JP2562192B2 - 血清アルブミンの純化方法 - Google Patents
血清アルブミンの純化方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
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- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え技法により産生されたタンパク質、特
に血清アルブミンの純化方法に関する。
に血清アルブミンの純化方法に関する。
ヒト血清アルブミン（“HSA"）は血漿の主なタンパク
成分であって585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドから
成り、約66,000ダルトンの分子量を有する。その17個の
分子内ジスルフィド架橋はアルブミン分子の高度の安定
性に寄与している。
成分であって585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドから
成り、約66,000ダルトンの分子量を有する。その17個の
分子内ジスルフィド架橋はアルブミン分子の高度の安定
性に寄与している。
血漿中のアルブミンの主機能は血管内のコロイド滲透
圧の保持である。更に該タンパク質は数種の配位子（リ
ガンド）例えばビリルビン及び脂肪酸の担体として作用
する〔諸文献:F.Rothstein,V.M.Rosenoer and W.L.Hugh
es in Albumin Struct.Funct.Uses（1977）７−25;U.Kr
agh−Hansen,Pharmacol.Rev.（1981）33:17−53;T.Pete
rs Jr.,Adv.Prot.Chem.（1985）37:161−245）参照のこ
と〕。
圧の保持である。更に該タンパク質は数種の配位子（リ
ガンド）例えばビリルビン及び脂肪酸の担体として作用
する〔諸文献:F.Rothstein,V.M.Rosenoer and W.L.Hugh
es in Albumin Struct.Funct.Uses（1977）７−25;U.Kr
agh−Hansen,Pharmacol.Rev.（1981）33:17−53;T.Pete
rs Jr.,Adv.Prot.Chem.（1985）37:161−245）参照のこ
と〕。
純化血清アルブミンは、重度の低アルブミン血症の状
態の際に血液量減少性ショックの予防と治療とのために
必要であり、血液透析処置の場合及び心肺副行路処置の
場合の助けとして、及び新生児期の高ビルビン血症の治
療時の交換輸血と関連して必要である。
態の際に血液量減少性ショックの予防と治療とのために
必要であり、血液透析処置の場合及び心肺副行路処置の
場合の助けとして、及び新生児期の高ビルビン血症の治
療時の交換輸血と関連して必要である。
血漿又は胎盤からのHSAの大規模な純化のためにはリ
バノール（Rivanol ）法及び（又は）液体クロマトグ
ラフィ法と共に、エタノール、ポリエチレングリコー
ル、トリクロロ酢酸又は硫酸アンモニウムを用いる沈殿
法が屡々用いられる〔前者の方法については諸文献:J.S
aint−Blancard,J.M.Kirzin,P.Riberon,F.Petit,J.Four
cart,P.Girot and E.Boschetti,Anal.Chem.Symp.Ser.
（1982）9:305−312;J.M.Curling in Methods of Plasm
a Protein Fractionation（1980）77−91;M.J.Harvey i
n Methods of Plasma Protein Fractionation（1980）1
89−200;N.E.Schultze and J.F.Heremans,Mol.Biol.Hu
m.Prot.（1966）1:261−270;J.Liautau,J.Pla,A.Debru
s,P.Gattel,R.Plan and L.Peyron,13th Jnt.Congr.IABS
（1973）27:107−114,Hao,Y−L,Vox Sang（1985）49:1
−8;and U.S.Patent No.4228154を参照されたい〕。
バノール（Rivanol ）法及び（又は）液体クロマトグ
ラフィ法と共に、エタノール、ポリエチレングリコー
ル、トリクロロ酢酸又は硫酸アンモニウムを用いる沈殿
法が屡々用いられる〔前者の方法については諸文献:J.S
aint−Blancard,J.M.Kirzin,P.Riberon,F.Petit,J.Four
cart,P.Girot and E.Boschetti,Anal.Chem.Symp.Ser.
（1982）9:305−312;J.M.Curling in Methods of Plasm
a Protein Fractionation（1980）77−91;M.J.Harvey i
n Methods of Plasma Protein Fractionation（1980）1
89−200;N.E.Schultze and J.F.Heremans,Mol.Biol.Hu
m.Prot.（1966）1:261−270;J.Liautau,J.Pla,A.Debru
s,P.Gattel,R.Plan and L.Peyron,13th Jnt.Congr.IABS
（1973）27:107−114,Hao,Y−L,Vox Sang（1985）49:1
−8;and U.S.Patent No.4228154を参照されたい〕。
研究室規模の場合については血清アルブミンの純化の
ための親和クロマトグラフィの適用が文献〔T.Peters J
r.,H.Taniuchi and C.B.Anfinsen Jr.,J.Biol.Chem.（1
973）248（７）:2447−2451;A.Wichman and L−O.Ander
sson,Biochem.Biophys.Acta（1974）372:218−224;and
A.Aslam,D.J.Jones and T.R.Brown,Anal.Biochem.（197
6）75:329−335〕に記載されている。
ための親和クロマトグラフィの適用が文献〔T.Peters J
r.,H.Taniuchi and C.B.Anfinsen Jr.,J.Biol.Chem.（1
973）248（７）:2447−2451;A.Wichman and L−O.Ander
sson,Biochem.Biophys.Acta（1974）372:218−224;and
A.Aslam,D.J.Jones and T.R.Brown,Anal.Biochem.（197
6）75:329−335〕に記載されている。
血清アルブミンは治療用に大量を必要とするのに、血
清アルブミン（血漿）供給源は限られているのでHSAの
大量製造のための他の技法が模索されていた。組換え体
DNA技法によって作られた形質転換微生物又は細胞系統
を用いる発酵にもとづくHSA製造の成功が報ぜられた。
例えばEP−Ａ−0073646号参照のこと。
清アルブミン（血漿）供給源は限られているのでHSAの
大量製造のための他の技法が模索されていた。組換え体
DNA技法によって作られた形質転換微生物又は細胞系統
を用いる発酵にもとづくHSA製造の成功が報ぜられた。
例えばEP−Ａ−0073646号参照のこと。
けれども形質転換細胞群を用いる発酵によって産生さ
れた血清アルブミンの純化における主問題のひとつは生
育培地（発酵ブロス）又は細胞分解物からの夾雑成分の
存在であってこれらは純化された均質な血清アルブミン
