JP3533687B2 - ヒト血清アルブミンの脱色方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンの脱色方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により発現さ
れるヒト血清アルブミンの脱色方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。 【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。 【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。 【０００５】ところが、遺伝子操作においては、宿主で
ある微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際
に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌す
る物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合するこ
とによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われ
る。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡ
の精製方法では充分に除去することはできない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作によりＨＳＡを得るに際し、従来の
血漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することがで
きなかった上記着色成分ならびに夾雑成分を除去し、着
色を充分に抑えられたＨＳＡを提供することにある。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程中に
還元剤で処理することにより、当該ＨＳＡを脱色できる
ことを見出し、本発明を完成した。 【０００８】即ち、本発明の遺伝子操作により得られる
ＨＳＡの脱色方法は、その精製工程中に還元剤で処理す
ることを特徴とする。 【０００９】本発明は、遺伝子操作によってＨＳＡを調
製する場合のＨＳＡの脱色方法に係わるものであり、当
該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌体（例
えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）を培養
し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。 【００１０】本発明の脱色処理の対象である、遺伝子操
作によるＨＳＡの採取ならびに精製は以下の通りであ
る。 （１）ＨＳＡ産生宿主の調製、培養ならびにＨＳＡの分
離採取 本発明における遺伝子操作により得られるＨＳＡは、遺
伝子操作によって得られるものであれば、その由来に特
に制限はない。従って、当該ＨＳＡを産生させるための
宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に
限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発される
ものであっても適宜利用することができる。当該宿種と
しては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とさ
れた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris ）〕を使用されることが好まし
い。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して
得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロ
マイセス・セレビシエＡＨ２２株（a, his 4, leu2, ca
n 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4 ）
等が好適に使用される。 【００１１】本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方
法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物から
のＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準
じた手法を採用することによって実施される。 【００１２】例えば、ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産
生株）の調製方法としては、通常のＨＳＡ遺伝子を用い
る方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１
５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なＨＳ
Ａ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特
開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を
用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清ア
ルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７
０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む
方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合
させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノー
ル含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2
プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、
同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの
発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨ
ＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９
５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵
母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公
報）などが例示される。 【００１３】また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわ
ち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースあるいはメタノール等を適度に少量づつ供
給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度
の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公
報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強す
る方法（特開平４−２９３４９５号公報）などが例示さ
れる。 【００１４】さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上
記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロ
テアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、
陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群よ
り選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分と
を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１
９８号公報）などが例示される。 【００１５】（２）ＨＳＡの精製 ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用
される。 【００１６】当該精製工程としては、例えば以下の〜
を含む工程が好適に挙げられる。 ＨＳＡの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜
５０万、および１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃
度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する。そして、 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 【００１７】また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後に、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈殿画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。 【００１８】（３）高度精製 さらに、ＨＳＡを高度精製するために以下のような処理
を行うことができる。 （ｉ）キレート樹脂処理 キレート樹脂処理は、ＨＳＡの脱色を目的として行う。
上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み
込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳ
Ａとを接触させることにより行われる。キレート樹脂の
担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、
