を含有する画分を、少なくとも１倍の体積の緩衝化硫酸アンモニウム含有 溶！　（１）Ｈ４，０−７，０）で希釈して、溶出物の硫酸アンモニウム製炭を 約０．２Ｍから約２．０Ｍにし、そして希釈された溶出物のｐＨを約４．５にし 、そして上記溶出物から約９５％から１００％の上記ＩＧＦ−１を吸着させるの に十分な条件下で十分な量の第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリック スと上記希釈溶出物を接触させるが、その際、上記第２疎水性相互作用クロマト グラフィーマトリックスがブチル置換ポリ（メタクリレート）で支持された疎水 性相互作用クロマトグラフィーマトリックスであり、上記媒体中のＩＧＦ−１の ダラムあたり、少な（とも約０．０５Ｍリットルの上記第２疎水性相互作用クロ マトグラフィーマトリックスを用い、そして上記接触を約２０℃から約２５℃の 範囲で行うか、または （２）完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を含有する工程（ｋ ）の溶出画分を濃縮し、そして濃縮された物質を十分な量のサイズ排除媒体と接 触させるが、該媒体は実質的にすべてのマルチマー形態の［ＧＦ−１がら完全な モノマーの正確に）ｔ−ルドされたｒＧＦ−１を分離するのに有効な適切なポア サイズを有し、そして （ｍ）（１）工程（１）（１）の後に、上記第２疎水性相互作用クロマトグラフ ィーマトリックスから吸着されたＩＧＦ−１を溶出するが、その際上記マトリッ クスを： （ｉ）最初に、実質的に硫酸アンモニウムを含まない溶出物を生成するのに十分 な、大量の、ｐＨ約４．５、または好ましくは最初のｐＩ−Ｉが５．０で最終的 なｐＨが約４．０の直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、そして（ｉｉ）好まし くはｐＨ約４．０の緩衝溶液と接触させ、次に、（ｉ　ｉ　ｉ）　（１）上記溶 出液のｐＨを約６．５〜約７．５に上昇させるのに十分な、大量の、最初のｐＨ が約４．０〜約４．５の、実質的に硫酸アンモニウムを含まない直線塩濃度勾配 緩衝溶液、または（２）大量の、ｐＨ約６．５から約７．５の緩衝溶液と接触さ せるか、または（ｍ）（２）工程（１）（２）の後に、１−２倍の体積の０．　 ０５Ｍ−０，１Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ６）または０．２Ｍの酢酸で上記サイ ズ排除マトリックスを溶出して上記マルチマー形態のＩＧＦ−１から完全なモノ マーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を分離する。

明細書および請求の範囲を通じて使用されている、「インスリン様成長因子−１ 」またはｒＩＧＦ−１ペプチド」または単にｒＩＧＦ−ＩＪという言葉は、さま ざまな形態の組換えにより生産されたＩＧＦ−１（即ち、完全な、モノマーの、 正確に）オールドされたＩＧＦ−１、並びにニックを入れられた形態、分割され た形態、マルチマーな形態およびミスフォールドされた形態）を意味する。本明 細書で用いられているとおり、［完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧ Ｆ−１」というｆｆｚは、天然ｒＧＦ−１［＋１７トウエイン（Ｒｏ　ｔｗｅ　 ｉ　ｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：４８２８−４８３２　（１９８ ６）］、並びに生物学的活性を有する類似体およびその誘導体と実質的に同し数 の７０アミノ酸配列および３次構造を有するｒＧＦ−１の形態を意味する。

本発明の精製工程の第１工程は、インスリン様成長因子−１含有媒体を十分な量 の第１カチオン交換マトリツクスに接触させるが、その際上記媒体から少なくと も約９５％から１００％の全ＩＧＦ−１を吸着させるのに十分な条件で該接触を 実施する。

インスリン様成長因子−ト含有媒体と第１カチオン交換マトリツクスとの接触は さまざまな方法により実施できる。例えば、第１カチオン交換マトリツクスは、 インスリン様成長因子−１含有媒体をパーコレートすることにょリカラムに含ま せることができる。別法として、インスリン様成長因子−１含有媒体を導入し、 次にマ１−ＩＪックスと液体媒体が接触するのに十分な時間撹拌し、次にＩＧＦ −１含有第１カチオン交換マトリツクスからＩＧＦ−１が除去された媒体をデカ ントすることにより、密閉容器中に含ませることができる。さらなる別法として 、第１カチオン交換マトリツクスをＩＧＦ−１含有媒体を含む容器に加えて、次 に■ＧＦ−１含有第１カチオン交換マトリックスがらＩＧＦ−１を除がれた媒体 を除去することができる。

本発明の第１接触工程において使用されるように意図されたカチオン交換マトリ ックス材料は当業界の範囲である。このような交換マトリックスは、高い流速を 有す、即ち、高い強度を有すことができることにより、高圧に耐え、付加的にマ クロポーラスな構造を有し、さらに広い範囲のｐｎにわたってＩＧＦ−１を結合 することができる強固なカチオン交換マトリックスを含む。強固なカチオン交換 マトリックスの例としては、カルボキシメチル化またはスルフォン化カチオン交 換マトリックスを含む。マトリックス材料、例えばセルロース、ポリスチレン、 デキストラン、アガロース、架橋アガロース等は、カチオン交換マトリックスの 調製に使用できる。この第１接触工程の用途に現在好ましいカチオン交換マトリ ックスはスルフィルプロピル化マトリックスである。

本質的ではないが、ＩＧＦ−１含有媒体の接触に先立ってカチオン交換マトリッ クスを活性化することはしばしば好ましい。このような活性化は、次のＩＧＦ− １含有媒体のためのマトリックスを望ましい状態にし、そして１ＧＦ−１ペプチ ドを吸着し、かつ、媒体中の他の成分からそのようなペプチドを分離するための マトリックスの効率を改良する。典型的な活性化の方法は、数カラム体積の希釈 された弱酸（例えば、２−５体積の０．２Ｍ酢酸）に続き、さらに大量の体積の より希釈された弱酸（例えば、２−１０体積の０．０２Ｍ酢酸溶液）をカチオン 交換マトリックスに連続的に接触させることを含む。

本発明の実施において用いられる第１カチオン交換マトリツクス材料の量は、広 範囲に変更可能である。典型的には、媒体中のＩＧＦ−１のダラムあたり、少な くとも約０．０３リツトルから１リツトルのマトリックスを用いる。

ｔＧＦ−１含有媒体の第１カチオン交換マトリツクスへの接触はさまざまな条件 下で実施できる。典型的には、そのような接触は約０．０１から約１時間あるい はさらに長い時間、約２℃から約３０℃、好ましくは約２２℃から約２５℃で実 施する。

ＩＧＦ−１がマトリックス材料に吸着されるのに十分な時間、ＩＧＦ−１含有培 地を第１カチオン交換マトリツクスに接触させ続けたならば、ＩＧＦ−１が豊富 な第１カチオン交換マトリツクスからＩＧＦ−１を含まない媒体を除くことが望 ましい。これは、さまざまな方法、例えば、濾過、デカント、遠心分離等により 実施できる。この接触および分離は、１つの操作工程により容易に実施でき、第 １カチオン交換マトリツクスのカラムにＩＧＦ−１含有媒体を通過させるが、そ の際該カラムは別の手段（例えば、スクリーン、穴を備えた支持プレート等）に 支持されていることにより上記第１カチオン交換マトリツクスをカラムに保持し 、液体の媒体を通過させる。この方法において、ＩＧＦ−１を除かれた培地は単 に第１カチオン交換マトリツクスを通過する。本発明によるカラムクロマトグラ フィーの実施において、カラムベッドの高さは約１０センチ以上が好ましく、約 ２０センチの高さが特に好ましい。

ＩＧＦ−１の溶出に先立って、実質的にすべてのＩＧＦ−１が第１カチオン交換 マトリツクスに吸着されたならば、ＩＧＦ−１含有マトリツクスを、第１カチオ ン交換マトリツクスの体積に対して約１から約１０倍の体積の希釈された弱酸に 接触させ、その後、マトリックスをさらに大量の体積の、最初の洗浄より高いイ オン強度の弱酸（またはより高いイオン強度およびｐＨ）に接触させる。この付 加的洗浄工程は、ＩＧＦ−１のようにそれほど強固に第１カチオン交換マトリツ クスに結合していない不純物を除去する機能を有する。例示的な希釈された弱酸 溶液は、約０．０２モラーの酢酸溶液またはリン酸溶液を含む。現在好ましい洗 浄系は、２０ｍＭ酢酸に続＜０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム （ｐＨ５）、または２０ｍＭ酢酸に続＜５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）に続 ＜５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）、または洗浄系：２０ｍＭ酢酸に続く ５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）に続＜０．１ＭのＮａＣ１を含む５０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）を含む。

実質的にすべてのＩＧＦ−１が第１カチオン交換マトリツクスに吸着し、そして 必要であれば上記のとおりに洗浄されたならば、次にＩＧＦ−１をＩＧＦ−１含 有マトリツクスから溶出するが、その際、十分に大量の、十分に高いｐＨまたは イオン強度を有する溶剤系にマトリックスを接触させることにより、マトリック スから実質的にすべてのＩＧＦ−１を脱離させる。所望の希釈を達成するために 十分高いｐＨまたはイオン強度を有する溶剤系は、マトリックス材料が平衡化さ れている水性媒体よりも高いイオン強度を有するか、またはマトリックス材料が 平衡化されている水性媒体よりも高いｐＨを有する溶剤系である。溶出は、溶剤 系のｐＨまたはイオン強度を上昇させることにより達成される。所望の希釈を達 成するための「十分に高いｐＨまたはイオン強度」を有する溶剤系は、ｐＨまた はイオン強度を十分に変化させることにより、移動相から安定相へのＩＧＦ−１ ペプチドの分配を実質的に増加させる。

この溶出工程に用いられるように意図された溶剤系は、ｐＨ約５．５の弱酸であ り、かつ、イオン性塩、例えば塩化ナトリウムを０．２−ＬＭの濃度で含む、希 釈された緩衝溶液を含む。この溶出系に用いられる現在好ましい溶剤系は、（１ ）ｐＨ約５．５の０．０２Ｍ酢酸ナトリウムであり、さらに約ＩＭの塩化ナトリ ウムを含むか、（２）０−０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ５，５）からなる直線勾配溶液か、または（３）０．３Ｍ塩化ナトリ ウムを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶Ｍ（ｐＨ５，５）である。０．３Ｍ塩化 ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶Ｍ（ｐＨ５，５）（即ち、上記溶 剤系（３））を用いて溶出工程を実施するならば、溶出工程の前に、２０ｍＭ酢 酸の律に５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５，５）を用い、次に０．１Ｍ塩化ナトリウムを含 む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で洗浄する洗浄系を使用することが特 に好ましい。

用いられる溶出溶剤系の量は広範囲に変更できる。典型的には、第１カチオン交 換マトリツクスの体積あたり、約３−１０倍の体積の溶剤系を用いる。

ＩＧＦ−１含有カチオン交換マトリツクスからのＩＧＦ−１の溶出はさまざまな 条件下で実施できる。典型的には、溶出温度を約２℃から約３０℃にする。典型 的には、溶出時間を比較的短時間の０．０１時間から１時間にするが、それより 長い時間も短い時間も使用することができる。

次に、第１カチオン交換マトリツクスから溶出された部分精製ＩＧＦ−４含有媒 体を十分な量の第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに接触させ るが、その際、ＩＧＦ−１含有線体から約９５％以上１００％のＩＧＦ−１を吸 着させるのに適した条件下で該接触を行う。そのような接触はバッチでも連続様 式でも実施できるが、カラムにマトリックスを含ませ、そしてその中にＩＧＦ− １該媒体を通過させることが現在好ましい。カラムベッドの高さが約２０センチ になるように十分な量のマトリックス材料を用いることが好ましい。

第１カチオン交換マトリツクスからの溶出物を第１疎水性相互作用クロマトグラ フィーマトリックスに接触させるのに先立って、最初の溶出物を十分な量の緩衝 塩含有溶液（ｐＨ４，０−７，０、好ましくは４．　５−５．　０）で処理して 、希釈された溶出物の塩濃度を約０．４Ｍから約１．０Ｍ、好ましくは０，６Ｍ 、そして希釈された溶出物のｐＨを約４．５にすることが典型的である。媒体中 の塩含有量を増加させることにより、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリ ックスへの［ＧＦ−１の親和結合を高める。そのような使用に意図される塩は、 １ＧＦ−１と疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスの間の疎水性相互 作用を改良するものであり、例えば、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アン モニウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウ ム、クエン酸ナトリウム等を含む。広義には、使用される塩含有量は約０．２Ｍ から約２．０Ｍの範囲であり、０．４Ｍから１．０Ｍが現在好ましい。特に好ま しい塩は０．４−０．８Ｍの硫酸アンモニウムである。

本発明のこの次の接触に用いるように意図された疎水性相互作用クロマトグラフ ィーマトリックス材料はアルキルまたはアリールで置換された疎水性相互作用ク ロマトグラフィーマトリックスである。疎水性相互作用は重大な生物学的意義を もつ現象である。それらの相互作用は蛋白質の３次構造を安定化させる主要な力 のひとつである。疎水性は非極性化合物と極性環境、例えば、水との反発作用で ある。疎水性化合物の回りの水の構造は疎水性相互作用をつくるので、水中に塩 を溶解させることにより水の構造を変えれば、疎水性相互作用は影響される。

例示的なマトリックスは、ブチル−、オクチル−１またはフェニル−置換疎水性 相互作用クロマトグラフィーマトリックスである。本発明の実施において疎水性 相互作用クロマトグラフィーマトリックスとして使用されるように意図された支 持体は、合成ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）等：セ ルロース、デキストラン、アガロース、架橋アガロース等を含む。本発明の実施 において使用されるための現在好ましい疎水性相互作用クロマトグラフィーマト リックスはブチル置換ポリ　（メタクリレート）疎水性相互作用クロマトグラフ ィーマトリックス（例えば、ＴＳＫブチルトヨバール−６５０Ｍマトリックス） である。

使用に先立って、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを活性化する ことができ、または使用後に疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを 再生することができ、以下の連続洗浄工程：■−１０倍カラム体積の水、 ３−１０倍力ラム体積の０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液、１−１０倍力ラム体積 の水、 ３−１０倍力ラム体積の５０％水性メタノール溶液、そして最後に１−１０倍力 ラム体積の水 を用い、その後、カラムを５−１０倍力ラム体積の塩含有酢酸／リン酸緩衝液（ ｐｌ−１約４．５、好ましくは５．０）で平衡化する。

本発明の実施に使用される第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス の量は、広範囲に変更可能である。典型的には、媒体中のＩＧＦ−１のダラムあ たり約０．０５リツトルから約１す７トルのマトリックスが使用される。

第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスへの部分精製ＩＧＦ−１含 有媒体の接触はさまざまな条件下で実施できる。典型的には、そのような接触は ０．　１分から３０分の時間、および１５℃から３０℃の温度で実施されるが、 約２０℃から約２５℃の温度が好ましい。

実質的にすべてのＩＧＦ−１が第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリッ クスにより吸着されたならば、ＩＧＦ−１を該第１疎水性相互作用クロマトグラ フィーマトリックスから溶出するが、その際、顕著な量の完全な七ツマ−の正確 にフォールトされた形態の吸着ＩＧＦ−１をマトリックスから除去することなし に、マトリックスからある種の異常なＩＧＦ−１ペプチドを除去するのに適した 条件下で最初にマトリックスを接触させ１次に実質的にすべての残りの吸着ＩＧ Ｆ−１をマトリックスから除去するのに適した条件下でマトリックスを接触させ る。溶出画分のＩＧＦ−１含有量はさまざまな技術、例えば、ＨＰＬＣにより測 定することができる。

ある種の異常なＩＧＦ−１ペプチドの最初の溶出は、マトリックスの体積に対し て約１倍から約１０倍の体積の、低い導電性を有する緩衝系、即ち、約１００ｍ Ｍ塩未満を含む緩衝系にマトリックスを接触させることにより達成される。例示 的な緩衝系は、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液、琥珀酸緩衝液、Ｂ１５ −Ｔｒｉｓ緩衝液等、並びにそれらの混合物（ｐＨ約４．５）を含む。このよう な緩衝液を大量に用いることにより、実質的に塩を含まない溶出物が生産される 。好ましくは、最初のＨＩＣマトリックスのこの最初の溶出は、５０ｍＭ酢酸ナ トリウム／リン酸ナトリウムでｐＨ５，０に緩衝された２０％飽和硫酸アンモニ ウムで開始し、同じ緩衝液でｐＨ４，０に緩衝された０％硫酸アンモニウムで終 わる直線硫酸アンモニウム勾配の使用を含む。これに続いて、硫酸アンモニウム を含まないｐＨ４，０の緩衝液を用いる洗浄を行ってもよい。

マトリックスからの残りの吸着ＩＧＦ−１の溶出は、約１から１０倍の体積の、 上昇させたｐＨを有する緩衝系にマトリックスを接触させることにより達成され るが、その際、上記緩衝液は溶出物のｐ　Ｉ−１を約６．　５−７．　５に上昇 させるのに十分な量で用いる。

［ＧＦ−１含有疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスからのｒＧＦ− １の溶出はさまざまな条件下で実施できる。典型的には、約１５℃から約３０℃ の温度、好ましくは約２０℃から約２５℃の温度を用いる。典型的には、溶出時 間はカラムの大きさ、マトリックス材料等により変更される。カラムを通した溶 出物の流速は約１０から約３００ｃｍ／ｈが典型的である。

必要であれば、上昇させたｐＨを有する緩衝液を用いて溶出された、第１疎水性 相互作用クロマトグラフィーマトリックスの溶出物の一部を同じ疎水性相互作用 クロマトグラフィーマトリックス（再生後）にのせ、そして上記２段階または３ 段階溶出プロトコルによりもう一度溶出してもよい。この様式において、追加量 の完全でモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１が得られる。実質的な量 の他の形態のＩＧＦ−１（例えば、２０％以上のマルチマー形態のＩＧＦ−１） に加えて、実質的な量の完全でモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を 含む溶出画分は、そのような第１カチオン交換クロマトグラフイーマトリツクス の追加の再使用の候補になりやすい。

次に、第１カチオン交換クロマトグラフイーマトリツクスの溶出物のうち、完全 でモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１含有画分を十分な量の第２カチ オン交換マトリツクスに接触させるが、その際の条件は溶出物からのｆＧＦ−１ ペプチド約９５％から１００％を吸着させるのに適した条件である。この工程は 、第２カチオン交換マトリツクス材料を含むカラムにＩＧＦ−１ペプチド含有線 体を通過させることにより都合よ〈実施される。必要であれば、ニックを入れら れたＩＧＦ−１、さらに真正［ＧＦ−１およびマルチマーＩＧＦ−１を含む■Ｇ Ｆ−１含有画分からニックを入れられた［ＧＦ−１を除去するために、この第２ カチオン交換クロマトグラフイーマトリツクスは使用される。本発明の特定の好 ましい態様において、メタノール酵母を用いることにより組換え［ＧＦ−１を生 産してよいが、その際、ニックを入れられたＩＧＦ−１のレベルは実際は無視し てよく、その場合、カチオン交換クロマトグラフィーの第２ラウンドは付加的で よく、そしてマルチマーＩＧＩ”−１から真正［ＧＦ−１を分離する必要があれ ば、上記のとおりに、次の疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製法をゲ ル濾過クロマトグラフィーの前に実施してよい。

本発明のこの接触工程の使用のために意図されたカチオン交換マトリックスは高 度分離能、即ち、完全なモノマーＩＧＦ−１からニックを入れられたＩＧＦ−１ を分離できる強固なカチオン交換マトリックスである。例示的なカチオン交換マ トリックスは、カルボキシメチル化またはスルフォン化されたカチオン交換媒体 を含む。本発明のこの接触工程の使用のための現在好ましいカチオン好ましいマ トリックスはスルフォン化されたアガロース（例えば、Ｆａｓ　ｔ−Ｆ　ｌｏｗ Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅまたはＴｏｙｏｐｅａｒｌ　５Ｐ５５０Ｃ）である。

本発明の実施に使用される第２カチオン交換マトリツクスの量は、広範囲に変更 可能である。典型的には、媒体中のＩＧＦ−１のダラムあたり約０．０５リツト ルから約１リツトルのマトリックスを使用する。

第２カチオン交換マトリツクスへのＩＧＦ−１含有培地の接触は、さまざまな条 件下で実施できる。典型的には、このような接触は少なくとも約０．１分の時間 、および約２℃から約３０℃の範囲の温度で実施され、約２０℃から約２５℃の 範囲の温度が好ましい。

必要であれば、導電性を低下させるために、第２カチオン交換マトリツクスに適 用される媒体は、第２カチオン交換マトリツクスへの接触前に少なくとも１倍体 積の水（またはカラム平衡化緩衝液のような低導電性緩衝液）で希釈できる。

