KR100392021B1

KR100392021B1 - 재조합 사람혈청알부민의 정제방법

Info

Publication number: KR100392021B1
Application number: KR1019950027882A
Authority: KR
Inventors: 노다무네히로; 수미아키노리; 오무라다카오; 요코야마가즈마사
Original assignee: 미쯔비시 웰 파마 가부시키가이샤
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2003-11-01
Also published as: DE69532492D1; EP0699687A2; CA2157219C; DE69532492T2; US6617133B1; CN1364643A; US5962649A; CN1080301C; CA2157219A1; ES2211889T3; TW363065B; CN1127299A; KR960007612A; EP0699687B1; EP0699687A3; DK0699687T3

Abstract

본 발명은 재조합 사람 혈청 알부민(rHSA) 및 rHSA-생성 숙주 세포를 함유하는 배양 배지를 가열하고, 흡착제 입자가 이들과 접촉을 이루도록 현탁되어 있는 유동층내로 가열 용액을 상부를 향해 공급한 후, rHSA를 함유하는 흡착 분획을 회수함으로써 rHSA을 정제하는 방법, 및 25% 알부민 용액으로 제형시 이하의 A350/A280비가 0.015 미만인 rHSA를 함유하는 조성물을 제공한다.

Description

재조합 사람 혈청 알부민의 정제방법

본 발명은 유전자 조작에 의하여 고수율로 수득된 사람 혈청 알부민을 용이하게 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 재조합 사람 혈청 알부민에 특징적인 심각한 문제점인 착색도가 극히 낮은 재조합 사람 혈청 알부민을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

사람 혈청 알부민(이하에서는 간단히 HSA로 언급함)은 혈장에 함유되어 있는 가장 풍부한 단백질이며, 혈액의 삼투압 유지에 기여하며, 영양소 및 대사물질에 결합하여 이들 물질을 수송한다. 이러한 기능을 기진 HSA는 알부민의 손실 또는 알부민 합성의 감소에 의하여 야기된 저알부민혈증, 및 출혈성 쇼크를 치료하기 위한 약제로서 사용되어 왔다.

HSA는 주로 수집된 혈액의 분획으로부터 수득된다. 그러나, 혈액으로부터 HSA를 생산하는 방법은 혈액의 산발적 공급, 경제적인 단점, 및 간염 바이러스와 같은 원치않는 물질에 의한 오염과 같은 문제점을 수반한다. 즉 천연 HSA의 대체물로서 사용가능한 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 상황에서, 재조합 DNA 기술이 진보함에 따라 (혈액에서 기원하는 HSA의 대체물로서) 유전자 조작에 의한 HSA의 대량 생산 및 정제 기술이 개발되어 왔다.

유전자 조작에 의해 수득된 HSA(이하에서 재조합 HSA로 언급하여 rHSA로 약칭함)를 정제하기 위해서는, 이와 같은 혈장 기원의 HSA를 정제하기 위해 통상적인 방법을 적용하는 것은 적절하지 않다. 그 이유는 rHSA로 부터 제거해야 할 불순물이 혈장 기원의 HSA에 함유되어 있는 것들과는 전적으로 상이하기 때문이다. 즉,rHSA는 예를 들면, 재조합 HSA에 특징적인 착색 물질, 숙주 세포 기원의 단백질, 폴리사카라이드 등으로 오염된다. 특히, 숙주 세포 기원의 성분들은 사람을 포함한 생존 유기체에게는 외래 물질이므로 항원성 문제를 야기할수 있으므로 이들을 충분히 제거시킬 필요가 있다.

따라서, 배양을 통해 생성된 rHSA를 숙주세포 및 배지 성분에서 기원하는 성분으로부터 충분한 정도로 분리 및 정제하기 위하여 각종 연구가 수행되어 있다. 통상적인 방법 중의 예로는, rHSA를 함유하는 효모 배양 배지를 압축→ 한외여과 막 처리→가열→ 한외여과 막 처리를 한 후 양이온 교환제, 음이온 교환제 및 소수성 크로마토그래피를 사용한 크로마토그래피로 처리하는 과정을 포함하는 방법[참조문헌: 유럽 특허원 제570916호에 상응하여 일본국 특허원 제5-317079호(본원에서 사용된 JP-A라는 용어는 "미심사 일본국 특허 출원을 의미한다"), Biotechnology of Blood Proteins 1993, 227, 293-298] 및 추가로 상기 기술된 방법에 이어 킬레이트 수지 처리 또는 붕산/붕산염 처리를 포함하는 방법[유럽 특허원 제570916호, 유럽 특허원 제612761호에 상응하는 일본국 특허원 제6-245789호]을 들 수 있다.

전술한 통상의 방법에서, 전술한 수 단계로 이루어진 정제 과정을 수행하여 숙주 세포 기원의 항원을 제거하고 고도의 정제를 달성하는 것이 필수적으로 요구된다. 한편, 이러한 방법은 rHSA 수율의 감소 및 다수의 단계에 기인한 처리 기간의 연장 등의 단점이 있다. 비록 rHSA의 수율을 향상시키기 위하여 각 단계의 수율을 증가시키기 위한 시도가 있었지만, 수율에 있어서 더 이상 추가 개선을 이룰 수 없었으므로, rHSA의 수율이 이미 상한선에 도달한 듯 하였다. 더욱이, 전술한 통상의 방법은, 압축이 개방 시스템에서 수행됨에 따라 오염의 소지가 존재하는 또 다른 문제로 곤란을 겪는다. 즉, 상기 방법에서는 의약품으로서의 rHSA 생산에 필수적으로 요구되는 위생 관리가 매우 어렵다. 게다가, rHSA의 착색도는 A350/A280의 비율이 단지 최저 약 0.015(250mg/ml의 rHSA를 함유하는 용액의 경우)까지만 감소될 수 있다(일본국 특허원 제7-170993호 및 유럽 특허원 제658569호에 상응하는 일본국 특허원 제7-170994호).

한편, 배양을 마친후, 세포의 제거 또는 배지의 농축과 같은 여타의 예비 처리를 수행함이 없이 조 배양 배지로 부터 직접 표적 단백질을 회수하는 방법이 개발되어 왔다[예를 들면, Pharmacia에 의해 개발된 팽창 베드 흡착 기술을 사용한 스트림라인법, 유럽특허원 제538467호에 상응하는 일본국 제6-500050호로 국제 공개].

전술한 팽창 베드 흡착 기술을 rHSA의 정제, 특히 효모 배양 배지로부터 rHSA의 회수 및 정제에 적용한 경우는 이제껏 보고된 바가 없다. 즉, 이러한 방법이 rHSA 정제의 합리화 및 rHSA 수율의 향상에 실질적으로 유용한지 여부는 알려지지 않은채로 남아있다. 그러나, 이러한 방법이나 이와 유사한 방법을 rHSA의 정제에 적용하는 경우 수 단계로 이루어진 통상적인 정제 처리 과정을 단순화할 수 있을 것으로 기대된다.

그러나, 전술한 방법에 사용하기 위한 스트림라인 컬럼에 의한 흡착(흡착제: 스트림라인 SP)에 사용되는 산성 조건하에서는, 배양 배지에 함유된 rHSA가 배양 배지에 함유된 프로테아제에 의해 신속히 분해되므로, rHSA의 수율이 심각하게 저하된다는 문제점이 발생한다. 따라서, 전술한 팽창 베드 흡착 기술을 rHSA의 정제에 적용하는 것은 곤란하다.

따라서, 팽창 베드 흡착 기술의 장점(정제 과정의 단순화 및 합리화)을 손상시키지 않으면서 rHSA가 안정한 상태에서 고수율로 고도로 정제될 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구된다.

본 발명의 목적은 재조합 HSA를 단기간에 고순도 수준 및 탁월한 질적 수준으로 정제하는 단순한 공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 숙주, 배지 등에서 기원하는 유전자 조작에 특징적인 착색 물질이 충분히 제거된 rHSA, 및 생성된 rHSA를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 문제점들을 해결하기 위하여 본 발명가들은 광범위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 숙주 세포가 잔존하는 HSA 생성 시스템의 배양 배지를 직접 가열함으로써 프로테아제를 신속하고 효과적으로 불활성화시킬 수 있음을 밝혀냈다. 이러한 발견을 토대로, 이렇게 가열한 용액을 이로부터 세포를 제거함이 없이 유동 층(fluidized bed)에 현탁된 흡착제 입자와 직접 접촉시키는 경우 rHSA가 손쉽게 고수율로 정제될 수 있다는 점도 추가로 밝혀냈다. 또한, 전술한 가열 처리를 흡착제 입자 처리와 병행함으로써 통상적인 rHSA 정제 방법의 다수의 단계를 5단계(즉, 압축-한외여과 막 처리-가열-한외여과 막 처리-양이온 교환제 처리)에서 2단계(가열-흡착제 입자 처리)로 단축시킬 수 있으므로, 수율은 증가시키면서 정제 기간을 상당히 단축시킬 수 있다는 점도 밝혀냈다.

