KR970003053B1

KR970003053B1 - 혈청알부민의 정제 방법

Info

Publication number: KR970003053B1
Application number: KR1019880015019A
Authority: KR
Inventors: 비난트 코니그 보유데비윤; 니콜라아스 하머스 미쉬엘; 야코부스 반 데르 라켄 코르넬리스
Original assignee: 기스트 브로카데스 나암로제 베노오트하프; 안스 윌터 라벤
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1997-03-14
Also published as: IE883435L; IL88326A0; KR890007753A; DK639288D0; AU2572688A; FI885341A0; FI92404C; DE3867046D1; JP2562192B2; FI885341A; ATE70455T1; IL88326A; IE61423B1; AU620355B2; CA1312031C; ES2040834T3; EP0319067B1; DK639288A; JPH0231687A; FI92404B

Abstract

내용없음

Description

혈청알부민의 정제 방법

제1도는 환원조건하의 사람 형청 알부민의 SDS-PAGE(은-연색)를 도시한다.

탈지된 HSA : 레인1(100ng); 5(500ng); 9(10㎍).

정제된 HSA : 레인2, 3(100ng); 6, 7(500ng); 10, 11(10㎍). 분자량마커 : 레인 4, 8.

제2도는 사람혈청 알부민의 등전점 전기여동(CBB R-250 염색)을 도시한다.

Ⅰ: 레인 1, 2, 3의 샘플에 대한 적용점. Ⅱ:레인 4, 5, 6의 샘플에 대한 적용점. Ⅲ:레인 7, 8, 9의 샘플에 대한 적용점. 탈지된 HSA(10㎍) : 레인1, 4, 7. 정제된 HSA(10㎍) : 나머지 레인.

제3도는 사람혈청 알부민의

상에서의 고성능 이온교환 크로마토그래피를 도시한다. 상단크로마토그램:정제된 HSA; 하단크로마토그램 : 탈지된 HSA.

제4도는 사람 혈청 알부민의 바이오-실

상에서의 고성능 크기축출 크로마토그래피를 도시한다. 단백질 시약으로 컬럼-후 유도(derivatization)에 의한 단백질의 검출. 상단크로마토그램:탈지된 HSA; 하단 크로마토그램:정제된 HSA.

제5도는 알칼리 침전과 친화성 크로마토그래피로 정제된 사람 혈청 알부민의

상에서의 고성능이온교환 크로마토그래피를 도시한다.

제6도는 환원 조건하에서의 사람 혈청 알부민의 SDS-PAGE(CBBR-250 염색)를 도시한다. 탈지된 HSA:레인 2(50㎍)및 3(100㎍). 정제된 재조합 HSA:레인4(35㎍)와 5(70㎍). 분자량 마커:레인1과 6(20㎍).

제7도는 사람 혈청 알부민의 등전점 전기영동(Ag-염색)을 도시한다. 마터:레인1과6. 탈지된 HSA:레인 2(0.25㎍)와 3(0.50㎍). 정제된 재조합 알부민:레인4(0.50㎍)와 5(0.25㎍).

제8도는 재조합 HSA의 고성능 액체 크로마토그래피를 도시한다. 바이오-실

상에서의 HPSEC(A),

상에서의 HPIEC(B).

본 발명은 재조합 제조되는 단백질, 구체적으로는 혈청 알부민의 정제에 관한 것이다.

사람 혈청 알부민("HSA")은 혈장의 주된 단백질성분이며 585아미노산의 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어지고 분자량은 약66,000달톤이다. 그의 분자내의 17이황화 가교는 알부민 분자의 높은 안정성에 기여한다.

알부민의 혈장에서 기본적인 기능은 혈관내의 교질 삼투압을 유지하는 것이다. 나아가, 단백질은 여러가지 리간드, 예컨대 빌리루빈과 지방산의 담체로서 작용한다(F.Rothstein, V.M. Rosenoer and W.L. jughes의 알부민 구조, 작용, 및 용도(1977)7-25; U. Kragh-Hannsen, Phamacol. Rev. (1981) 33 : 17-53; T.Peters Jr., Adv. Prot. Chem.(1985) 37 : 161-245 참조.)

정제된 혈청 알부민은 혈액투석 및 심폐 우회 과정에서의 부산물로서의 심각한 저알부민혈증이 있는 상태 및 신생아의 과민빌리루빈혈증의 치료에 교환수주와 관련있는 체액 상실성 충격의 예방 및 치료에 요구된다.