希釈されたＩＧＦ−１含有線体のｌ）Ｈは、第２カチオン交換マトリツクスへの 適用前に約４．５に調節することが好ましい。

使用前に第２カチオン交換マトリツクスは活性化することができ、または使用後 に第２カチオン交換マトリツクスは再生することができるが、その方法は、以下 の連続洗浄工程による： １−１０カラム体積の水、 ３−１０カラム体積の０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液、１−１０カラム体積の水 、 ３−１０カラム体積の５０％水性メタノール溶液、そして最後に、１−１０カラ ム体積の水で洗浄し、その後、カラムを３−５力ラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ４，５Ｌおよび１０−２０力ラム体積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ ｐＨ４，５）で平衡化する。

実質的にすべてのＩＧＦ−１がＩＧＦ−１の溶出前に第２カチオン交換マトリツ クスに吸着したならば、マトリックスの体積に対して約１から約５体積の弱酸の 希釈緩衝液にＩＧＦ−１含有マトリツクスを接触させることが望ましい。この目 的のために意図された弱酸は酢酸およびリン酸を含む。弱酸の現在好ましい希釈 緩衝液はｐＨ約４．５の０．０５Ｍ酢酸ナトリウムである。この追加の洗浄はＩ ＧＦ−１のようにそれほど強固に第２カチオン交換マトリツクスに結合していな い不純物の除去のために機能する。好ましくは、この追加の洗浄工程は、ｐＨ約 ４、　５（７）０．　０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液、続いてｐＨ約５．５１７）０ ．　０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液の使用を含む。

実質的にすべてのＩＧＦ−１が第２カチオン交換マトリツクスに吸着され、そし て上記の追加の洗浄を施されたら、次にＩＧＦ−１含有マトリツクスからＩＧＦ −１を溶出するが、十分な量の、十分なイオン強度を有する緩衝系にマトリック スを接触させて、実質的にすべての［ＧＦ−１ペプチドをマトリックスから別々 に脱離させることにより該溶出を行う。典型的には、少なくとも１倍の体積の溶 出液をこの目的に使用し、約３倍から約１２倍の体積が好ましい。

この別々の脱離を達成するための都合よい方法は、緩衝溶剤系中の塩化ナトリウ ム勾配を用いることである。例えば、ｐＨ５，５の酢酸ナトリウム緩衝液の塩化 ナトリウム量を時間と共に増加させることができる。即ち、最初に０．０５Ｍ酢 酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）を用いて直線勾配を開始し、そして第２溶剤系 の量を増加させるが、その際、第２溶剤系は０．０５Ｍ酢酸ナトリウム１０゜３ Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５，５）からなる。

ｒＧＦ−１含有カチオン交換マトリツクスからのＩＧＦ−１の溶出はさまざまな 条件下で実施できる。典型的には、温度の範囲を約２℃から約３０℃にするが、 約２０℃から約２５℃が好ましい。典型的には、溶出時間は、カラムの大きさ、 マトリックス材料等の函数として変更される。カラムからの溶出速度は典型的に は、約１０から約３００ｃｍ／ｈである。

第２カチオン交換マトリツクスの溶出は、第２疎水性相互作用クロマトグラフィ 一工程、または好ましくは、ゲル濾過法のいずれかにより処理されうる。このよ うな処理は実質的に精製されたＩＧＦ−１含有線体からの残りのマルチマーの除 去に用いられる。

実質的に精製されたＩＧＦ−１含有線体から残りのマルチマーを除去するために ゲル濾過を用いるならば、完全でモノマーの正確にフォールドされた形態の■Ｇ Ｆ−１を主に含む第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスまたは第 ２カチオン交換クロマトグラフイーマトリツクスのいずれかからの溶出物の一部 を、実質的にすべてのモノマーＩＧＦ−１をマルチマー形態から分離するのに適 した条件下で、十分な量のゲル濾過媒体に接触させる。これは、ゲル濾過媒体を 含むカラムにＩＧＦ−１含有線体を通過させることにより達成される。本発明の 実施において使用されることを意図されたゲル濾過媒体は、所望の完全でモノマ ーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１とそのマルチマー形態を分離させ るのに適したポアサイズを有するサイズ除外媒体を含む。例示的なゲル濾過媒体 は、セファデックス、セファクリル、スーパーデックス、ポリマーを基にした樹 脂等を含む。

本発明の実施において使用されるゲル濾過媒体の量は、処理される媒体中のＩＧ Ｆ−１のダラムあたり１−１０リツトルの範囲のゲル濾過媒体が典型的である。

ゲル濾過媒体へのＩＧＦ−１含有線体の接触はさまざまな条件下で実施できる。

典型的には、このような接触は少なくとも１２０分の時間、および約２０から約 ２５℃の範囲で実施される。

使用後は、以下の連続洗浄方法によりゲル濾過媒体を再生できる・０、　５−２ ．　０力ラム体積の水、０．　５−２．　０力ラム体積の０．５ＭのＮａＯＨ１ ０，５−２，０力−ｙム体積（７）５０％メタノール、そして最後！、：０．　 ５−２゜０力ラム体積の水；そしてその後、１−５力ラム体積の０．０５Ｍ酢酸 ナトリウム（ｐＨ６，０）または０．２Ｍ酢酸。

ＩＧＦ−１含有線体をゲル濾過媒体に適用したならば、次にＩＧＦ−１をゲル濾 過媒体から溶出するが、その際、十分な量の溶出液にゲル濾過媒体を接触させて 、マトリックスへの顕著な非可逆的な蛋白質の吸着なしに、異なる移動度のマル チマーＩＧＦ−１およびモノマーＩＧＦ−１をゲル濾過媒体に通すことにより該 溶出を実施する。典型的には、この目的には少なくとも１倍体積の溶出液を用い るが、約１から約１．５倍の範囲が好ましい。ゲル濾過媒体からのＩＧＦ−１の 溶出に使用される例示的な溶出液は、塩含有緩衝液、例えば５０ｍＭ酢酸アンモ ニウム（ｐＨ６，０）　、または低導電性の緩衝液、例えば０．２Ｍ酢酸を含む 。

適切なポアサイズの実質的にすべてのゲル濾過材料を上記塩含有緩衝液でクロマ トグラフィーするが、ポリマーを基にした樹脂、もっとも好ましくはＴｏｙｏｐ ｅａｒｌ　ＨＷ５０Ｆ　（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ）を用いたゲル濾過マトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーを実施 し、そして酢酸溶液、例えば０，２Ｍ酢酸を用いて溶出することが最も好ましい 。

ＩＧＦ−１含有ゲル濾過媒体からのＩＧＦ−１の溶出はさまざまな条件下で実施 できる。典型的な温度は約２０℃から約２５℃を用いる。典型的には、溶出時間 はカラムの大きさ、ゲル濾過媒体等の函数として変更される。カラムからの溶出 速度は典型的には５から５０ｃｍ／ｈｒである。

ゲル濾過の代わりに第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを用い 、そして先に第２カチオン交換マトリツクスの溶出物の一部を第２疎水性相互作 用クロマトグラフィーマトリックスに接触させる場合、実質的な量の完全でモノ マーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を含む第２カチオン交換マトリツクス の溶出物を、必要であればｐＨ約４．０から約７．０、好ましくはｐＨ約４゜５ から約５，０の十分な量の緩衝化塩含有溶液で希釈することにより、希釈された 溶出物の塩濃度を約０．　４から約１．０Ｍ、好ましくは領　６Ｍにする。

次に、実質的な量の完全でモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−４を含む 第２カチオン交換マトリツクスの溶出物の一部を第２疎水性相互作用クロマトグ ラフィーマトリックスに接触させるが、該マトリックスは前で用いた第１疎水性 相互作用クロマトグラフィーマトリックスと同じでも異なるものでもよい。

第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスの量およびこの工程の接触 条件は、第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスへのＩＧＦ−１含 有媒体の接触において前で用いられたのと同様である。

実質的にすへての形態のＩＧＦ−４（即ち、精製工程のこの段階においてまだ存 在する形態のＩＧＦ−１）が第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリック スに吸着されたならば、第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに おいて前に記載したとおりにマトリックスを再び接触させてＩＧＦ−１をマトリ ックスから溶出する。即ち、マド１７ツクスを最初に処理するが、完全でモノマ ーの正確にフォールトされた［ＧＦ−１以外の実質的にすへての形態のＩＧＦ− １を除去するのに適した条件下で、顕著な量の完全でモノマーの正確にフォール トされたＩＧＦ−１を脱離しないようにし、そしてその後、実質的にすべての形 態のＩＧＦ−１をマトリックスから除去するのに適した条件下でマトリックスを 処理する。

完全でモノマーの正確に）ｔ−ルトされたＩＧＦ−１以外の形態の［ＧＦ−１（ 優位なマルチマー形態のＩＧＦ−１）の溶出は、低導電性を有する緩衝系を用い て達成される。そのような緩衝液は主としてマルチマー形態のＩＧＩ”ｌの溶出 を促進する。このような目的に有用な例示的緩衝液は、実質的に塩を含まない溶 出物を生成するのに十分なＭのｐ　）−１約４５の緩衝液の直線塩勾配である。

好ましくは、０．０５Ｍ酢酸／リン酸でｐＨ５，０に緩衝された２０％胞ＩＵ硫 酸アンモニウムで１）ｎ姶し、同し緩衝液でｐＨ４，０に緩衝された０％硫酸ア ンモニウムで終わる直線硫酸アンモニウム勾配をこの目的に使用する。これは、 さらに硫酸アンモニウムを含まないｐｉ（４，０の緩衝液を用いて洗浄してよい 。

残りの吸着ＩＧＦ−１のマトリックスからの溶出は、ＨＩＣマトリックスを平衡 化するのに使用される水性媒体のｐＨより高いｐＨを有する緩衝系を用いて達成 される。このような媒体を提供するのに都合よい手段は最初のｐＨが約４．０の 実質的に塩を含まない緩衝液の直線勾配であるが、その際、この緩衝液のｐＨは 約６．５から約７．５に徐々に上昇させる。別法として、この媒体は約６．５か ら約７．５の緩衝液であってよい。

第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスにおいて記載されていると おり、上昇させたｐＨを用いて溶出され、そして少量の完全でモノマーの正確に フォールトされたＩＧＦ−１に加えて優位な量のマルチマー形態のＩＧＦ−１を 含む第２ＨＩＣマトリツクスの溶出物の一部を第２疎水性相互作用クロマトグラ フィーマトリックスに再び適用して、上記の同じ溶出プロトコルにしたがって溶 出できる。

上記多工程法により得られた実質的に精製された生成物は、必要に応じて処理す ることにより、精製された生成物から残っている塩を除去し、そして精製された 生成物を含む媒体を濃縮する。例えば、塩の除去は、ゲル濾過、ダイア濾過（ｄ ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）等により達成できるが、精製された生成物を含む媒 体の濃縮は凍結乾燥、ダイア濾過等により達成できる。

本発明のＩＧＦ−１精製法に従ってＩＧＦ−１が回収される媒体は広範囲に変更 できる。天然、合成および／または組換え物質の回収は現在意図される。好まし くは、媒体１リツトルあたり約ＯＯ１グラムのＩＧＦ−１ペプチドを含む媒体は 本発明の実施に用いられる。

本発明により完全ｆｉ　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１モノマーが回収され、そして精製され る、ＩＧＦ−１の合成源は、ｆＧＦ−１ペプチドをＦｓ能的にコートするひとつ 以上のＤＮＡ配列を含む、組換え体修飾酵母、バクテリアおよび／または削孔動 物細胞を含む。現在好ましいのは、ピキア属から選択される酵母種であるが、該 酵母は］Ｇ「？−１を発現することかできる少なくとも一つの１）ＮＡ断片で形 質転換されており、特に、下記ＤＮＡ配列を転写方向に含む構築物からＩＧＦ４ が発現され、該配列は以下のとおりである （１）ピキアバストリスのメタノール感受性遺伝子のプロモーター、例えばＡＯ Ｘ１遺伝子のプロモーター、 （ｉｉ）（ａ）サンカロミセスセレビシエのアルファ接合因子（ＡＭＦ）のプレ プロ配列であって、ｌｙｓ−ａｒｇ；およびＩｙｓ−ａｒｇ−（ｇｌｕ−ａｌａ ）、からなる群から選択されるプロセッシング部位を含むが、その際Ｘは１から 約３の整数であり、および （ｂ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ４）ペプチドからなるポリペプチドを コートするＤＮＡ配列、および（ｉ　ｉ　ｉ）ピキアバストリス中て機能する転 写ターミネータ−１であるが、その際、上記ＤＮＡ配列は上記ポリペプチドをコ ートする配列の転写のために互いに機能的に結合している。

特定のピキアバストリス株、Ｇ＋［ＧＦ２０１Ｓ１．Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ２゜Ｇ ＋［ＧＦ２０１Ｓ６．Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ１０．Ｇ＋ＩＧＦ２０２Ｓ３．Ｇ＋ｒ ＧＦ２０２ｓ５．Ｇ＋ＩＧＦ２０４Ｓ２．Ｇ＋１ＧＦ２０４Ｓ８．Ｇ＋ＩＧＦ２ ０６Ｓ２．Ｇ＋ｒＧＦ２０６Ｓ５．Ｇ＋１ＧＦ２０６Ｓ８．Ｇ＋ＩＧＦ２０６Ｓ ９．Ｇ＋１ＭＢ２０２Ｓ２．Ｇ＋［ＭＢ２０４Ｓ１４．Ｇ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１． 。

Ｇ＋ｒＭＢ２０６Ｓ３．Ｇ−１ＭＢ２０６ｓ１．Ｇ−１ＭＢ２０６ｓ２．　また ｌｉＧ−１ＭＢ２０６Ｓ３が現在好ましいが、なぜならば、これらは発酵に際し て高いレベルのＩＧＦ４を生産するように改良されてきたからである。これら特 定の現在もっとも好ましい株は、係属中の出願第５７８．７２８号に記載されて いるとおりにして調製され、モしてｒＧＦ−１を発現するが、該株の調製および 該株によるＩＧＦ−１の発現に関するさらなる詳細については該出願に指示され ている。蛋白質分解活性を欠損し、そして高いレベルのＩＧＦ−１、および低レ ベルの二ｌりを入れられたＩＧＦ−１を発酵の際に生産するピキアバストリスの 株は、本出願人か共願の１９９１年４月１日出願の米国出願第６７８．９１６号 、および本出願人力哄願の［９９１年９１１４日出願のＰ　Ｃ１’国際出願第Ｕ Ｓ９１１０６４５２号に記載されており、これら出願の開示内容は引用により本 明細書の一部をなす。高いレベルのＩＧＦ−１、および低レベルのニックを入れ られたｒＧＦ−１を生産する特に好ましいピキアパストリス株はＭ＋ＩＭ８２０ ６Ｓ１である。

精製されるＩＧＦ−１が発酵操作により発酵培地に含まれる場合は、第１カチオ ン交換マトリツクスへのＩＧＦ−１含有媒体の最初の接触の前に、発酵培地から 細胞物質および粒状物質を分離することが好ましい。好ましくは、精製されるＩ ＧＦ−４は、高密度発酵操作により実質的に細胞を含まない発酵培地に含まれる 。この状況においては、必要に応じて、培地を第１カチオン交換マトリツクスに 接触させる前に緩衝媒体で希釈する。この目的に用いられる緩衝液は低導電性で あり、そして第１カチオン交換マトリツクスを平衡化するのに用いられる媒体と ほぼ同じｐＨであるべきである。

本発明は以下の非限定の実施例を参照することにより、今より詳細に記載される 。

−丈一施一廻一 のブロス　の　え　白　の 次の３段階高細胞密度バッチ発酵法： １）過剰のグリセロール下での増殖 ２）限定されたグリセロール下での増殖、および３）限定されたメタノール下で の増殖 に従って実施される１０リットル発酵物中の増殖する旦、バストリス（匣１虹ｕ ）（７）ＩＧＦ−１分泌株、Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４およびＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ １　（米国特許第５７８，７２８号、１９９０年９月４日出願、および米国特許 第６７８゜９１６号、１９９１年４月１日出願および国際特許ｐｃＴ／ＵＳ９１ １０６４５２．１９９１年９月４日出願）により組換えＩＧＦ−１が産生された 。

細胞は最初グリセロール下バッチ様式で増殖される。グリセロールはＡｏｘｌプ ロモーターを強く抑制するので［ＧＦ−１遺伝子（このプロモーターにより制御 されている）はこの段階では発現されない。グリセロールの枯渇に続き、限定さ れたグリセロールの供給を行う、グリセロールはこの段階では蓄積されず、細胞 の量が増加し、Ａｏｘｌプロモーターは抑制されない、最後に、第３段階におい てメタノールの供給が開始され、それによりＩＧＦ−１の産生のためのΔ」ノー １プロモーターが十分に誘導される。

正しく折りたたまれた（ｆｏｌｄｅｄ）　、完全な単量体ＩＧＦ−１が本発明の 陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨｒＣ ）およびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、ｌＯリットル発酵容器のブロス から精製された。

Ａ、Ｐ、バストリス　ａｓｔｏｒｉｓ）　、Ｇ＋　ｌＭＢ２０４　Ｓ　１４およ びＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のｌＯリットル ３．５リツトルのＩＯＸ基本塩Ｃ４２ｄ　Ｂ５％リン酸／ｐ、１．８ｇの硫酸カ ルシウム・２Ｈ２Ｏ／ｌ、２８．６　ｇの硫酸カリウム／ｌ、２３．４ｇの硫酸 マグネシウム・７ＨｆｆｉＯ＃！、６．５ｇの水酸化カリウム／Ｎ）および２２ ０ｇのグリセロールを含み総量を５．５リツトルとした液を入れた１５リンドル の発酵槽（Ｂｉｏｌａ−ｆｉｔｔｅ　：　Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ、　ＮＪ）を殺菌 した０発酵槽を冷却した後、２４ｄのＰＴＭ、微量塩（６，ＯｇｖＬ酸第二銅５ Ｈｔ　Ｏ／ｌ、０．０８ｇ　ヨ’７化ナトリウム／ｌ、３．Ｏｇ　ｆＬ酸マンｉ ｆン−Ｈｚ　Ｏ／ｌ、　０．２　ｇ％’Ｊブテン酸−ｊ−トリウム−２Ｈ，Ｏ／ ｌ、０．０２ｇ＃つ酸／ｉ、０．５ｇ塩化コベコハル／　４７．２０．０ｇ塩化 亜鉛／ｌ、６５．０ｇ硫酸第一鉄−ＩＨｔ　Ｏ／ｅ、０．２０ｇビオチン／ｌ、 ５．　Ｏａｆ硫酸／ｆｆ１）ヲ添加し、２８％（濃）水酸化アンモニウムを加え てＰＨを５に調整した。ＰＨは同じ溶液の添加により制御された。発泡は５Ｌｒ ｕｋｔｏｌ　Ｊ　６７３の５％溶液の添加により抑えられた。温度は３０°Ｃに 維持され、かき混ぜ、通気、反応器圧力を増加させることにより、または酸素を 給気することにより溶存酸素を飽和濃度の２０％以上に維持した。接種物は２％ グリセロールを含む緩衝化酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）（１１，５ｇ／Ｌ　ＫＨ ，ＰＯ，，２，６６８／Ｌ　Ｋ！ＨＰＯ４，６，７８／Ｌ　酵母窒素原礎培地、 ｐＨ６）中で一夜増殖させた旦、バム上四玉（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株Ｇ＋ｌＭＢ ２０４Ｓ１４またはＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１１７１細胞から調製された。

発酵槽に０Ｄｂｅｏが２−８まで増殖させた培養細胞５００−７００ｍを接種し 、ハツチ増殖法を１８−２４時間続けた。溶解酸素濃度の増加により示されるグ リセロール枯渇の時点で、１００ｍ／時間でグリセロールの供給を開始した（５ ０％　ｗ　／　ｖグリセロールに１２ａｆ／Ｌ　ＰＴＭＩを加えたもの）、この 時点で株ｃ＋ｌＭＢ２０４ｓ１４の発酵においてはｐＨ制御器の指定値を２．７ −２．８にあわせた。４時間後、細胞代謝の結果ＰＨは指定値まで減少した。グ リセロールの供給を止め、２０１ｄ／時間でメタノールの供給（１００％メタノ ールに１２ｄ／Ｌ　ＰＴＭ、を加えたもの）を開始した。株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ １においてはｐＨ’１ｔＨＢ機の指定値を２．８−３．０に調整した。メタノー ル供給を始めてから４時間後、メタノール供給速度を６０ｄ／時間に増加させた 、この速度を総計で約７２時間になるまで維持し、その時点で容器から採取した 。

８０発ブロスの　え白の− ＩＣ；Ｆ−１発現■、バストリス（匣１凹ｎ）株の発酵ブロス中、と±１（■０ ｉ！り産生ＩＣＦ−１は細胞を除いたブロスのイムノプロントおよびＨＰＬＣ分 析で明示されるごとく、完全で、単量体で正しく折りたたまれたＩＧＦ−１を含 むいくつかの形で存在する。■、イクストリス（Ｐ１江ｕ）株Ｇ＋ｌＭＢ２０４ Ｓ１４およびＭ＋［ＭＢ２０６Ｓ１の発酵物からの細胞を含まない粗ブロスのＨ ＰＬＣ分析（実施例３Ａ１に記載されたプロトコールを用いて）では種々のＩＧ Ｆ−１種を適切に分離できないので、小規模の陽イオン交換クロマトグラフィー によりブロスを前処理して天然の旦、バストリス（組Ｉ笠鎚）蛋白質が除去され た。