더욱이, 본 발명가들은 전술한 방법을 통해, 숙주 세포 기원의 여타의 불순물을 실질적으로 함유하지 않고 통상의 방법에 의해 수득된 rHSA에 비하여 충분히 저하된 착색도를 보이는 rHSA를 수득할 수 있음을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명은 rHSA 및 rHSA-생성 숙주를 함유하는 배양 배지를 가열하고, 가열 용액을 유동층에 현탁된 흡착제 입자와 접촉시킨 다음 흡착 분획을 회수함을 특징으로 하는 rHSA 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 rHSA 및 rHSA-생성 숙주를 함유하는 배양 배지를 가열하고, 가열 용액을 흡착제 입자가 현탁되어 있는 유동층내 상부 방향으로 공급하여 가열 용액을 흡착제 입자와 접촉시킨 다음, 유동 방향을 역전시키고 완충액을 하부 방향으로 공급하여 흡착제 입자에 의해 흡착된 rHSA를 용출 및 회수한다.

본 발명은 또한 rHSA-생성 숙주를 배양 배지를 1분 내지 10시간 동안 50 내지 100℃의 온도로 가열하는 정제 방법, 가열 용액을 0.1 내지 50mS의 전기 전도율의 환경하에서, 약 3 내지 5의 pH값에서 흡착제 입자와 접촉시키는 rHSA 정제 방법 및 흡착제 입자가 강한 양이온 교환 그룹을 갖는 rHSA 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술한 정제 방법에 의해 유동층으로부터 회수된 rHSA를 함유하는 흡착 분획을 바람직하게는 환원제의 존재하에 가열한 후에, 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환제 처리, 킬레이트 수지 처리, 붕산/붕산염 처리 및 한외여과 막 처리로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 정제 처리를 수행하여, rHSA를 정제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 알부민의 25%용액(즉, rHSA농도: 250mg/ml)으로 제형화될 경우, 0.015 미만의 A350/A280 비를 보이는 재조합 사람 혈청 알부민을 포함하는조성물에 관한 것이다.

(1) 유전자 조작에 의해 수득된 HSA

본 발명에 있어서, 유전자 조작에 의해 수득된 HSA-생성 숙주는 유전자 조작에 의해 제조되는 한은 특별히 제한되지는 않는다. 즉, 일반에 공지된 문헌에 보고된 것들이나 장래에 개발될 것들이 HSA-생성 숙주로서 적절히 선택될 수 있을 것이다. 특히, 이러한 숙주에는 예를 들면, 유전자 조작에 의해 수득된 HSA-생성 미생물[에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 효모, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등] 및 동물 세포가 있다. 효모, 특히 사카로마이세스(Saccharomyces)속에 속하는 효모(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)) 또는 피키아(Pichia)속에 속하는 효모(예를 들면, 피키아 파스토리스(P. pastoris))을 숙주로 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 영양요구성 균주 및 항생제-민감성 균주도 숙주용으로 유용하다. 사카로마이세스 세레비지애 AH22균주(a, his4, leu2, can1) 또는 피키아 파스토리스 GTS115 균주(his 4)를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

HSA-생성 숙주의 제조, 이의 배양에 의한 rHSA의 생산 및 배양 육즙으로 부터 rHSA의 분리 및 회수는 모두 경미하게 변형될 수 있는 공지의 방법에 따라 수행된다. 예를 들면, HSA-생성 숙주의 제조는 천연 HSA 유전자가 사용되는 방법(유럽 특허원 제73646호에 상응하는 일본국 특허원 제58-56684호, 유럽 특허원 제91527호에 상응하는 일본국 특허원 제58-150517호), 변형된 사람 혈청 알부민 유전자가 사용되는 방법(유럽 특허원 제206733호에 상응하는 일본국 특허원 제1-98486호 및 제62-29985호), 합성 시그날 서열이 사용되는 방법(유럽 특허원 제329127호에 상응하는 일본국 특허원 제1-240191호), 혈청 알부민 시그날 서열이 사용되는 방법(유럽 특허원 제319641호에 상응하는 일본국 특허원 제2-167095호), 재조합 플라스미드가 염색체내로 도입되는 방법(유럽 특허원 제399455호에 상응하는 일본국 특허원 제 3-72889호), 숙주가 융합되는 방법(유럽 특허원 제409156호에 상응하는 일본국 특허원 제3-53877호), 메탄올-함유 배지에서 돌연변이를 발생시키는 방법, 돌연변이 체 AOX2 프로모터가 사용되는 방법(유럽 특허원 제50640호), HSA를 바실러스 서브틸리스에서 발현시키는 방법(유럽 특허원 제229712호에 상응하는 일본국 특허원 제 62-215393호), HSA를 효모에서 발현시키는 방법(유럽 특허원 제123544호에 상응하는 일본국 특허원 제60-41487호, 유럽 특허원 제248657호에 상응하는 일본국 특허 원 제63-39576호, 및 유럽 특허원 251744호에 상응하는 일본국 특허원 제63-74493호), 및 HSA를 피카아에서 발현시키는 방법(유럽 특허원 제344459호에 상응하는 일본국 특허원 제2-104290호)을 사용하여 달성할 수 있다.

이들 방법중에서, 메탄올-함유 배지에서 돌연변이를 유도하는 방법은 다음과 같이 수행된다. 적절한 숙주, 바람직하게는 피키아 효모, 예를 들면, 균주 GTS115(NRRL 기탁 번호 Y-15851)의 형질전환체는, HSA가 AOX₁프로모터의 조절하에서 발현되는 전사 단위를 함유하는 플라스미드를 숙주의 AOX₁유전자 영역에 도입시킴으로써 통상의 방법으로 수득된다(일본국 특허원 제2-104290호 참조). 이러한 형질전환체는 메탄올-함유 배지에서는 거의 성장하지 않는다. 결과적으로, 이러한 형질전환체는 돌연변이를 일으키도록 메탄올-함유 배지에서 배양시키고, 배지에서 성장할 수 있는 균주를 분리한다. 배지의 메탄올 농도는 예를 들면, 0.0001 내지 5% 범위일 수 있다. 배지는 합성 배지이거나 천연 배지일 수 있다. 배양 과정은 예를 들면 15 내지 40℃의 온도에서 적절하게는 1 내지 1000시간 동안 수행될 수 있다.

HSA-생성 숙주의 배양은, 전술한 특허에 기술된 각각의 방법; 생산자 세포에 대한 고농도 기질 억제를 회피하기 위하여, 글루코스, 메탄올 등의 고농도 용액을 적절한 소량으로 점진적으로 공급하는 방법으로 수행되는 공급-회분식 배양(fed-batch culture)(반-회분식 배양)에 의해 생산자 세포 및 생성물이 고농도로 수득되는 방법(일본국 특허원 제3-83595호); 또는 지방산을 배양 배지에 첨가하여 HSA 생성율을 향상시키는 방법(유럽 특허원 제504823호 및 미합중국 특허 제 5,334,512호에 상응하는 일본국 특허원 제4-293495호)에 의해 달성될 수 있다.

탄소수 10 내지 26의 지방산 또는 이의 염이 보충된 당해 분야에 일반적으로 사용되는 배지는 형질전환된 숙주의 배양용 배지로 사용될 수 있으며, 형질전환체의 배양은 공지된 조건하에서 수행될 수 있다. 배지는 합성 배지이거나 천연 배지일 수 있으나, 바람직하게는 액체 배지이다. 예를 들면, 적합한 합성 배지는 각종 사카라이드와 같은 탄소원, 요소, 암모늄 염, 질산염 같은 질소원; 각종 비타민, 뉴클레오타이드 같은 미량 영양소; 및 Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co 및 Cu 같은 무기 염으로 구성될 수 있다. 이와 같은 배지의 실례는 0.7% 효모 질소 베이스(Yeast Nitrogen Base)(Difco) 및 2% 글루코스로 이루어진 YNB 액체 배지이다. 유용한 천연 배지는 예를 들면, 1% 효모 추출물(Difco), 2% 박토 펩톤(Difco) 및 2% 글루코스로 구성된 YPD 액체 배지이다. 배지의 pH는 중성, 약 염기성 또는 약 산성일 수 있다. 메틸요구성(methylotrophic) 숙주의 경우, 배지는 약 0.01 내지 5% 양의 메탄올로 추가 보충될 수 있다.