HSA의 혈장 또는 태반으로부터의 대규모 정제를 위해서는 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 트리클로로아세트산 또는 황산 암모늄을

과 함께 사용하는 침전법 및/또는 액체 크로마토 그래히법이 자주 이용된다.(후자에 대해서는 J.Saint-Blancard, J.M. Kirzin, P. Riberon, F. Petit, J. Fourcart, P. Girot and E. Boschetti, Anal. Chem. Symp. Ser.(1982) 9 : 305-312; J.M. Curling in Methods of Plasma Protein Fractionation(1980) 77-91; M.J. Harvey in Methods Plasma Protein Fractionatio(1980) 189-200; N. E. Schultze and J.F. Heremans, Mol. Biol. Hum. Prot.(1966) 1:261-270; J. Liautau, J. Pla, A. Debrus, P. Gattel, R. Plan and L. Peyron, 13th Int. Congr. IABS(1973) 27:107-114, Hao, Y-L, Vox Sang(1985) 49:1-8; 및 U.S. 특허 제4,228,154호 참조.)

실험실 규모로 혈청 알부민을 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피의 응용이 티.피터스 쥬니어, 에이치.타니우치와시.비.안핀센 쥬니어에 의해 J. Biol. Chem.(1973) 248 (7) : 2447-2451에; 에이.위크만과 엘-오.앤더슨에 의해 Biochim. Biophys. Acta(1974) 372 : 218-224에; 에이. 아슬람, 디.제이.죤스와 티.알. 브라운에 의해 Anal. Biochem.(1976) 75 : 329-335에 기재되어 있다.

치료에는 대량의 혈청 알부민이 필요하고 혈청알부민의 공급원(혈장)이 제한되기 때문에, 대량으로 HSA를 제조하는 다른 기법이 연구되어 왔다. 재조합 DNA기법에 의해 만들어진 형질전환된 미생물 또는 셀라인을 사용하여 발효에 의하여 HSA를 제조하는 성공적인 사례가 보고되어 있다. 예컨대 EP-A-0073646참조.

그러나, 형질전환된 세포를 사용하는 발효에 의하여 제조된 혈청알부민의 정제시에 주된 문제점중의 하나는 정제되고 동종성인 혈청알부민을 얻기 위해서는 성장 배지(발효 브로스) 또는 세포용해물로부터 제거되어야만 하는 오염 성분의 존재이다.

이들 오염물은 예컨대 면역학적 반응을 일으키는 것으로 기대되기도 하는 외래단백질이다. 오염된 HSA의 투여는 충격을 유도할수도 있다. 이들 오염물은 혈장 또는 태반으로부터의 혈청 알부민의 분별중에 일어나는 것들과는 완전히 다르다. 이것은 천연 공급원으로부터의 HSA에 대해 개발된 정제방법이 재조합 혈청 알부민의 정제에 대해서는 보외될수 없음을 의미한다. 형질전환된 미생물 또는 셀라인에 의해 제조된사람 혈청알부민의 대규모 정제를 위한 실제적인 방법은 지금까지 공개 되지않았으며 아직은 활용할수 없다.

재조합 제조된 혈청 알부민은 알칼리침전의 초기단계, 선택적으로 산성 pH에서의 이온 교환 크로마토그래피, 및 수성상에서 흡착제거제로서 지질 음이온을 사용하여 친유성표면 고정상을 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제된다. 높은 회수 및 순도가 얻어진다.

본 발명에 따라서, 재조합 기법에 의해 제조된 혈청 알부민, 특히 사람 혈청 알부민이 약리적 생성물로서 사용하기 위하여 고수율 및 고순도로 정제된다. 정제 방법은 발효 브로스의 여과에 의해 진행된다. 그 방법은 그로써 얻어진 상징액 또는 용해후의 세포에 대해 적용될수 있다. 그 방법은 일반적으로 오염물의 알칼리 침전; 선택적으로 산성 음이온 교환수지로의 처리 및 임의로 배지 농축을 위한 투석과 이어서, 친유성 고정상과 용리액중의 흡착제거제로서 친유성 음이온을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.

그런다음 혈청 알부민은 탈염 및 농축에 의해 수확될 수 있다. 원한다면, 혈청 알부민은 건조 생성물을 제공하기 위하여 동결건조될수 있다.