１、粗兄酵ブ旦各ｐ前免理 粗旦、ハストリス（匣旦江旦）ブロスのＨＰＬＣへの直接注入では通常明瞭なピ ークを持ったクロマ［グラムが得られない。粗ブロスの成分のＨＰＬＣ（実施例 ３に記載されているプロトコールを用いて）による直接分析を行うため、小規模 陽イオン交換クロマトグラフィ一工程を用いて内因性旦、バノ１’ＪＸ（照牡ぜ 旦）夾雑物を除去するための浄化法が開発された。いくつかの陽イオン交換系が この目的のために試験された：スルフィルプロピル陽イオン交換カプセル（ＦＭ Ｃ（Ｐｉｎｅｂｒｏｏｋ、ＮＪ）およびＣｕｎｏ　（Ｍｅｒｉｄｅｎ、　ＣＴ） ）およびバルク陽イオン交換体（例えば５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏ ｗ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）、　５Ｐ−３ ｐｈｅｒｏр■■ （ｌ　Ｂ　Ｆ、　Ｃｏｌｕｍｂｉａ、　ＭＯ）　、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ　 Ｓ　Ｐ　６５０　Ｍおよび５Ｐ５５０Ｃ（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ、　Ｐｈ１ｌａｄ ｅｌｐｈｉａ、　Ｐ＾））を１０ａｆの貯液部を備えた２＃！の使い捨てポリプ ロピレンカラム（０，８Ｘ２．４ｃｍ、　ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 　ＣＡ）に充填して使用、これらの系のどれもが満足すべき結果を与えた。ＩＧ Ｆ−１の濃度の定量的ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析のための粗ブロスの前処理に日常的に使 用された２つの系ではＣｕｎ。

陽イオン交換カプセルまたはカラム様式のＳ　Ｐ　−５ｐｈｅｒｏｄｅｘまたは ５Ｐ５５０Ｃ陽イオン交換体が用いられた。粗ブロスは陽イオン交換クロマトグ ラフィーにより浄化され、ＨＰＬＣカラムへ直接注入された。得られたクロマト グラムではブロス中の異なったＩＧＦ−１種が明瞭に分離されている。

ａ、イオン六　カプセルを　いるＩ処」Ｃｕｎｏカプセルは２５閣のディスクで ある。このディスクは最初に４ｍｌの０．２Ｍ酢酸で洗浄し、次に４１ｒｉの０ ．０２　Ｍ酢酸中で平衡化した。細胞を含まない粗ブロス（１−１０ｄ）を０． ０２　Ｍ酢酸で１＝２に希釈し、ディスクに加えた。

ディスクに加えた後、ディスクを１．５ｄの０．０２Ｍ酢酸で洗浄し、ＩＧＦ− １はＩＭ　ＮａＣ１を加えた４戚の０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、ＰＨ５，５で溶 出した。

最初の１．５ｄの溶出液が全Ｉ　ＧＦ−１の７５−８０％を含んでおり、通常こ の熔出容量だけが集められた。カプセルは４ｄの１００％メタノールで洗浄する ことにより再生できる。

ｂ、夾之寿梯式ズのバルク　イオン六　いる！使い捨てカラムへ、０．２５ｄの 前もって水和されている陽イオン交換体を充填した。吸着剤は最初に２ｄの０． ２Ｍ酢酸で洗浄し、続いて２ｄの０．０２Ｍ酢酸で平衡化した。ブロス（ｌＩｔ ｌ）をカラムへ負荷し、ｌｌｌ１．の０．０２Ｍ酢酸で洗浄した。

すべての緩衝液およびブロスはカラム床の崩壊を避けるため注意してカラムへ加 えた。いくらかの吸着剤の懸濁がカラムへの液体の添加時に通常起こるが、試料 の結合または溶出の害にはならなかった。試料および緩衝液の両方ともカラムを 動力により通過させた。ＩＧＩ”−１はＩＭ　ＮａＣｌを含む２ｄｆ７１０．０ ５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ　Ｈ５，５で溶出した。最初の１ミリリツトルの溶出液 は２ｄの溶出緩衝液で溶出される総ＩＧＦ−１の８０−９０％を含んでいた。同 期的に（約５−ｉｆｌ試料毎）塩溶山稜に５０％のメタノールによる洗浄を行い カラムを再生した。メタノール洗浄はど頻繁ではないが、カラムは０．５Ｍ　Ｎ ａＯＨでも再生された。これらのカラムは何回使用してもその選択的結合能を保 持している。

２、磯−認 Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４またはＭ＋ｌＭＢ２０６ｓ１株の発酵物からの細胞を含 まないブロスの小規模陽イオン交換クロマトグラフィー後に得られた溶出液は実 施例３に記載したＨＰＬＣにより分離できるすべてのＩＣＦ−１種（即ち、切れ 目のはいった、誤って折りたたまれた、多量体および完全な正しく折りたたまれ た単量体）を含んでいる。陽イオン交換クロマトグラフィーにかけられたブロス のＨＰＬＣ分析によるクロマトグラム中に検出された異なったピークは組換え旦 、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）発酵で産生されるＩＣＦ−１の異なった形に 対応する。これらのピークに対応する蛋白質の同定はブロスおよびブロス成分（ ）ＩＰＬＣ、ゲル濾過、陽イオン交換および疎水的相互作用クロマトグラフィー により単離された）のＨＰＬＣ、イムノプロットおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に より行われた。

ＩＧＦ産生旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の発酵によるブロスのＨＰＬ Ｃ分析（実施例３Ａ＋に記載されているごと〈実施された）からのクロマトグラ ムは正しく折りた−たまれた完全なＩＧＦ−１単量体を示す約１ｏ分でＨＰＬＣ カラムから溶出される蛋白質に対応するピークを含んでいる。この蛋白質の同定 は最初にそのＨＰＬＣの溶出時間に基づいて行われ、それは標準組換えＩ　Ｇ　 Ｆ−１（Ａ＋ｗｇｅｎ。

Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、　ＣＡ）の溶出時間と同一である。さらに、約１ ｏ分のＨＰＬＣ溶出時間を持つ蛋白質は実施例２に記載したように精製され、異 なる分析が行われた。

精製蛋白質の還元および非還元試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は同一の結果を与え 、ＩＧＦ−１標準品と同時に移動する７、７ｋＤａ完全蛋白質であることを示し ている。精製蛋白質のイムノプロット分析はそれがＩＧＩ’−１の最後の１４の アミノ酸に対して発生させた抗体と反応することを示した。精製蛋白質のゲル濾 過クロマトグラフィーでは正しい大きさのＩＣＦ−１単量体に予想されるごとく 溶出する。最後に、アミノ酸分析により、精製された蛋白質のアミノ酸比が標準 ＩＧＦ−１のものと対応することが確認された。蛋白配列分析は精製蛋白質の完 全アミノ酸配列は標準ＩＣＦ−１のものと同一であることを示した。

ＨＰＬＣカラムから約８．６分で溶出される蛋白質は暫定的に誤って折りたたま れたＩＣＦ−１と同定された。この蛋白質はＨＰＬＣおよび疎水的相互作用クロ マトグラフィーにより単離され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノプロットおよび蛋白 配列分析（実施例３Ｃおよび３Ｆのプロトコール参照）により確認された。この 蛋白質の還元および非還元試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析はこの形は基準単量体■ ＧＦ−１と共に移動し、それがＩＧＦ−１の切れ目のはいった形ではないことを 示している（即ち、それは−次構造が互いに単にペプチド結合のみで保たれてい る完全な蛋白質であり、ジスルフィド結合により２つまたはそれ以上のペプチド 断片が互いに保たれている切断されたＩＣＦ−１分子に反している）。［ＧＦ− １のＣ末端に対する抗体を用いるこの蛋白質のウェスタン　プロット分析により これが免疫反応性であったことが示された。この蛋白質のアミノ末端蛋白配列決 定により、ただ１つのアミノ末端配列（標品のＩＧＦｉと同し）が同定されたの でこの分子は無傷であることがｔｉ認された。さらに、ジチオスレイトールで処 理されたＩＧＦ−１のこの仮定の誤って折りたたまれた形の還元試料は逆相ＨＰ ＬＣにかけた場合標準ＩＧＦ−１の還元試料と同時に溶出した。これらの結果は 、この形が誤って折りたたまれた化学種であることを示唆している。

ＨＰＬＣカラムから約１０．５−１１．５分で溶出される蛋白質はＩＧＦ−１の 切れ目のはいったまたは分解された形（即ち、１つまたはそれ以上のペプチド結 合の切断により生じ、ジスルフィド結合により互いに保たれている２つまたはそ れ以上のペプチド断片を含むＩＧＦ−１分子）と同定された。きれいにされたブ ロスのＨＰＬＣクロマトグラフィー分析ではＩＧＦ−１の切れ目のはいった形に 対応する少なくとも２つのピークが現れる。主ピーク（１０，７分に溶出）によ り示される蛋白質はＩＧＦ−１精製法のＳ−セファロース陽イオン交換工程（実 施例２Ｃ参照）の間に単離された。

この単離されたＩＧＦ−１化学種の非還元試料の銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中 で、この分子はＩＣＦ−１標品と同じに移動し単一のバンドとして現れる。しか しながら、単離物質の還元試料の銀染色ゲル中では各々約３−４ｋＤａ（無傷の ＩＧＦ−１の約半分の大きさ）の２つのペプチドを表わしている二重線が検出さ れた。ゲル中のこの二重線の位置は細胞を含まない粗プロスの還元試料を含むゲ ル中で無傷のＩＧＦ−１を表わしているバンドの下に検出された２つのバンドの 低い方の位置に対応した。これらの結果はこの分子は切断されまたは切れ目が入 れられており、ジスルフィド結合により互いに保持されていることを示している 。この蛋白質のアミノ末端蛋白配列分析により２つのアミノ末端が検出されたの で（１つはＩＧＦ−１の残基ｌで始まり、他方はＩＧＦ−１の残基４０で始まっ ている）この分子は残基４０の前で切れ目がはいっていることが確認された。

この単離された切れ目のあるＩＣＦ−１分子の還元および非還元試料のイムノプ ロント分析で、その分子は無傷のＩＧＦ−１よりＩＧＦ−１のＣ末端に対する抗 体に対して反応性が低いことが明らかにされた。

精製工程の第１の陽イオン交換クロマトグラフィ一工程（実施例２Ａ参照）から 回収されたＩ　ＧＦ−１の蛋白配列分析において２つの別の切れ目を持つ化学種 が同定された。一方または両方のこれらの化学種はきれいにされた細胞を含まな いブロスのＨＰＬＣクロマトグラム中の少ない方のピークに対応できた（１１分 に溶出する蛋白質）、これらの切れ目のある分子の１つのＣ末端断片のアミノ末 端はＩＧＦ−１の残基２５から始まっている。株Ｇ＋１ＭＢ２０４Ｓ１４のブロ ス中に検出された別の切れ目のある化学種のＣ末端断片のアミノ末端はＩＧＦ− １の残基１４で始まっている。

細胞を含まないブロスのＨＰＬＣにより検出された最後の組の蛋白質はＨＰＬＣ カラムから１１．５−１６分で溶出し、ＴＧＦ−１のジスルフィド結合多量体で アルヨウである。旦、へ丞上■ス（組１虹ｎ）ブロス中のジスルフィド結合ＩＣ Ｆ−１多量体の存在は、ブロスの５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのイムノプロット により示された。仮定の多量体は非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上、ＩＧＦ−に量 体および三量体として移動し、イムノプロットにおいて［ＧＦ−１のＣ末端に対 する抗体と反応性があった。これらの多量体を還元した場合、それらは５ＤＳ− ＰＡＧＥゲル中標準単量体ＩＣＦ−１と同しに移動し、ＨＰＬＣにおいては単量 体のＩＧＦ−１と同しに溶出された。さらに、多量体ＩＧＦ−１（明らかな三量 体および三量体）種はゲル濾過カラム上で単離され、ＨＰＬＣにより分析された （実施例３Ｂ）。単離された多量体はカラムから１２−１４分で溶出されており 、それはＩＧＦ−１の多量体であろうと提唱されているブロス中の蛋白質の溶出 時間に対応している。

実施例２：Ｐ、パストリス（ａｓｔｏｒｉｓ　ブロスか”の　しく　たたまれた ☆なＩＧＦ−１の ■、バストリス（匣１凹ｎ）発酵ブロスからの正しく折りたたまれた完全な単量 体ＩＧＦ−１の精製法は陽イオン交換、疎水的相互作用およびゲル濾過クロマト グラフィーの組合せに基づいている。この方法は株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４およ びＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１の１０リットル発酵のブロスからの正しく折りたたまれ た、完全な単量体ＩＧＦ−１の精製に応用された。ＩＣＦ−１精製の各々の工程 後に得られた物質は生成物のＩＣＦ−１の収量および純度を決定するために定性 的および定量的に（ＨＰＬＣにより：プロトコールの記載は実施例３Ａを参照） 分析された。これらの分析の結果は表■および表■に表にされている。

Ｌｊ− ■、パストリス（組１江ｎ）株　Ｇ＋　ｌＭＢ２０４　Ｓ　１４（７）ｉｌｌ胞 ヲ含まない発酵ブロスがらのＩＧＦ−１の精製の結果細胞を含まないブロス　５ ２５　ＮＤ　１００　６．０５Ｐ−２５０カフセルからの回収　４２５　３４　 ８１　０．８４ブ＋ル旧Ｃ２３５７４４５０，５９ Ｓ−セファＯ−ス２０３　９１　３９　０．２０最終ＨＩＣ１４７＞９７％　２ ８　０．３２ＮＤ二ニ　されていない 一人一一エー Ｐ、バストリス（匣１虹ｎ）株　Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓｌ（７）ｔ！胞を含まない ブロスからのＩＧＦ−１の精製蛋白質　総ＩＧＦ−１標準ＩＧＦ−１全収率−− Ｊ：−−−＝王ｚ−一　りｙ　ム（ＢＣＡ）　グｔＡ（ＩＩＰＬｃ）　グ５ム（ ＨＰＬＣ）　皿細胞を含まないブロス８１．０　２．４４３　０．９７６　１０ ０ＳＰ−回収　５．０　１．６０７　０．７２９　７５ブチｚｌｆＣ＋、００６ 　０．６７３　０．６１３　６３Ｓ−（！７７０−ス０．８６０　０．５８０　 ０．５３１　５４ゲル濾過　０．６２０　０．４９０　０．４９０　４９ダイア フイルトレーシヲン　０．４２０”　０．４６３　０．４５３　４６ａ　最終試 料はアミノ酸分析により分析された。

Ａ、ブロスのか“のＩＧＦ−１の 雲（Ｐｉｃｈｉａ）産生ＩＧＦ−１はＣＵＮＯラジアル　フロー　Ｚｅｔａ　Ｐ ｒｅｐＳＰ−２５０（スルフィルプロピル）陽イオン交換カプセルまたはＴｏｙ ｏｐｅａｒｌＳＰ５５０Ｃイオン交換剤（ＴｏｓｏＨａａｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅ ｌｐｈｉａ、ＰＡ）を充填した５ｃｍのカラムを用いて粗発酵ブロスから回収さ れた。

１．　を４まないブロスのｉ１１ 細胞からブロスを分離するため■、パストリス（ｎ１ぎｎ）株　Ｇ＋ｌＭＢ２０ ４３１４またはＭ＋１ＭＢ２０６Ｓ１の発酵培養物の約１０リツトルを６５００ ｘｇで２０分間遠心分離した。ＨＰＬＣで測定して（実施例３Ａ参照）４０〇− ６００■の完全なＩＧＦ−１単量体を含む約５から６リツトルの細胞を含まない 上清液がＧ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスから得られた。細胞ベレットを約４− ５リツトルの２０ｍＭ酢酸で洗浄し、再び細胞を遠心分離により除去することに より細胞ベレットからさらに４０−６０■の完全なＩＧＦ−１単量体が回収され た。第１の遠心分離からの上清液を２０ｍＭ酢酸で１：１に希釈し、細胞ペレッ ト洗液と合併した。約７．３１の細胞無しのブロスがＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１の粗 ブロスから回収され、約９７６ｇの標品ＩＣＦ−１を含んでいた。完全な細胞を 含まないブロス調製液は次にワットマンＧＦ（ガラス繊維）フィルターを通して 濾過された。

ラジアル　フロー　ＺｅｔａＰｒｅｐ　５Ｐ−２５０（スルフィルプロピル）陽 イオン交換カプセル（ＣＵＮＯ，Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）はカプセルに３カラム 容量（７５０ｄ）の０．２Ｍ酢酸、続いて４カラム容量の２０ｍＭ酢酸を５０ｄ ／分の流速でポンプで送って平衡化させた。この最初の陽イオン交換接触のすべ ての工程は約４゛Ｃで実施された。

ｂ、　Ｔｏｏｅａｒｌ　５Ｐ５５０　イオン六　クロマトグラフィーカラムもし くは、直径５ｃｍのカラムに２５０ｄのＴｏｙｏｐｅａｒｌ　Ｓ　Ｐ　５５０　 Ｃイオン交換剤（０，５Ｍ、ＮａＣＩ）を１ｏａｄ／分（３００ｃｍ／時間）の 速度で充填した。

充填後、＋２ｃ■のへノドの高さは２３５ｄのヘッド容量であることが測定され た。

カラムは６回の別々な洗浄により再生された：ｌ！のＩＭ　ＮａＣ１続いて２５ ０ｄの水、両方とも５Ｏ−７５ｄ／分の流速、１Ｏ−２０Ｉ１１／分で１リツト ルの０．５Ｍ　ＮａＯＨ１２５−５０ｄ／分で２５０−の水、１Ｏ−２０ａｆ／ 分で１１の５０％メタノール、２５−５０ｄ／分で２５０ｄの水。貯蔵のために はカラムは室温で２０％エタノール中に置く、使用のためにカラムを調製するに は５００ｄの２００ｍＭ１ｔ￥酸を５Ｏ−７５ｉｄ／分でカラムへ加え、続いて ５Ｏ−７５ｄ／分の流速を用い、１．５−２．ＯＩ！、の２０ｍＭ酢酸で平衡化 させた。このカラムのすべての操作は室温で実施された。

Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４の発酵物から希釈され、濾過された細胞を含まないブロ ス（約１７リツトル）を５０ｄ／分の流速でＺｅｔａＰｒｅｐカプセル上へポン プで送った。陽イオン交換カプセル上へ細胞を含まないブロスを加える間に得ら れた流出液の分析によりブロス中の着色物質および天然の旦、バストリス（ＬＩ ｕ口）蛋白質のほとんどがカプセルを通過していることが５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ び視覚による観察により決定され、一方ブロス中の全ＩＧＦ−１のほとんどが（ 〉９５％）カプセルにより保持されることが流出液のＨＰＬＣ分析により決定さ れた。

希釈されたブロスがカプセル上へ加えられた後、カプセルを５（１１７分の流速 で２０ｍＭ酢酸を含む２カラム容量の１１衝化溶液続いて４カラム容量の０．２ 　ＭＮａＣＩを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（２０ｍＭ酢酸にＩＯＭ　 ＮａＯＨを加える）で洗浄した。

ｂ、Ｔｏｏｅａｒｌ　５Ｐ５５０Ｃイオン六　クロマトグーフィー　カラムＭ＋ ｌＭＢ２０６Ｓ１の発酵物からの細胞を含まないブロスを５０−７０ｍ／分の流 速で５Ｐ５５０Ｃカラムへ加えた。カラムは５０ｍ／分の流速で、ＩＩｌの２０ ｍＭ酢酸で洗浄し、続いて各々１１の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０およ び５０ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｐ　Ｈ５，５で洗浄した。もしくはカラムは５０ｄ ／分の流速で４つの別々のＩＮの洗液により洗浄された：２０ｍＭ酢酸、５０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５，０，０５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，５，０，１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５，５゜４、土ｑ旦二土９撥皇 ａ、陽±土Ｚ交換左１皇次 全Ｉ　ＣＦ−１は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐ　Ｈ５，５およびＩＭ　ＮａＣ１ を含む６カラム容量の緩衝液でカラムを洗浄することにより（５（１１７分の流 速で）溶出された。１カラム容量（２５０ｄ）に等しい分画を０，２および１． ０Ｍ　ＮａＣ１含有緩衝液を用いる洗浄の間に集めてＨＰＬＣにより検定し、Ｉ ＧＦ−１含有分画が同定された。

ｂ、　Ｔｏｏｅａｒｌ　５Ｐ５５０Ｃイオン六換ｇフィーｊ〜文ＡＩＣＦ−１は ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ＰＨ５，５中０から０．５　ＭのＮａＣ１を含む２リ ツトルの直線濃度勾配溶液でカラムから溶出された。溶出分画（各々２５−３０ ｄ）をカラムの洗浄および溶出の間に集めた。もしくは、ＩＧＦ−１は０．３Ｍ 　ＮａＣ１を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、ｐ　Ｈ５，５で溶出された。