배양 온도는 바람직하게는 15 내지 43℃(효모의 경우 20 내지 30℃, 세균의 경우 20 내지 37℃) 범위이다. 교반 및 통기하의 회분식, 반-회분식 또는 연속 배양 또는 정치 또는 진탕식 배양에 의한 배양기간은 1 내지 1000시간, 바람직하게는 20 내지 360시간의 범위이다. 교반 및 통기하의 회분식, 반회분식 또는 연속식 배양 또는 정치 또는 진탕식 배양에 의한 회분식 배양에 앞서 시드 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 시드 배양은 전술한 YNB 액체 배지 또는 YPD 액체 배지를 사용하여 바람직하게는 30℃(효모의 경우) 또는 37℃(세균의 경우)에서 10 내지 100시간 동안 수행될 수 있다.

(2) rHSA의 정제

(i) 가열 처리

본 발명에 따르는 rHSA 정제 방법에서, 전술한 배양 단계에서 수득된 HSA-생성 숙주의 배양 배지는 숙주 세포를 함유한 채로, 원심분리나 한외여과 막 처리같은 여타의 분리 과정을 수행함이 없이 직접 가열 처리할 수 있다. 즉, 가열 처리는 본 발명의 정제 과정에서는 제1단계에서 수행될 수 있다.

가열은 일반적으로 50 내지 100℃에서 1분 내지 10시간, 바람직하게는 60 내지 80℃에서 20분 내지 3시간 동안, 더욱 바람직하게는 68℃에서 30분간 수행된다. 이러한 처리 과정은 안정화제의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 안정화제에는 예를 들면, 아세틸트립토판, 탄소수 6 내지 18의 유기 카복실산 및 이의 염이 포함된다. 이들 안정화제는 함께 사용될 수도 있다. 아세틸트립토판은 최종 농도가 예를 들면, 약 1 내지 100mM이 되도록 하는 양으로 첨가된다. 탄소수 6 내지 18의 유기 카복실산에는 예를 들면, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 팔미트산, 및 올레산이 포함된다. 10mM의 카프릴산을 사용하는 것이 바람직하다. 이의 염에는 예를 들면, 알칼리 금속염(나트륨 염, 칼륨 염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염 등)이 포함된다. 탄소수 6 내지 18의 이들 유기 카복실산 또는 이들의 염은 예를 들면, 약 1 내지 100mM의 양으로 첨가될 수 있다.

가열로 초래되는 착색화를 억제하기 위해서는, 약 1 내지 100mM, 바람직하게는 5 내지 30mM의 티올 화합물(예를 들면, 머캅토에탄올, 시스테인, 환원 글루타티온 등) 및, 바람직하게는 추가로 10 내지 1,000mM의 아미노구아니딘을 가열 단계에서 첨가하는 것이 효과적이다(일본국 특허원 제3-103188호).

통상의 방법에 있어서는, 숙주 배양 배지를 원심분리하거나 여과하여 수득한 상층액(여액) 또는 세포를 가열시킨다. 이는 세포를 함유하는 배양 배지를 직접 가열할 경우, 불순물, 지질, 핵산, 프로테아제 등의 누출로 표적 물질의 정제에 원치않는 영향을 미치게 할 것을 우려하기 때문이다. 즉, 세포 함유 배양 배지의 직접 가열이 표적 물질의 정제에 효과적인지 아닌지는 알려져 있지 않다.

그러나, 본 발명에 따라, rHSA 및 숙주 세포를 함유하는 배양 배지를 직접 가열시키는 경우, rHSA의 구조적 기능 또는 이의 수율 어느 것도 저하되지 않았지만 배양 배지에 함유된 강력한 프로테아제는 효과적으로 불활성화될 수 있음이 밝혀졌다. 즉, 프로테아제의 불활성화 과정이 단순화될 수 있다. 더욱이, 유전자 조작에 의해 수득된 HSA는 이하에서 기술하게 될 과정에 의해 효과적으로 정제될 수 있다.

(ii) 가열 용액의 희석 및 이의 특성의 조절

상기(i)에서 수득한 가열 용액을 이어서 유동층에 현탁시킨 흡착제 입자로 처리한다. 이러한 처리에 앞서, 이 가열 용액이 흡착제 입자와 0.1 내지 50mS, 바람직하게는 0.5 내지 35mS, 더욱 바람직하게는 5 내지 15mS의 전기 전도율의 환경 하에서 접촉되도록 가열 용액을 희석시키는 것이 바람직하다. 하기의 시험 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 흡착제 입자에 결합하는 rHSA의 양은, 가열 용액의 희석율이 상승하고 가열 용액이 흡착제 입자와 접촉하는 환경의 전기 전도율이 저하됨에 따라 증가하고, 대략 8 내지 12mS의 전기 전도율에서 최대 수준에 도달한다. 희석제로서 사용되는 용매는, 가열 용액중의 rHSA의 구조적 기능이 이에 의해 저하되지 않는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이는 흡착 조건을 고려하여 적절히 선택될 수 있다. 희석제로는 예를 들면, 50mM 이하 농도의 아세테이트 완충액 및 증류수가 있다. 편의상 증류수를 사용하는 것이 바람직하다.

이어서, 용액의 pH값은 흡착제 입자에 의한 흡착에 적합한 산성 수준으로 조절된다. 일반적으로 pH 3 내지 5, 바람직하게는 pH 4 내지 4.8, 더욱 바람직하게는 약 pH 4.5로 조정한다. 비록 여타의 산성 용액이 pH의 조절용으로 사용될 수 있지만, 아세트산을 사용하는 것이 바람직하다.

(iii) 흡착제 입자 처리

희석 및 pH 값의 조절 후, 생성된 가열 용액을 흡착제 입자와 접촉시킨다.

흡착제 입자에는 예를 들면, 설포 그룹형 또는 카복실 그룹형의 흡착제 입자와 같이, 양이온 교환 그룹을 갖는 담체(즉, 양이온성 흡착제)가 포함된다. 설포 그룹형 흡착제 입자의 예를 들면, 설포-아가로스(스트림라인 SP, S-세파로스, 양자 모두 Pharmacia사 제조), 설포-셀룰롤스(S-Cellulofine, Chisso Corp. 제조). 설포프로필-아가로스(SP-세파로스, Pharmacia사 제조), SP-Cellthru-Big Beads(Sterogene사 제조), 설포프로필-덱스트란(SP-세파덱스, Pharmacia사 제조) 및 설포프로필-폴리비닐(SP-Toyopearl, Tosoh Corp. 제조)이 있다. 카복실 그룹형의 흡착제 입자의 예를 들면, 카복시메틸-아가로스(CM-Cellthru-Big Beads, Sterogene사 제조), 카복시메틸-덱스트란(CM-세파덱스, Pharmacia사 제조) 및 카복시메틸-셀룰로스(CM-Cellulofine, Chisso Corp. 제조)이 있다. 설포 그룹형의 강한 양이온성 흡착제 입자를 사용하는 것이 바람직하며, 스트림라인 SP(Pharmacia사 제조)가 특히 바람직하다.

흡착제 입자의 크기는 일반적으로 예를 들면 30 내지 1100μm, 바람직하게는 100 내지 3000μm의 범위이다.

접촉 과정은 약 3 내지 5, 바람직하게는 약 4 내지 4.8, 더욱 바람직하게는 약 4.5의 pH 값, 및 약 0.01 내지 0.2M, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.1M의 염 농도에서 수행될 수 있다.

전술한 접촉 조건하에서 흡착제 입자를 예비적으로 평형화시키는 것이 바람직하다. 특히, 50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로흡착제 입자를 평형화시키는 것이 바람직하다.

하기의 과정에 따라, 흡착제 입자를 일반적으로 평형화시키고 샘플을 흡착제 입자 함유 유동층에 주입하며, 흡착제 입자와 접촉시킨 다음 유동층으로부터 용출시킨다.