の収得のために除去されねばならない。
れた血清アルブミンの純化における主問題のひとつは生
育培地（発酵ブロス）又は細胞分解物からの夾雑成分の
存在であってこれらは純化された均質な血清アルブミン
の収得のために除去されねばならない。
夾雑物は例えば外来タンパク質であってこれは免疫学
的応答を起すことが予期されよう。夾雑されたHSAの投
与はショックへ導く可能性をもつ。夾雑物は血漿又は胎
盤からの血清アルブミンの分画化の際に見出される夾雑
物とは全く異なる。このことは天然源由来のHSAのため
に開発された純化方法が組換え体由来の血清アルブミン
の純化に外挿（適用）され得ないことを意味する。形質
転換微生物又は細胞系統により産生されたヒト血清アル
ブミンの大規模純化の実用的方法は未だ刊行されず、未
だ使用されない。
的応答を起すことが予期されよう。夾雑されたHSAの投
与はショックへ導く可能性をもつ。夾雑物は血漿又は胎
盤からの血清アルブミンの分画化の際に見出される夾雑
物とは全く異なる。このことは天然源由来のHSAのため
に開発された純化方法が組換え体由来の血清アルブミン
の純化に外挿（適用）され得ないことを意味する。形質
転換微生物又は細胞系統により産生されたヒト血清アル
ブミンの大規模純化の実用的方法は未だ刊行されず、未
だ使用されない。
組換え技法により産生された血清アルブミンを第一工
程のアルカリ沈殿によって純化し、任意に酸性のpHにお
いてイオン交換クロマトグラフィにかけ、水相内での脱
着剤としてのリピドアニオン使用下の親油性表面固定相
を用いる親和クロマトグラフィによって純化する。かよ
うにして高度の回収及び純化が達成される。
程のアルカリ沈殿によって純化し、任意に酸性のpHにお
いてイオン交換クロマトグラフィにかけ、水相内での脱
着剤としてのリピドアニオン使用下の親油性表面固定相
を用いる親和クロマトグラフィによって純化する。かよ
うにして高度の回収及び純化が達成される。
本発明に従い、組換え技法により産生された血清アル
ブミン、特にヒト血清アルブミンは薬理学的製品として
の使用のために高純度において、高度回収性を以て純化
される。純化工程前に発酵液（ブロス）の濾過を行な
う。上澄液に対し、又は分解後の細胞群に対し、純化工
程を施す。工程は一般に夾雑物のアルカリによる沈殿化
を含み；任意に酸性アニオン交換樹脂を用いて処理し、
任意に透析して培地を濃厚化し、続いて親油性固定相の
使用及び溶出液中の脱着剤としての親油性アニオンの使
用下に親和クロマトグラフィを施すことを含む。次いで
血清アルブミンを塩析と濃厚化とによって収穫する。所
望により血清アルブミンを凍結乾燥して乾燥製品を提供
する。
ブミン、特にヒト血清アルブミンは薬理学的製品として
の使用のために高純度において、高度回収性を以て純化
される。純化工程前に発酵液（ブロス）の濾過を行な
う。上澄液に対し、又は分解後の細胞群に対し、純化工
程を施す。工程は一般に夾雑物のアルカリによる沈殿化
を含み；任意に酸性アニオン交換樹脂を用いて処理し、
任意に透析して培地を濃厚化し、続いて親油性固定相の
使用及び溶出液中の脱着剤としての親油性アニオンの使
用下に親和クロマトグラフィを施すことを含む。次いで
血清アルブミンを塩析と濃厚化とによって収穫する。所
望により血清アルブミンを凍結乾燥して乾燥製品を提供
する。
上記方法により製造された血清アルブミンをイオン交
換クロマトグラフィ、粒径除外（Size exclusion）クロ
マトグラフィ、SDS−PAGE及びウサギに対する免疫操作
を含む免疫学的試験により測定したところ、これは実質
的に均質で単量体（モノメリック）である。
換クロマトグラフィ、粒径除外（Size exclusion）クロ
マトグラフィ、SDS−PAGE及びウサギに対する免疫操作
を含む免疫学的試験により測定したところ、これは実質
的に均質で単量体（モノメリック）である。
本方法は、微生物使用下の組換え技法により調製され
た血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの製造にそ
の用途を見出すものである。微生物は原核性又は真核性
であってよく、特に真核性であってよく、細菌類例えば
大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、B.リヘニホ
ルミス（B.licheniformis）、ストレプトミセス（Strep
tomyces）、プソイドモナス（Pseudomonas）等を含む。
真核菌には酵母、例えばサッカロミセス（Saccharsmyce
s）、シゾサッカロミセス（Schizo saccharomyces）、
クルイベロミセス（Kluyveromyces）、カンジダ（Candi
da）等、糸状菌（filamentous fungi）、ノイロスポラ
（Neurospora）、アスペルギルス（Aspergillus）等が
含まれる。
た血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの製造にそ
の用途を見出すものである。微生物は原核性又は真核性
であってよく、特に真核性であってよく、細菌類例えば
大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、B.リヘニホ
ルミス（B.licheniformis）、ストレプトミセス（Strep
tomyces）、プソイドモナス（Pseudomonas）等を含む。
真核菌には酵母、例えばサッカロミセス（Saccharsmyce
s）、シゾサッカロミセス（Schizo saccharomyces）、
クルイベロミセス（Kluyveromyces）、カンジダ（Candi
da）等、糸状菌（filamentous fungi）、ノイロスポラ
（Neurospora）、アスペルギルス（Aspergillus）等が
含まれる。
血清アルブミンの発現は微生物体に産生物の分泌又は
保持をもたら。ブロスを発酵器から回分式又は連続式で
取出す。分泌の場合には純化工程で細胞不含有の上澄液
を用いる。細胞不含上澄液は、発酵液の清澄化により、
便宜には遠心分離法又は限外濾過法を用いるブロスの濾
過によるタンパク質の濃厚化により得られる。濾過器は
一般に500〜25000D、更に通常の場合に少なくとも約100
0Dの部分の切捨て装置（cut−off）を有する。望ましく
は最終的濃厚化量生物は少なくとも0.5mg/ml、好ましく
は少なくとも約1mg/mlであるべきである。産生物が細胞
の細胞質内に保持されている場合には細胞群を収穫す
る。細胞分解物は便宜な技法、細胞群の機械的又は化学
的分解操作を用いる技法、に従って産生され得る。細胞
砕片を遠心分離によって除去し得る。
保持をもたら。ブロスを発酵器から回分式又は連続式で
取出す。分泌の場合には純化工程で細胞不含有の上澄液
を用いる。細胞不含上澄液は、発酵液の清澄化により、
便宜には遠心分離法又は限外濾過法を用いるブロスの濾
過によるタンパク質の濃厚化により得られる。濾過器は
一般に500〜25000D、更に通常の場合に少なくとも約100
0Dの部分の切捨て装置（cut−off）を有する。望ましく
は最終的濃厚化量生物は少なくとも0.5mg/ml、好ましく
は少なくとも約1mg/mlであるべきである。産生物が細胞
の細胞質内に保持されている場合には細胞群を収穫す
る。細胞分解物は便宜な技法、細胞群の機械的又は化学
的分解操作を用いる技法、に従って産生され得る。細胞
砕片を遠心分離によって除去し得る。
細胞不含上澄液又は細胞分解物のpHを約7.5〜９、更
に好ましくは８〜8.5に調節する。pHは便宜な手段、例
えば水酸化ナトリウム、又は他の適宜な塩基、通常は0.