５、回収物Ｑ１認 ａ、隈工ｔｙ交操左ブ±ル 細胞を含んでいないブロスを加えであるＳ　Ｐ　−２５０ＺｅｔａＰｒｅｐカプ セルの０．２Ｍ　ＮａＣｌによる洗浄の間に溶出される最初の分画は非常に少量 の完全な単量体ＩＧＦ−ＩＬ、か含んでいなかったが、かなりの量の切れ目を持 ったおよび多量体ＩＣＦ−１を含んでいた。完全な単量体ＩＧＦ−１は０．２Ｍ 　ＮａＣｌ洗液の最終分画およびＩＭ　ＮａＣｌ洗液の最初の３つから４つの分 画で溶出を始めた。ＬＭ　ＮａＣｌ溶出での溶出分画をプールした。このプール は８４０ｄの容量中に約４２５■の部分的に精製された完全な単量体ＩＧＦ−１ を含んでいた。

従って、ＩＣＦ−１精製法の最初の陽イオン交換工程はＩＧＦ−１調製試料から 望まれていない切れ目を持つおよび多量体のＩＧＦ−１形をかなりの量除去して 粗ブロスからＩＧＦＩを回収するために実施される。約８１％の完全な単量体Ｉ ＧＦ−１がこの工程で回収された。

ｂ、　Ｔｏｏｅａｒｌ　５Ｐ５５０Ｃイオン六　クロマトグラフィー　カラムカ ラム上へブロスを加える間に得られた流出物のイムノプロットおよびＨＰＬＣ分 析で標ｔ１１１ＣＦ−１は無視できる量であるがかなりの量の天然〈±１（ｎ９ １ｉａ）　蛋白質夾雑物および多量体のＩＣＦ−１が明らかにされた。従って大 部分の夾雑と土７　（Ｐｉｃｈｉａ）蛋白質はマトリックスに結合せず、カラム を通すことにより流出物へ現れブロスから除去される。一方、大多数のｒＧＩ− １はマトリックスへ結合される。

溶出分画の定量的１（ＰＬＣ分析はかなりの量の切れ目を持つＩＧＦ−１がｐＨ ５，５洗液（分画４１８０）および塩濃度勾配溶出の最初の部分（分画Ｅｌｌ− １１９）の間で試ｔＪから除去されていることを明らかにしている。塩濃度勾配 溶出の中間で集められた分画１０１−１１９を含むプールのＨＰ　Ｌ　Ｃ分析に より示されているごとく、ｉｌｌ！ＩＧＦ−１はこれらの分画ヘカラムから溶出 され始めるが、誤まって折りたたまれたおよび多量体のＩＧＦ−１もまた含まれ ていた。

以丁の基準がさらなる精製のためにプールされる分画の選択に使用された：（１ ）分画中の切れ目のはいったＩＧＦ−１が１０％未満および（２）分画中の標準 ＩＧＦ−１の濃度が１１００ＩＩ＃！より高い、これらの基準および残りの溶出 分画のＩ（Ｐ　Ｌ　Ｃ分析に基づいて、分画１２０−１５５がプールされ、この プールは本方法の次の工程での更なる精製のために調製された。このプールのＨ ＰＬＣ分析は標品ＩＣＦ−１がこのプールに含まれる優性ＩＧＦ−１種であった ことを示していた。Ｍ初にプロス中に含まれていた９７６にの標準ＩＧＦ、−１ の約７３０ｑがｌリフ１−ルの容積中に回収され、この工程の収率は７５％であ った。このプールは２１％の誤って折りたたまれたＩＧＦ−１（３４７１ｇ）３ ０％の多量体ＩＦ−１（４８８１１ｇ）ならびに４５％の標準ＩＣＦ−１（７３ ０＃）を含んでいた。このプールのクロマトグラム中には分離されていないが切 れ目を持つＩＧＦｉもまたこのプール中に約４０−５０Ｉ１ｇ（２−３％）のレ ベルで存在した。

少くとも３００■の切れ目を持つｒＧＦ−１ならびに４００１１ｇの多量体ＩＧ Ｆ−１がこの工程で試料から除去された。

回収されたプール（分画１２０−１５５）および出発ブロスの総蛋白量を比較す ると（ＢＣＡ　（）”１ｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ　Ｌ）アンセイによ り決定された）最初の回収工程の間に、細胞を含んでいないプロス中に存在して いた総蛋白の９４％が調製ｖ、ｔ’＋から除去されたことを示している。

Ｂ、第１９葎丞的相　：　クロマトグーフィーエ１隅イオン交換クロマトグラフ ィーを用いる細胞を含まない旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ブロスからの ＩＧＦ−１の回収に続いて、ＩＧＦ−１はＴ　Ｓ　Ｋ　ＢｕｔｙｌＴｏｙｏｐｅ ａｒｌ−６５０Ｍマトリックス（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ＋　ｌ’ｈｉｌａｄｅｌｐ ｈｉａ、ＰＡ）を用いた疎水的（０互作用クロマトグラフィー（ＨＩ　Ｃ）によ り更に精製された。この第１のＨＩ　Ｃ接触のすべての工程は２（１−２５°Ｃ で実施された。

■、九戸ｔＩ ｎ″′Ｒ中の硫酸アンモニウムの濃度および媒質のｐＨに特に注意をはらい、Ｈ ＩＣマトリックスへのＩＣＦ−１の結合に関して種々の条件を検討した。ＨＩＣ に対して使用された代表的条件では、ＩＣＦ−１が高い硫酸アンモニウム濃度（ 飽和の約１５％以上または約０．６Ｍ　（ＮＨ−）ｔ　ＳＯ４）でＨＩ　Ｃマト リックスに結合することが観察された。従ってＨＩＣマトリックスの平衡化には 硫酸アンモニウムの添加が含まれている。

直径２．５Ｃ１１のカラムに５−２４ｍ／分で水と混合した約３７ｄまたは１２ ３ＪｄのＴｏｓｏＨａａｓ　Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　−６５０Ｍマト リックスを充填した。３７ｄのマトリックスを充填したカラムのベット高は７． ５Ｃ園であり、一方１２５ｊｄのマトリックスで充填したカラムは２５ｃ■のベ ット高を持づていた。カラムは８００−１０００ｒｍ／ｈｒの流速で４または５ の別々の洗液で洗浄することにより）再生された＝２００−２５０ＩＩｌの水、 ２００−８００ｍｌの０．５Ｎ　ＮａＯＨ，１００−８００＃ｆの５０％メタノ ールおよび１００−２５０ｄの水、カラムが５つの洗液で再生される場合はＮ　 ａ　ＯＨおよびメタノール洗浄の間に水（２５０ｍ）による洗浄が含まれる。マ トリックスは次に２００−７５０ｄの緩衝液（１５−２０％飽和硫酸アンモニウ ム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４，０−５，０ ）で平衡化された。（ｌリットルの１００％飽和硫酸ナトＩＪ　’７ムは５３３ グラムの固形塩を含むものとして定義される。）緩衝液のこの硫酸アンモニウム ｆ！４度は現在のところマトリックスへのＩＧＦ−１の至適な結合に好適である 。ＨＩＣによるＩＧＦ−１のすｎ製に使用するために記載されたすべての榎街化 γ１液に当てはまるが、ｌｌＩｃ結合緩街液緩衝液化ナトリウムに適当なｐＨ（ ａに滴定された０、５Ｍ酢酸および０．５Ｍリン酸−ナトリウムのＩＯＸ濃縮溶 液から調製された。

ＩＧＦ−１＋仏成料 Ｚｅｔａ−Ｐｒｅｐ　陽イオン交換カプセルを通して株Ｇ＋ｌＭＢ２０４ＳＩ４ の細胞を含まない発酵ブロスから得られた約４２５＋ｌＩｇの部分的に精製され た完全で単量体で正しく折りたたまれたＩＣＦ−１に、５Ｍ塩化ナトリウム、０ ．５Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．５Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ４，０を含む緩衝 液を加えて総量で３リツトルまで希釈した。１リツトルの硫酸アンモニウムの８ ０％飽和溶液を３１Ｊツトルの希釈液に徐りに加えた。このことにより沈殿した ＩＧＦ−１を含む濁った溶液を得た。ＧＳＡＳ−ローター中、００Ｏｒｐｍで２ ０分間この溶液を遠心分離することにより沈殿を除去した。沈殿を１リツトルの ＰＨ４，５の酢酸／リン酸緩衝液に溶解した。４リツトルの可溶性物質（遠心分 離後に得られた上清液）はＰ　Ｈ４，５に調整し、再懸濁させた沈殿物と合併さ せて総計で５リツトルとした。

このＩＧＦ−１（４２５ｓ＋ｇ）、硫酸アンモニウム（飽和の１６％）、４０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４，５および０．４Ｍ　Ｎ ａＣｌを含む５リンドル溶液を）（ＩＣマトリックス上へ加えた。すべての溶液 をＨ，ＩＣマトリックスを含むカラムへ製造元が推せんするように約８Ｏ−３０ ０ｇ膳／ｈｒの流速で加えた。精製法の続いての工程でのＩＣＦ−１の沈殿を避 けるため、ＩＧＦ−１含有物質のＰＨはｐＨ４，５またはそれ以上に維持された 。

ｂ、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロスか゛　１されている１立り二１Ω試料 標準ＩＧＦ−１を特別なレベルの純度で含む最初の５Ｐ５５０Ｃ陽イオン交換ク ロマトグラフイ一工程からの溶出分画（分画１２（１−１５５）をプールした。

ｌりントルの容積に約７３０＠の部分的に精製された標品ＩＧＦ−１を含むこの プールを２００ｍの酢酸ナトリウム／リン酸ｐＨ５，０緩衝液のＩＯＸ貯蔵液お よび試料中の硫酸アンモニウムの濃度を飽和の１５％に調整するために１６０ｇ の硫酸アンモニウムを含む８００ｍの水を加えることにより２リツトルに希釈し た。

硫酸アンモニウム溶液を徐々に加える前にＮａＯＨまたはＨＣＩによりｐＨをｐ Ｈ５，０に調整した。ＩＧＦ−１含有溶液は続いてカラム上へ１５＋ｄ／分（１ ８０ｃ＋ａ／ｈｒ）で加えた。

３．１ＧＦ二１９捜用 ＩＣＦ−１の精製法の開発を目的とするこの研究の過程において、驚くことにこ のＨＩＣ精製工程において用いられた溶出緩衝液のｐＨがＩＧＦ−１溶出プロフ イールをまったく劇的に変化させることが発見された。ｐＨ７，５では、完全な ＩＧＦ−１単量体は０．６　Ｍ硫酸アンモニウムの所の塩溶用濃度勾配で溶出を 始め、濃度勾配の硫酸アンモニウム濃度が０．２　Ｍに減少した所で完全に溶出 されている。

より低いｐＨ値では完全なＩＧＦｉは濃度勾配の硫酸アンモニウム濃度がより低 い値に減少するまで溶出し始めなかった。もし緩衝液のｐＨが５未満であれば（ 好適には４．５　）　、硫酸アンモニウム濃度を０％にしても完全なｒＧＦ−１ 単量体はほとんどカラムから溶出されないが、そのような条件下誤って折りたた まれたおよび多量体のｒＧＦ−１はマトリ・７クスから除去される。それ故、低 ＰＨでカラムの硫酸アンモニウム濃度を減少させることにより標品ＩＧＦ−１か ら誤って折りたたまれたおよび多量体のＩＧＦ−１が分離された。続いて、標準 ＩＧＦ−１はｐＨを高くすることによりマトリックスから溶出された。

これらの発見に基づいて、蛋白質は典型的にはＨＩＣカラムから２つまたは３工 程で溶出される。第４に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリうム を含みｐＨ４，５−５，０に緩衝化された５００ｄの硫酸アンモニウム濃度勾配 溶液を用い、８０〜３００Ｃ曹／ｈｒの流速でカラムの硫酸アンモニウム濃度を ２０％飽和からＯへ減少させる。現在のところ、５０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩でｐ Ｈ５，０に緩衝化された２０％飽和硫酸アンモニウムで始め、同し緩衝液でＰＨ ４，０に緩衝化され硫酸アンモニウムを含まない緩衝液で終わる直線濃度勾配の 硫酸アンモニウム濃度勾配溶液が好適である。これに続き硫酸アンモニウムを含 まない４００ｄのｐＨ４，０の緩衝液を流す。カラムのｐＨを増加させるとこの 系において疎水的相互作用が驚くほど減少するので次の溶出工程では０．５−２ す・ノトルの硫酸アンモニウムを含まない緩衝勾配（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、 ５０ｍＭリン酸ナトリウム）を用いてＰＨが約４．０−４．５から６．５−７． ５へ高められた。

４、匣収Φ確認 ａ、Ｇ＋１ＭＢ２０４Ｓ１４のブロスか゛の１ＣＦ−１の′Ｉにおする　ｌのＨ ＩＣ工　での日収溶出方法の各々の工程で溶出分画（約７．５ｄ）を集め、ＩＧ Ｆ−１含有分画を同定するためＨＰＬＣで分析した。データカ媚集され、ＴＧＦ −１の各々の形の溶出プロフィールが図１にグラフで示されている。すべての誤 って折りたたまれたＩＧＦ−１は硫酸アンモニウム濃度勾配溶液でカラムを溶出 する間にＨＩＣマトリックスから溶出された（分画〇−６０）。多量体の約７５ ％は硫酸アンモニラ１．濃度勾配溶出（分画０−６０）およびｐＨ勾配溶出の最 初の部分（分画６〇−８４）でマトリックスから除去された。しかしながら、正 しく折りたたまれた完全なおよび切れ目を持つＩＧＦ−１の単量体形はマトリッ クスに結合されたまま残っていた。ＰＨ勾配溶出を用いる溶出工程の第２の段階 で（分画８５−１２５）、ＩＧＦ−１の完全な単量体および切れ目を持つ形がカ ラムから溶出された。

図１のごとく分画は群ｌおよび２に分けられ、次の精製のため各々プール１およ び２ヘプールされた。第１のプールはカラムの硫酸アンモニウム濃度が０％であ る時（分画６０）から始まり、大多数の多量体がマトリックスから除去された時 （分画８４）までの間に集められた分画からなっている。第２のプールはｐＨ勾 配溶出工程の間に集められた分画８５から１２５を含んでいる。これらの２つの プールのＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によるクロマトグラムは第２のプールには非常に少量 の多量体は存在するが実際的には誤って折りたたまれたＩＣＦ−１は存在せず、 主としてＩＧＦ−１単量体および切れ目を持つ１ＧＦｉから成っていることを示 している。希釈プール２試料のＨＰＬＣ分析では明らかでなかったけれども、こ れらの試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノプロット分析による決定では第２の プール中にいくらかの残留多量体が存在していた（実施例３Ｃ参照）。

ｂ、Ｍ＋ｌＭＢ２０６ＳＩのブロスからのＩＣＦ−Ｉ　＋にお番る　１のＨＩＣ 工　でＱ匣収 次の工程のためのＩＧＦ−１含有分画を同定するため、溶出法の各々の工程で分 画（２５−３０ｄ）が集められ、ＨＰＬＣ（２０μ！注入）および５ＤＳ−ＰＡ ＧＥおよびイムノプロットで分析された。誤って折りたたまれたＩＧＦ−１は硫 酸アンモニウム濃度勾配の分画ｌから１８中に除去された。誤って折りたたまれ たＩＧＦ−１はカラムから約９０％の純度で溶出された。

分画１−２０のプールの非還元試料の染色ゲルは高分子量蛋白質を表わす幅広い ハンド、標準ｆＧＦ−１単量体と同じに移動する蛋白質に対応するハンドおよび 、他の２つのハンドの間のかすかなバンド（＋ＧＦ−１の二量体形であろう）を 示した。

ｐＨ４洗浄（硫酸アンモニウムを含まない）により樹脂に結合されていた大多数 の多量体ＩＧＦ−１が除去された。この５０ｍＭ酢酸ナトリウム／リン酸ｐＨ４ 洗浄は分画１９から３０のを集める間行われた０個々の分画を確認した後、分画 ２１から２９をプールし分析用ＨＰＬＣにて確認した。得られたクロマトグラム においては多量体［ＧＦ−１に対応するピークがクロマトグラム中のピーク面積 の７５％を占めていた。クロマトグラムはまたこのプールにおける少量の標品（ ４ＢＩ１ｇ）および切れ目を持つ（１３ｍｇ）ＩＧＦ−１の存在を明らかにした 。この工程において失われる標準ＩＣＦ−１の量はカラムの容量に関係するよう である。

ｐＨ４洗浄プールの試料（分画２ｌ−２９）を染色ゲル５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅおよ びウェスタンプロット分析で試験すると多量体形が主であることが明らかであっ た。還元されない場合、プールの還元試料では検出されなかった多くの高分子量 形が試料中に存在した。このプールの還元試料は主として単量体ＩＧＦ−１と同 しに移動する物質から成っていた。

プロトコールの次の工程での更なる精製のため、標準ＴＧＦ−１含有溶出分画の 選択に使用された基準は以下のごと（であった：第１に分画中に存在する多量体 ＩＧＦ−１は６０％未満のレベルであり、第２に標準ＩＣＦ−１の濃度は１００ １ｇ／Ｌを越えているものである。ｐＨ勾配溶出の間に集められた分画３０−８ ０が精製法の次の工程に応用するために選択されプールされた。ＨＴＣカラムへ 加えた７３にの標準ＩＧＦ−１のうち総計で６１３＋ａｇがこのプール中へ回収 された。この収量はこの工程では８４％の回収率に対応するが株Ｍ＋ｌＭＢ２０ ６Ｓｌの細胞を含まないブロスからの累積収率では６３％となる。このプールの ＨＰＬＣ分析はまた３＋ａｇ（０，５％）の誤って折りたたまれたおよび２７Ｉ １ｇ（４％）の多量体のＩＧＦ−１の存在を示した。切れ目を持つ１ＧＦ−１は クロマトグラム中では分離されなかったが２１ｍｇ　（３％）の切れ目を持つＩ ＧＦ−１がプール中に存在していたと見積もられた。それ故このプール中の標準 ＩＧＦ−１の純度は９２％と見積もられた。ＨＩＣ工程で回収された溶出プール 中の蛋白質の総量は１グラム（表■）またはカラムに加えられた総蛋白量の２０ ％と見積もられた。

ｐＨ勾配溶出の間で集められたすべての分画が次の精製のためにプールされたた め、勾配溶出を単一の５０ｍＭ酢酸ナトリウム／リン酸ＰＨ７，５段階的溶出に 置き換えることができる。ＰＨ段階的溶出は回収されたＩＣＦ−１の容量を約１ リンドルに減少させ、溶出工程を非常に簡素化する。従って、標準ＩＧＦ−１の 大多数はＰＨ段階的溶出の間溶出の標準ＩＣＦ−１濃度が１００１ｇ／Ｉ！、未 満になるまで集められた溶出液中に存在した。このプールは標準ＩＣＦ−１を含 むｐＨ４洗液の最終分画と合併できる。

５、カラムへの試料の両温　および口　の　１ＨＩＣカラム上へ加えられた株Ｇ ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスから５Ｐ−２５０カプセルで精製された完全な、 正しく折りたたまれた単量体ＩＣＦ−１の約４０％（１７０■）のみがＨＩＣカ ラムからの溶出分画の第２のプール中へ回収された。図１は大量の完全なＩＧＦ −１単量体（８７■）が第１のプール中に切れ目を持つおよび多量体のＩＧＦ− １と伴に存在していたことを示している。完全な単量体ＩＧＦ−１をさらに回収 するために、溶出分画の第１のプールをＨＩＣカラムへ負荷しなおして、最初の ＨＩＣ精製で使用された方法と同じ方法に従って溶出された。さらに６５■の完 全な単量体ＩＧＦ−１がＨＩＣカラムから回収された。このプール２物質を最初 のプール２物質と合併させ７４％の純度で、５９０ｄの液量中に２３５ｍｇの完 全な正しく折りたたまれた単量体ＩＧＦ−１を含む最終プールを得た。従って、 ブチルＨＩＣカラム上に加えられた５Ｐ−２５０力プセル精製完全単量体ＩＧＦ −１の約５５％が回収され、本精製法のこの段階での総置収率を４５％に減少さ せた０本精製法のこのＨＩＣ工程はこのように調製試料のほとんどの多量体形の および誤って折りたたまれた形のＩＧＦ−１を効果的に除去した。

および完全単量体のＩＧＦ−１種はＰａ５ｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓ ｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋　Ｐｉｓｃ−ａｔａｗａｙ、　ＮＪ）マトリックス を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された。このマトリックス はＨＩＣマトリックスの再生に記載したプロトコール（実施例２Ｂ）と同一のプ ロトコールを使用するカラム再生によりクロマトグラフィーのために調製された 。この第２の陽イオン交換クロマトグラフィー法のすべての工程は２０１５°Ｃ で実施された。

■、夾ｉムΩ週製 直径２．５ｃｍ０カラムに２−２０１１１／分で水を加えた約３５−８０ｄのＰ ｈａｒｓａｃ−ｉａ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅを充填した 。ｔｏｏ−２５０−の０．５　Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ　Ｈ４，５、続いて３０（ １−７５０ｄの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ＰＨ４，５をカラムに通すことにより カラムを平衡化した。蛋白質上に陽性荷電を提供する為の十分に低いｐＨに緩衝 化されているこの低塩溶液が陰性に荷電しているマトリックスへのＩＧＦ−１の 結合を容易にするために使用された。