즉, 전술한 흡착제 입자를 우선 적절한 컬럼에 충전하고 침지시킨다. 이어서, 평형 완충액을 컬럼의 저부 입구로부터 상부 방향으로 공급함으로써 흡착제 입자를 현탁시킨다. 이 단계에서, 컬럼내 상부로 유동하는 완충액의 유속은 중력에 의해 침강하는 흡착제 입자에 대한 균형력으로서 작용하므로, 흡착제 입자는 평형 상태에서 균일하게 현탁된다(즉, 소위 유동층) 전술한 유동층이 형성되는 컬럼내로, 상기 (i) 가열 및 (ii) 희석 단계에 따라 처리된, 세포를 함유하는 조 배양 배지가 컬럼의 저부 입구로부터 상부 방향으로 공급된다. 이후, 표적 rHSA는 흡착제 입자에 결합하는 반면에, 숙주 세포 또는 배양 배지 기원의 미세 입자 및 불순물은 유동층내 흡착제 입자 사이를 통과하므로, 컬럼의 상부 입구로부터 배출된다. 또한, 흡착제 입자에 약하게 결합된 불순물은 계속적으로 상부 방향으로 공급되는 세척 완충액으로 세척된다. 이들 과정은 팽창 베드 흡착 기술[참조 문헌: Journal of Chromatography, 597 (1992), 129-145]에 따라 수행하는 것이 바람직하다.

세척 완충액으로서, 평형 완충액이 사용된다.

표적 단백질, 즉, rHSA는 유동 방향을 역전시키고 용출 완충액을 컬럼의 상부 입구로부터 하부 방향으로 공급함으로써 회수된다. rHSA의 용출은 약 8 내지 10, 바람직하게는 약 8.5 내지 9.5, 더욱 바람직하게는 약 9 범위의 pH값, 및 약0.2 내지 0.5M, 바람직하게는 약 0.3 내지 0.4M 범위의 염 농도에서 수행될 수 있다. 용출 완충액의 특정 예는 0.3M의 염화나트륨을 함유하는 0.1M 포스페이트 완충액(pH 9)이다.

흡착제 입자의 평형, 흡착제 입자 함유-유동층으로의 샘플의 주입, 흡착제 입자와의 접촉, 유동층으로부터의 용출 등을 포함한 전술한 작업 과정은 스트림라인 컬럼(흡착제: 스트림라인 SP, Pharmacia사 제조)과 함께 제공된 스트림라인 시스템(Pharmacia사 제조)을 사용함으로써 고재현률로 용이하게 효과적으로 수행될 수 있다.

이렇게 하여, 고순도의 rHSA가 수득될 수 있다. 흡착제 입자를 사용하여 전술한 처리에 의해 수득된 rHSA의 순도는 압축-한외여과 막 처리- 가열-한외여과 막 처리-양이온 교환제 처리를 포함하는 수 단계로 이루어진 통상의 방법으로 수득된 rHSA의 순도에 거의 필적한다. 더욱이, 흡착제 입자를 사용한 처리에 앞서 배양 배지를 가열함에 따라 rHSA가 안정한 형태로(즉, 분해됨이 없이) 고수율로 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하여, 전술한 통상의 rHSA 정제 방법의 다수의 단계를 5단계에서 2단계로 단축, 즉 정제 기간이 크게 단축될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 통상의 방법과 비교해서, 배양 배지로부터 rHSA의 수율이 상승될 수 있다.

이러한 처리로 수득된 rHSA는 통상적인 정제 방법에 의해 추가 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 정제 방법에는 예를 들면, 소수성 크로마토그래피, 한외 여과 막 처리, 음이온 교환제 처리, 킬레이트 수지 처리 및 붕산/붕산염 처리와 같은 당해 분야에 통상적으로 사용되는 방법들이 포함된다. 이들 처리 방법중 하나를 사용하거나 이들을 병행해서 사용할 수 있다. 향상된 품질의 정제된 rHSA 생성물을 수득하기 위해서는, 소수성 크로마토그래피, 한외여과 막 처리, 음이온 교환제 처리, 한외여과 막 처리, 킬레이트 수지 처리, 붕산/붕산염 처리 및 한외여과 막 처리의 순으로 수행하는 것이 바람직하다.

전술한 정제 과정에 앞서, 용액을 환원제의 존재하에 흡착제 입자와 접촉시킨 후 용출된 흡착 분획을 재차 가열하는 것이 바람직하다. 하기의 시험 실시예 6에서 제시된 바와 같이, 이러한 가열 처리는 이 과정이 생략된 경우와 비교해서 비록 rHSA의 수율이 이에 의해 영향을 받지는 않지만, rHSA의 특징적 착색도를 저하시키는데 매우 효과적이다. 즉, 이러한 가열 처리 과정으로 후속 정제 과정에 의한 착색 물질을 상당히 제거할 수 있다.

가열 온도는 일반적으로 50 내지 100℃, 바람직하게는 약 60 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 60℃이다. 가열 기간은 보통 10분 내지 10시간, 바람직하게는 약 30분 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 1시간이다.

본원에서 사용되는 환원제는, 환원 효과를 갖는 한은 특별히 제한되지 않는다. 환원제에는 예를 들면, SH 그룹이 있는 저 분자량 화합물(예를 들어, 시스테인, 시스테아민, 시스타민, 메티오닌, 글루타티온 등), 설파이트, 피로설파이트, 포스포러스 피로셀파이트 및 아스코브산이 포함된다. 시스테인이 바람직하게 사용된다. 첨가 수준과 관련하여, 예를 들면, 시스테인은 약 1 내지 100mM의 최종 농도를 부여하는 양으로 첨가될 수 있는 반면에, 설파이트는 약 0.001 내지 10%의 최종농도를 부여하는 양으로 첨가될 수 있다.

이러한 처리 과정은 안정화제의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 안정화제의 예에는 아세틸트립토판 및 탄수소 6 내지 18의 유기 카복실산 또는 이의 염이 포함된다. 이들 안정화제는 함께 사용될 수도 있다. 아세틸트립토판은 예를 들면, 용액중 최종 농도 약 1 내지 100mM을 부여하는 양으로 첨가될 수 있다. 탄소수 6 내지 18의 유기 카복실산에는 예를 들면, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 팔미트산 및 올레산이 포함된다. 10mM의 카프릴산을 사용하는 것이 바람직하다. 이들의 염에는 예를 들면, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(예: 칼슘염 등)이 포함된다. 탄소수 6 내지 18의 이들 유기 카복실산 및 이들의 염은 예를 들면, 약 1 내지 100mM의 양으로 첨가될 수 있다. 10 내지 1,000mM의 아미노구아니딘을 추가로 첨가함으로써, 가열에 기인한 착색을 억제시킬 수 있다(일본국 특허원 제3-103188호).

(a) 소수성 크로마토그래피

소수성 크로마토그래피는 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 소수성 크로마토그래피용 담체에는 예를 들면, 탄소수 4 내지 18의 알킬 그룹(부틸 그룹, 옥틸 그룹, 옥틸데실 그룹 등) 또는 페닐 그룹을 갖는 불용성 담체가 포함된다. 페닐-셀롤로스(페닐-Cellulofine, Chisso Corp. 제조)와 같은 페닐 그룹을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 단계에서, rHSA는 비흡착 분획내로 회수될 수 있다. 접촉 과정은 예를 들면 약 pH 6 내지 8, 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 7 및 약 0.01 내지 0.5M, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.2M의 염 농도에서 수행될 수 있다.

(b) 음이온 교환제 처리

음이온 교환제 처리도 또한 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 음이온 교환 그룹을 갖는 불용성 담체인 한, 어떠한 음이온 교환제도 사용될 수 있다. 음이온 교환 그룹에는 예를 들면, 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹 및 4급 아미노에틸(QAE) 그룹이 포함된다. DEAE-아가로스(DEAE-세파로스, Pharmacia사 제조), DEAE-덱스트란(EDAE-세파덱스, Pharmacia사 제조) 및 DEAE-폴리비닐(DEAE-Toyopearl, Tosoh Corp. 제조)와 같이 DEAE 그룹을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 단계에서, rHSA는 비흡착 분획내로 회수될 수 있다. 접촉 과정은 예를 들면, 약 pH 6 내지 8, 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 7, 및 약 0.01 내지 0.1M의 염 농도에서 수행될 수 있다.

이러한 음이온 교환제 처리에 의하여, 착색 물질 및 미량의 불순물이 제거될 수 있다.

(c) 한외여과 막 처리

소수성 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환제 처리를 마친후, 회수된 rHSA-함유 분획을 바람직하게는 한외여과 막 처리에 적용한다. 이러한 한외여과 막 처리에 의해, 발열 물질이 제거될 수 있다. 한외여과 막 처리에 있어서, 분자량 컷 오프가 100 내지 300K인 한외여과 막을 사용하는 것이 바람직하다. 이의 특정한 예로서 펠리콘(Pellicon) 카세트 막 100K(Millipore사 제조)가 언급될 수 있다.