例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリ
ル酸とメタクリル酸の共重合体などが挙げられる。 【００１９】一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミ
ン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレ
ンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRBO2（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAI
ON CR20 （リガンド部；−ＮＨ（CH2 CH2 NH) n Ｈ、三
菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳ
ＮＨ2 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００など
が好適に使用される。 【００２０】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐ
Ｈ４〜７） 時間：１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量） 【００２１】（ii）疎水性クロマト処理 上記精製工程（〜およびキレート樹脂処理を含む）
を経て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で
検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去され
ていない。 【００２２】そこで、これらの処理終了後に得られるＨ
ＳＡを、ｐＨ２〜５（好ましくは、ｐＨ３〜４）、塩濃
度０．４〜１Ｍ（好ましくは、０．４〜０．７Ｍ）の条
件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６
〜８（好ましくは、ｐＨ６．５〜７）、塩濃度０．０１
〜０．３Ｍ（好ましくは、０．０５〜０．２Ｍ）の条件
下で溶出する工程を組み合わせる。または、前記の工程
の代わりに当該疎水性クロマト処理工程を組み合わせ
る。こうして、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性
の遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを回収する
ことができる。 【００２３】ここにフェノール硫酸法とは、一般的には
糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液に
フェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振
盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成さ
れるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を
比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検
出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖
（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オ
リゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが
例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体
反応を起こさない夾雑物質を言う。 【００２４】疎水性クロマト用担体としては、炭素数４
〜１８のアルキル基型（例：ブチル基型、オクチル基
型、オクチルデシル基型など）、フェニル基型などが例
示される。ブチル基型としては、ブチル−アガロース、
ブチル−ポリビニル（商品名ブチル−トヨパール、東ソ
ー社製）などが、オクチル基型としては、オクチル−ア
ガロースなどが、オクチルデシル基型としては、オクチ
ルデシル−アガロースなどが、フェニル基型としては、
フェニル−セルロース（商品名フェニルセロファイン、
生化学工業社製）などが例示される。 【００２５】（iii) ホウ酸またはその塩による処理 ＨＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによっ
て、宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫
酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質を除去
することができる。 【００２６】使用されるホウ酸としては、例えばオルト
ホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。また
その塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウ
ムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で
０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程
度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９
〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間
程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であるこ
とが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さ
らに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体
的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示さ
れる。 【００２７】ホウ酸またはその塩による処理終了後、例
えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回
収して濃縮脱塩する。 【００２８】（iv）限外濾過処理 上記精製工程を経て、回収されたＨＳＡは限外濾過処理
することが望ましく、分画分子量約１０万の限外濾過膜
が好適に使用される。限外濾過処理によりパイロジェン
（発熱性物質）を除去することができる。 【００２９】（４）還元剤処理 還元剤処理は、上記（２）の精製工程中、または（３）
の高度精製工程中のいずれで行えばよい。また、当該処
理は、精製工程と同時に行ってもよく、工程直後に行っ
てもよい。 【００３０】当該還元剤処理に用いる還元剤としては、
還元作用を有する物質であれば、特に限定されないが、
具体的には、ＳＨ基を含む低分子化合物（例、システイ
ン、システアミン、シスタミン、アミノプロパンチオー
ル、メチオニン、エチオニン、グルタチオン等）、亜硫
酸、次亜硫酸、ピロ亜硫酸、亜リン酸・亜硫酸、亜リン
酸・ピロ亜硫酸、亜硫酸・ピロリン酸、アスコルビン酸
またはそれらの塩が例示される。塩の形態としては、ア
ルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）、アル
カリ土類金属塩（例、カルシウム塩）等が例示される。
処理対象となるＨＳＡの処理濃度は、０．０１〜２５
％、好ましくは０．１〜５％程度が例示される。還元剤
の添加量は、システイン等の場合で１〜１００ｍＭ程
度、亜硫酸塩等の場合で０．００１〜１０％程度が例示
される。処理温度は、１０〜１００℃、好ましくは２０
〜８０℃程度が例示される。処理時間は、１０分間〜２
４０時間、好ましくは３０分間〜１２０時間程度が例示
される。 【００３１】また、着色を抑制することが知られている
アミン化合物（特開平５−２６０９８０号公報）を併用
することができる。当該アミン化合物としては、アルキ
ルアミン類、ジアミン類、グアニジン類、ベンズアミジ
ン類、塩基性アミノ酸、アミノフェニル酢酸が挙げられ
る。アルキルアミン類としては炭素数１〜６のものが好
ましく、例えばメチルアミン、エチルアミン、プロピル
アミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン等が挙げら
れる。ジアミン類としては、アルキレンジアミン（特に
炭素数１〜６のもの、例えばメチレンジアミン、エチレ
ンジアミン、プロピレンジアミン等）、Ｎ，Ｎ−ジアル
キルアルキレンジアミン（特にアルキル、アルキレンお
のおのの炭素数１〜６のもの、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミ
ン等）が挙げられる。グアニジン類としては、グアニジ
ン、アミノグアニジン、フェニルグアニジン等が挙げら
れる。ベンズアミジン類としては、ベンズアミジン、ｐ
−アミノベンズアミジン等が挙げられる。塩基性アミノ
酸としては、リジン、アルギニン等が挙げられる。アミ
ン化合物の添加量としては、０．０１〜１０ｗ／ｖ％
（好ましくは０．１〜１ｗ／ｖ％）が例示される。 【００３２】ＳＨ化合物の場合、処理ｐＨは６〜８、好
ましくはｐＨ６．５〜７．５が例示される〔特に加熱処
理（５０〜１００℃程度）を伴う場合〕。また、加熱処
理を伴わない場合（４０℃以下）は処理ｐＨは３〜６、
好ましくはｐＨ４〜５が例示される。アスコルビン酸の
場合、処理ｐＨは３〜６、好ましくはｐＨ４〜５が例示
される。その他の還元剤の場合、処理ｐＨは６〜１０、
好ましくはｐＨ８〜９が例示される。 【００３３】本発明の還元剤による脱色処理によれば、
ＨＳＡ着色度は、処理直前に比較して処理直後は１０〜
７０％低減される。 【００３４】（５）製剤化 上記で得られたｒＨＳＡ（含有組成物）は、公知の手法
（限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤
化することができる。また、製剤化工程での安定性及び
製剤化した後での保存安定性を確保するため、必要に応
じて安定化剤としてアセチルトリプトファンまたはその
塩（例えば、ナトリウム塩）およびカプリル酸ナトリウ
ムが配合される。安定化剤の添加量としては、0.01〜0.