본방법에 의해 제조된 혈청 알부민은 이온 교환 크로마토그래피, 크기 축출 크로마토그래피, SDS-PAGE 및 토끼의 면역감작을 포함하는 면역학적 시험에 의하여 측정되는바 실질적으로 동종성이고 단량체이다.

그 방법은 미생물을 활용하는 재조합 기법에 의해 제조된 혈청알부민, 특히 사람 혈청 알부민의 생성을 이용하는 사용을 발견한다. 미생물은 원핵 또는 진핵, 특히 진핵 미생물일수 있으며, 대장균(E. Coli), 고초균(B.subtilis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis), 스트렙토마이세스(streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)등과 같은 박테리아를 포함한다. 진핵생물중에서는 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candia)등과 같은 효모, 뉴로스포라(Neurospora), 아스페르길루스(Aspergillus)등의 사상균이 있다.

혈청알부민의 발현은 유기체 안에서의 생성물의 분비 또는 보유를 유발할수 있다. 브로스는 발효기로부터 배치-식으로 또는 연속적으로 제거될수 있다. 분비의 경우에, 세포-유리 상징액이 정제 과정에 사용된다. 세포-유리 상징액은 발효 브로스의 청징에 의하여, 편리하게는 브로스의 원심분리 또는 여과에 의하여, 단백질 생성물의 농도에 대한 한외여과를 사용하여 얻어진다. 필터는 일반적으로 500내지 25,000D, 보다 통상적으로는 적어도 약 1000D의 컷-오프(cut-off)를 가질 것이다. 최종 생성물 농도는 최소한 약 0.5㎎/㎖이어야 하는 것이 바람직하고 적어도 약1㎎/㎖인 것이 보다 바람직하다. 생성물이 세포의 원형질에 보유되는 경우에 세포가 수확된다. 용해물은 용해물을 얻기 위한 기계적 또는 화학적인 세포의 파괴를 사용하여 어떠한 종래 기법에 따라서도 제조될 수 있다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될수 있다.

세포-유리 상징액 또는 세포용해물의 pH는 약 7.5내지9, 보다 바람직하게는 8내지8.5로 조정된다. pH는 수산화나트륨, 또는 다른 편리한 염기의 통상은 약 0.1내지 농축범위의 상태까지의 첨가와 같은 어떠한 편리한 수단에 의하여 변형될 수 있다. 혼합물은 편리하게 단시간, 일반적으로 약 5내지 30분동안 교반되며 약 25μ보다 큰, 바람직하게는 약 20μ보다 큰, 보다 바람직하게는 약 5μ보다 큰 입자를 실질적으로 보유하는 필터를 통해 여과된다. 침전물은 적합하게 완충된 용액, 통상은 8이하의 pH에서 완충되고 일반적으로 완충제농도가 약20에서 100mM로까지 희석된 용액으로 세척된다. 완충액은 pH가 약 6.5내지 8의 pH범위에 있는 것이 바람직하다. 세척액의 부피는 중요하지 않지만 일반적으로 여과액의 부피를 토대로 하여 약 0.1내지 0.5의 부피이다. 완충액은 일반적으로 약0.1재지 100mS/cm, 바람직하게는 약 1내지 50mS/cm 사이의 전도율을 가질 것이다. 그런다음, 여과액과 세척액이 조합된다.

다음의 필수적인 단계는 친유성 고정상이 사용되는 친화성 크로마토그래피이다. 친화성 크로마토그래피 단계에서, 혈청 알부민 함유 용액이 컬럼안의 고체 표면, 통상은 약 6내지 12탄소원자, 바람직하게는 약 6내지 10탄소원자, 보다 바람직하게는 8탄소원자의 친유성 사슬로 피복되거나 기능화된 입자와 접촉하게 되며, 그중 기는 일반적으로 지지체에의 공유 결합에 대한 기능성과 결합된 알킬기를 포함할 것이다. 예시적인 화합물로는 옥타노에이트, 옥틸숙시네이트 등이 있으며, 그중 친유성기는 에테르, 아미드 또는 다른 적당한 기능성을 통해서 지지체에 결합될수 있다. 용리액에 포함된 것들은 친유성 화합물일 것이며 편리하게는 약 50내지 250, 보다 통상적으로는 75내지 150mM의 범위의 농도에서 수성배지에 녹을 수 있는 카르복실산염, 에스테르등이다. 기법의 추가의 설명을 위해서는 위크만과 앤더슨(1974)의 참고문헌(상기동일)참조.