２、成扛週製夫よび添加 株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４の細胞を含まないブロスから部分的に精製されたＩＧ Ｆ−１のＨＩＣ精製により得られたＩＧＦ−１含有溶出分画のプールは７　ｍｍ ｈａの導電率を持っており、約２３５■の完全なＩＧＦ−１単量体を含んでいる 。１１１ＣカラムからのＩＧＦｉの溶出に使用された低塩条件はイオン交換クロ マトグラフィーに先立っての溶出の操作を少なくする。株Ｇ＋１ＭＢ２０４Ｓ１ ４またはＭ＋１ＭＢ２０６Ｓ１のブロスからのＩＧＦ−１試料のＨＩＣ精製によ るＩＧＦ−１含有溶出分画のプールのＰＨは４．５に調整され、プールの容量は ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５を添加して１リンドルに合わせた。更なる 操作なしで、Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅの陽イオン交換マト リックス上へ直接ＨＩＣ精製ＩＧＦ−１を加えた。蛋白質を２　Ｌ５ｄ／分でカ ラム上へ加えた後、カラムを約１００ａｙｆの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ＰＨ４ ，５で洗浄した。カラムは次にさらに３３０ｍβの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐ Ｈ５，５（この追加の洗浄は好適である）で洗浄した。

３、±９」二二Ｂケ溶出 ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｐ　Ｈ５，５で緩衝化された５００−または１０００ Ｉｄの０から０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配を用いてカラムからＩＣＦ−１が 溶出された。より高いｐＨは蛋白質およびマトリックス間のイオン性相互作用を 減少させ、ＨＰＬＣで決定される完全で、正しく折りたたまれた単量体ＩＧＦ− １を含む溶出分画をプールした。マトリックスは２０％エタノール中で貯蔵され た。

４、匣収９確認 ａ、Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスが゛のＩＣＦ−１の　１に本復１−η囚陽 イオン六　クロマトグラフィーかヱ４１ル区濃度勾配溶出の間に集められた溶出 分画（各々約８ａｔｔ）のＨＰＬＣ分析により作られたＩＧＦ−１化学種の各々 の溶出プロフィールが図２に示されている。この陽イオン交換クロマトグラフィ 一工程で試料中に存在した切れ目のはいったおよび完全な単量体形が完全に分離 された。カラム中の濃度勾配洗浄溶液のＮａＣ１濃度の範囲が０．１５から０． ２５　Ｍの時に得られた溶出分画２Ｂ−５０をプールした。溶出分画のプールの ５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロン）ＨＰＩ、Ｃおよびゲルｎ過分析（そのプロト コールは実施例３Ａ、３Ｂおよび３Ｃを参照されたい）の結果はすべて残留する 多量体の存在を示した（ＨＰＬＣおよびゲル濾過定量では多量体レベルが９％で あることが示された）、それにもかかわらず、Ｆａｓｔ　ＦｌｏｗＳ−５ｅｐｈ ａｒｏｓｅカラムに加えられた８６％（２０３■）の完全な、正しく折りたたま れたＩＧＦ−１単量体が溶出プール中に回収され、精製法でのこの工程で全回収 率は３９％であった（表１）。

ｂ、Ｍ＋ｒＭＢ２０６ｓ１のブロスからのｒＧＦ−１の　に殻吠弘　２の　イオ ン六　クロマトグラフィーからΦ厘収精製法の次の工程のためにプールできるＩ ＧＦＩ含有分画を同定するため溶出過程を通して集められた分画（２５−３０ａ ｆ）がＨＰＬＣにより分析された。

ｐＨ５，５洗浄において（分画６−１７）　、約１０■の切れ目を持つＩＣＦ− １が試料から除去された。このプールの非還元試料には存在しないがこのプール の還元試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび対応するイムノプロントにおいてＩＣ Ｆ−１標品より角、速に移動するより小さな分子量ペプチドの存在は切れ目のは いったＴＧＦ−１の存在の指標である。切れ目を持つＩＧＦ−１は非還元状態で は完全な単量体の大きさであるが、還元により２つのペプチドへ解離し、各々の ペプチドは完全な分子より小さい。

塩濃度勾配溶出の最初の部分である分Ｎ２１−２９を集めた。５Ｐ５５００カラ ムの回収工程での直線塩濃度勾配の溶出の初期の段階の場合のように、Ｓ−５ｅ ｐｈａｒｏｓｅカラムの塩濃度勾配溶出の最初の部分にいくらかの標準ＩＧＦ− １が切れ目を持つＩＧＦ−１と一緒に溶出したようである。このプールの５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析は非還元および還元の両方の条件下ＩＧＦ−１標品より遅（移動 するＩＧＦ−１の化季種を示していた。これらは非常に低レベルで存在するＩＣ Ｆ−１のグリコジル化または他の修飾形であろう可能性がある。

次の精製のためにプールする溶出分画の選択のために使用される基準は以下のご とくである：分画中に存在する切れ目を持つＩＧＦ−１のレベルが５％未満およ び標準ＩＣＦ−１の濃度は１５０５ｇ／Ｌを越えるもの。塩濃度勾配溶出の第２ の半分の間に集められた分画３０−４５がこれらの基準に基づいて選択され、精 製法の次の工程に応用するためにプールされた。カラムに加えられた６１３■の 標準ＩＧＦ−１から全量で５３１１１ｇの標準［ＧＦ−１が回収され、この工程 での回収率は８７％であり、株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１の細胞を含まないブロスか らの通算回収率は５４％であった。このプールのＨＰ　Ｌ　Ｃ分析により３ｇ（ ０，５％）の誤まって折りたたまれた、３■（０，５％）の切れ目のある、およ び４３■（７゜５％）の多量体形のＩＧＦ−１もまた含まれていることが示され た。

Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラフイ一工程の上記回収プール 中の蛋白質の全量は０．８６グラムと測定された（表■）。このプールはまた５ ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノプロットによっても分析された。プール中に含まれ ている少量の多量体ＩＧＦ−１が非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ染色ゲルで観察された 。

Ｄ、２の　・　クロマトグラフィーエ　および゛ル゛クロマトグーフィー工 かなり純粋な完全単量体ＩＧＦ−１調製試料の多量体レベルを減少させるため、 株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスからの部分的精製ＩＣＦ−１のＰａ５ｔ　Ｆ ｌｏｗＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラフイーによる溶出分画 のプールが下記実施例２．　Ｄ、１．に記載されているようにＩＣＦ−１の精製 の第２のおよび最後のＨＩＣ工程として再生ＴＳＫ　Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅ ａｒｌ−６５０Ｍマトリックス（マトリックス再生の記述は実施例２Ｂを参照さ れたい）に加えられた。この第２のＨＩＣ過程の全工程は２０−２５°Ｃにて実 施された。

現在のところゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製されたＩＧＦ−１から残 っている多量体を除去するのが好適である。実施例３Ｂにも記載されているごと く、ｒＧＦ−１の多量体および単量体形はゲル濾過クロマトグラフィーによりよ く分離される０株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロスから部分的に精製されたＩＧＦ −１のＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラ フイーからの溶出分画のプールが下記実施例２．　Ｄ、２．に記載されているよ うなゲル濾過クロマトグラフィーカラムへ加えられた。

１、ｃ＋ｌＭＢ２０４ｓ１４のブロスか゛のＩＧＦ−１の　にお番る２の　イオ ン六　工　でプール　れた゛か゛　ための２１７）比重Ω工程 ａ、試料周製 溶出分画のプールをＩ（ＩＣカラム上へ加えるのに先立って、０．５■の酢酸ナ トリウムおよび０．５Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ４，５を含む５０ｍの緩衝溶液 を添加することによりプールを５００ａｄに希釈した。ｔｓ液のｐＨを４．５に 調整するために十分な量のＩＮ　ＨＣＩを加えた６次に水を加えて全量を４３８ ａｄに増加させ、硫酸アンモニウム（６３ｄの８０％飽和溶液）を徐々に加え、 ＩＧＦ−１（２０３１ｇ）、硫酸アンモニウム（１０％飽和Ｌ５０ｍＭ酢酸ナト リウムおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ＰＨ４，５を含む５０（ｌｄの溶液を 得た。溶出液への硫酸ナトリウムの添加によっても沈殿は生成しなかった。

ｂ、Ｂおよび　′ 実施例２Ｂに記載されている２段階溶出法がＨＩＣカラムからのＩＧＦ−１の溶 出に使用された。第１のＨｒＣＩＣ工程載したように（実施例２Ｂ参照）溶出分 画は２つのプールにまとめ、プールｌはＨＩＣカラムへ負荷しなおしてプール中 に含まれている完全なＩＧＦ−１単量体を回収するために溶出させた。ＨＩＣ’ マトリックスの２回の溶出からのプール２溶出物を混合し、精製されたＩＧＦ− １単量体の一つのプールを得た。

Ｃ１匣収Ω確認 最終溶出液プールのＨＰＬＣ分析により、この完全なＩＧＦ−１単量体の試料は ９７％以上の純度であり、３２０ｄの液量の中に１４７ｇの完全なＩＧＦ−１単 量体を含んでおり、細胞を含まないブロス中に存在した完全なＩＣＦ−１単量体 の最終回収率は２８％であった（表Ｉ）。

２、Ｍ＋ｆＭＢ２０６Ｓ１のフ゛ロス１゛のＩＧＦ−１の　にお番る　２の　イ オン六　工　でプール　れた゛　の°ル゛クロマ　グーフａ、左芝ム調製 ６０ｃｓＸ１．６ｃｍ直径ゲル濾過カラムに始めから詰めである５ｕｐｅｒｄｅ χ７５１６／　６０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅ ｕ）が１．４　ｄ／分での６０１ｉの水、０．５ｄ／分の流速での１２０ｄの０ ．５Ｍ　ＮａＯＨ１０，５ｍ／分で６０ｄの水、０．５１１ｉ／分で１２０＋ｄ の５０％イソプロピルアルコール、および０．５ｄ／分で６０ｍの水を用いて再 生された。再生または貯蔵後カラムは少くとも２カラム容量（２５０−３５０ｄ ）の５０ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡化した。（カラムは２０％エタノール中で 貯蔵された。）このカラムを用いるすべての操作は室温で実施された。

もしくは、直径２．５　ｃｍのカラムに５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐ）（６，０ に加えたＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＨＷ５０　Ｆサイズ排除媒質を６ａｆ／分（７３ ｃｍ／ｈｒ）の流速でヘッド高９２ｃｍ（４５０ｄベツド容量）になるまで充填 した。カラムを１５０１１の水、３００ｄの０．５Ｍ　ＮａＯＨ１１５０戚の水 、３００戚の５０％メタノール続いて１５０ａｆの水で洗浄することによりカラ ムを再生した。再生の間の流速は水酸化物洗浄の間の高い逆圧のため２１Ｉｌ／ 分へ減少させた。カラムは２０％エタノール中で貯蔵されカラム操作は室温で実 施された。

ｂ、成科虞袈および添加 実施例２．　Ｃ０４，ｂ、に記載したごとく、標準ＩＧＦ−１を特定のレベルの 純度で含んでいるＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　カラムの塩濃度勾配溶出の間に得ら れた分画をプールした。このプール（約５３０ｍｇの標準ＩＧＦ−１を含んでい る）は次に、２０００Ｄａより大きな分子量を持つ蛋白質を保持する（即ち、２ ０００ｍ、ｗ。

力、トオフ）ＹＭ２Ｍを用いて４０（ｌｌｄのＡｍ１ｃｏｎ圧力セル中で容量を ４２０ｄから６０ｍに濃縮した。６０ｄに一１１ｍされたプールを２０に分割し た（各々約３０朝の標準ＴＧＦ−１を含んでいる）。一部づつ個々にカラムへ加 えるのでバッチ当り各々総計で２０回のクロマトグラフィーの実施が必要とされ る。２０サイクルの各々の試料の添加の間、緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、 ｐＨ６，０）の流速は０．７　ａｆ／分であった。添加１５分後、流速を１．４ 　ｙｄ１分に！ｊ１節した。単量体および多量体がカラムから溶出された後、次 の一部をカラムへ添加し、このサイクルを繰返した。より高い能力を持つより大 きなカラムは必要とされるサイクルの数を減少させるであろう。

もしくは、部分的精製ＩＧＦ−１からの残留多量体の除去のためのゲル濾過クロ マトグラフィーにＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＨＷ　５０　Ｆカラムが使用される場合 、０．２Ｍ酢酸が溶出緩衝液として使用できる。興味あることに、酢酸緩衝液が 使用され次に５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液が使用された場合ＩＣＦ−１単量 体はより遅く溶出された。このマトリックスおよび単量体ＩＣＦ−１を含む何ら かの相互作用があるらしく、それが単量体ＩＧＦ−１の溶出を遅らせ、単量体お よび多量体ＩＧＦ−１の分離を促進させている。

Ｃ０工旦旦二Ｊ少按皇 カラム溶出液は２８０ｎｍの波長にセットされたオンラインＵＶ吸光度検出器で モニターされた。カラムから蛋白質が溶出し始めたら（ＵＶ吸光度検出器により 示される）、ＵＶ＠光度の鋭い増加により示されるカラムからの標準ＩＧＦ−１ 単量体の溶出が始まるまで溶出液の分画（各々７ｍ）を５分毎に集めた。この時 点で遷移的分画が分析できるように約３分の間０．５分（０，７ａｄ）の分画を 連続的に集めた。３分期の終了時には残りの単量体溶出物を集めるため５分の分 画（各々７ｍ）を集めた。単量体が完全に溶出されたらＩＧＦ−１を３０１１ｇ 含む別の一部をカラムに加え溶出過程を繰り返した。

ｄ、匣収ｐ確認 全２０サイクルのゲル濾過カラムから集められた分画はＨＰＬＣで分析された。

カラムから最初に溶出したＩＧＦ−１物質はカラムから６４１ｄの緩衝液が溶出 された直後に始まり、カラムから１００ａｆの溶出液が溶出された直後に終る（ 即ち溶出液の６５から１００ミリリツトルの間の物質）期間の集められた。第１ のピークとしてゲル濾過カラムから溶出されたこの物質のＨＰＬＣ分析では蛋白 質は検出されなかった（即ちＨＰＬＣクロマトダラムにピークは表れなかった） 。従って多分多量体ＩＧＦ−１種であろうこの高分子雪積の濃度は、より後に溶 出される二量体ＩＣＦ−１（ＨＰＬＣ分析で定量可能）の２８０ｎｍの吸光度と この物質の２８０ｎｍでの吸光度を比較することにより推定された。この溶出プ ールの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は非還元条件下ゲルの頂点に位置する非常に高い分 子量の蛋白質を示した。還元条件下この高分子量蛋白質に対応するバンドはその 強度を非常に弱め、単量体ＩＧＦ−１に対応するバンドがゲル中に存在した。こ れらのゲルのウェスタンプロットにおいては、非常に淡いバンドが非還元試料を 含むプロットの頂点にみられ、単量体バンドは還元試料のプロット中に観察され た。

ゲル濾過オンライン検出器クロマトグラム上の第２のピークは溶出液の１００か ら１２０ミリリツトル目に溶出した物質に対応していた。この物質の大部分は非 還元状態での５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび対応するウェスタンプロ・ントに示さ れるごと＜ＩＣＦ−１の三量体の分子量に一致する明瞭な分子量を持っていた。

加えてこの物質はこれらの分析により検出されるようにより高い分子量の化学種 を含んでいた。還元条件下、この溶出液プールのゲルおよびイムノプロットで観 察された唯一のバンドは標準ＩＣＦ−１と同しに移動する蛋白質に対応していた 。

このプールのＨＰＬＣクロマトグラムはＩＣＦ−１装置体は比較的長い保持時間 を持っていることを示した（即ち溶出は１４から１６分すぎに起こった）。

ゲル濾過クロマトグラム上の第３のピークは溶出液の１２５から１３５ミリリツ トル目に溶出する物質に対応した。ＨＰＬＣ分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび ウェスタン分析はこの溶出液プールは主としてＩＧＦ’−に量体から成っており 、少量の単量体および三量体ＩＣＦ−１も含まれていることを示していた。ＨＰ ＬＣカラム上では、このプールは１１から１４分の間に溶出された。

標準、ＩＧＦ−１は溶出液の１２６ミリリソトル目に溶出し始め、それはかなり 高いレベルの二量体ＩＧＦ−１も含んでいた。しかしながら、単量体が溶出し始 めた後の最初の２．１ｄ（１，５分）の溶出液は０．２ｍｇのみの単量体しか含 んでいなかった。続いての２．１　ｄの溶出の間に３■の単量体ＩＧＦ−１が溶 出され、約１０％の二量体ＩＧＦ−１を含んでいる。このプールはこの過程の回 収率を改良するためにカラムへ加えられるＩＧＦ−１プールへリサイクルされた 。もしこのプールのカラムへの再添加によるサイクルがなされなかったら、全単 量体ＩＣＦ−１の１０％が失われるであろう（各々の負荷で３０Ｉ１ｇのうちの ３＋ａｇ）、全量で１３Ｍの溶出液で溶出された後の時点では、多量体ＩＣＦ− １濃度は３％未満に減少し、残りの溶出液は単量体溶出の終了時（それは１５０ ミリリ・ントル目の溶出で終わる）まで回収された。Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ工 程からの２０に分けられた溶出液の２０の別々のゲル濾過の各々の後に得られた 単量体プールが集められ６００ａｆの液量中、全体で４８１■の標準ＩＣＦ−１ が得られた。この工程の収率は９１％であり、この時点までの精製過程の全収率 は４９％であった（表■）。単量体プールのＨＰＬＣ分析は、純度が９８％で多 量体レベルが０．９％であることを示した。ｉｌ１体プールの５ＤＳ−ＰＡＧＥ およびウェスタンプロット分析では還元および非還元条件下の両方で単量体ＩＧ Ｆ−１のみが検出され、このプールのＨＰＬＣの分析結果と一致した。

第２のＨＩ　Ｃ工程からプールされた溶出液（３２０ｄ）として得られた最終精 製ＩＣＦ−１生成物は４００ｄのへ＊１ｃｏｎ圧力セル中２００００ａより大き な蛋白質を保持するフィルター（ＹＭ２フィルター、八−４ｃｏｎ、　Ｄａｒｖ ｅｒｓ、ＭＤ）を通して濾過することにより約２０＃ｆの容量に濃縮した。濃縮 ＩＧＦ−１試料の緩衝液を濃１ｉＩ［ＧＦ−１を４００ｍまで０．１　Ｍ酢酸で 希釈することにより０．１　Ｍ酢酸へ交換し、続いて濾過により約２０ｄの総量 まで再び蛋白質をＮａ縮した。はとんど完全な緩衝液交換を達成するためこの過 程を２回繰り返した。ダイアフィルトレーンヨンは２−１Ｏ°Ｃの温度で実施さ れた。

を集めると４８１■の標準ＩＧＦ−１を含む総量で６００ｄのプールを得た。こ のプールは続いてＹＭ２膜（２，０００ｍ０ｗ、カットオフ）を用いてＡｍ１ｃ ｏｎ圧力セル中５０ａｆの容量まで濃縮された。アンモニウム塩を除去するため 濃縮、精製単量体プールを１０倍の０．１　Ｍ酢酸で希釈し、再濃縮した。この 希釈および濃縮工程を２回繰返した。４５ｄの最終容量を圧力セルから除き、フ ィルターを０．１Ｍ酢酸で２回洗浄（Ｍｔ５ｄ）した、最初の４５−をＣｏｒｎ ｉｎｇ　０．２２ミクロンフィルターに通し、次にフィルター洗浄の５！Ｒ１を 同しフィルターで濾過し、４５ｔｅ液と混合して最終精製標準ＩＧＩ−１の総量 を５０ｄとなした。濃縮ＩＣＦ−１の置（表旧はＨＰＬＣにより４５３＋１ｇと 決定され、ｉ１！縮工程の収率は９４％であり、全精製過程に対する全収率は４ ６％であった。

この過程によりアンモニアが除去されていることを確かめるため、アンモニア結 合電極（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｍｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いて濃縮および希釈 の間に集められた各々の濾液中のアンモニア濃度が決定された。標準曲線は既知 のアンモニア濃度から作成された。アンモニア濃度はゲル濾過緩衝液に対しては ５３ｍＭおよび最初の４縮工程から得られた最初の濾液は４２ｍＭと計算された 。続いての一連の１０倍希釈および４縮による濾液は４．６．０．０１６および ０．００１ｍＭアンモニアと計算された。

実施例３：発酵グ兄スケｈ楚ｌ査力犬占］プロよ一巾広１社、　ｌ　−（、Ｆ− 二↓−Ｑ確認上記の過程の何回かの繰返しの第２のＨＩＧ工程後に得られた精製 ＩＧＦ−１の溶出液プールは実施例２Ｅに記載し、たごとくダイアフィルトレー ソヨンにより０．１Ｍ酢酸中へａ縮された。上記のごとく株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ １４および株Ｍ＋−ＩＭＢ２０６Ｓｌのブロスから精製された完全で、単量体の 正しく折りたたまれた１ＧＦ−１の典型的試料はＨＰ　Ｉ−Ｃ、ゲル濾過クロマ トグラフィー、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノプロット、アミノ酸組成およびアミノ 酸配列分析により確認され定置された。