2 Ｍ、好ましくは0.02〜0.05Ｍ程度が例示される。ま
た、ナトリウム含量は3.7mg/ml以下が例示される。当該
安定化剤の添加時期は、限外濾過、除菌濾過、分注、凍
結乾燥等の処理前である。 【００３５】かくの如き限外濾過、除菌濾過されたｒＨ
ＳＡ製剤は、投与単位あたりに容器に無菌充填される。
ここで、投与単位あたりに容器に充填するとは、ｒＨＳ
Ａ製剤の投与量、例えば、ｒＨＳＡを25％含有し、ｐＨ
は 6.4〜7.4 程度、浸透圧比は１程度の液状製剤を、20
〜50ml（ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ）ごとに容器に充填
することを意味する。あるいはｒＨＳＡを５％含有し、
100 〜250ml ( ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ) ごとに容器
に充填することを意味する。ｒＨＳＡ製剤を充填する容
器としては、10〜250ml 容のガラス製容器、ポリエチレ
ン製容器、脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器（特開
平４−２１０６４６号公報）等が挙げられる。 【００３６】 【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡについて、原料中のある種の着色成分、ある
いは微生物が分泌する物質が夾雑し、これらがＨＳＡと
結合することによって起こる着色が充分に抑えられたＨ
ＳＡを提供することができる。 【００３７】 【実施例】本発明をさらに詳細に説明するために、実施
例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のはない。 【００３８】参考例１ ＨＳＡ産生宿主の培養 (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1 プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。 【００３９】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。 【００４０】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。 【００４１】 【表１】 【００４２】（前培養）ＹＰＤ培地５ｌを含む１０ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。 【００４３】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０ｌに前培養液を植菌し、１，２００ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。 【００４４】 【表２】【００４５】 【表３】 【００４６】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特開平４−２９９９８４号公報）。
参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳ
Ａを産生させた。 【００４７】参考例３ (1) 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間
の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナト
リウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速
に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度
分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜
分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過
膜を用いてＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換し
た。 【００４８】(2) 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにＨ
ＳＡを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９
でＨＳＡの溶出を行った。 【００４９】(3) 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたＨＳＡ溶液
を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝
液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを
充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはフェ
ニルセルロファインに吸着することなく、カラムを通過
した。カラムを通過したＨＳＡは、分画分子量３万の限
外濾過膜を用いて液量を約５０ｌに濃縮するとともに、
ＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
６．８に交換した。 【００５０】(4) 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったＨ
ＳＡ溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化
したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加し
た。この条件ではＨＳＡはＤＥＡＥ−セファロースに吸
着することなく、カラムを通過した。 【００５１】実施例１ 参考例１または参考例２で得られた培養液約８００ｌを
圧搾することにより、培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分
画分子量約３万の限外濾過膜で用いて約８０ｌに濃縮し
た〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃で３時間加熱
処理した。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、５
ｍＭアセチルトリプトファン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンおよび１０ｍＭシステインの共存下にｐＨ７．５で
行った。システイン処理の前後で着色度（２８０ｎｍと
３５０ｎｍの吸光度の比、以下Ａ350 ／Ａ 280）が２３
％低減した。 【００５２】実施例２ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、亜リン酸・亜硫酸ナ
トリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム、亜硫酸・ピ
ロリン酸ナトリウム）を１％濃度となるように添加し、
ＨＳＡ０．５％濃度、ｐＨ９の条件下で３７℃２４時間
放置した。結果を表４に示す。 【００５３】 【表４】 【００５４】いずれの還元剤処理においても、着色度が
２０〜３０％程度低減した。 【００５５】実施例３ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（アスコ
ルビン酸）を１％濃度となるように添加し、ＨＳＡ０．
５％濃度、ｐＨ４．５の条件下で１５℃２４時間放置し
た。結果を表５に示す。 【００５６】 【表５】 【００５７】アスコルビン酸処理において、着色度が２
０％程度低減した。 【００５８】実施例４ （ｐＨの影響） 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム）を１％濃度となるよう添加し、ＨＳＡ０．