친화성 크로마토그래피를 수행함에 있어서, 배지는 약간 생리적인 pH에, 일반적으로는 약 6.5내지 8의 범위에, 보다 일반적으로는 약 7내지 7.5의 범위에 있을 것이다. 완충제 농도는 약 50내지 150mM 범위에 있을 것이다.

친화성 흡착제상에 혈청 알부민 배지의 부하시에 컬럼이 약 0.5내지 1.5M의 염(NaCl)이 첨가된 평형 완충액으로 세척되는 것이 바람직하다.

친화성 크로마토그래피에 앞서서 또는 후에 이온 교환이 혈청 알부민의 정제를 추가로 증진시키기 위해 또한 사용되는 것이 바람직하다. 전자의 경우에는 침전물이 완충용액, 통상 7이하의 pH에서 완충된, 일반적으로는 완충제 농도가 약20내지 100mM에 있게될 희석된 용액으로 세척된다. 완충액의 pH가 약 4내지 5.5범위에 있는 것이 바람직하다. 세척액의 부피는 중요하지 않지만 일반적으로 여과액의 부피를 토대로 약0.1내지 0.5이다. 완충액은 일반적으로 약 0.1내지 100mS/cm, 바람직하게는 약 1내지 50mS/cm의 전도율을 가질것이다. 여과액과 세척액을 합한후, 용액의 pH는 약 pH3.5내지 6, 바람직하게는 4내지 5.5로 저하된다. 후자의 경우에, 친화성 크로마토그래피에 이어서, 용출액의 pH가 약 3.5내지6, 바람직하게는 4내지 5.5로 저하된다.

이온 교환단계는 핵산, 오염 단백질 및 색소의 제거를 돕는다. 혈청 알부민 배지는 접촉상태가 정상적으로 약 5내지 60분, 바람직하게는 10내지 30분동안 유지될 컬럼을 배치식으로 또는 연속적으로 통과하는 이온교환수지와 조합될수 있다. QAE, 또는 상업적으로 쉽게 구할수 있는 담체와 결합된 DEAE와 같은 음이온 교환 흡착제가 사용된다. 혈청 알부민 배지는 일반적으로 3.5내지 6의 범위의 pH, 보다 통상적으로는 약4내지 5.5의 범위의 pH를 가지는 산성 배지로서 사용될수 있고, 완충제의 각종 산의 첨가에 의하여 쉽게 만들어질수 있다. 완충제농도는 일반적으로 약 25내지 100mM의 범위내일 것이다. 단백질에 대한 이온 교환수지의 중량비율은 일반적으로 최소한 약1:1이고 약 30:1을 초과하지 않을것이며 바람직하게는 약5내지 15:1, 보다 바람직하게는 약10:1이다. 사용에 앞서, 음이온 교환수지는 일반적으로 혈청알부민 배지와 함께 사용된 낮은 pH의 완충액으로 평형화될 것이다.

그런다음 혈청 알부민 배지는 어떠한 편리한 방법, 예컨대 5분동안 2000Xg에서의 원심분리와 이어서 이온교환수지의 부피에 대한 낮은 pH의 완충액의 부피가 일반적으로 약 1내지 20배, 통상은 2내지 10배일 낮은 pH의 완충액으로 이온교환수지를 세척함에 의하여 수지로부터 단리된다. 일회 또는 그 이상의, 통상은 2회의 세척이 사용될수 있다. 액체 배지는 조합되고 pH는 약 중성으로, 일반적으로는 약 6.5내지 8의 범위로, 보다 통상적으로 약 7내지 8로 올라갈 것이다. 그런다음 대략 중성의 배지는 예를들어 약6내지 10, 바람직하게는 약6내지 8의 pH와, 약 0.5내지 100mS/cm, 바람직하게는 약 0.5내지 20mS/cm의 전도율을 가지는 인산염 완충액에 대해 투석된다. 어느 경우에도 완충용액은 친화성 컬럼에 사용된것과 같을것이다. 배지의 농도는 통상 약1내지 20㎎ 단백질/㎖, 보다 통상적으로는 약2내지 15㎎/㎖의 농축물을 수용할 것이다.