Ａ、用旦旦す匁折 １、ズ旦上ｐ−二匹 Ｗａｔｅｒｓ　（Ｍｅ＋Ｈｏｒｄ、ＭＡ）　６０　ＯＮ媒送液システム、Ｗａｔ ｅｒｓモデル４８　Ｌ　ＬａｍｂｄａＭａｘ波長可変検出器、Ｗｉｓｐ７１０オ ートインジェクターおよびＳｃｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｒｏｖｓ−Ｐａｃ　（Ｃｏｌ ｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｍｏｏｒｅｐａｒｋ、　ＣＡ）インチグレーター でＨＰ　Ｉ−Ｃシステムが構成された。ガードカラムを備えたＶｙｄａｃ　Ｃ４ カラム（０，４６Ｘ５ｃｕ）が〈±１　バストリス（叶帥知　凹１町ｎ）産生Ｉ ＧＦ−１試料の成分の分離に使用された。精！！過程の間に得られた試料および ＩＣＦ−１の最終精製調製物からの試料は１ｍ／分の流速でカラムへ注入され、 トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／アセトニトリル濃度勾配溶出により溶出された。

溶出液は移動相Ｂ（９５％アセトニトリル、５％水、０．１％ＴＦＡ）の希釈に 移動相Ａ（０，１％ＴＦＡ）を用いることにより調製された。カラムに注入され た物質を溶出するため１ｍ／分の流速で、１％／分の勾配で２５％から４２％の 移動相Ｂを１７分の間カラムを通過させた。カラムは次に１００％移動相Ｂを２ 戚／分の流速で４分間続いて２５％移動相Ｂを２ｄ／分で４分間流して再生され た。流速を次に１〆／分に減少させ、カラムは分析されるべき他の試料を再注入 する前に２分間平衡化した。検出器は０．０５吸光中位をフルスケールとしくＡ ＵＦＳ）、最高の感度を得るため２１５ｍｍの波長が使用された。

イ七ヱ（Ｐｉｃｊｊｑ）産生ＩＧｆ−１の濃度をＨＰ　Ｌ　Ｃにより定量するた めに既知の量の１１［！ＩＧＦ−Ｉ　（Ａｍｇｅｎ）　（０，５−５，０μｇ） がＨＰＬＣカラムへ注入され、クロマト・グラム中の対応するピークの面積が測 定された。標準曲線はＨＰ　Ｌ　Ｃカラムへ注入されたＩＧＦ−１のｐｇに対す る面積をプロットすることにより作製された。ＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム　ピ ークの面積をＩＧＦ−１に変換するために使用される換算係数は標準曲線から計 算された。検出器が０．０５ＡＩＪＦＳおよび２１５ｍｍの波長に設定され場合 、換算係数はカラムへ注入された夏ＧＦ−１のｐｇ当り３５０単位から４０５単 位まで変化した。この情報を用いて試料のＩＰ！、Ｃ分析のクロマトグラム上の 対応するピークの面積を測定することによりブロスまたは精製試料中に存在する 正しく折りたたまれた、完全な、単量体ＩＧＦ−１の濃度を決定することが可能 であった。この換算係数は、他のｒＧＦ−１種の大体の濃度を見積もるためにも また使用された。しかしながら、これらの他の種の絶対濃度はその特異的換算係 数の相違に依存して変化するであろう。

２、槍製材料９分析 精製ＩＧＦ−１の何種類かの希釈溶液がＨＰＬＣにより分析された。濃縮精製Ｉ ＧＦ−１の５．　２．　Ｉ、　０．５．０．２および０．１ｕＥの均等物が０４ カラムへ注入された。０．１から１−２μｉの試料の分析によるクロマトグラム 中の完全で、正しく折りたたまれた、単量体のＩＧＦ−１に対応するピークの面 積は試料の容量に直接比例した。Ａｍｇｅｎから得られたＩＧＦ−１種品を用い て、標準曲線が作製され、株ｃ＋ｌＭＢ２０４ｓ１４のブロスからの精製試料の ＩＧＦ〜１濃度に対する８、２±１．４１１ｇ／ｙｄ、および株Ｍ＋ｌＭＢ２０ ６Ｓ１のブロスがらの精製試料のＩＣＦ−１濃度に対する９、０±０．３■／Ｉ １１の濃度の計算に使用された。

ＩＧＦ−１試料の純度評価はＨＰ　Ｌ　Ｃカラムへ注入された精製物質の容量を 減少させると増加した。Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスから精製された２μｌ の試料のクロマトグラムは試料の９７．３％が純粋な完全で、正しく折りたたま れたＩＧＦ−１単量体であり、前部の肩ピーク（多分誤って折りたたまれたＩＧ Ｆ）、後部側ピーク（切れ目を持つＩＧＦ）および多量体領域ピーク（各々試料 の０．９％、０．４％および１．４％）により代表される３つのより少ない夾雑 物を含んでいた。ｌμｌの試料のＨＰＬＣ分析に基づいて決定された純度は９８ ．７％の純粋で正しく折りたたまれた完全なＩＧＦ−１単量体で多量体は存在し ておらず、一方０．２μｌの試料のＨＰＬＣ分析では、この試料は９９．４％純 粋で正しく折りたたまれた完全なＩＧＦ単量体であった。多量体はＨＰＬＣカラ ムから幅広い不均質なピークとして溶出されるのでＨＰＬＣによりその存在を評 価することは困難である。しかしながら、２μ！の−ａ縮精製ＩＧＦ−１はほと んど１５μｇのＩＧＦ−１と等価である。従って、２μｌの精製ＩＧＦ−１のＨ ＰＬＣ分析においては低レベル夾雑物が検出されるであろうことが期待される。

株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓｌのブロスから精製された試料２μｌのクロマトグラムは 試料の９７，３％が純粋な標準ＩＧＦ−１であり、１．１％の多量体、０．７３ ％の切れ目のある、および０．９％の推定の誤って折りたたまれたＩＧＦ−１が 含まれていることを示した。０．１−０．５μ２の試料の純度評価では９９％以 上であった。

２４〆のベッド容積（１０Ｘ３００ｍ）の５ｕｐｅｒｄｅｘ７５　ＨＲ１０／３ ０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒ＊ａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ） が最終精製ＴＧＦ−１の確認に使用された。上記のＨＰＬＣシステム（実施例３ Ａ参照）がこのカラムの使用のために改変された。検出器は波長を２８０ｎｍに および感度を０．０５ＡｔＪＦＳに設定された。ブロスからのＩＧＦ−１精製の 間に得られたＩＧＦ−１含有試料がカラムへ注入され、大きさによりＩＧＦ−１ 種を分離するため０．５　ｍ／分の流速で０．１から０．３　Ｍの酢酸アンモニ ウムを含む＄１衝液が使用された。

株Ｇ４−ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスからの精製ＩＧＦ−１試料中に存在するＩ ＧＦ−１多量体の実際の濃度を評価するため０．３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６ 、で２００μｌの容量まで希釈した５０μ！の濃縮精製ＩＣＦ−１（約２５０μ ｇ）がゲル濾過クロマトグラフィーにより分析された。２つの速く溶出する夾雑 物（多量体ＩＧＦ−１）に対応する２つのピークの積分により、第１のピーク（ 多分三量体であろう２２．６７分に溶出する物質）が全面積の１．０％であり、 第２のピーク（多分二量体であろう２４．７５分に溶出する物Ｗ）が全面積の２ ．６％であったことが示された。精製試料中の多量体の総パーセントは３．６％ と計算さ瓢単量体（クロマトグラム中３番目に速く溶出する化学種）のパーセン トは９４．９％と計算された。これら３つのピークに対応する物質が集められ別 々にＨＰＬＣにより分析された（実施例３Ａに記載されているプロトコール参照 ）。

ゲル濾過クロマトグラム中の単量体ピークに対応する物質のＨＰＬＣクロマトグ ラムから、ゲル濾過カラムへ加えられたＩＧＦ−１単量体の９５％以上が溶出液 中に回収されたことが計算された。ゲル濾過カラムからの約１９μｇの完全な単 量体ＩＣＦ−１が０４カラムに注入されたが、ＨＰＬＣクロマトグラムでは多量 体は検出されなかった。

２つの最も速く溶出される化学種としてゲル濾過カラムから溶出されたＩＣＦ− １の多量体形もＨＰＬＣで分析されたが、ＨＰＬＣ上で検出するには多量体の濃 度はあまりにも低すぎた。

精製ＩＧＦ−１中に少ない量で存在しているであろう多量体積のいくっがを分析 するため、精製の第１のＨ［Ｃ工程（実施例２Ｄ参照）の溶出物分画の第１のプ ールからの物質２００μ７！（比較的高レベルの多量体を含んでいるので）をゲ ル濾過クロマトグラフィーにかけた（上記のごとく）。個々のピークに対応する 物質を集め、ＨＰＬＣにより別々に分析した。第１のＨＩＣ工程の溶出液分画の 第１のプールの成分のＨＰＬＣクロマトグラムではゲル濾過カラムから各々２２ ゜７分（三量体）および２４．８分（三量体）に溶出された。ゲル濾過カラムか ら約３５．５分に溶出された物質もＨＰＬＣで分析されたが、ＨＰＬＣ（クロマ トグラム上ではピークは検出されなかった。多分、これは小さなＩＧＦ−１ペプ チドであり、０４カラムに非常に強く結合して溶出勾配液では除去されないがま たはＣ４にまったく結合しないためであろう。

ｂ、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロス１゛　１１　れたＩＣＦ−１株Ｍ＋ｌＭＢ２ ０６Ｓ１のブロスがら精製された最終試料の４５０ｔＩｇのゲル濾過クロマトグ ラフィー分析のクロマトグラムから９９．２％の単量体および０．８％の多量体 ＩＧＦ−１が含まれていることが示された。この試料の２００μｇのクロマトグ ラムはそれが１００％単量体から成っていることを示した。

トリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（トリシン５ ＤＳ−ＰＡＧＥ）システム［Ｓｃｈａｇｇｅｒ、　Ｈおよびｖｏｎ　ＪａｇｏＨ ，Ｇ　（１９８７）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６６　：　３６　Ｂ　）　 （システムは５から２０ｋＤａの範囲の蛋白質の分離のために最適化されている ）がＩＣｌ−１含有試料の電気泳動分析に使用された。簡単に記すと、電気泳動 はＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ■（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈ＋ｗ−ｏｎｄ、ＣＡ ）垂直ゲルシステム中で実施された０分離ゲルは１３％Ｔ、３％Ｃであり、濃縮 用ゲルは４％Ｔ、３％Ｃであった。Ｓｃｈａｇｇｅｒおよびｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ 　（上記文献）により定義されているごとく、Ｔは両方の単量体（アクリルアミ ドおよびビスアクリルアミド）の濃度の総計のパーセントを表わし、Ｃは総濃度 Ｔに対する架橋剤のパーセント濃度を表わしている。

電気泳動試料は試料緩衝化成分を以下の濃度になるように添加した後：２％ＳＤ Ｓ、１２％グリセロール、５０ｍＭ）リスＭＣＩ、ＰＨ６，８，０，００２５％ クーマシーブリリアントブルーおよびｏ、ｏｏｉ％ピロニンＹ、２−３分間沸煮 水浴上にそれらを置くことにより調製された。さらに、試料緩衝液中に１００ｍ Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を包ませることによりいくつかの試料のジス ルフィド結合が還元された。試料緩衝液の一定量が゛°ブランク”レーンを含む ゲルの各々のウェルに加えられた。電気泳動は追跡用色素がゲルの底に到達する まで最大１００ボルトで実施された。ゲルは次にウェスタンプロット分析または 蛋白質染色のために処理された。

＋＋、　およびクーマシ−１シン゛ル ク一マシー染色による蛋白質可視化はゲルを５０％エタノール、１０％酢酸、５ ％ＴＣＡおよび２００■／Ｌ　クーマシーブリリアント　ブルーＲ−２５０中で ３０分間インキュベートすることにより実施された。この溶出に含まれているエ タノールのためクーフシ−染色後ゲルは部分的に脱水された。従って染色後ゲル は１０％エタノール、７％酢酸、１％ＴＣ八および５に／Ｌ　クーマシーブリリ アントブル　Ｒ−２５０中で再水和させた。ゲル中に蛋白質を共有結合で固定す るため、ゲルは１０％グルタルアルデヒド中で３０分間インキュベートした。

最終のインキュベーション後、ゲルはグルタルアルデヒドを除くため蒸留水でよ く洗浄した。典型的には洗浄操作には２時間の蒸留水中へのゲルの浸漬（その微 少くとも２同断しい水が加えられた）、続いての数倍の容量の蒸留水中でのゲル の一夜のインキュベーションが含まれる。

ｂ−エムＬズ旦ｌ上 イムノプロントにより分析された精製蛋白質および細胞を含まないブロス蛋白ｆ ｆ状ｔ４は、最初にトリシンゲル電気泳動（実施例３．　Ｃ９１，ａ参照）によ り分離され、続いてＴｏｗｂｉｎ　＄１街液（２５ｍＭ）リスＭＣＩ、ｐＨ８， ３，１９０ｍＭグリシン、２０％メタノール）中、０．ＩＩＩｍニトロセルロー ス上ヘエレクトロブロノトされた。電気的転移の前に蛋白質ゲルは３０分間Ｔｏ ｗｂｉｎ転移緩衝液中で平衡化させた。非還元ゲルは１％β−メルカプトエタノ ールを含むＴｏｗｂｉｎ　１１街液中で平衡化された。

蛋白質をニトロセルロース上に転移させた後、フィルターは１時間阻止！１衝液 （０，２５％、ゼラチン、リン酸緩衝化塩溶液、０．０５％トウィーン２０．０ ，０２％アジ化ナトリウム）中でインキユベートした。Ｃ末４１ＧＦ−１ペプチ ドに対して発生させたウサギ抗ＩＧＦ−１抗血清を阻止緩衝液で１：２０００に 希釈し、フィルターと一夜インキユベートした。フィルターを１時間阻止緩衝液 で洗浄し、Ｉｔｓ　ｌ−プロティンＡ（０，０２μＣｉ／ｄ）と４５分間インキ ュベートした。１時間阻止緩衝液で洗浄後フィルターを風乾し、−７５’Ｃで増 強スクリーンを持つＸ線フィルムに暴露した。

アミノ酸組成分析により決定された５、２．　１．０．５．０．２および０．１ 　ｔｔ　ｇのＩＧＦ−１を含む精製ＩＣＦ−１の非還元および還元試料を電気泳 動およびクーマシー染色にかけた。クーマシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出 できた還元または非還元ＩＣＦ−１の最少量は０．２μｇであった。標準ＩＧＦ −１と同じに移動する蛋白質に対応する単一のバンドが精製ＩＧＦ−１の非還元 および還元試料（０，２，０，５，１または２μｇ）を含むゲル中で見られた。

しかしながら、２つのバンド（１つは標準ＩＧＦ−１と一緒に移動する蛋白質に 対応し１つは標準１ＧＦ−１より遅く移動する蛋白質に対応する）が非還元およ び還元された５μｇのＩＣＦ−１の試料のゲルで観察された。非還元５μｇ試料 中のより遅く移動する蛋白質はＩＧＦ−１単量体がジスルフィドで結合されてい る多量体と同定された。ＩＧＦ−１多量体および既知の量の精製ＩＧＩＩに対応 するバンドの強度の視覚的比較に基づいて精製ＩＣＦ−１試料中に存在する多量 体の量は総ＩＣＦ−１の４−１０％と見積もられた。

還元された５μｇの精製ＩＣＦ−１の試料のゲル中の単量体ＩＧＦ−１に対応す るバンドの上に検出されたうすいバンドは多量体ＩＧＦ−１と同じ位置に移動し た。より強い還元条件下で実施された精製ＩＣＦ−１の還元試料をさらに５ＤＳ −ＰＡＧＥで分析するとこのバンドは検出されなかった。さらに、このバンドは 精製ＩＧＦ−１の還元試料の対応するウェスタンプロット（実施例３Ｃ２ｃ参照 ）上には存在し、それがＩＧＦ−１の多量体形であることを示唆している。従っ てこのより上のバンドはおそらく電気泳動に先立ったＩＧＦ−１の不完全な還元 の結果生じたものであろう。単量体ＩＧＦ−１より速く移動する蛋白質に対応す るバンド（切れ目を持つまたは分解されたＩＣＦ−１の存在を示唆する）は還元 試料のゲル中には検出されなかった。他のバンドは還元されたゲル上に見られな かったので、精製ｒＧＦ−１の純度レベルはおそらく９５％より上であろう。

ｉｉ、　Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロスから　１１されたＩＣＦ−１２００，５ ００，１０００および２０００ｎｇの標準ＩＧＦ−１を含む株Ｍ÷ｌＭＢ２０６ Ｓ１のブロスからの精製試料の一部を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン内へ加えた 。非還元試料は！！染色ゲル上多量体ＩＣＦ−１に対応するかすかなバンドを示 した；しかしながらこの化学種は精製試料の２０００ｎｇ未溝のウェスタンブロ ンド中ではほとんど観察できなかった。染色強度は蛋白質の濃度に比例しなかっ たので（特に低レベルの夾雑物に対し）、銀染色ゲルから多量体のレベルを決定 できなかった。非還元ＩＣＦ−１を１０００および２０００ｎｇを含む銀染色ゲ ルのレーン中の単量体バンドのすぐ上に別のバンドが観察されていた。

この化学種は多量体夾雑物のレベルより低いレベルで存在していた。還元試料の ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルは２０００ｎＨのＩＣＦ−１を含んでいるレーン中の多量 体の位置の非常に薄いバンドを除いて夾雑物を示さなかった。

ｂ、走査（はン２夕しくし丈＝ 精製ｒＧＦ−１の５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ分析の結果から多量体濃度をより正確に決 定するために、株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスから精製されたＩＧＦ−１の 還元および非還元試料のゲルが５８０ｎｍの波長に固定されたＨｏｅｆｅｒ　（ Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）走査型デンシトメーターを用いる走査型 デンシトメトリーにかけられた。デンシトメータートレーシングは非還元５ｕｇ および２μｇ試料および還元５μｇおよび２μｇ試料のゲルの走査により得られ た。非還元試料のゲルの走査により得られたトレーシング中の２つのピークは各 々多量体および単量体■ＧＦ−１に対応した。精製１（１，Ｆ−１の還元試料の ゲルの走査により得られたデンシトメータートレーシング中の小さなピークは不 完全に還元されたＩＧＦ−１多量体に対応し、同じトレーシング中の大きなピー クは還元された多量体に単量体ＩＧＦ−１を加えたものに対応した。精製された 非還元ＩＣＦ−１の０．２から５μｇに対応する単量体ピークのために計算され た面積をｒＧＦ−１の量に対してプロットし、標準曲線を確立した。０．２から ２μｇのＩＧＦ−１の間曲線は直線状であった。しかしながら、５μｇの非還元 ＩＧＦ−１を含むゲル中の多量体バンドに対応するピークは（このレーンに現れ る多量体は２μｇ未満であるので）存在する多量体の量の計算にまだ使用できる 。５μｇ多量体ピークの面積は０．６３μｇの量と計算され、それは１２．７％ の多量体濃度に相当する。２μｇの非還元ＩＧＦ−１中の多量体に対応するピー クの面積に基づいて０．０７μｇの多量体量が計算され、それは３．４％の多量 体に相当する。２μｇ未満のＩＧＦ−１を含１００％純粋単量体ＩＧＦ−１であ ることを示している。非還元精製ＩＣＦ−１のゲルの走査により作られたトレー ソング中にかなりの量バンクグラウンドが存在することに注意せねばならず、こ のバックグラウンドが多量体ピークの面積計算に含まれることになる。従って、 走査デンシトメトリーに基づいて精製ＩＧＦ−１の多量体濃度について計算され た値は実際の濃度より過大に評価されている。

ｃ、ｃ＋＋ＭＢ２０４ｓ１４のブロスから　＋Ｉ建友ＩＧＦ−１９歪ムｌグ旦ヱ 上分析 精製ＩＣＦ−１の還元および非還元試料（精製ＩＣＩ”−１のＨＰＬＣ分析に基 づいた完全なＩＧＦＩ単量体の０．１．０．２．０．５．　ｌ、　２および５μ ｇ）のトリシン５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルはまたイムノプロッティングにかけられた 。イムノプロット分析に基づ＜　ＩＧＦ−１多量体および単量体の濃度の評価は 分析に使用されたポリクローナル抗血清への多量体および単量体の相対的な結合 性に依存しており、単量体ＩＧＦ−１と比較して多量体による抗血清のより大き な結合の証拠が存在する。従って、精製ＩＧＦ−１のイムノプロット分析はＩＧ Ｆ−１多量体の検出には５ＤＳ−ＰＡＧＥよりも感度の良い方法である。しかし ながら、イムノプロット分析により精製ＩＧＦ−１中の多量体の量を評価する場 合、相対的抗体結合の可能な効果を心にとめておく必要がある。