５％濃度、ｐＨ７〜１０の条件下で３７℃１２時間放置
した。結果を表６に示す。 【００５９】 【表６】 いずれのｐＨ（ｐＨ７〜１０）においても着色度の低減
が認められるが、特にｐＨ８，９における還元剤処理の
効果が優れていた（着色度が２３〜２４％程度低減）。 【００６０】実施例５ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム）を添加
し、ｐＨ９の条件下、１５℃で放置した。還元剤処理後
に０．３％塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に対して透析を行い、還元剤を除去し
た。結果を表７に示す。 【００６１】 【表７】【００６２】いずれにおいても、着色度が３０〜４５％
程度低減した。 【００６３】実施例６ （各精製段階における還元剤処
理効果） 各精製段階における還元剤処理効果を確認した。参考例
３に記載した陽イオン交換体処理、疎水性クロマト処
理、陰イオン交換体処理の各精製段階のＨＳＡを０．３
％溶液に調製後に還元剤（亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウ
ム）を２％濃度となるように添加し、ｐＨ９の条件下、
１５℃５日放置した。還元剤処理後に０．３％塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対
して透析を行い、還元剤を除去した。結果を表８に示
す。 【００６４】 【表８】 【００６５】各精製段階において良好な脱色効果を認め
た。また、長波長領域での脱色効果はより顕著であっ
た。 【００６６】実施例７（精製処理と還元剤との同時処
理） 還元剤の共存下に精製処理を行った場合の脱色効果を検
討した。参考例３の最終工程で実施した。還元剤（亜硫
酸ナトリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム）の共存
下に陰イオン交換体処理（Ｑ−セファロース、ファルマ
シア社製）を行った。還元剤を含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ９）で接触させ、室温で一晩放置（すな
わち、還元剤の共存下である）する。５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９）で洗浄して還元剤を洗浄除去後
に、１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９）でＨＳＡを溶出した。精製したＨＳＡの
着色度を結果として表９に示す。 【００６７】 【表９】 【００６８】本実施例においては、還元剤共存下に陰イ
オン交換体処理を行った場合、還元剤濃度０．１〜０．
５％で良好な脱色効果を認めた。 【００６９】実施例８ 参考例３の（１）で６０℃３時間の加熱処理を行った
後、１５℃において１０ｍＭシステイン含有緩衝液（ｐ
Ｈ４）で透析して、そのまま１６時間放置した。その結
果、着色度（Ａ350 ／Ａ280 ）は加熱処理後に０．１で
あったが、還元剤処理後は０．０６６に減少した。
れるヒト血清アルブミンの脱色方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。 【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。 【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。 【０００５】ところが、遺伝子操作においては、宿主で
ある微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際
に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌す
る物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合するこ
とによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われ
る。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡ
の精製方法では充分に除去することはできない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作によりＨＳＡを得るに際し、従来の
血漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することがで
きなかった上記着色成分ならびに夾雑成分を除去し、着
色を充分に抑えられたＨＳＡを提供することにある。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程中に
還元剤で処理することにより、当該ＨＳＡを脱色できる
ことを見出し、本発明を完成した。 【０００８】即ち、本発明の遺伝子操作により得られる
ＨＳＡの脱色方法は、その精製工程中に還元剤で処理す
ることを特徴とする。 【０００９】本発明は、遺伝子操作によってＨＳＡを調
製する場合のＨＳＡの脱色方法に係わるものであり、当
該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌体（例
えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）を培養
し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。 【００１０】本発明の脱色処理の対象である、遺伝子操
作によるＨＳＡの採取ならびに精製は以下の通りであ
る。 （１）ＨＳＡ産生宿主の調製、培養ならびにＨＳＡの分
離採取 本発明における遺伝子操作により得られるＨＳＡは、遺
伝子操作によって得られるものであれば、その由来に特
に制限はない。従って、当該ＨＳＡを産生させるための
宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に
限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発される
ものであっても適宜利用することができる。当該宿種と
しては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とさ
れた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris ）〕を使用されることが好まし
い。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して
得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロ
マイセス・セレビシエＡＨ２２株（a, his 4, leu2, ca
n 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4 ）
等が好適に使用される。 【００１１】本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方
法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物から
のＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準
じた手法を採用することによって実施される。 【００１２】例えば、ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産
生株）の調製方法としては、通常のＨＳＡ遺伝子を用い
る方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１
５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なＨＳ