1乃至それ以上の範囲の規定液の添加により修正され
る。混合物を適宜に短時間だけ、一般には約５〜30分間
撹拌してから約25μ、好ましくは約20μ以上、更に好ま
しくは約５μ以上の粒子群を実質的に保持する濾過器へ
通して濾過する。沈殿物を、適当な緩衝溶液、通常はpH
8以下に緩衝されていて一般には緩衝剤濃度約20〜100mM
を有する希釈液を用いて洗浄する。望ましくは緩衝液の
pHは約6.5〜８の範囲内にある。洗浄用液の容積は臨界
的でなく濾液容積にもとづき一般に約0.1〜0.5である。
緩衝液の導電率は一般に約0.1〜100mS/cm、好ましくは
約１〜50mS/cmである。かように操作した後に濾液と溶
液とを合併する。
に好ましくは８〜8.5に調節する。pHは便宜な手段、例
えば水酸化ナトリウム、又は他の適宜な塩基、通常は0.
1乃至それ以上の範囲の規定液の添加により修正され
る。混合物を適宜に短時間だけ、一般には約５〜30分間
撹拌してから約25μ、好ましくは約20μ以上、更に好ま
しくは約５μ以上の粒子群を実質的に保持する濾過器へ
通して濾過する。沈殿物を、適当な緩衝溶液、通常はpH
8以下に緩衝されていて一般には緩衝剤濃度約20〜100mM
を有する希釈液を用いて洗浄する。望ましくは緩衝液の
pHは約6.5〜８の範囲内にある。洗浄用液の容積は臨界
的でなく濾液容積にもとづき一般に約0.1〜0.5である。
緩衝液の導電率は一般に約0.1〜100mS/cm、好ましくは
約１〜50mS/cmである。かように操作した後に濾液と溶
液とを合併する。
必須の次工程は親和クロマトグラフィの工程であって
これには親油性固定相を使用する。親和クロマトグラフ
ィの工程において血清アルブミン含有溶液を固相、即ち
通常はコラム中の粒子群、と接触させるが該粒子群は、
“炭素原子数約６〜12、好ましくは約６〜10、更に好ま
しくは８を有する親油性炭素鎖であって支持体への共有
結合のために官能基へ結合するアルキル基を通常の場合
に有している該鎖”によって被覆されるか又は官能性化
されている。該化合物の例はオクタノエート、オクチル
サクシネート等であってこれらの化合物においてはエー
テル、アミド又はその他の安定な官能性を有するものを
介して親油基が支持体に結合している。溶出剤の中には
親油性化合物、即ち便利なものとしてはカルボキシレー
ト、エステル、及び類似物が含まれ、これらは約50〜25
0、更に普通には75〜150mMの濃度で水性媒体に可溶性で
ある。この技法の詳細については上掲文献〔Wichman an
d Anderson（1974）〕を参照されたい。
これには親油性固定相を使用する。親和クロマトグラフ
ィの工程において血清アルブミン含有溶液を固相、即ち
通常はコラム中の粒子群、と接触させるが該粒子群は、
“炭素原子数約６〜12、好ましくは約６〜10、更に好ま
しくは８を有する親油性炭素鎖であって支持体への共有
結合のために官能基へ結合するアルキル基を通常の場合
に有している該鎖”によって被覆されるか又は官能性化
されている。該化合物の例はオクタノエート、オクチル
サクシネート等であってこれらの化合物においてはエー
テル、アミド又はその他の安定な官能性を有するものを
介して親油基が支持体に結合している。溶出剤の中には
親油性化合物、即ち便利なものとしてはカルボキシレー
ト、エステル、及び類似物が含まれ、これらは約50〜25
0、更に普通には75〜150mMの濃度で水性媒体に可溶性で
ある。この技法の詳細については上掲文献〔Wichman an
d Anderson（1974）〕を参照されたい。
親和クロマトグラフィの遂行において培地はおよそ生
理学的pH、通常は約6.5〜８、更に普通には約７〜7.5の
pH値を有する。緩衝液濃度は約50〜150mMであることが
一般である。
理学的pH、通常は約6.5〜８、更に普通には約７〜7.5の
pH値を有する。緩衝液濃度は約50〜150mMであることが
一般である。
望ましくは親和吸着剤上へ血清アルブミン含有培地を
負荷させるに当り、約0.5〜1.5Mの塩（NaCl）を添加さ
れた平衡化緩衝液を用いてコラムを洗浄する。
負荷させるに当り、約0.5〜1.5Mの塩（NaCl）を添加さ
れた平衡化緩衝液を用いてコラムを洗浄する。
望ましくは親和クロマトグラフィ操作の前又は後に、
イオン交換をも使用して血清アルブミンの純化を更に増
進させる。前者の場合には緩衝化溶液、即ち通常はpH7
以下で、一般に希釈されて緩衝剤濃度約20〜100mMを有
する該溶液を用いて沈殿物を洗浄する。望ましくは緩衝
液のpHは約４〜5.5の範囲内にある。洗液の容積は臨界
的でなく、濾液容積にもとづき約0.1〜0.5であることが
一般である。緩衝液の導電率は約0.1〜100mS/cm、好ま
しくは約１〜50mS/cmであることが一般である。濾液と
洗液とを合併した後に溶液のpHを約3.5〜６、好ましく
は４〜5.5に下げる。後者の場合には親和クロマトグラ
フィ操作後の溶出液のpHを約3.5〜６、好ましくは４〜
5.5に下げる。
イオン交換をも使用して血清アルブミンの純化を更に増
進させる。前者の場合には緩衝化溶液、即ち通常はpH7
以下で、一般に希釈されて緩衝剤濃度約20〜100mMを有
する該溶液を用いて沈殿物を洗浄する。望ましくは緩衝
液のpHは約４〜5.5の範囲内にある。洗液の容積は臨界
的でなく、濾液容積にもとづき約0.1〜0.5であることが
一般である。緩衝液の導電率は約0.1〜100mS/cm、好ま
しくは約１〜50mS/cmであることが一般である。濾液と
洗液とを合併した後に溶液のpHを約3.5〜６、好ましく
は４〜5.5に下げる。後者の場合には親和クロマトグラ
フィ操作後の溶出液のpHを約3.5〜６、好ましくは４〜
5.5に下げる。
イオン交換工程の目的は核酸、夾雑タンパク質及び色
素類の除去にある。血清アルブミン含有培地は、回分式
又は連続式でのコラム通過時にイオン交換樹脂と結合
し、該接触は約５〜60分間、好適には10〜30分間保たれ
ることが常である。アニオン交換吸着剤例えばQAE又はD
EAE（いずれも後文参照）を使用し、これらは商業上入
手可能な担体に結合している。血清アルブミン含有培地