광범위한 종류의 지지체와 흡착제가 고체 담체 또는 지지체로서 사용될수 있다. 그러한 고체 담체로는 유리 및 실리카겔 같은 무기담체, 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 이중기능성 아크릴레이트의 비닐 공중합체 및 다양한 히드록실화 단량체와 같은 유기, 합성 또는 천연 발생담체등이 있다. 상업적으로 쉽게 구할수 있는 담체는

, XAD 수지등의 상표로 시판된다.

다양한 단계에 대한 조건은 비-변성조건, 일반적으로는 약-10℃내지 30℃범위의 편리한 온도, 보다 통상적으로는 순환하는 온도 근방에서 수행될 것이다. 크로마토그래피 단계는 편의에 따라 배치식으로 또는 연속적으로 수행될수 있다. 원심분리, 여과, 따라버리기(decanting)등과 같은 어떠한 편리한 분리방법이 사용될수 있다.

발명의 바람직한 구체예는 : 혈청알부민이 발현되는, 혈청알부민 코드화 구조 유전자를 포함하는 발현 구조로 형질전환된 효모세포를 영양배지중에서 성장시키는 단계; 청징된 발효 브로스 또는 세포 용해물로서 생성배지를 단리하는 단계; 생성배지를 약7.5내지 9으 범위의 pH로 알칼리화하고 침전물과 알칼리 배지를 분리하는 단계; 상기 알칼리 배지를 약 4.0내지 5.5의 범위의 pH로 산성화하고 상기 산성화된 배지를 음이온 교환 흡착제와 항온반응시키는 단계; 상기 산성화된 배지의 pH를 농축된 혈청 알부민을 제공하기 위하여 생리적 정도의 pH로 변화시키고 상기 농축된 배지를 친유성 고정상으로 크로마토그래피하며 흡착제거제로서 수용성 지질 음이온을 첨가함으로써 알부민을 용출하는 단계; 및 실질적으로 오염물이 없는 정제도니 알부민을 상기 미생물로부터 단리하는 단계로 이루어진다.

다음 실시예를 제한의 방법이 아니라 예시로서 제공한다.

실험

실시예 1

청징된 발효 브로스로부터의 HSA의 정제

클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)균주 CBS 2360을 70시간동안 30℃에서 효모추출물, 0.5%(중량/부피), 콘 스팁고체물, 2%(중량/부피), 글루코스, 0.7%(중량/부피) 및 금속염을 함유하는 배지중에서 성장시켰다. 발효도중에 글루코스를 공급하였다. 발효브로스를 원심분리하고(4000 rpm 에서 5분)상징액을 세이츠 K500 필터를 통해서 여과시켰다. 최종용액을 커트-오프가 1000D인 필터를 사용하여 한의여과에 의하여 6배 농축하였다. 최종 단백질농도는 1㎎/㎖이었다.

알칼리 침전 : 이 청징되고 농축된 발효 브로스에 탈지되고 정제된 HSA(Cohm Fraction V)를 첨가하여 HSA의 함량이 단백질 함량(10㎎/㎖)의 90%(중량/중량)이었다. HSA-함유 용액의 pH를 8.1로 높여서, 15분동안 교반하고 20㎛필터를 통하여 여과하였다. 필터케이크를 50mM아세트산 나트륨 pH 4.5로 2회 세척하고 계속해서 조합된 여과액의 pH를 pH4.5로 조정하였다.

QAE-세파덱스 크로마토그래피 : 전단계에서 얻어진 HSA용액을 50mM아세트산 나트륨 완충액 pH4.5로 평형화하여 놓은 QAE-세파덱스

로, 1:10의 단백질:흡착제의 비율(중량/중량; 건조중량)로 30분동안 배치식으로 항온 반응하였다. 항온반응후, 겔 현탁액을 원심분리로 제거하거 계속해서 50mM 아세트산나트륨 완충액 pH4.5로 2회 세척하였다. 수집한 상징액을 조합하여 이 용액의 pH를 pH7.4로 조정하고 계속해서 투석하고 10㎎/㎖의 단백질 농도로 농축하였다.