(d) 킬레이트 수지 처리

킬레이트 수지 처리는 유전자 조작으로 수득한 HSA에 특징적인 착색 물질을 제거하는데에 특히 효과적이다. 전술한 정제 과정에서, 이러한 처리 단계는 바람직하게는 소수성 크로마토그래피-한외여과 막 처리-음이온 교환제 처리-한외여과 막 처리에 이어서 수행된다. 이는 특이성 리간드를 갖는 킬레이트 수지를 rHSA와 접촉시키는 방법으로 수행되며 rHSA는 통과된 분획에서 수득된다. 킬레이트 수지의 담체 부분이 소수성을 지닌것이 바람직하다. 이러한 것들에는 예를 들면, 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 및 아크릴산/메타크릴산 공중합체가 포함된다. 한편, 킬레이트 수지의 리간드 부분에는 예를 들면, N-메틸글루카민과 같은 폴리올 그룹, 분자내에 다수의 이미노 그룹, 아미노 그룹, 에틸렌이미노 그룹들을 갖는 (폴리에틸렌 폴리아민과 같은 폴리알킬렌 폴리아민을 포함한) 폴리아민 그룹 및 티오우레아 그룹이 포함된다. DIAION CRBO2(리간드: N-메틸글루카민 그룹, Mitsubishi Kasei Corp. 제조), LEWATIT TP 214(리간드: -NHCSNH₂, Bayer사 제조) 및 Amberlite CG4000과 같이, 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 담체를 갖는 시판 제품을 사용하는 것이 편리하다.

이러한 킬레이트 수지 처리를 위한 적절한 조건은 다음과 같다.

pH : 산성, 중성 또는 염기성 (pH 3 내지 9, 바람직하게는 pH 4 내지 7)

기간 : 1시간 이상, 바람직하게는 6시간 이상,

이온 농도 : 50mmho 이하, 바람직하게는 1 내지 10mmho

혼합비 : HSA 250mg당 수지 0.1 내지 100g, 바람직하게는 1 내지 10g (습윤질량 기준)

(e) 붕산/붕산염 처리

전술한 처리에 의하여 수득한 rHSA-함유 용액을 붕산 또는 붕산염(본원에서는 붕산/붕산염으로 언급함)으로 추가 처리함으로써, 페놀-황산법에 의해 검출가능한 비항원성 부재 불순물 및 숙주 기원의 항원성을 띄는 불순물이 제거될 수 있다.

본원에서 사용될 수 있는 붕산에는 예를 들면, 오르토 붕산, 메타붕산 및 테트라붕산이 포함된다. 붕산염에는 예를 들면, 알칼리 금속염(예: 나트륨 염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(예: 칼슘염 등)이 포함된다. 칼슘 사붕산염을 사용하는 것이 바람직하다. 붕산 또는 붕산염은 약 0.01 내지 1M, 바람직하게는 약 0.5 내지 0.2M의 최종 농도를 부여하는 양으로 첨가될 수 있다. 이러한 처리 과정은, 예를 들면, 약 pH 8 내지 11, 바람직하게는 약 pH 9 내지 10에서 약 1 내지 100시간, 바람직하게는 약 5 내지 50시간 동안 수행된다. 이 단계에서, 낮은 전기 전도율을 갖는 rHSA-함유 용액이 더욱 바람직하다. 예를 들면, rHSA-함유 용액의 전기 전도율은 1mS 이하이다. 또한, 높은 rHSA 농도를 갖는 rHSA-함유 용액이 더욱 바람직하며, 예를 들면 5% 이상, 바람직하게는 약 15 내지 25%이다.

전술한 붕산/붕산염 처리를 마친후, rHSA는 원심분리 또는 한외여과와 같은 통상적인 방법에 의해 상층액으로부터 회수된다.

(3) 유전자 조작 기원의 고순도 HSA의 특성

이렇게 하여 수득된 고순도 rHSA는 분자량이 약 67,000이고 등전점이 4.9인 균질상 물질이다. 이는 단량체만으로 이루어지며, 이량체, 중합체 또는 분해 생성물(분자량: 약 43,000)은 실질적으로 존재하지 않는다. 또한, 생산자 숙주 기원의 여타의 항원성 불순물 또는 폴리사카라이드도 실질적으로 존재하지 않는다.250mg/ml의 rHSA 용액(25% 용액)으로 제형될 때 A350/A280비가 0.015 미만, 바람직하게는 0.013 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 0.015이다. 이처럼 감소된 착색도(즉, 낮은 A350/A280 값)를 갖는 rHSA는 공지의 정제 기술[전술한 기술(a) 내지 (e)등]을 적절히 병행하여 사용함으로써 수득될 수 있다.

본 발명에 의하여, rHSA의 25% 용액으로 제형화하는 경우 0.015 미만의 A350/A280 비를 나타내는 재조합 HSA(또는 이를 함유하는 조성물)를 처음으로 제공할 수 있게 되었다.

(4) 제형화

본 발명에 방법에 의해 수득된 rHSA는 공지의 방법(한외여과 막 처리, 안정화제의 첨가, 살균 여과, 피펫팅, 동결 건조 등)에 의해 제제로 제형화될 수 있다. 이렇게 하여 수득된 rHSA 제제는 혈장 기원의 통상적인 HSA의 경우에 사용되는 것들과 동일한 용량 및 동일한 방법으로 혈장 알부민 제제로서 임상 목적으로 적용될 수 있다. 이들은 또한 약제용 안정화제, 충전제 또는 담체로서도 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "rHSA-함유 조성물"이란 용어는 100% 미만의 고농도의 본 발명에 따른 고순도 rHSA를 미량의 기타 성분(들)과 함께 함유하는 물질을 의미한다.

하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하며 이로써 제한되지는 않는다.

실시예 1

(1) 배양 배지의 가열 처리

HSA-생성 효모 피키아 파스토리스를 입수하여 유럽특허원 제655503호에 기술된 방법에 따라 배양했다.

이렇게 하여 수득된 세포를 함유하는 배양 배지 약 2.8ℓ 를 그 자체로 30분간 68℃로 가열했다. 가열 처리는 10mM의 나트륨 카프릴레이트 존재하에 수행했다. 상기 배양 배지는 pH 값이 6이었다. 이어서, 가열 용액을 약 15℃로 급히 냉각시키고 증류수를 사용하여 약 2배로 희석시켰다(총 용적: 5.5ℓ). 이어서, 아세트산 용액으로 이의 pH 값을 4.5로 조절했다.

(2) 흡착제 입자 처리(스트림라인 SP처리)

50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화 시킨 스트림라인 SP 컬럼(C50, 5x100cm, 겔 용적: 300ml, Pharmacia사 제조)에 전술한 가열 처리(1)에 의해 수득된 효모 세포를 함유하는 배양 배지(전기 전도율 : < 10mS) 5.5ℓ 를 상부 방향으로 공급했다. 교반하에 100cm/h의 유속으로 공급했다. 이어서, 컬럼의 평형화에 사용된 것과 동일한 완충액(컬럼 용량 2.5배의 용적)을 컬럼내 상부 방향으로 공급하여, 컬럼을 100cm/h 유속으로 1시간 동안, 이어서 300cm/h 유속으로 30분 동안 세척했다. 이어서, 유동 방향을 역전시키고 용출제[염화나트륨 300mM을 함유하는 100mM 포스페이트 완충액(pH 9), 유속 : 50cm/h]를 컬럼내로 공급했다. 이에 따라 rHSA를 함유하는 분획이 수득되었다.

이와 같이 하여 용출된 rHSA-함유 분획을 280nm에서의 흡광도를 측정하여 검출했다.

(3) 가열 처리

이와 같이 하여 수득된 rHSA-함유 분획을 60℃에서 1시간 동안 10mM의 시tm테인, 5mM의 나트륨 카프릴레이트 및 100mM의 아미노구아미딘 하이드로클로라이드 존재하에 pH 7.5에서 가열했다.

(4) 소수성 크로마토그래피

상기(3)에서 가열된 rHSA 용액을, 0.15M의 염화나트륨을 함유하는 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.8)으로 평형화시킨 페닐-Cellulofine(5x25cm, 겔 용적 : 500ml, Chisso Corp. 제조)으로 충전시킨 컬럼에 부었다. 이러한 조건하에서, rHSA는 페닐-Cellulofine 컬럼에 의해 흡착되지 않고 이를 통과했다. 컬럼을 통과하는 rHSA-함유 용액을 분자량 컷 오프가 30,000인 한외여과 막(Millipore사 제조)을 사용하여 약 0.2ℓ 의 용적이 되도록 농축하고, rHSA-함유 용액을 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.8)으로 대체했다.