は酸性培地として使用されるが該培地は一般にはpH3.5
〜６、更に普通には約４〜5.5を有するものであり、該p
Hは各種の酸又は緩衝剤の添加により容易に達成され
る。緩衝剤濃度は一般に約25〜100mMの範囲内にある。
イオン交換樹脂対タンパク質の重量比は一般に少なくと
も約1:1であって約30:1を越えてはならず、好ましくは
約５〜15:1、更に好ましくは約10:1である。使用前にア
ニオン交換樹脂を、“血清アルブミン含有培地に使用さ
れる低度pHの緩衝液”を用いて平衡化させることが一般
である。
素類の除去にある。血清アルブミン含有培地は、回分式
又は連続式でのコラム通過時にイオン交換樹脂と結合
し、該接触は約５〜60分間、好適には10〜30分間保たれ
ることが常である。アニオン交換吸着剤例えばQAE又はD
EAE（いずれも後文参照）を使用し、これらは商業上入
手可能な担体に結合している。血清アルブミン含有培地
は酸性培地として使用されるが該培地は一般にはpH3.5
〜６、更に普通には約４〜5.5を有するものであり、該p
Hは各種の酸又は緩衝剤の添加により容易に達成され
る。緩衝剤濃度は一般に約25〜100mMの範囲内にある。
イオン交換樹脂対タンパク質の重量比は一般に少なくと
も約1:1であって約30:1を越えてはならず、好ましくは
約５〜15:1、更に好ましくは約10:1である。使用前にア
ニオン交換樹脂を、“血清アルブミン含有培地に使用さ
れる低度pHの緩衝液”を用いて平衡化させることが一般
である。
次に血清アルブミン含有培地を樹脂から便宜の手段、
例えば５分間、2000×ｇの遠心分離、によって単離し、
続いて低度pHの緩衝液を用いてイオン交換樹脂を洗浄す
るがこの場合にイオン交換樹脂容積に対する低度pHの緩
衝液の容積は一般に約１〜20倍、通常は２〜10倍であ
る。１回又は複数回、通常は２回の洗浄を行なう。液状
培地を合併するとpHは通常の場合に上昇しておよそ中
性、一般には約6.5〜８、更に普通には約７〜８とな
る。およそ中性となった該培地について次いで例えば、
pH約６〜10、好ましくは約６〜８を有すると共に導電率
約0.5〜100mS/cm、好ましくは約0.5〜20mS/cmを有する
リン酸塩緩衝液に対する透析を行なう。いかなる場合に
も緩衝液は、親和クロマトグラフィコラムに対して使用
されたものと同じである。該培地を濃厚化すると通常は
濃度約１〜20mgタンパク質/ml、更に通常の場合に約２
〜15mg/mlを与える。
例えば５分間、2000×ｇの遠心分離、によって単離し、
続いて低度pHの緩衝液を用いてイオン交換樹脂を洗浄す
るがこの場合にイオン交換樹脂容積に対する低度pHの緩
衝液の容積は一般に約１〜20倍、通常は２〜10倍であ
る。１回又は複数回、通常は２回の洗浄を行なう。液状
培地を合併するとpHは通常の場合に上昇しておよそ中
性、一般には約6.5〜８、更に普通には約７〜８とな
る。およそ中性となった該培地について次いで例えば、
pH約６〜10、好ましくは約６〜８を有すると共に導電率
約0.5〜100mS/cm、好ましくは約0.5〜20mS/cmを有する
リン酸塩緩衝液に対する透析を行なう。いかなる場合に
も緩衝液は、親和クロマトグラフィコラムに対して使用
されたものと同じである。該培地を濃厚化すると通常は
濃度約１〜20mgタンパク質/ml、更に通常の場合に約２
〜15mg/mlを与える。
固状担体又は支持体として広範囲にわたる支持体又は
吸着剤を使用し得る。かような固状担体には無機担体例
えばガラス及びシリカゲル、有機担体、合成又は天然源
担体例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ポ
リアミド、ポリアクリルアミド、二官能性アクリレート
のビニルコポリマー及び各種のヒドロキシル化モノマー
及び類似物が含まれる。商業上入手可能な担体は商標名
セファデクス（Sephadex ）、トリサクリル（Trisacry
l ）、ウルトロゲル（Ultrogel ）、ダイノスフィア
（Dynospheres ）、マクロソルブ（Macrosorb ）、XA
D樹脂類及びその他として販売されている。
吸着剤を使用し得る。かような固状担体には無機担体例
えばガラス及びシリカゲル、有機担体、合成又は天然源
担体例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ポ
リアミド、ポリアクリルアミド、二官能性アクリレート
のビニルコポリマー及び各種のヒドロキシル化モノマー
及び類似物が含まれる。商業上入手可能な担体は商標名
セファデクス（Sephadex ）、トリサクリル（Trisacry
l ）、ウルトロゲル（Ultrogel ）、ダイノスフィア
（Dynospheres ）、マクロソルブ（Macrosorb ）、XA
D樹脂類及びその他として販売されている。
上記の各工程における条件は非変性化条件、即ち一般
には約−10℃〜＋30℃の便宜の温度範囲、更に普通には
およそ周辺温度である。クロマトグラフィ工程は便宜に
回分式又は連続式で遂行され得る。分別についてはいか
なる便宜方法例えば遠心分離、濾過、デカンテーション
又は類似法も使用され得る。
には約−10℃〜＋30℃の便宜の温度範囲、更に普通には
およそ周辺温度である。クロマトグラフィ工程は便宜に
回分式又は連続式で遂行され得る。分別についてはいか
なる便宜方法例えば遠心分離、濾過、デカンテーション
又は類似法も使用され得る。
本発明方法の具体化は下記の諸工程即ち： 血清アルブミンをコードする構造遺伝子を有する発現
性構成体の使用による形質転換の結果その中に血清アル
ブミンを発現している酵母細胞群を普通培地中で生育さ
せ； 産生物含有培地を清澄化発酵液又は細胞分解物として
単離し； 産生物含有培地をpH約7.5〜９のアルカリ性としてか
らこのアルカリ性培地を沈殿物から分別し； 該アルカリ性培地のpH値を約4.0〜5.5に酸性化させて
からこの酸性化培地をアニオン交換吸着剤と共に恒温保
持し； 該酸性化培地のpH値を生理学的pHの近似値へ変更させ
て濃厚化血清アルブミンを生成させ、この濃厚化培地を
親油性固定相の使用下にクロマトグラフィによって処理