친화성 크로마토그래피 : 전단계에서 얻어진 HSA용액을 에이.위크만과 엘-오.앤더슨(1974, 상기 동일)에 따라 1, 4-디이미노-부탄-세파로스 4B에 커플된 옥틸숙신산 무수물과 접촉시켰다. 이 친화성 흡착제를 100mM 인상나트륨 완충액 pH7.4로 평형화하였다. 친화성 흡착제의에 HSA-함유 용액을 부하한후 1MNaCl이 첨가되어 있는 평형 완충액으로 세척하고, 100mM인산나트륨 완충액(pH 7.4)으로 HSA를 용출하였다. 정제된 HSA를 탈염시키고 10㎎/㎖의 단백질 농도로 농축하였다. 이 실시예에 기재된 과정을 따라서 HSA의 회수는 75%이었고 오염물이 없음을 그결과가 얻어진 HSA의 고순도를 가리키는 SDS-PAGE(제1도), IEF(제2도), HPIEC(제3도) 및 HPSEC(제4도)에 의하여 증명할수 있었다. 나아가, 정제된 혈청 알부민의 특성확인은 또한 면역학적방법에 의하여 수행하였다:정제된 HSA로 토끼를 면역시키고 항혈청을 0. 오크털로니의 이중확산방법(Acta Path. Microbiol. Scand. (1948) 28:186-191)에 따라 발효 브로스로부터의 탈지된 HSA 또는 클루이베로마이세스 락티스 단백질에 대한 항체반응에 대해 스크린하였다.

이 기법을 사용하여 HSA를 향하여 지시된 항체만을 검출하였다.

실시예 2

청징된 발효 브로스로부터의 이온교환크로마토그래피를 사용하지않은 HSA의 정제

실시예 1을 이온교환단계를 제외하고 반복하였다. 이 과정의 HSA 회수(90%)는 실시예 1에서 얻어진 것보다 높았다. 단백질에 대한 알부민의 비율(중량/중량)이 1이었지만, 정제된 혈청 알부민의 HPIEC 크로마토그램(제5도)은 HSA 피크앞에 작은 피크가 있음을 나타냈다. 그외에도, 탈지된 HSA와 실시예 1에서 얻어진 HSA와는 대조적으로, 최종 생성물은 희미한 황색이었고 그것은 발효 브로스로부터 기원하는 색소의 존재를 가리킨다.

실시예 3

청징된 세포 용해물로부터의 HSA의 정제

클루이베로마이세스 락티스의 세포 페이스트(CBS 2360; 실시예 1에 기재된 바와같이 배양됨)를 물로 1:1로 희석하고 다이노밀 장치안에서 유리비드로 파괴하였다. 용해된 세포를 20분동안 15,000rpm에서 소르발 원심분리, SA600로터로 원심분리하고 상징액을 그자체로서 사용하였다.

알칼리 침전 : 청징된 세포 용해물에, 탈지되고 정제된 HSA(Cohn Fraction V)를 첨가하여 HSA의 함량이 총단백질함량:100㎎/㎖의 5(중량/중량)가 되었다. HSA-함유 용액의 pH를 8.1로 올리고, 15분동안 교반하여 20㎛ 및 5㎛아세트산 나트륨 완충액 pH4.5로 2회 세척하고, 계속해서 조합된 여과액의 pH를 pH 4.5로 조정하였다.

QAE-세파덱스 크로마토그래피 : 전단계에서 얻어진 HSA 용액을 50mM 아세트산 나트륨 완충액 pH5.0으로 평형화하여 놓은, 0.25M NaCl 함유 QAE-세파덱스

로 배치식 항온 반응시켰다(흡착제:단백질 비율(중량/중량)=10:1). 항온반응후, 겔 현탁액을 원심분리에 의해 제거하고 흡착제를 평형 완충액으로 2회 세척하였다.

수집한 상징액을 합하여, 이 용액의 pH를 7.4로 조정하고, 계속해서 HSA-함유 용액을 투석하고 10mg/㎖의 단백질농도로 농축하였다. HSA 를 함유하는 불순한 용액의 추가의 처리를 실시예 1에서 설명한 바와같은 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다. HSA 회수율은 50% 이었고 최종 생성물의 순도는 mg 알부민/mg 단백질로 표시하여 0.85였다.