(5) 음이온 교환제 처리

소수성 크로마토그래피를 마친 후, 농축하고 완충액을 대체한 rHSA-함유 용액을, 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.8)으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 FF(5x25cm, 겔 용적: 500ml, Pharmacia사 제조)로 충전시킨 컬럼에 부었다. 이러한 조건하에서, rHSA는 DEAE-세파로스 컬럼에 흡착되지 않고 이를 통과했다. 컬럼을 통과하는 rHSA를 분자량 컷오프가 30,000인 한외여과막(Millipore사 제조)을 사용하여 약 0.2ℓ 의 용적이 되도록 농축한 다음, rHSA-함유 용액을 증류수로 대체했다.

(6) 킬레이트 수지 처리

농도가 약 7%인 정제된 rHSA 0.2ℓ 에 아세트산을 가하여 pH 값을 4.5로 조절했다. 이어서, 이를 50mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화시킨 DIAION CRBO2 (5x2.5cm, 겔 용적: 500ml, Mitsubishi Kasei Corp. 제조)로 충전시킨 컬럼에 붓고 밤새 순환시켰다. 이러한 조건하에서, rHSA는 겔에 의해 흡착되지 않고 컬럼을 통과했다.

(7) 붕산/붕산염 처리

rHSA 농도를 2.5%로 조정하는 한편, 용액의 전기 전도율은 1mS 이하로 조절했다. 여기에 최종 농도가 100mM이 되도록 나트륨 사붕산염을 가했다. 이어서, 염화칼슘을 가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 하면서, pH값은 9.5에서 유지시켰다. 약 10시간 동안 정치시킨 후, 이렇게 하여 형성된 침전물을 제거하고 상층액을 회수하여 농축 및 탈염시켰다. 이어서, 분자량 컷오프가 30,000인 한외여과막 Millipore사 제조)을 사용하여 농축한 다음 완충액을 대체했다. 필요한 경우, 안정화제(나트륨 카프릴레이트 및 아세틸트립토판)를 가하고, 이어서 0.22μ m 필터(Millipore사 제조)를 사용하여 여과 멸균을 수행했다. 생성된 rHSA 용액은 주사용으로 사용될 수 있다.

시험 실시예 1

rHSA 배양 배지에 미치는 가열 처리의 안정화 효과

rHSA 배양 배지에 함유되어 있는 강력한 프로테아제가 rHSA를 분해한다는 사실이 공지되어 있다. 표 1에서 보여 주는 바와 같이, rHSA의 분해는 pH 4의 산성 조건하에서 급속하게 진행된다.

[표 1]

rHSA 배양 배지의 pH 안정성

rHSA는 스트림라인 SP에 의해 약 pH 4.5에서 흡착되었다. 즉, 약 pH 4.5에서의 rHSA의 안정성을 검사하고, rHSA를 안정한 상태로 유지하기 위한 예비 처리로서 프로테아제의 불활성화에 효과적인 가열 조건은 가열 용액의 pH값을 4.5로 조절하고 이를 실온에서 밤새 정치시킨 후에 rHSA의 안정성을 측정함으로써 검사되었다. 결과를 제1도에 나타냈다. 가열 단계에서, 나트륨 카프릴레이트를 각 샘플에 가하여 최종 농도 10mM을 수득했다. 사용된 가열 조건은 다음과 같다.

A : 대조군

B : 68℃, 30분, pH 6.0.

C : 68℃, 30분, pH 6.8.

D : 68℃, 30분, pH 7.5.

E : 68℃, 30분, pH 8.2.

F : 60℃, 2시간, pH 6.0.

G : 60℃, 2시간, pH 6.8.

H : 60℃, 2시간, pH 7.5.

I : 60℃, 2시간, pH 8.2.

J : 60℃, 2시간, pH 6.8, 시스테인 10mM.

K : 60℃, 2시간, pH 7.5, 시스테인 10mM.

L : 실온 (25℃), 2시간, pH 6.0.

M : 실온 (25℃), 2시간, pH 8.2.

결과적으로, 60℃로 2시간 동안 가열하는 것 보다는 68℃로 30분간 가열하는 것이 더욱 효과적이었다. pH값과 관련하여, 가장 바람직한 결과는 가열할 배양 배지의 초기 pH 값인 약 pH 6에서 수득되었다.

시험 실시예 2

rHSA 배양 배지의 pH값과 흡착제에 대한 결합능간의 관계

배양 배지(rHSA: 55.6mg)의 pH값을 아세트산을 사용하여 다양한 수준(pH 4.5 내지 4.9)으로 조절하고 이어서 50mM 아세테이트 완충액으로 평형화시킨 1ml의 스트림라인 SP 겔을 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 혼합 및 교반하고, 각 평형 완충액으로 세척한 후, 비흡착 분획에 잔류하는 rHSA의 양(%)을 측정했다. 결과적으로, 흡착제에 결합하는 rHSA의 양은 pH값의 감소에 따라 증가했고 약 pH 4.5에서 최고치를 이룬것으로 밝혀졌다(표 2).

[표 2]

rHSA 배양 배지의 pH값 및 겔에 대한 결합능

시험 실시예 3

가열 용액과 흡착제 입자의 접촉을 위한 환경의 전기 전도율과 흡착제 입자에 대한 rHSA의 결합능간의 관계

가열 후, 배양 배지[전기 전도률: 약 20mS(25℃에서), rHSA: 47.1mg]를 증류수를 사용하여 다양한 희석액으로 희석시키고 각 희석액의 pH값을 아세트산을 사용하여 4.5로 조절한 다음, 50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화시킨 스트림라인 SP 겔 1ml를 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 혼합하고 평형 완충액으로 세척한 후에, 0.3M의 염화나트륨을 함유하는 0.1M 포스페이트 완충액(pH 9)으로 rHSA를 용출시켰다. 결과적으로, 희석율의 증가와 용액의 전기 전도율의 감소에 따라 흡착제 입자에 결합하는 rHSA의 양이 증가하고, 가열 용액이 흡착제 입자와 접촉되는 환경(겔 혼합물중)의 전기 전도율인 약 8 내지 12mS에서 최대 수준에 도달한 것으로 밝혀졌다(제2도).

시험 실시예 4

스트림라인 SP 용출액의 안정성

배양 배지를 증류수로 2배로 희석시키고 pH값을 아세트산을 사용하여 4.5로 조절했다. 이어서, 여기에 50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화시킨 소정량의 스트림라인 SP 겔을 가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. 이어서, 겔을 평형 완충액으로 세척하고 0.3M의 염화나트륨을 함유하는 0.1M 포스페이트 완충액(pH 9)을 사용하여 rHSA를 용출시켰다. 이어서, 분획(pH 8)내 rHSA의 안정성을 검사했다. 결과적으로, 예비 가열한(68℃, 30분) 배양 배지중의 rHSA는 3일 후 아무런 변화도 보이지 않은 반면에, 비처리 배양 배지 기원의 rHSA는 분해로 인하여 약 50%로 감소했다(표 3)

[표 3]

스트림라인 SP용출액의 안정성(실온, 3일간, pH 8)

시험 실시예 5

(가열→흡착제 입자)처리와 (비가열→흡착제 입자)처리간의 rHSA 수율 및 착색도의 비교

시험 실시예 1 내지 4의 결과를 토대로 하여, 가열→ 흡착제 입자 처리 과정의 최적 흐름도가 정립되었다(제3도).

제3도의 흐름도에 따라, 스트림라인 SP 컬럼(5x100cm, 겔 용적 : 300ml)을 사용하여 효모 세포를 함유하는 배양 배지(2.8ℓ)로 부터 rHSA를 정제하려는 시도가 행해졌다. 한편, 효모 세포를 함유하는 배양 배지(2.7ℓ)를 초기 가열없이 흡착제 입자로 처리하여 rHSA를 정제했다.

결과적으로, (비가열→흡착제 입자) 처리에 의해 달성된 총 수율은 50%인 반면에, 본 발명에 따른 (가열→흡착제 입자) 처리에 의해서는 더 높은 총 수율(약 85%)이 달성되었다. 또한, (비가열→흡착제 입자) 처리에 의해 수득된 rHSA는 A350/A280에서 0.048의 착색도를 보인 반면에, 본 발명의 (가열→흡착제 입자) 처리에 의해 수득된 rHSA는 더 낮은 착색도(0.0345)를 나타냈다(표 4). (가열→흡착제 입자) 처리에 있어서 스트림라인 SP 용출액의 겔 여과 HPLC 프로필과 (비가열→흡착제 입자) 처리에 있어서 스트림라인 SP 용출액의 겔 여과 HPLC 프로필간의 비교 결과를 제4도에 나타냈다. 후자에서는 rHSA가 심하게 분해되고 붕괴됨을 알 수 있다.