し、脱着剤としての水溶性リピドアニオンの添加により
アルブミンを溶出させ； そして 微生物由来の夾雑物を実質的に含有しない純化された
血清アルブミンを単離する諸工程を含む。
性構成体の使用による形質転換の結果その中に血清アル
ブミンを発現している酵母細胞群を普通培地中で生育さ
せ； 産生物含有培地を清澄化発酵液又は細胞分解物として
単離し； 産生物含有培地をpH約7.5〜９のアルカリ性としてか
らこのアルカリ性培地を沈殿物から分別し； 該アルカリ性培地のpH値を約4.0〜5.5に酸性化させて
からこの酸性化培地をアニオン交換吸着剤と共に恒温保
持し； 該酸性化培地のpH値を生理学的pHの近似値へ変更させ
て濃厚化血清アルブミンを生成させ、この濃厚化培地を
親油性固定相の使用下にクロマトグラフィによって処理
し、脱着剤としての水溶性リピドアニオンの添加により
アルブミンを溶出させ； そして 微生物由来の夾雑物を実質的に含有しない純化された
血清アルブミンを単離する諸工程を含む。
下記の諸例は例示のためのみであって本発明を限定す
るためではない。
るためではない。
例 １ 清澄化発酵ブロスからのHSAの純化 イーストエキス0.5％（w/v）、コーンスチープ固形物
２％（w/v）、グルコース0.7％（w/v）及び無機塩を含
む培地中でクルイベロミセスラクチス（K.laactis）菌
株CBS2360を70時間、30℃で生育させた。発酵中にグル
コースを供給した。発酵ブロスを遠心処理（4000rpm,5
分間）してから上澄液を濾過器（Seitz K500）によって
濾過した。1000Dの切捨て装置を有する濾過器を用いる
限外濾過法によって最終溶液を６倍に濃厚化した。最終
のタンパク質（アルブミン）濃度は1mg/mlであった。
２％（w/v）、グルコース0.7％（w/v）及び無機塩を含
む培地中でクルイベロミセスラクチス（K.laactis）菌
株CBS2360を70時間、30℃で生育させた。発酵中にグル
コースを供給した。発酵ブロスを遠心処理（4000rpm,5
分間）してから上澄液を濾過器（Seitz K500）によって
濾過した。1000Dの切捨て装置を有する濾過器を用いる
限外濾過法によって最終溶液を６倍に濃厚化した。最終
のタンパク質（アルブミン）濃度は1mg/mlであった。
アルカリ添加沈殿生成：上記の清澄化濃厚化発酵ブロス
に対して純化HSAの脱脂物（Cohn Fraction V）を添加し
てHSAの含有率がタンパク質含有量（10mg/ml）の90％
（w/w）となるようにした。HSA含有溶液のpHは8.1にま
で増加した。これを15分間攪拌してから20μｍ濾過器に
よって濾過した。フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウ
ム（pH4.5）で２回洗浄し、続いて合併した濾液のpHを
4.5に調節した。
に対して純化HSAの脱脂物（Cohn Fraction V）を添加し
てHSAの含有率がタンパク質含有量（10mg/ml）の90％
（w/w）となるようにした。HSA含有溶液のpHは8.1にま
で増加した。これを15分間攪拌してから20μｍ濾過器に
よって濾過した。フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウ
ム（pH4.5）で２回洗浄し、続いて合併した濾液のpHを
4.5に調節した。
QAE−セファデクス使用のクロマトグラフィ：前記工程
で得られたHSA溶液をQAE−セファデスクＡ−50 と共に
回分式で30分間恒温保持した。該QAE−セファデクスは5
0mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）を用いて平衡化され
たものであり、タンパク質：吸着剤（乾物重量）の比
（w/w）は1:10である、恒温保持後にゲルサスペンショ
ンを遠心処理によって除去し、続いて50mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.5）を用いて２回洗浄した。上澄液を集
めて合併してからこの溶液のpHを7.4に調節し、次に透
析及び濃厚化によりタンパク質濃度10mg/mlとした。
で得られたHSA溶液をQAE−セファデスクＡ−50 と共に
回分式で30分間恒温保持した。該QAE−セファデクスは5
0mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）を用いて平衡化され
たものであり、タンパク質：吸着剤（乾物重量）の比
（w/w）は1:10である、恒温保持後にゲルサスペンショ
ンを遠心処理によって除去し、続いて50mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.5）を用いて２回洗浄した。上澄液を集
めて合併してからこの溶液のpHを7.4に調節し、次に透
析及び濃厚化によりタンパク質濃度10mg/mlとした。
親和クロマトグラフィ：上記工程で得られたHSA溶液
を、文献〔A.Wichman and L−O.Andersson（1974）上掲
書〕記載に従って1,4−ジアミノ−ブタンセファロース4
Bとカプリングさせたオクチルサクシネート無水物に接
触させた。該親和吸着剤を100mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.4）の使用で平衡化させた。HSA−含有溶液を親
和吸着剤上へ負荷してから“1M NaClが添加された平衡
化用緩衝液”でそれを洗浄した後に“100mMオクタン酸
ナトリウムが添加された100mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）”を用いてHSAを溶出させた。純化HSAを塩析
してタンパク質濃度を10mg/mlにまで濃厚化した。
を、文献〔A.Wichman and L−O.Andersson（1974）上掲
書〕記載に従って1,4−ジアミノ−ブタンセファロース4
Bとカプリングさせたオクチルサクシネート無水物に接