精製ＩＧＦ−１の非還元試料のイムノプロットにおいて、多量体ＩＣＦ−１に対 応するハンドが軸ｇｅｎ　ＩＧＦ−１標品ならびに精製ＩＣＦ−１の５，２およ び１μｇの試料を含むレーンに検出された。２μｇの精製ＩＧＦ−１を含有する レーン中の多量体バンドは０．　Ｉ　ＩＩ　ｇの精製ＩＧＦ−１含有レーン中の 単量体バンドの強度（５％の多量体レベルと相等しいであろう）と類似している ようであり、および精製ＩＣＦ−１（多量体レベル〈１０％）の０．２μｇを含 むレーン中の単量体バンドより強度が小さかった。非還元試料のウェスタンプロ ット分析による精製ＩＧＦ−１中の１ＧＦ−１多量体含をの視覚的評価（５−１ ０％）は非還元試料のクーマン−染色５Ｏ３−ＰＡＧＥゲルの視覚的評価により 得られた値と十分に比較された。

精製ＩＧＦ−１の還元試料のクーマシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルと類似して還 元試料のイムノプロットもまた５μｇ試料において不完全還元を示した。最も重 要なことは、精製ＩＣＦ−１のクーマシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に現れた すべてのハンドは試料のイムノプロント中に存在したことである。このことば精 製試料中には非ＴＧＦ−１夾雑物は存在しておらず、精製ＩＣＦ−１中に存在す る唯一の容易に測定可能な夾雑物は多量体ＩＧＦ−１であることを示唆している 。

Ｄ、Ｇ４−ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロスか゛　ｌ）邪友上９トニＶΦＨ已Ｖへ　 ゛ル゛ロマトグーフィー　５Ｏ３−ＰＡＧＥおよびイムノプロット少要約 ＨＰＬＣ（１，４％）、ゲル濾過クロマトグラフィー（３，６％）、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ（４−１０％）、イムノプロット（５−１０％）およびクーマシー染色５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー（３，４−１２，７％）により決定され た精製ＩＧＦ−１試料中のＩ　Ｇ　Ｆ−１多量体のパーセント値は、試料中に存 在する低レベルの多量体を考えるとすべてかなりよく一致しているようである。

２５０μｇのＩＧＦ−１がゲル濾過カラム上に加えられたので、この技術が多分 、精製ＩＧＦ−１の多量体レベルの決定には最も正確であろう、さらに、５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析のための試料調製は精製試料中のい（つかの単量体ＩＣＦ−１の 凝集を起こさせる可能性があり、その結果、多量体レベルを高めに評価するであ ろう、そのような試料の調製はゲル濾過クロマトグラフィーでは実施されない、 精製ＩＧＦ−１の試料の染色ゲルとイムノプロットを比較した場合非ＩＧＦ−１ 蛋白質夾雑物は検出されなかった。

多量体ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１試料の純度の測定に使用される種々の技術により 同定できるが、ＩＧＦ−１の切れ目のはいったおよび誤って折りたたまれた形は ＨＰ　Ｌ　Ｃによってのみ区別し、検出された。切れ目のはいったＩＧＦ−１の パーセントはＨＰ　Ｌ　Ｃによっては約０．４％であると測定されたが、還元さ れた精製ＩＧＩ−１の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノプロット分析では０％であ った。１１ＰＬＣ分析はまた完全で、正しく折りたたまれた単量体ＩＧＦ−１に 対応するピークの前部に肩として現われる夾雑物を示した。この夾雑物は０．９ ％のレベルで存在し、ＩＧＦ−１の誤って折りたたまれた形であろうと推測され た。

Ｅ、　７まｌ数分析 １、プロトコール 精製ＩＧＦ−１が酸加水分解され、得られたアミノ酸はＢｅｃｋｍａｎ　（Ｐａ ｌｏ＾１ｔＯ１ＣＡ）６３ｄＯアミノ酸分析機で確認された。ＩＧＦ−１蛋白質 を酸加水分解するには、注意深く測定された容量の精製ＩＣＦ−１溶液を６×５ ０−のガラス管に加え、５ａｖａｎｔ　（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）　５ ｐｅｅｄ　Ｖａｃ、中で乾燥させた。これらの管を６Ｎ　ＭＣＩを含む反応フラ スコ中に置いた。真空にしフラスコをシールすることにより酸化を最小にした。

フラスコは１１０℃のオーブン中に一装置き、蛋白質は熱ＨＣＩ蒸気により加水 分解された。

加水分解に続き、反応フラスコを室温まで冷却し、加水分解ガラス管を取り除い た。管内に凝縮したＨＣＩは５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ中で乾燥することにより除去さ れた。

遊離アミノ酸は分析機の５０μ２ループに注入するため最少の１００μｌ　Ｂｅ ｃｋ−＊ａｎアミノ酸試料希釈緩衝液、Ｎａ−３に溶解した。アミノ酸標準溶液 および再懸濁加水分解試料の積分されたクロマトグラムを比較し定量化するため Ｎｅｌ　５ｏｎ（Ｃｕｐｅｒｔｔｎｏ、　ＣＡ）　３０００シリーズ　クロマト グラフィーデータシステムを使５．１５■／ｌｄの蛋白質濃度がノルロイシンを 内部標準として用いた精製ＩＣＦ−１の８回の別々の分析から決定された。　０ ．２６１１ｇ／ｄｌの標準偏差もまた計算された。従って総量で３８ｄの精製Ｉ ＧＦ−１中には１８Ｇから２０６■の蛋白質が含まれていた０表旧よ推測および 実際のアミノ酸比を示している。　ｃｙｃ、　Ｉ＋ｅｔおよびｔｙｒ残基の数に 対して計算された値はこれらのアミノ酸の加水分解条件下での酸化的分解により 実際の値よりすべて少くなっていた。スレオニン残基の数の高い計算値はおそら くこの残基および隣接するセリン残基の不完全な分離により生じるピーク積分エ ラーであろう、これらのずれは、この方法で予想される限界内である。

一表一　ｍ− 株Ｇ＋　Ｉ　ＭＢ　２０４　Ｓ　ｌ　４のブロスから精製されたＩＧＦ−１のア ミノ酸組成分析 Ｔｈｒ　３　５．２　５．２　４．８　５．４　４．０　４．０　４．１　４． ２　４．６Ｓｅｒ　５　４．６　４．１　４．６　４．１　４．２　４．２　４ ．３　４．４　４．３Ｇｌｕ（＋Ｇ１ｎ）　６　６．９　６．６　６．７　６． ６　６．１　６．５　６．５　６．５　６．５Ｐｒｏ　５　５．０　５．７　０ ．０　６．１　０．０　５．７　６．０　６．０　４．３Ｇｌｙ　７　７．５　 ６．８　６．５　６．８　６．７　６．７　６．８　６．７　６．８＾１ａ　６ 　６．４　６．４　６．８　６．５　６．５　６．４　６．４　６．４　６．５ Ｃｙｓ　６　．０　０．０　０．０　０．０　１．４　１．７　１．９　２．０ 　．９Ｖａｌ　３　２．９　２．７　２．６　２．５　２．４　２．２　２．２ 　２．２　２．５Ｍｅｔ　１　．０　０．０　０．０　．１　．３　．１　．１ 　．１　．１夏ｌｅ　１　．４．４．３．３．４．４．４．４　．４Ｌｅｕ　６ 　６．０　６．０　６．０　６．０　６．０　６．０　６．０　６．０　６．０ Ｔｙｒ　３　１．９　２．３　１．９　１．８　２．１　１．９　１．６　１． ６　１．９Ｐｈｅ　４　３．６　３．９　３．５　３．５　３．９　３．８　３ ．５　３．５　３．６）Ｉｔｓ　Ｏ，２０，０，２，２，５，４０，０，４，２ Ｌｙｓ　３　３．６　３．０　３．０　２．９　３．５　３．０　２．９　２． ９　３．ＩＡｒｇ　６　５．０　５．０　５．４　５．４　５．６　５．４　５ ．５　５．５　５．４ａ　Ｒｏｔｗｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ　（上記文献）により公 表されたヌクレオチド配列に由来する。

ｂ、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロス１゛　れたＩＧＦ−アミノ酸組成分析は株Ｍ ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロスから精製された最終ＩＧＦ−１に対して実施さね、 ８．４■／１Ｉ１１の濃度が計算された１表■は精製されたＩＧＦ−１に対して 算定されたアミノ酸比およびヒトＩＧＦ−１に対して実際の公表されたアミノ酸 比を表している。算定されたおよび公表された比は近い一致を示しており、算定 されたおよび公表された組成のわずかなずれはこの分析で予想される限界内であ った。

一表−ｒＶ− 株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブロスから精製されたＩＣＦ−１アミノ　デ一 二乙輩１−　公匙ジ党Ｊ誠−叉腋値 Ａｓ　ｐ　（＋Ａｓ　ｎ）　５　５．８Ｇｌｕ　（十〇Ｉｎ）　６　６．９ Ａｌａ　６　６．８ Ｃｙ　ｓ　６　５．５ ”／ａ１　３　２．６ Ｍｅｔ　１　０．９ １１ｅ　１　０．６６ Ｐｈｅ　４　３．６ Ｈｉｓ　０　０ Ｌｙｓ　３　３．３ Ａ　ｒ　ｇ　６　６．７ Ｆ、蛋白配列分析 １、Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブロス）“　たＩＧＦ−１精製ＩＣＦ−１の全ア ミノ酸配列を決定するため、この物質の試料は直接＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｓ＋ｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）　４７０／　１２０ガスフ エーズ　プロティン　シークエンサーに加えられた。配列決定はＨｕｎｋａｐｉ ｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ［５ｃｉｅｎｃｅ　２１９：６５０　（１９８３））に より記載されている方法に従って実施された。この物質はＮ末端アミノ酸から可 能な限りの蛋白質配列の残りが配列決定された。この分析で精製蛋白質の最初の ５９残基の配列がわかった。

残基５９のアミノ酸はメチオニン残基であるのでメチオニン残基後の蛋白質の臭 化シアン分解により、精製物質の蛋白配列分析を完成させるのに使用するための 精製ＩＣＦ−１のＣ末端１１アミノ酸（残基６Ｏ−７０）から成るペプチドを単 離することが可能であった。精製ＩＧＦ−１のＣ末端の１１のアミノ酸はペプチ ド断片として臭化シアン処理ＩＣＦ−１からＨＰＬＣ（実施例３Ａ１に記載した ものと同じ６４カラムを用いて）により単離された。この断片をプロテインシー クエンサーにかけ、Ｃ末端アミノ酸（ア迅）酸６Ｏ−Ｔｏ）の配列を決定した。

本発明の過程に従って精製された物質の残基はすべて肯定的に同定された（シス ティンを除いて）、これらの残基はそのサイクル中任意の残基が完全に存在しな いことにより同定された。全配列はヒトＴＧＦ−１標品に対応した。

ｂ、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓｌのブロスか゛　れたＩＧＦ−１株Ｍ＋１ＭＢ２０６Ｓ １のブロスから精製されたＩＣＦ−１のアミノ末端配列分析により最初の３０ア ミノ酸はヒトＩＧＦ−１のＮ末端配列と同一であったことが示された。

本発明はそのある特定の実施態様に関して詳細に説明されてきたが、本開示内容 の精神および範囲内にある道理に合った変形および変更も本開示内容および付随 する請求の範囲により企図されたものである。