실시예4

청징된 발효 브로스로부터의 재조합 HSA의 정제

사전공개되지 않은 EP-A-8820 1632.2 (1988년 7월 28일에 출원됨) 의 실시예10에 기재된 바와같이 HSA 에 대한 유전자 함유 플라스미드로 형질전환된 클루이베로마이세스 락티스 균주 CBS 2360을 110시간동안 30℃에서 본명세서의 실시예1에 기재한 바와같은 배지중에서 성장시켰다. 발효중에 글루코스를 공급하였다. 발효브로스를 원심분리하고(4000 rpm 에서 5분) 상징액을 커트-오프가 1000 D 인 필터를 사용하여 한외여과함으로써 20 배 농축하였다. 최종 단백질 농도는 10㎎/㎖이었고 그중 0.45㎎/㎖은 재조합기법으로 제조된 단량체 HSA로 구성되었다.

재조합 HSA-함유 용액의 pH를 pH 8.1로 올렸다. 용액을 15분동안 교반하고 20 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 필터케이크를 50mM 아세트산 나트륨 pH 4.5 로 2회 세척하고 계속해서 조합된 여과액의 pH를 4.5로 조정하였다. 실시예1에서 설명한 바와같이 재조합 HSA의 추가의 정제를 QAE-세파덱스 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다.

이 실시예에서 설명한 과정을 따라서 희미한 황색의 정제된 단량체 재조합 알부민의 수율은 70%였다. 소량의 오염물(총 8%이하)을 SDS-PAGE(제6도), IEF(제7도), HPSEC(제8a도) 및 HPIEC(제8b도)에 의해 증명할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본발명이 재조합 기법을 사용하여 만들어진 신속하고 효과적인 혈청 알부민의 정제를 제공하는 것이 명백하다. 그러므로, 발현숙주로서 사용된 미생물로부터 실질적으로 오염물이 없는 생성물을 제공하기 위한 혈청 알부민과 유사단백질의 정제에 대한 신속하고 효과적인 방법이 제공된다. 이 방법으로 대량으로 효과적으로 제조될 수 있는, 제약분야에 유용한 생성물이 얻어질수 있으며 고수준의 회수가 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허출원은 본발명이 속하는 기술분야에 숙련된 사람들의 기술수준을 가리킨다. 본원에 참고로 삽입된 모든 공보 및 특허출원은 각 별개의 공보 또는 특허출원이 참고로 삽입되도록 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 같은 정도이다.

전술한 발명이 이해를 명확하게 할 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 어느정도 상세히 설명되었지만 첨부된 청구범위의 범주내에서 어떤 수정 및 변형이 실제화될수 있음이 명백할 것이다.

Claims

정제된 재조합 혈청 알부민의 제조방법에 있어서, 혈청알부민이 발현되는, 혈청알부민 코드화 구조유전자를 포함하는 발현구조로 형질전화된 미생물을 배지중에서 성장시키는 단계; 청징된 발효 브로스 또는 세포 용해물로서 생성배지를 단리하는 단계; 생성배지를 알칼리성으로 만들어 알칼리배지를 침전물로부터 분리하는 단계; 상기 알칼리 배지의 pH를 농축된 혈청 알부민을 제공하기 위하여 생리적부근의 pH로 변화시키고 상기 농축된 배지를 친유성 고정상으로 크로마토그래피하여 흡착제거제로서 수용성 지질 이온을 수성상에 첨가함으로써 알부민을 용출하는 단계; 및 실질적으로 오염물이 없는 정제된 혈청 알부민을 상기 미생물로부터 단리하는 단계로 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법이 추가로 상기 크로마토그래피 단계에 앞서 상기 알칼리 배지를 산성화하고 그 결과의 산성화된 배지를 음이온 교환수지와 항온 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 산성화된 배지가 4.0내지 5.5 의 범위의 pH인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항 또는 3항에 있어서, 상기 항온반응후 상기 산성화된 배지를 투석하는 추가의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 4항중 어느하나에 있어서, 상기 알칼리 배지가 약 7.5 내지 9.0의 범위의 pH인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 5항중 어느하나에 있어서, 상기 흡착제거제가 약 6내지 12 탄소원자의 알킬기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 흡착제거제가 약6 내지 12 탄소원자의 카르복실산염인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 7항중 어느하나에 있어서, 상기 정제된 혈청 알부민을 투석하는 추가의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 8항중 어느하나에 있어서, 상기 미생물이 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 9항중 어느하나에 있어서, 상기 혈청 알부민이 사람 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 방법.