触させた。該親和吸着剤を100mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.4）の使用で平衡化させた。HSA−含有溶液を親
和吸着剤上へ負荷してから“1M NaClが添加された平衡
化用緩衝液”でそれを洗浄した後に“100mMオクタン酸
ナトリウムが添加された100mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）”を用いてHSAを溶出させた。純化HSAを塩析
してタンパク質濃度を10mg/mlにまで濃厚化した。
本例記載の操作に従うとHSA回収率は75％であり、SDS
−PAGE（第１図）、IEF（第２図）、HPIEC（第３図）及
びHPSEC（第４図）に示される通り夾雑物は含まれてい
ない。これらの成績はHSA収得製品の高純度を証明する
ものである。
−PAGE（第１図）、IEF（第２図）、HPIEC（第３図）及
びHPSEC（第４図）に示される通り夾雑物は含まれてい
ない。これらの成績はHSA収得製品の高純度を証明する
ものである。
更に純化血清アルブミンの特性化を免疫学的方法によ
っても又遂行した：即ちウサギを純化HSAによって免疫
処置し、二重拡散法〔.Ouchterlony Acta Path.Micro
biol.Scand.（1948）28:186−191〕に従って、脱脂され
たHSA又は発酵ブロスからのK.ラクチスのタンパク質に
対する抗体応答に関して抗血清をスクリーニングした。
この技法の使用によるとHSAに対する抗体のみが検出さ
れた。
っても又遂行した：即ちウサギを純化HSAによって免疫
処置し、二重拡散法〔.Ouchterlony Acta Path.Micro
biol.Scand.（1948）28:186−191〕に従って、脱脂され
たHSA又は発酵ブロスからのK.ラクチスのタンパク質に
対する抗体応答に関して抗血清をスクリーニングした。
この技法の使用によるとHSAに対する抗体のみが検出さ
れた。
例 ２ イオン交換クロマトグラフィ不使用下の清澄化発酵ブロ
スからのHSAの純化 イオン交換工程不使用の下で例１の操作を繰返した。
本例でのHSA回収率（90％）は例１での該回収率よりも
高かった。けれどもアルブミン対タンパク質（w/w）の
比は１であったし、純化血清アルブミンのHPIECクロマ
トグラム（第５図）はHSAピークの前部における小さい
ピークの存在を示した。のみならず脱脂HSA及び例１で
得られたHSAとは対照的に、最終製品は微黄色を呈し、
これは発酵ブロスから由来する色素の存在を示す。
スからのHSAの純化 イオン交換工程不使用の下で例１の操作を繰返した。
本例でのHSA回収率（90％）は例１での該回収率よりも
高かった。けれどもアルブミン対タンパク質（w/w）の
比は１であったし、純化血清アルブミンのHPIECクロマ
トグラム（第５図）はHSAピークの前部における小さい
ピークの存在を示した。のみならず脱脂HSA及び例１で
得られたHSAとは対照的に、最終製品は微黄色を呈し、
これは発酵ブロスから由来する色素の存在を示す。
例 ３ 清澄化細胞分解物からのHSAの純化 クルイベロミセス ラクチス（CBS2360;例１記載のよ
うにして培養されたもの）の細胞ペーストを水を用いて
1:1に希釈し、擂潰器（Dynomill apparatus）中でガラ
ス球によって分裂させた。分解細胞群を遠心分離器（So
rvall centrifuge,SA600）中で15000rpmに20分間遠心処
理し、上澄液を次工程で使用した。
うにして培養されたもの）の細胞ペーストを水を用いて
1:1に希釈し、擂潰器（Dynomill apparatus）中でガラ
ス球によって分裂させた。分解細胞群を遠心分離器（So
rvall centrifuge,SA600）中で15000rpmに20分間遠心処
理し、上澄液を次工程で使用した。
アルカリによる沈殿化：清澄化細胞分解物に対して脱脂
純化HSA（Cohn Fraction V）を添加し、かようにして全
タンパク質含有量:10mg/mlの５％（w/w）をHSA含有量に
相当させた。HSA−含有溶液のpHは8.1に上昇した。これ
を15分間撹拌してから20μｍ及び５μｍ濾過器へ通して
濾過した。フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH4.5）で２回洗浄し、続いて合併した濾液のpHを
4.5に調節した。
純化HSA（Cohn Fraction V）を添加し、かようにして全
タンパク質含有量:10mg/mlの５％（w/w）をHSA含有量に
相当させた。HSA−含有溶液のpHは8.1に上昇した。これ
を15分間撹拌してから20μｍ及び５μｍ濾過器へ通して
濾過した。フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH4.5）で２回洗浄し、続いて合併した濾液のpHを
4.5に調節した。
QAE−セファデクス クロマトグラフィ：上記工程で得
られたHSA溶液を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）
で平衡化され、0.25M NaClを含有しているQAE−セファ
デクスＡ−50 〔吸着剤：タンパク質の比（w/w）＝10:
1〕と共に回分式で恒温保持した。恒温保持後にゲルサ
スペンションを遠心処理によって除去し、平衡化緩衝液
の使用下に吸着剤を２回洗浄した。
られたHSA溶液を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）
で平衡化され、0.25M NaClを含有しているQAE−セファ
デクスＡ−50 〔吸着剤：タンパク質の比（w/w）＝10:
1〕と共に回分式で恒温保持した。恒温保持後にゲルサ
スペンションを遠心処理によって除去し、平衡化緩衝液
の使用下に吸着剤を２回洗浄した。
集められた上澄液を合併し、この溶液のpHを7.4に調
節してからHSA−含有溶液を透析し、タンパク質濃度を1
0mg/mlにまで濃厚化した。HSAを含有する不純溶液を更
に処理するために例１記載のようにして親和クロマトグ
ラフィを行なった。HSA回収率は50％であり、最終製品