画分１ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　２１１００　 Ｈ Ｃｌ２Ｒ１：８４） （Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８４） ＣＯ７Ｋ　９９：００ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＪＰ Ｉ （７２）発明者　プライアリ−、ラッセル・エイアメリカ合衆国ペンシルバニア 州１９３４１゜イクストン、スト−トン・サークル　２４７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程： （ａ）上記媒体を十分な量の第１カチオン交換材料と、上記媒体から少なくとも 約９５％の全ＩＧＦ−１を吸着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ）十分に 高いｐＨまたはイオン強度を有する十分な量の溶媒系と上記カチオン交換材料を 接触させて工程（ａ）のＩＧＦ−１含有カチオン交換材料から吸着ＩＧＦ−１を 溶出することにより、上記カチオン交換材料から上記ＩＧＦ−１を実質的に全部 脱離し、 （ｃ）適切な溶媒中で、工程（ｂ）の溶出物のＩＧＦ−１含有画分と十分な量の 第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス材料とを、上記溶出物から 約９５％から１００％の上記ＩＧＦ−１を吸着するのに十分な条件下で接触させ 、 （ｄ）樹脂の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導電率を有 するバッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上記第１疎 水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、上記第１ 疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全なモノマー の正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上記マトリ ックスから異常なＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリックスの体積に 比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファー系と上記マト リックスを接触させるが、その際、上記高いｐＨとは残りの吸着したＩＧＦ−１ を上記マトリックスから実質的にすべて脱離させるのに十分な高さであり、（ｅ ）高いｐＨを有する上記バッファー系を用いて、主たる形態として完全なモノマ ーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を含む、工程（ｄ）により溶出された画 分を十分な量の第２カチオン交換マトリックスと、上記溶出物から約９５％から １００％の全ＩＧＦ−１を吸着するのに十分な条件下でに接触させ、（ｆ）マト リックスの体積に比較して少なくとも等しい体積の、十分なイオン強度を行する バッファー系と上記マトリックスを接触させることにより上記第２カチオン交換 マトリックスから吸着ＩＧＦ−１を溶出して、上記マトリックスから実質的にす べてのＩＧＦ−１ペプチドを別々に脱離し、（ｇ）（１）上記溶出物からの全形 態のＩＧＦ−１約９５％から１００％を吸着するのに十分な条件下で、十分な量 の第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、または （２）実質的にすべてのマルチマーの形態のＩＧＦ−１から完全なモノマーの正 確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分離するのに効果的な適切なポアサイ ズの、十分な量のゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスれかと、適切な溶剤 系の中で、工程（ｆ）の溶出物の完全なモノマーの正確にフォールドされた形態 のＩＧＦ−１を接触させ、そして（ｈ）（１）工程（ｇ）（１）の後、マトリッ クスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導電率を有するバ ッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上記第２疎水性相 互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、顕著な量の完全 なモノマーの正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく 上記マトリックスから完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ− １以外の実質的にすべての形態のＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリ ックスの体積に比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファ ー系と上記マトリックスを接触させることにより、残りの吸着ＩＧＦ−１を実質 的にすべて上記マトリックスから脱離させるか、または （２）（ｇ）（２）の工程の後、十分な量の溶出バッファーで上記ゲル濾過クロ マトグラフィーマトリックスを溶出することにより上記マルチマー形態のＩＧＦ −１から完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分離する ことよりなる、モノマーで完全な正確にフォールドされたインスリン様成長因子 −１ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精製方法。 ２．上記媒体が上記媒体１リットルあたり少なくとも０．０１グラムのＩＧＦ− １ペプチド含む、請求項１記載の方法。 ３．上記第１カチオン交換マトリックスが高い流速を有することが可能な強固な カチオン交換マトリックスである、請求項１記載の方法。 ４．上記第１カチオン交換マトリックスがカルボキシメチル化またはスルフォン 化されたカルボキシメチル交換媒体から選択される、請求項３記載の方法。 ５．上記第１カチオン交換マトリックスがスルフィルプロピル化されたセルロー スマトリックスである、請求項４記載の方法。 ６．工程（ａ）により意図される接触が、約２℃から約３０℃の範囲の温度で実 施される、請求項３記載の方法。 ７．上記第１カチオン交換材料にＩＧＦ−１含有媒体を通すことにより、工程（ ａ）により意図される接触を実施する、請求項３記載の方法。 ８．工程（ｂ）の前に、マトリックスの体積あたり約１から約５倍の体積の希釈 された弱酸溶液に上記マトリックスを接触させ、次に、マトリックスの体積あた り約１から約６倍の体積の、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ５の希釈弱酸の 緩衝液に接触させる、請求項７記載の方法。 ９．上記弱酸溶液が酢酸またはリン酸溶液である、請求項８記載の方法。 １０．約２倍の体積の上記弱酸溶液を用いるが、その際、上記弱酸溶液が０．０ ２Ｍの酢酸溶液であり；そして、約４倍の体積の、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含 むｐＨ５の上記緩衝液を用いるが、その際、上記緩衝液が０．２Ｍ塩化ナトリウ ムを含むｐＨ５の０．０２Ｍ酢酸ナトリウム溶液である、請求項９記載の方法。 １１．工程（ｂ）の溶出に適切な溶剤系が約１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ ５．５の弱酸溶液の緩衝液である、請求項１記載の方法。 １２．第１カチオン交換マトリックスからのＩＧＦ−１の溶出において、上記マ トリックスの体積あたり約３倍から約１０倍の体積の上記適切な溶剤系を用いる 、請求項１１記載の方法。 １３．工程（ｂ）の溶出に適切な溶剤系が約１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ ５．５の０．０２Ｍ酢酸ナトリウムである、請求項１記載の方法。 １４．工程（ｃ）の前に、十分な体積の緩衝化塩含有溶液（ｐＨ４．５）で上記 工程（ｂ）のＩＧＦ−１含有溶出物を希釈することにより該溶出画分を処理して 、希釈溶化物の塩濃度を約０．２Ｍから約２Ｍにし、希釈溶出物のｐＨを約４． ５にする、請求項１３記載の方法。 １５．上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを含むカラムに 工程（ｂ）の溶出物のＩＧＦ−１含有画分を通過させることにより工程（ｃ）に より意図された接触を実施し、上記第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマト リックスを含むカラムに工程（ｆ）の溶出物のＩＧＦ−１含有画分を通過させる ことにより工程（ｇ）（１）により意図された接触を実施し、そして上記第１お よび第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスが、各々別々に、アル キルまたはアリールで置換された疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリック スである、請求項１記載の方法。 １６．上記疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチル、オクチル またはフェニルで置換された疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスで ある、請求項１５記載の方法。 １７．上記疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチルで置換され たポリ（メタクリレート）で支持されたＨＩＣマトリックスである、請求項１６ 記載の方法。 １８．工程（ｃ）および（ｇ）（１）により意図された接触を約１５℃から約３ ０℃の範囲の温度で各々別々に実施する、請求項１５記載の方法。 １９．上記第１および／または第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリッ クスが非シリカ基材マトリックスであり、そして、該マトリックスを３−１０カ ラム体積の水、 ３−１０カラム体積の０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液、３−１０カラム体積の５ ０％水性メタノール溶液、そして最後に３−１０カラム体積の水 からなる４連続洗浄により再生し、そしてその後、該カラムを５−１０カラム体 積の、硫酸アンモニウムを含有する酢酸／リン酸緩衝液（ＰＨ４．５）で平衡化 する、請求項１５記載の方法。 ２０．工程（ｄ）および（ｈ）（１）によるＩＧＦ−１含有マトリックスからの 吸着ＩＧＦ−１の溶出において、それぞれの工程において上記マトリックスを（ ｉ）最初に、実質的に塩を含まない溶出物を生成するのに十分な量のｐＨ約４． ５の緩衝液の直線塩勾配と接触させ、次に（ｉｉ）上記溶出物のｐＨを約６．５ に上昇させるのに十分な量の、最初のｐＨが約４．５の実質的に塩を含まない緩 衝液の直線勾配に接触させることからなる、請求項１記載の方法。 ２１．工程（ｅ）に進む前に、上昇させたｐＨで溶出された工程（ｄ）の溶出物 の一部を再度工程（ｃ）および（ｄ）に供し、そして完全なモノマーの正確にフ ォールドされたＩＧＦ−１を主に含む工程（ｄ）の溶出物の画分を混合する、請 求項１記載の方法。 ２２．上記第２カチオン交換材料を含むカラムにＩＧＦ−１を含む上記画分を通 過させることにより工程（ｅ）により意図された接触を実施し、そして上記第２ カチオン交換材料が、高い精度で分離することができる強固なカチオン交換マト リックスである、請求項１記載の方法。 ２３．工程（ｅ）により意図された接触前に、工程（ｄ）の溶出物のｐＨを約４ ．５に調節し、そして上記溶出物を少なくとも１倍体積の水または低導電性緩衝 液により希釈する、請求項２２記載の方法。 ２４．上記第２カチオン交換マトリックスがカルボキシルメチル化またはスルフ ォン化されたカチオン交換媒体である、請求項２２記載の方法。 ２５．上記第２カチオン交換マトリックスがスルフィルメチルアガロースである 、請求項２４記載の方法。 ２６．工程（ｅ）により意図された接触を約２℃から約３０℃の範囲の温度で実 施する、請求項２２記載の方法。 ２７．３−１０カラム体積の水、 ３−１０カラム体積の０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液、３−１０カラム体積の５ ０％水性メタノール溶液、そして最後に３−１０カラム体積の水、 からなる４連続洗浄により上記第２カチオン交換マトリックスを活性化／再生し 、そしてその後、上記カラムを、３−５カラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ ｐＨ４．５）、および１０−２０カラム体積の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）で平衝化する、請求項２２記載の方法。 ２８．マトリックスの体積に対して約１倍から約５倍の体積の、弱酸の希釈緩衝 液からなる少なくとも一つの溶液に上記第２カチオン交換マトリックスを接触さ せることにより、工程（ｆ）の前に該マトリックスを洗浄する、請求項２２記載 の方法。 ２９．酢酸またはリン酸に基づく緩衝液である少なくとも一つの溶液で上記第２ カチオン交換マトリックスを洗浄する、請求項２２記載の方法。 ３０．（１）０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）からなる緩衝液；ま たは（２）０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）からなる緩衝液に続く ０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）からなる緩衝液からなる群から選 択される溶液に上記第１および／または第２カチオン交換マトリックスを接触さ せることにより該マトリックスを洗浄する、請求項２９記載の方法。 ３１．工程（ｆ）のために意図される適切な溶剤系が酢酸ナトリウム（ｐＨ５． ５）中の塩化ナトリウム勾配である、請求項１記載の方法。 ３２．第２カチオン交換マトリックスからのＩＧＦ−１の溶出において、上記マ トリックスの体積あたり約３から約１５体積の上記適切な溶剤系を用いる、請求 項３１記載の方法。 ３３．直線勾配として第１溶剤系および第２溶剤系を混合して上記塩化ナトリウ ム勾配を提供するが、その際、 上記第１溶剤系が０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）からなり、そし て、 上記第２溶剤系が０．０５Ｍ酢酸ナトリウム／０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐ Ｈ５．５）からなる、 請求項３２記載の方法。 ３４．工程（ｇ）（１）の前に、十分な体積の緩衝化塩含有溶液（ｐＨ４．５） で工程（ｆ）のＩＧＦ−１含有容出物を希釈することにより該溶出物を処理して 、希釈溶出物の塩濃度を約０．２Ｍから約２Ｍにし、希釈溶出物のｐＨを約４． ５にする、請求項１記載の方法。 ３５．上記第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスが非シリカ基材 マトリックスであり、そして、該マトリックスを３−１０カラム体積の水、 ３−１０カラム体積の０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液、３−１０カラム体積の５ ０％水性メタノール溶液、そして最後に３−１０カラム体積の水 からなる４連続洗浄により再生し、そしてその後、該カラムを５−１０カラム体 積の、硫酸アンモニウムを含有する酢酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化 する、請求項１５記載の方法。 ３６．工程（ｅ）に進む前に、上昇させたｐＨで溶出された工程（ｈ）（１）の 溶出物の一部を再度工程（ｈ）（１）および（ｈ）（１）に供し、そして完全な モノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を主に含む工程（ｈ）（１）の溶 出物の画分を混合する、請求項１記載の方法。 ３７．モノマーで完全な正確にフォールドされたインスリン様成長因子−１ペプ チド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精製方法であって、その際、 ＩＧＦ−１を含む上記媒体は、高細胞密度の酵母発酵操作による実質的に細胞を 含まない発酵媒体であり、そして上記酵母は少なくとも一つのＤＮＡ断片で形質 転換されており、該断片は転写の方向に以下の配列：（ｉ）ピキアパストリスの メタノール感受性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）遺伝子のプロモーター領域； （ｉｉ）（ａ）ｌｙｓ−ａｒｇおよびｌｙｓ−ａｒｇ−（ｇｌｕ−ａｌａ）■（ 式中、ｘは１から約３の整数）からなる群から選択されるプロセシング部位を含 むサッカロミセスセレビシエのアルファ交配因子（ＡＭＦ）プレープロ配列、お よび （ｂ）インスリン様成長因子−■（ＩＧＦ−１）ペプチドからなるポリペプチド をコードするＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）ビキアパストリス内で機能する転写 終結因子（ｔｅｒｍｉｎａｌｏｒ）、 を含むが、その際、上記ＤＮＡ配列は上記ポリペプチドをコードする配列の転写 のために互いに機能的に連結されており、上記方法は以下の工程：（ａ）必要で あれば、下記工程（ｂ）で用いられるカチオン交換材料を平衡化するのに用いら れる媒体と同じｐＨを有する低導電性バッファー媒体で上記ＩＧＦ−１含有媒体 を希釈し、 （ｂ）上記媒体を十分な量のスルフィルプロピル化されたカチオン交換媒体と接 触させるが、その条件は上記媒体から少なくとも約９５％の上記ＩＧＦ−１を吸 着させるのに適切な条件であり、その際、上記媒体中の１グラムのＩＧＦ−１あ たり少なくとも０．０５リットルの上記カチオン交換材料を用い、そして約２℃ から約３０℃の範囲の温度で上記接触を実施し、、（ｃ）上記ＩＧＦ−１含有カ チオン交換材料を、上記カチオン交換材料の少なくとも約２倍の体積の０．０２ Ｍ酢酸溶液と接触させ、次に、約４倍の体積の、０．２Ｍの塩化ナトリウムを含 む０．０２Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）と接触させ、 （ｄ）十分な量の、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ酢酸ナトリウム溶 液（ｐＨ５．５）と、工程（ｂ）（１）の上記マトリックス材料を接触させるこ とにより、工程（ｃ）の上記ＩＧＦ−１含有カチオン交換マトリックス材料から 吸着ＩＧＦ−１を溶出させ、 （ｅ）十分な量の緩衝化硫酸アンモニウム含有溶液（ｐＨ４．５）に工程（ｄ） のＩＧＦ−１含有溶出物を接触させて該溶出物の硫酸アンモニウム濃度を約０． ４Ｍから約０．８Ｍに、そして希釈溶出物のｐＨを約４．５にし、（ｆ）工程（ ｅ）の生成物を、十分な量の第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリック スと接触させるが、約９５％から１００％の上記ＩＧＦ−１を上記溶出物から吸 着させるのに適した条件下で上記接触を行い、その際、上記第１疎水性相互作用 クロマトグラフィーマトリックスがブチル置換ポリ（メタクリレート）で支持さ れた疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスであり、そして上記媒体中 の１グラムのＩＧＦ−１あたり少なくとも約０．０５リットルの上記疎水性相互 作用クロマトグラフィーマトリックスを使用し、そして上記接触が約２０℃以上 ２５℃までの範囲で実施され、（ｇ）上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィ ーマトリックスから吸着ＩＧＦ−１を溶出するが、その際、上記マトリックスを （１）最初に、実質的に硫酸アンモニウムを含まない溶出物を生成するのに十分 な、大量の、ｐＨ約４．５の直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、次に（２）上 記溶出液のｐＨを約６．５に上昇させるのに十分な、大量の、初期ｐＨが約４． ５の、実質的に硫酸アンモニウムを含まない直線塩濃度勾配緩衝溶液と接線させ 、 （ｈ）工程（ｇ）（２）で得られた溶出画分の少なくとも一部を実質的に十分な 量の上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスと接触させるが、 上記溶出物から残りのＩＧＦ−１の約９５％以上１００％を吸着させるのに適し た条件で該接触を実施し、上記媒体中のＩＧＦ−１のグラムあたり少なくとも約 ０．０５リットルの上記第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを 用い、そして上記接触を約２０℃から約２５℃の範囲で実施し、（ｉ）上記第１ 疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから吸着したＩＧＦ−１を溶出 するが、その際、上記マトリックスを、（１）最初に、実質的に硫酸アンモニウ ムを含まない溶出物を生成するのに十分な、大量の、ｐＨ約４．５の直線塩濃度 勾配緩衝溶液と接触させ、次に（２）上記溶出液のｐＨを約６．５に上昇させる のに十分な、大量の、初期ｐＨが約４．５の、実質的に硫酸アンモニウムを含ま ない直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、 （ｊ）主要な形態として完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を 含む、工程（ｇ）（２）および（ｉ）（２）の溶出部分の混合物を接触させるが 、その際、上記接触を十分な量の第２カチオン交換マトリックス材料で実施し、 上記溶出物からＩＧＦ−１の約９５％以上１００％を吸着させるのに適した条件 で該接触を実施し、上記マトリックスがスルフィルメチル化またはスルフィルプ ロビル化されたマトリックスであり、上記媒体中のＩＧＦ−１のグラムあたり少 なくとも約０．０５リットルの上記マトリックスを用い、そして上記接触を約２ ℃から約３０℃の範囲で実施し、 （ｋ）上記ＩＧＦ−１含有第２カチオン交換マトリックス材料を、上記カチオン 交換マトリックス材料の体積あたり少なくとも１から５倍の体積の０．０５Ｍ酢 酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）と接触させ、（１）マトリックスの体積に比較 して少なくとも５倍の体積の塩化ナトリウム勾配溶液と上記マトリックス材料を 接触させることにより上記第２カチオン交換マトリックス材料から吸着ＩＧＦ− １を溶出するが、その際、上記勾配溶液は上記第１溶剤系と第２溶剤系からなる 直線勾配溶液であり、上記第１溶剤系は０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５ ．５）からなり、そして 上記第２溶剤系は０．０５Ｍ酢酸ナトリウム／０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５ ．５）からなり、 （ｍ）下記（１）または（２）のいずれかの工程を実施するが、上記工程は：（ １）工程（１）の溶出物のうち完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ −１を含有する画分を、少なくとも１倍の体積の緩衝化硫酸アンモニウム含有溶 液（ｐＨ４．５）で希釈して、溶出物の硫酸アンモニウム濃度を約０．２Ｍから 約２．０Ｍにし、そして希釈された溶出物のｐＨを約４．５にし、そして上記溶 出物からの上記ＩＧＦ−１約９５％から１００％を吸着させるのに十分な条件下 で十分な量の第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスと上記希釈溶 出物を接触させるが、その際、上記第２疎水性相互作用クロマトグラフィーマト リックスがブチル置換ポリ（メタクリレート）で支持された疎水性相互作用クロ マトグラフィーマトリックスであり、上記媒体中のＩＧＦ−１のグラムあたり、 少なくとも約０．０５Ｍリットルの上記第２疎水性相互作用クロマトグラフィー マトリックスを用い、そして上記接触を約２０℃から約２５℃の範囲で行うか、 または （２）工程（１）の溶出物である完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧ Ｆ−１を含有する画分を十分な量のゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスと 接触させるが、該マトリックスは実質的にすべてのマルチマー形態のＩＧＦ−１ から完全なモノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を分離するのに有効な 適切なボアサイズを有し、そして（ｎ）（１）工程（ｍ）（１）の後に、上記第 ２疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから吸着されたＩＧＦ−１を 溶出するが、その際上記マトリックスを： （ｉ）最初に、実質的に硫酸アンモニウムを含まない溶出物を生成するのに十分 な、大量の、ｐＨ約４．５の直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触させ、次に（ｉｉ） 上記溶出液のｐＨを約６．５に上昇させるのに十分な、大量の、初期ｐＨが約４ ．５の、実質的に硫酸アンモニウムを含まない直線塩濃度勾配緩衝溶液と接触さ せるか、または （２）工程（ｍ）（２）の後に、十分な量の溶出緩衝液で上記ゲル濾過クロマト グラフィーマトリックスを溶出して上記マルチマー形態のＩＧＦ−１から完全な モノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を分離することよりなる、上記精 製方法。 ３８．上昇させたｐＨで溶出された工程（ｎ）（１）の溶出物の一部を再度上記 疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに接触させ、工程（ｎ）（１） にしたがって溶出し、そして主要な形態として完全なモノマーの正確にフォール ドされたＩＧＦ−１を含む工程（ｎ）（１）の両溶出物の溶出画分を混合し、そ して保管する、請求項３７記載の方法。 ３９．以下の工程： （ａ）上記媒体を十分な量の第１カチオン交換材料と、上記媒体から少なくとも 約９５％の全ＩＧＦ−１を吸着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ）十分に 高いｐＨまたはイオン強度を有する十分な量の溶媒系と上記カチオン交換材料を 接触させて工程（ａ）のＩＧＦ−１含有カチオン交換材料から吸着ＩＧＦ−１を 溶出することにより、上記カチオン交換材料から上記ＩＧＦ−１を実質的に全部 脱離し、 （ｃ）適切な溶媒中で、工程（ｂ）の溶出物のＩＧｒ−１含有画分と十分な量の 第１疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス材料とを、上記溶出物から の上記ＩＧＦ−１約９５％から１００％を吸着するのに十分な条件下で接触させ 、そして （ｄ）樹脂の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導電率を有 するバッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上記第１疎 水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、上記第１ 疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全なモノマー の正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上記マトリ ックスから異常なＩＧＦ−１ペプチドを税離して、次に、マトリックスの体積に 比較して約１から約１０倍の体積の、高いｐＨを有するバッファー系と上記マト リックスを接触させるが、その際、上記高いｐＨとは残りの吸着したＩＧＦ−１ を上記マトリックスから実質的にすべて脱離させるのに十分な高さであることよ りなる、モノマーで完全な正確にフォールドされたインスリン様成長因子−１ペ プチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精製方法。 ４０．工程（ｂ）の溶出の前に、（１）（ｉ）希釈酢酸溶液、次に（ｉｉ）ｐＨ 約５で約０．２Ｍの塩濃度を有する酢酸緩衝液；（２）（ｉ）希釈酢酸溶液、次 に（ｉｉ）ｐＨ約５の酢酸緩衝液、そして次に（ｉｉｉ）ｐＨ約５．５の酢酸緩 衝液；からなる群から選択される段階式洗浄系に、ＩＧＦ−１含有カチオン交換 クロマトグラフィーマトリックスを供する、請求項３９記載の方法。 ４１．工程（ｂ）の溶出の前に、（１）２０ｍＭ酢酸、次に０．２ＭのＮａＣｌ を含むｐＨ５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、または（２）２０ｍＭ酢酸、次に５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）そして次に、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５． ５）からなる群から選択される段階式洗浄系に、ＩＧＦ−１含有カチオン交換ク ロマトグラフィーマトリックスを供する、請求項３９記載の方法。 ４２．工程（ｂ）の溶出の前に、（１）希釈酢酸溶液；（２）塩を含まないｐＨ 約５．５の酢酸緩衝液；（３）ｐＨ約５．５であり、約０．０５Ｍの塩を含む酢 酸緩衝液；そして（４）ｐＨ約５．５であり、約０．１Ｍの塩を含む酢酸緩衝液 からなる群から選択される段階式洗浄系に、ＩＧＦ−１含有カチオン交換クロマ トグラフィーマトリックスを供する、請求項３９記載の方法。 ４３．上記段階式洗浄系が２０ｍＭ酢酸、次に５０ｍＭ酢酸ナトリウム、次に５ ０ｍＭ酢酸ナトリウム中の０．０５ＭのＮａＣｌ、そして次に５０ｍＭ酢酸ナト リウム中の０．１ＭのＮａＣｌからなる、請求項４２記載の方法。 ４４．工程（ｂ）の上記溶剤系がｐＨ約５．５であり約０．３Ｍの塩を含む酢酸 緩衝液である、請求項４２記載の方法。 ４５．工程（ｂ）の上記溶剤系が０．３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの酢酸ナトリウ ム（ｐＨ５．５）である、請求項４３記載の方法。 ４６．工程（ｂ）の上記溶剤系が、実質的に塩を含まないｐＨ約５．５の緩衝液 で開始し、実質的にｐＨが同じで塩濃度が約０．５Ｍである緩衝液で終了する直 線塩勾配である、請求項３９記載の方法。 ４７．塩が塩化ナトリウムである、請求項４６記載の方法。 ４８．十分低い導電性を有する上記緩衝系が５０Ｍ酢酸ナトリウム／リン酸ナト リウムでｐＨ４．５に緩衝された２０％飽和硫酸アンモニウムで開始し、そして 同じ緩衝液でｐＨ４．５に緩衝された０％硫酸アンモニウムで終了する直線勾配 である、請求項３９記載の方法。 ４９．上昇させたｐＨを有する上記緩衝系がｐＨ約４．５で開始し、ｐＨ約６． ５で終了するｐＨ上昇直線勾配である、請求項４８記載の方法。 ５０．十分低い導電性を有する上記緩衝系が５０Ｍ酢酸ナトリウム／リン酸ナト リウムでｐＨ５．０に緩衝された２０％飽和硫酸アンモニウムで開始し、そして 同じ緩衝液でｐＨ４．０に緩衝された０％硫酸アンモニウムで終了する直線勾配 である、請求項３９記載の方法。 ５１．直線勾配の後に、上記疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスを 、ｐＨ４．０に緩衝された硫酸アンモニウムを含まない溶液にさらに接触させる 、請求項５０記載の方法。 ５２．上昇させたｐＨを有する上記緩衝系のｐＨが６．５から７．５の溶液であ る、請求順５１記載の方法。 ５３．工程（ｄ）の後に、 （ｅ）適切な緩衝系中で上昇させたｐＨを有する緩衝系に上記マトリックスを接 触させた後に得られた、工程（ｄ）からの溶出物である、完全なモノマーの正確 にフォールドされたＩＧＦ−１含有画分を、実質的にすべてのマルチマー形態の ＩＧＦ−１から完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分 離するのに効果的な適切なポアサイズを有する、十分な量のゲル濾過クロマトグ ラフィーマトリックスに接触させ；そして（ｆ）十分な量の溶出液で上記ゲル濾 過クロマトグラフィーマトリックスを溶出することにより上記マルチマー形態の ＩＧＦ−１から完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分 離する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。 ５４．上記溶出液が約６０ｍＭの硫酸アンモニウムを含み、そしてｐＨが約６． ０の溶液である、請求項５３記載の方法。 ５５．上記ゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスがポリマーに基づく樹脂で あり、そして工程（ｆ）の溶出液が酢酸溶液である、請求項５３記載の方法。 ５６．上記ゲル濾過クロマトグラフィーマトリックスがトヨパール（Ｔｏｙｏｐ ｅａｒｌ）ＨＷ５０Ｆであり、そして工程（ｆ）の溶出液が約０．２Ｍの濃度の 酢酸溶液である、請求項５３記載の方法。 ５７．以下の工程： （ａ）上記媒体を十分な量の第１カチオン交換材料と、上記媒体から少なくとも 約９５％の全ＩＧＦ−１を吸着させるのに十分な条件で接触させ、（ｂ）十分な 量の、ｐＨ約５．５の、緩衝化された０．３ＭＮａＣｌ溶液に上記カチオン交換 材料を接触させて工程（ａ）のＩＧＦ−１含有カチオン交換材料から吸着ＩＧＦ −１を溶出することにより、上記カチオン交換材料から上記ＩＧＦ−１を実質的 に全部脱離するが、その際、上記溶出の前に、（１）希釈酢酸溶液；（２）塩を 含まないｐＨ約５．５の酢酸緩衝液；（３）ｐＨ約５．５であり、約０．１Ｍの 塩を含む酢酸緩衝液からなる群から選択される段階式洗浄系に、ＩＧＦ−１含有 カチオン交換クロマトゲラフィーマトリックスを供し、（ｃ）適切な溶媒中で、 工程（ｂ）の溶出物のＩＧＦ−１含有画分と十分な量の第１疎水性相互作用クロ マトグラフィーマトリックス材料とを、上記溶出物からの上記ＩＧＦ−１約９５ ％から１００％を吸着するのに十分な条件下で接触させ、 （ｄ）樹脂の体積に比較して約１から約１０倍の体積の、十分に低い導電率を有 するバッファー系と上記マトリックスを最初に接触させることにより上記第１疎 水性相互作用クロマトグラフィーから吸着したＩＧＦ−１を溶出して、上記第１ 疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから顕著な量の完全なモノマー の正確にフォールドされた形態の吸着ＩＧＦ−１を脱離することなく上記マトリ ックスから異常なＩＧＦ−１ペプチドを脱離して、次に、マトリックスの体積に 比較して約１から約１０倍の体積の、上昇させたｐＨを有する緩衝系と上記マト リックスを接触させるが、その際、該緩衝系はｐＨ約４で開始しｐＨ約７で終了 するｐＨ上昇勾配であり、それにより、実質的にすべての残りの吸着された形態 のＩＧＦ−１を上記マトリックスから脱離し、（ｅ）主たる形態として完全なモ ノマーの正確にフォールドされたＩＧＦ−１を含む、工程（ｄ）により溶出され た画分を、十分な量の第２カチオン交換マトリックスと、ｐＨ約４．５の上記画 分のｐＨに調節するのに適切な溶液中で、上記溶出物からの全ＩＧＦ−１約９５ ％から１００％を吸着するのに十分な条件下で接触させ、 （ｆ）マトリックスの体積に比較して少なくとも等しい体積の緩衝系と上記マト リックスを接触させることにより上記第２カチオン交換マトリックスから吸着Ｉ ＧＦ−１を溶出するが、その際、上記緩衝系は、ｐＨ約５．５に緩衝化された０ ％のＮａＣｌで開始し、そして同じ緩衝液で緩衝化された０．３ＭのＮａＣｌで 終了する直線塩勾配であり、それにより、実質的にすべてのＩＧＦ−１ペプチド が上記マトリックスから別々に脱離し、そして溶出の前に、上記第２カチオン交 換マトリックスを洗浄するが、十分な量の緩衝化された塩を含まない溶液（ｐＨ 約４．５）に続き、十分な量の緩衝化された塩を含まない溶液（ｐＨ約５．５） に上記マトリックスを接触させることにより該洗浄を実施し、（ｇ）工程（１） の後に、適切な溶剤系中で、工程（ｆ）からの溶出物である完全なモノマーの正 確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を、十分な量のトヨパールＨＷ５０Ｆゲ ル濾過クロマトグラフィーマトリックスに接触させて、実質的にすべてのマルチ マーの形態のＩＧＦ−１から完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩ ＧＦ−１を分離し、そして（ｈ）十分な量の０．２Ｍ酢酸溶出液で上記ゲル濾過 クロマトグラフィーマトリックスを溶出して、上記マルチマー形態のＩＧＦ−１ から完全なモノマーの正確にフォールドされた形態のＩＧＦ−１を分離すること よりなる、モノマーで完全な正確にフォールドされたインスリン様成長因子−１ ペプチド（ＩＧＦ−１）を含む媒体からの該ペプチドの精製方法。