[표 4]

스트림라인 SP 컬럼에 의한 rHSA의 정제

시험 실시예 6

rHSA의 착색도에 미치은 시스테인 존재하의 가열 효과

출발 물질로서 사용된, 상기 표 4의 (가열→흡착제 입자) 처리에 있어서 스트림라인 SP 컬럼으로부터의 rHSA 용출액을 실시예 1 (4) 및 (5)에 기술된 소수성 크로마토그래피 및 음이온 교환제 처리를 하고 착색도(A350/A280)를 평가했다. 이 평가에서, 스트림라인 SP 용출액의 두 샘플, 즉, 시스테인의 존재하에 가열하여 생성된 샘플(최종 농도: 10mM) 및 시스테인 존재하에 가열없이 생성된 다른 샘플을 사용했다. 결과적으로, 이들 두 샘플의 rHSA의 수율은 시스테인의 존재와 무관하게 거의 동일했다. 그러나, 착색도와 관련하여, 시스테인 존재하에 가열한 샘플은 음이온 교환제 처리후 비가열 샘플의 0.0184와 비교하여 현저히 낮은 0.0128을 나타냈다(표 5).

[표 5]

스트림라인 단계 후 rHSA의 정제

시험 실시예 7

스트림라인 SP 처리에 의한 rHSA의 착색도(A350/A280) 감소

음이온 교환제 처리 단계까지, 통상적인 방법에서의 각 단계의 rHSA 및 스트림라인 SP 단계를 포함한 본 발명의 방법에서의 각 단계의 rHSA간의 착색도(A350/A280) 변화를 비교한 결과를 제5도에 나타냈다. 스트림라인 SP 처리가 사용되고 직후에 시스테인 존재하에 가열 단계가 수행된 본 발명의 방법에서, 통상적인 방법과의 큰 차이점은 소수성 크로마토그래피 단계에서 관찰되었다. 음이온 교환제 처리를 마친후, 지극히 낮은 착색도(0.0128)가 관찰되었다. 표 5에 제시된 바와 같은 통상적인 방법의 킬레이트 수지 처리 후 생성된 샘플(곡선 1)과 실시예 1에서 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 정제 과정의 음이온 교환제 처리 및 킬레이트 수지 처리후 생성된 샘플(곡선 2 및 3)간의 흡수 스펙트럼을 비교한 결과를제6도에 나타냈다. 결과적으로, 표 5에서 제시된 바와 같은 통상적인 방법의 킬레이트 수지 처리 후 생성된 샘플과 비교하여, 본 발명의 방법에 의해 정제된 rHSA의 흡수 스펙트럼은 이미 음이온 교환제 처리후 가시 영역(350 내지 700nm)에 걸쳐서 현저히 낮은 패턴을 나타냈다. 본 발명의 방법에서 킬레이트 수지로 처리한 후, 이러한 차이점은 더욱 명백해졌다.

시험 실시예 8

본 발명의 방법으로부터 생성된 rHSA의 겔 여과 HPLC에 의한 분석

실시예 1에서 기술한 바와 같이 본 발명에 따른 방법의 언급된 단계 후에 생성된 rHSA 샘플(rHSA 배양 배지, 스트림라인 SP 용출액, 스트림라인 SP 비흡착 분획, DEAE-후처리 분획)의 겔 여과 고성능 액체 크로마토그래피(GPC-HPLC) 분석 결과를 제7도에 나타냈다. 결과적으로, 배양 배지에 함유된 rHSA 및 저분자량 물질외의 고분자량 물질이 효모 세포와 함께 스트림라인 SP 비흡착 분획내로 고효율로 대부분 세척되고, 알부민이 용출액중으로 특이적으로 회수됨이 명백해졌다. 출발 물질로서 이러한 분획을 사용하고 음이온 교환제(DEAE) 처리로 추가 정제함으로써 제조된 샘플의 HPLC 패턴은 알부민(HSA 단량체) 단독의 급격한 피크를 나타냈다. 즉, 이의 순도는 통상적인 정제 방법의 DEAE 단계로부터 생성된 샘플에 필적하거나 오히려 월등했다.

이들 시험 실시예를 토대로 하여, 통상적인 정제 방법의 DEAE 단계로부터 생성된 rHSA 수율과 흡착제 입자(스트림라인 SP) 처리 단계를 수반한 방법의 DEAE 농축 단계로부터 생성된 rHSA 수율을 계산하여 상호 비교했다. 흡착제 입자(스트림라인 SP) 처리를 수반하는 방법에서, 단계의 수는 통상의 과정(즉, 압축→ 막→ 가열→ 막→ 양이온 교환제 처리)의 5 단계에서 2단계로 단축되었다. 즉, 처리 기간이 크게 단축되고 수율이 30% 증가되었다.

시험 실시예 9

숙주 기원 불순물의 분석

알부민을 생성하지 않는 효모의 배양 배지를 실시예 1에서 기술된 본 발명의 방법과 동일한 방법으로 정제했다. 이어서, 이를 사용하여 토끼를 면역화시켰다. 이렇게 하여 수득된 항혈청을 사용하여, 정제된 알부민 용액중의 효모 기원의 불순물 검출 시험을 수행했다. 이를 위해서 효소 면역검정법(EIA)이 사용되었다. 샘플의 알부민 농도를 250mg/ml로 조정했다.

결과적으로, 효모 기원의 비항원성 불순물이 붕산/붕산염 처리후 생성된 정제 알부민으로부터 0.1ng/ml의 검출 한계에서 검출되었다.

시험 실시예 10

실시예 1의 방법에 의해 정제된 본 발명의 rHSA의 특성

(1) 분자량

전술한 HPLC 겔 여과법에 의해 분자량을 측정했다. 본 발명의 방법에 따라 정제된 rHSA는 분자량이 약 67,000으로서, 즉, 혈장 기원의 HSA의 분자량과 거의 동일했다.

(2) 등전점

등전점은 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 문헌[참조: Allen et al., J.Chromatog, 146, 1 (1978)]의 방법에 따라 측정했다. 본 발명의 방법에 따라 정제된 rHSA는 등전점이 약 4.9로서 혈장 기원의 HSA의 등전점과 거의 동일했다.

(3) 착색도

착색도는 정제된 rHSA 용액(알부민 농도: 250mg/ml)을 사용하여, 이 용액의 흡광도를 280nm 및 350nm에서 측정한 다음, A350/A280비를 계산함으로써 측정되었다. 본 발명의 방법에 따라 정제된 rHSA는 약 0.012의 극히 낮은 착색도(A350/A280)를 나타냈다.

실시예 2

(1) 배양 배지의 가열 처리

실시예 1에서와 동일한 방법으로 유럽 특허원 제655503호에 기술된 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는 약 1,000ℓ 의 배양 배지를 그 자체로 30분간 68℃로 가열했다. 가열 처리를 10mM의 나트륨 카프릴레이트 존재하에 수행했다. 이러한 배양 배지의 pH 값은 6이었다. 이어서, 가열 용액을 약 25℃로 냉각하고 증류수로 약 2배로 희석했다(총 용적: 약 2,000ℓ). 이어서, 이의 pH 값을 희석전의 배양 배지 용적의 약 1.1%(v/v) 양의 아세트산 용액(99.7%)을 사용하여 4.5로 조절했다.

(2) 흡착제 입자 처리(스트림라인 SP 처리)

50mM의 염화나트륨을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 평형화시킨 스트림라인 SP 컬럼(C1000, 100x110cm, 겔 용적: 150ℓ, Pharmacia사 제조)에 전술한 가열 처리(1)에 의해 수득한 효모 세포를 함유하는 2,000ℓ 의 배양 배지를 상부 방향으로 공급했다. 컬럼에 배양 배지의 첨가가 완료될 때까지 세포가 침전되지 않도록 교반하에 100 내지 250cm/h의 유속으로 공급했다. 이어서, 컬럼의 평형화에 사용된 것과 동일한 완충액(컬럼 용량 5배의 용적)을 컬럼내 상부 방향으로 공급하여, 컬럼을 100 내지 500cm/h 의 유속으로 세척했다. 이어서, 유동 방향을 역전시키고 용출제[300mM의 염화나트륨을 함유하는 100mM 포스페이트 완충액(pH9), 유속: 50 내지 100cm/h]를 컬럼내로 공급했다. 이렇게 하여, rHSA를 함유하는 분획을 수득했다.