の純度はこれをアルブミンmg/タンパク質mgとして特性
化すると0.85であった。
節してからHSA−含有溶液を透析し、タンパク質濃度を1
0mg/mlにまで濃厚化した。HSAを含有する不純溶液を更
に処理するために例１記載のようにして親和クロマトグ
ラフィを行なった。HSA回収率は50％であり、最終製品
の純度はこれをアルブミンmg/タンパク質mgとして特性
化すると0.85であった。
例 ４ 清澄化発酵ブロスからの組換え体由来のHSAの純化 未刊行のEP−Ａ−88201632・２（1988年７月28日出
願）明細書中の例10記載の通りのHSA発現性遺伝子を有
するプラスミドを用いて形質転換させたクルイベロミセ
スラクチス菌CBS2360を本明細書例１記載の培地中で30
℃に110時間生育させた。発酵過程でグルコースを供給
した。発酵ブロスを遠心処理（4000rpm,5分間）してか
ら上澄液を、1000D部分の切捨て装置を具える濾過器を
用いる現外濾過法によって20倍に濃厚化した。最終のタ
ンパク質濃度は10mg/mlであってそのうちの0.45mg/mlは
組換え技法により産生された単量体の（モノメリック
な）HSAから成っていた。
願）明細書中の例10記載の通りのHSA発現性遺伝子を有
するプラスミドを用いて形質転換させたクルイベロミセ
スラクチス菌CBS2360を本明細書例１記載の培地中で30
℃に110時間生育させた。発酵過程でグルコースを供給
した。発酵ブロスを遠心処理（4000rpm,5分間）してか
ら上澄液を、1000D部分の切捨て装置を具える濾過器を
用いる現外濾過法によって20倍に濃厚化した。最終のタ
ンパク質濃度は10mg/mlであってそのうちの0.45mg/mlは
組換え技法により産生された単量体の（モノメリック
な）HSAから成っていた。
組換え体由来HSA−含有溶液のpHを8.1に上昇させた。
この溶液を15分間撹拌してから20μｍ濾過器へ通した。
フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウム（pH4.5）で２
回洗ってから合併した濾液のpHを4.5に調節した。組換
え体由来HSAを更に純化するためにQAE−セファデクスク
ロマトグラフィ及び親和クロマトグラフィを例１記載の
ようにして遂行した。
この溶液を15分間撹拌してから20μｍ濾過器へ通した。
フィルターケーキを50mM酢酸ナトリウム（pH4.5）で２
回洗ってから合併した濾液のpHを4.5に調節した。組換
え体由来HSAを更に純化するためにQAE−セファデクスク
ロマトグラフィ及び親和クロマトグラフィを例１記載の
ようにして遂行した。
本例記載の操作によると純化されたモノメリックな組
換え体由来アルブミンは微黄色を呈していてその回収率
は70％であった。SDS−PAGE（第６図）、IEF（第７
図）、HPSEC（第8A図及びHPIEC（第8B図）によって上記
アルブミン中の僅少な夾雑物（全部で＜８％）の存在が
示されている。
換え体由来アルブミンは微黄色を呈していてその回収率
は70％であった。SDS−PAGE（第６図）、IEF（第７
図）、HPSEC（第8A図及びHPIEC（第8B図）によって上記
アルブミン中の僅少な夾雑物（全部で＜８％）の存在が
示されている。
前記諸成績から本発明は組換え技法を用いた迅速で効
率良好な血清アルブミン純化を達成する。即ち本発明は
血清アルブミン及び類似タンパク質精製のための迅速で
有効な方法を提供すると共に発現用宿主として使用され
た微生物から由来する夾雑物を実質上含有しない製品を
提供する。かようにして製薬学的に有用で、大量生産に
効果を奏し、高度の回収率を達成する製品を与えること
が可能である。
率良好な血清アルブミン純化を達成する。即ち本発明は
血清アルブミン及び類似タンパク質精製のための迅速で
有効な方法を提供すると共に発現用宿主として使用され
た微生物から由来する夾雑物を実質上含有しない製品を
提供する。かようにして製薬学的に有用で、大量生産に
効果を奏し、高度の回収率を達成する製品を与えること
が可能である。
本明細書中に言及されたすべての刊行物及び特許出願
明細書は本発明が関係する技術分野の熟練技術者の技術
レベルを示すものである。該すべての刊行物及び特許出
願明細書は特別に個々に参考として示されている。
明細書は本発明が関係する技術分野の熟練技術者の技術
レベルを示すものである。該すべての刊行物及び特許出
願明細書は特別に個々に参考として示されている。
本明細書中の諸例の記載は本発明の解明と理解とに資
することを目的としており、本発明の範囲内で或種の変
更及び修正が施され得ることは自明であろう。
することを目的としており、本発明の範囲内で或種の変
更及び修正が施され得ることは自明であろう。
添付図面の第１図は還元条件下のヒト血清アルブミンの
SDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）（銀染色）の結果を示す。脱脂HSA:
泳路１（100ng）;5（500ng）;9（10μｇ）。純化HSA:泳
路2,3（100ng）;6,7（500ng）;10,11（10μｇ）。分子
量マーカー：泳路4,8。 第２図はヒト血清アルブミンの等電点分画電気泳動（CB
B Ｒ−250染色）の結果を示す。I:泳路1,2,3による試
料の適用個所。II:泳路4,5,6における試料の適用個所。
III:泳路7,8,9における試料の適用個所。脱脂HSA（10μ
ｇ）：泳路1,4,7。純化HSA（10μｇ）：その他の泳路。 第３図はMono Q 上のヒト血清アルブミンの高性能イオ
ン交換クロマトグラフィの結果を示す。上方のクロマト
グラム：純化HSA;下方のクロマトグラム：脱脂HSA。 第４図はBio−Sil TSK−250 上のヒト血清アルブミン
の高性能粒径除外クロマトグラフィの結果を示す。タン
パク質試薬を用いるタンパク質検出（Post−column der
ivatizationによる）。上方のクロマトグラム：脱脂HS
A;下方のクロマトグラム：純化HSA。 第５図はアルカリ沈殿法及び親和クロマトグラフィによ
る純化されたヒト血清アルブミンのMono Q 上の高性能
イオン交換クロマトグラフィの結果を示す。 第６図は還元条件下のヒト血清アルブミンのSDS−PAGE
（CBB Ｒ−250染色）の結果を示す。脱脂HSA:泳路２
（50μｇ）及び３（100μｇ）。純化組換え体由来HSA:
泳路４（35μｇ）及び５（70μｇ）。分子量マーカー：
泳路１及び６（20μｇ）。 第７図はヒト血清アルブミンの等電集束法（銀染色）に
よる結果を示す。マーカー：泳路１及び６。脱脂HSA:泳
路２（0.25μｇ）及び３（0.50μｇ）。純化組換え体由
来アルブミン：泳路４（0.50μｇ）及び５（0.25μ
ｇ）。 第８図は組換え体由来HSAの高性能液体クロマトグラフ
ィの結果を示す。 A:Bio−Sil TSK250 上のHPSEC,B:Mono Q 上のHPIE
C。
SDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）（銀染色）の結果を示す。脱脂HSA:
泳路１（100ng）;5（500ng）;9（10μｇ）。純化HSA:泳
路2,3（100ng）;6,7（500ng）;10,11（10μｇ）。分子
量マーカー：泳路4,8。 第２図はヒト血清アルブミンの等電点分画電気泳動（CB
B Ｒ−250染色）の結果を示す。I:泳路1,2,3による試
料の適用個所。II:泳路4,5,6における試料の適用個所。
III:泳路7,8,9における試料の適用個所。脱脂HSA（10μ
ｇ）：泳路1,4,7。純化HSA（10μｇ）：その他の泳路。 第３図はMono Q 上のヒト血清アルブミンの高性能イオ
ン交換クロマトグラフィの結果を示す。上方のクロマト
グラム：純化HSA;下方のクロマトグラム：脱脂HSA。 第４図はBio−Sil TSK−250 上のヒト血清アルブミン
の高性能粒径除外クロマトグラフィの結果を示す。タン
パク質試薬を用いるタンパク質検出（Post−column der
ivatizationによる）。上方のクロマトグラム：脱脂HS
A;下方のクロマトグラム：純化HSA。 第５図はアルカリ沈殿法及び親和クロマトグラフィによ
る純化されたヒト血清アルブミンのMono Q 上の高性能
イオン交換クロマトグラフィの結果を示す。 第６図は還元条件下のヒト血清アルブミンのSDS−PAGE
（CBB Ｒ−250染色）の結果を示す。脱脂HSA:泳路２
（50μｇ）及び３（100μｇ）。純化組換え体由来HSA:
泳路４（35μｇ）及び５（70μｇ）。分子量マーカー：
泳路１及び６（20μｇ）。 第７図はヒト血清アルブミンの等電集束法（銀染色）に
よる結果を示す。マーカー：泳路１及び６。脱脂HSA:泳
路２（0.25μｇ）及び３（0.50μｇ）。純化組換え体由
来アルブミン：泳路４（0.50μｇ）及び５（0.25μ
ｇ）。 第８図は組換え体由来HSAの高性能液体クロマトグラフ
ィの結果を示す。 A:Bio−Sil TSK250 上のHPSEC,B:Mono Q 上のHPIE
C。
フロントページの続き (72)発明者 コルネリス ヤコブス ファン デル ラーケン オランダ国 2318エヌヘー レイデン クルースカルペル ９
Claims (10)
- 【請求項１】純化された組換え体由来血清アルブミンの
製造方法において、 血清アルブミンをコードする構造遺伝子を有する発現構
成体の使用による形質転換の結果その中に血清アルブミ
ンを発現している微生物細胞群を培地中で生育させ； 産生物含有培地を清澄化発酵液として、又は細胞分解物
として単離し； 産生物含有培地をアルカリ性としてからこのアルカリ性
培地を沈殿物から分別し； 該アルカリ性培地のpH値を生理学的pHの近似値へ変更さ
せて濃厚化血清アルブミンを生成させ、この濃厚化培地
を親油性固定相の使用下にクロマトグラフィによって処
理し、脱着剤としての水溶性リピドアニオンの水相に対
する添加により、アルブミンを溶出させ；そして 微生物由来の夾雑物を実質的に含有しない純化された血
清アルブミンを単離する諸工程を含むことを特徴とする
前記の方法。 - 【請求項２】クロマトグラフィ処理の前に、アルカリ性
培地を酸性化し、この酸性化培地をアニオン交換樹脂の
使用下に恒温保持する工程を更に含む請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】酸性化培地のpHが4.0〜5.5である請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】恒温保持後の酸性化培地を透析する追加の
工程を含む請求項２又は３記載の方法。 - 【請求項５】アルカリ性培地のpHが約7.5〜9.0である請
求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】脱着剤が炭素原子数約６〜12のアルキル基
を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】脱着剤が炭素原子数約６〜12のカルボキシ
レートである請求項６記載の方法。 - 【請求項８】純化血清アルブミンを透析する追加工程を
含む請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】微生物が酵母である請求項１〜８のいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項１０】血清アルブミンがヒト血清アルブミンで
ある請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87202261 | 1987-11-18 | ||
| EP87202261.1 | 1987-11-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0231687A JPH0231687A (ja) | 1990-02-01 |
| JP2562192B2 true JP2562192B2 (ja) | 1996-12-11 |
Family
ID=8197703
Family Applications (1)
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