이렇게 하여 용출된 rHSA-함유 분획을 280nm에서의 흡광도를 측정하여 검출했다.

(3) 가열 처리

이렇게 수득된 rHSA-함유 분획을, 10mM의 시스테인, 10mM의 나트륨 카프릴레이트, rHSA 1mol당 4mol 양의 나트륨 올레이트 및 100mA의 아미노구아니딘 하이드로클로라이드의 존재하에 pH 7.5에서 1시간 동안 60℃로 가열하여, rHSA의 착색도를 감소시키고 이량체의 단량체로의 전환을 가속시켰다.

표 6은 배양 배지 1톤을 사용한 4회 시행의 결과를 각각 보여준다. 30분간 68℃의 가열 처리후와 시스테인 존재하의 가열 처리후의 평균 수율은 각각 98.6% 및 88.4%이었다. 4회 시행의 총 수율은 87.1%의 우수한 결과를 보여주며, 이는 실험적 규모의 컬럼(C50)이 사용된 실시예 1의 결과와 잘 일치한다. 따라서, 본 발명의 방법이 대규모로도 재현가능함이 확인되었다.

[표 6]

참조 실시예 1

rHSA의 측정(수율 평가)

상기 시험 실시예 1 내지 8 및 10에 있어서, rHSA-함유 용액을 겔 여과 HPLC 하여 정량적으로 평가했다(수율 포함). 상세한 용출 조건은 다음과 같다.

rHSA-함유 용액을 0.1%의 NaN3 및 0.3%의 NaCl을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH6.5)으로 평형화시킨 TSK-Gel G 3000 SWxL 컬럼(0.78 x 30cm, Tosoh Corp. 제조)에 부었다. 이어서, 평형 완충액을 용출제로 사용하여 1ml/분의 유속으로 rHSA를 용출시키고, 280nm 및 350nm에서의 흡광도를 측정했다.

본 발명은 효모를 함유하는 배양 배지 자체를 직접 가열함으로써 프로테아제가 용이하게 효과적으로 불활성화될 수 있다는 사실에 기초하여 완성되었다. 즉, 본 발명은 효모 세포가 잔존하는 배양 배지를 가열하고 가열 용액을 유동층에 현탁된 흡착제 입자와 직접 접촉시킴으로써 rHSA를 용이하게 효과적으로 정제하는 방법을 제공한다. 따라서, 다수의 단계가 통상적인 방법의 5단계(압축→막→ 가열→ 막→ 양이온 교환체 처리)에서 가열→흡착제 입자 처리의 2단계로 단축된다. 따라서, 처리 기간이 크게 단축되고 수율이 상승된다. 더욱이, 재조합 HSA에 특징적인 착색 문제가 착색을 야기하는 착색 물질이 효율적으로 제거될 수 있는 본 발명의 정제 방법에 의해 해결될 수 있다.

또한, 본 발명의 정제 방법에 따르면, 세포의 배양에서부터 정제까지의 단계를 포함한 재조합 HSA의 생산의 전과정이 폐쇄 시스템 라인에서 수행될 수 있으므로, HSA의 생산이 자동화될 수 있고 의약품으로서 rHSA의 생산에 필수적으로 요구되는 위생 관리가 용이하게 달성될 수 있다는 잇점이 제공된다.

따라서, 본 발명의 방법은 처리 기간을 단축하고 수율을 상승시킬 수 있을 뿐 아니라 생성물의 품질도 향상시킬 수 있는 rHSA 정제 방법으로서 매우 유용하다.

또한, 본 발명에 의해, 생산자 숙주 등에 관련된 불순물을 함유하지 않고 약제로서의 유용성을 위해 충분히 억제된 착색화를 보이는 rHSA가 제공될 수 있다.

본 발명이 상세하게 이의 특정 양태를 참조로 기술되었지만, 당해 분야의 전문가에게는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 다양하게 변화 및 변형될 수있음이 명백할 것이다.

제1도는 rHSA 배양 배지에 미치는 가열 처리의 안정화 효과를 보여주는 그래프도이다.

제2도는 가열 용액이 흡착제 입자와 접촉하는 환경하에서의 전기 전도율과, rHSA의 흡착제 입자에 대한 결합능간의 관계를 나타내는 그래프도이다.

제3도는 스트림라인(Streamline) SP의 사용하에 (효모 세포를 함유하는) 배양 배지로 부터 rHSA 정제에 이르는 최적 흐름도를 나타내는 작업 공정도이다.

제4도는 가열 단계(가열→흡착제 입자) 처리를 포함하는 스트림라인 SP 용출액[(a)] 및 가열 단계가 없는(가열 않음→흡착제 입자) 스트림라인 SP 용출액[(b)]의 겔 여과 HPLC 프로필도이다(흡광도 : 280nm에서 측정).

제5도는 각 단계에서 rHSA의 착색도(A350/A28)의 변화를 모니터함에 의한 통상적인 방법과 본 발명의 방법간의 비교도이다.

제6도는 통상적인 방법에 의해 수득한 rHSA와 비교한, 본 발명의 방법에 의해 수득한 rHSA의 흡수 스펙트럼도이다.

제7도는 본 발명의 방법으로 수득한 rHSA의 GPC-HPLC 분석 결과를 나타내는 크로마토그램도이다(흡광도 : 280nm에서 측정).

이들 도면에서 부호의 의미는 다음과 같다.

A : 대조군

B : 68℃, 30분, pH 6.0

C : 68℃, 30분, pH 6.8

D : 68℃, 30분, pH 7.5

E : 68℃, 30분, pH 8.2

F : 60℃, 2시간, pH 6.0

G : 60℃, 2시간, pH 6.8

H : 60℃, 2시간, pH 7.5

I : 60℃, 2시간, pH 8.2

J : 60℃, 2시간, pH 6.8, 10mM 시스테인

K : 60℃, 2시간, pH 7.5, 10mM 시스테인

L : 실온(25℃), 2시간, pH 6.0

M : 실온(25℃), 2시간, pH 8.2

1 : 통상적인 방법(압축→막→가열→막→ 양이온 교환제→소수성 크로마토그래피→음이온 교환제 처리)에 이은 킬레이트 수지 처리에 의해 정제된 rHSA.

2 : 실시예 1의 방법에 따라 음이온 교환제(DEAE)로 처리된 rHSA.

3 : 실시예 1의 방법에 따라 킬레이트 수지로 처리된 rHSA.

Claims

재조합 사람 혈청 알부민 및 이를 생성하는 숙주 세포를 함유하는 배양 배지를 가열하는 단계;

가열 용액을 상기 알부민이 선택적으로 흡착되는 조건하에서 유동층에 현탁된 흡착제 입자와 접촉시키는 단계; 및

흡착 분획을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제1항에 있어서, 재조합 사람 혈청 알부민 및 이를 생성하는 숙주 세포를 함유하는 배양 배지를 가열하는 단계;

상기 알부민이 선택적으로 흡착되는 조건하에서 가열 용액과 흡착제 입자가 접촉을 이루도록 흡착제 입자가 현탁되어 있는 유동층내 상부 방향으로 가열 용액을 공급하는 단계; 및

유동 방향을 역전시키고 완충액을 하부 방향으로 공급하여 흡착 분획을 용출시키고 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 가열 단계를 50 내지 100℃에서 1분 내지 10시간 동안 수행하는 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제3항에 있어서, 가열 용액을 pH 약 3 내지 5에서 흡착제 입자와 접촉시키는, 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제4항에 있어서, 가열 용액을, 전기 전도율이 0.1 내지 50mS인 환경하에서 흡착제 입자와 접촉시키는, 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제5항에 있어서, 흡착제 입자가 강한 양이온 교환 그룹을 갖는 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 정제 방법에 의해 회수된 사람 혈청 알부민을 함유하는 흡착 분획을, 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환제 처리, 킬레이트 수지 처리, 붕산/붕산염 처리 및 한외여과막 처리로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 처리 단계로 추가 정제하는 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 정제 방법에 의해 회수된 사람 혈청 알부민을 함유하는 흡착 분획을, 환원제의 존재하에 가열시킨 다음, 소수성 크로마토크래피, 음이온 교환제 처리, 킬레이트 수지 처리, 붕산/붕산염 처리 및 한외여과 막 처리로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 처리 단계로 정제하는 재조합 사람 혈청 알부민의 정제 방법.
25% 알부민 용액으로 제형화하는 경우 A350/A280 비가 0.015 미만인 재조합 사람 혈청 알부민을 포함하는 사람 혈청 알부민-함유 조성물.