Ａ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特
開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を
用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清ア
ルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７
０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む
方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合
させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノー
ル含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2
プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、
同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの
発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨ
ＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９
５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵
母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公
報）などが例示される。 【００１３】また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわ
ち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースあるいはメタノール等を適度に少量づつ供
給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度
の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公
報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強す
る方法（特開平４−２９３４９５号公報）などが例示さ
れる。 【００１４】さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上
記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロ
テアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、
陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群よ
り選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分と
を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１
９８号公報）などが例示される。 【００１５】（２）ＨＳＡの精製 ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用
される。 【００１６】当該精製工程としては、例えば以下の〜
を含む工程が好適に挙げられる。 ＨＳＡの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜
５０万、および１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃
度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する。そして、 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 【００１７】また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後に、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈殿画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。 【００１８】（３）高度精製 さらに、ＨＳＡを高度精製するために以下のような処理
を行うことができる。 （ｉ）キレート樹脂処理 キレート樹脂処理は、ＨＳＡの脱色を目的として行う。
上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み
込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳ
Ａとを接触させることにより行われる。キレート樹脂の
担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、
例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリ
ル酸とメタクリル酸の共重合体などが挙げられる。 【００１９】一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミ
ン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレ
ンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRBO2（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAI
ON CR20 （リガンド部；−ＮＨ（CH2 CH2 NH) n Ｈ、三
菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳ
ＮＨ2 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００など
が好適に使用される。 【００２０】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐ
Ｈ４〜７） 時間：１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量） 【００２１】（ii）疎水性クロマト処理 上記精製工程（〜およびキレート樹脂処理を含む）
を経て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で
検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去され
ていない。 【００２２】そこで、これらの処理終了後に得られるＨ
ＳＡを、ｐＨ２〜５（好ましくは、ｐＨ３〜４）、塩濃
度０．４〜１Ｍ（好ましくは、０．４〜０．７Ｍ）の条
件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６
〜８（好ましくは、ｐＨ６．５〜７）、塩濃度０．０１
〜０．３Ｍ（好ましくは、０．０５〜０．２Ｍ）の条件
下で溶出する工程を組み合わせる。または、前記の工程
の代わりに当該疎水性クロマト処理工程を組み合わせ
る。こうして、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性
の遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを回収する
ことができる。 【００２３】ここにフェノール硫酸法とは、一般的には
糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液に
フェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振
盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成さ
れるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を
比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検
出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖
（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オ
リゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが
例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体
反応を起こさない夾雑物質を言う。 【００２４】疎水性クロマト用担体としては、炭素数４
〜１８のアルキル基型（例：ブチル基型、オクチル基
型、オクチルデシル基型など）、フェニル基型などが例
示される。ブチル基型としては、ブチル−アガロース、
ブチル−ポリビニル（商品名ブチル−トヨパール、東ソ
ー社製）などが、オクチル基型としては、オクチル−ア
ガロースなどが、オクチルデシル基型としては、オクチ
ルデシル−アガロースなどが、フェニル基型としては、
フェニル−セルロース（商品名フェニルセロファイン、
生化学工業社製）などが例示される。 【００２５】（iii) ホウ酸またはその塩による処理 ＨＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによっ
て、宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫
酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質を除去
することができる。 【００２６】使用されるホウ酸としては、例えばオルト
ホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。また
その塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウ
ムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で
０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程
度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９
〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間
程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であるこ
とが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さ
らに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体
的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示さ
れる。 【００２７】ホウ酸またはその塩による処理終了後、例
えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回
収して濃縮脱塩する。 【００２８】（iv）限外濾過処理 上記精製工程を経て、回収されたＨＳＡは限外濾過処理
することが望ましく、分画分子量約１０万の限外濾過膜
が好適に使用される。限外濾過処理によりパイロジェン
（発熱性物質）を除去することができる。 【００２９】（４）還元剤処理 還元剤処理は、上記（２）の精製工程中、または（３）
の高度精製工程中のいずれで行えばよい。また、当該処
理は、精製工程と同時に行ってもよく、工程直後に行っ
てもよい。 【００３０】当該還元剤処理に用いる還元剤としては、
還元作用を有する物質であれば、特に限定されないが、
具体的には、ＳＨ基を含む低分子化合物（例、システイ
ン、システアミン、シスタミン、アミノプロパンチオー
ル、メチオニン、エチオニン、グルタチオン等）、亜硫
酸、次亜硫酸、ピロ亜硫酸、亜リン酸・亜硫酸、亜リン
酸・ピロ亜硫酸、亜硫酸・ピロリン酸、アスコルビン酸
またはそれらの塩が例示される。塩の形態としては、ア
ルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）、アル
カリ土類金属塩（例、カルシウム塩）等が例示される。
処理対象となるＨＳＡの処理濃度は、０．０１〜２５
％、好ましくは０．１〜５％程度が例示される。還元剤
の添加量は、システイン等の場合で１〜１００ｍＭ程
度、亜硫酸塩等の場合で０．００１〜１０％程度が例示
される。処理温度は、１０〜１００℃、好ましくは２０
〜８０℃程度が例示される。処理時間は、１０分間〜２
４０時間、好ましくは３０分間〜１２０時間程度が例示
される。 【００３１】また、着色を抑制することが知られている
アミン化合物（特開平５−２６０９８０号公報）を併用
することができる。当該アミン化合物としては、アルキ
ルアミン類、ジアミン類、グアニジン類、ベンズアミジ
ン類、塩基性アミノ酸、アミノフェニル酢酸が挙げられ
る。アルキルアミン類としては炭素数１〜６のものが好
ましく、例えばメチルアミン、エチルアミン、プロピル
アミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン等が挙げら
れる。ジアミン類としては、アルキレンジアミン（特に
炭素数１〜６のもの、例えばメチレンジアミン、エチレ
ンジアミン、プロピレンジアミン等）、Ｎ，Ｎ−ジアル
キルアルキレンジアミン（特にアルキル、アルキレンお
のおのの炭素数１〜６のもの、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミ
ン等）が挙げられる。グアニジン類としては、グアニジ
ン、アミノグアニジン、フェニルグアニジン等が挙げら
れる。ベンズアミジン類としては、ベンズアミジン、ｐ
−アミノベンズアミジン等が挙げられる。塩基性アミノ
酸としては、リジン、アルギニン等が挙げられる。アミ
ン化合物の添加量としては、０．０１〜１０ｗ／ｖ％
（好ましくは０．１〜１ｗ／ｖ％）が例示される。 【００３２】ＳＨ化合物の場合、処理ｐＨは６〜８、好
ましくはｐＨ６．５〜７．５が例示される〔特に加熱処
理（５０〜１００℃程度）を伴う場合〕。また、加熱処
理を伴わない場合（４０℃以下）は処理ｐＨは３〜６、
好ましくはｐＨ４〜５が例示される。アスコルビン酸の
場合、処理ｐＨは３〜６、好ましくはｐＨ４〜５が例示
される。その他の還元剤の場合、処理ｐＨは６〜１０、
好ましくはｐＨ８〜９が例示される。 【００３３】本発明の還元剤による脱色処理によれば、
ＨＳＡ着色度は、処理直前に比較して処理直後は１０〜
７０％低減される。 【００３４】（５）製剤化 上記で得られたｒＨＳＡ（含有組成物）は、公知の手法
（限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤
化することができる。また、製剤化工程での安定性及び
製剤化した後での保存安定性を確保するため、必要に応
じて安定化剤としてアセチルトリプトファンまたはその
塩（例えば、ナトリウム塩）およびカプリル酸ナトリウ
ムが配合される。安定化剤の添加量としては、0.01〜0.
2 Ｍ、好ましくは0.02〜0.05Ｍ程度が例示される。ま
た、ナトリウム含量は3.7mg/ml以下が例示される。当該
安定化剤の添加時期は、限外濾過、除菌濾過、分注、凍
結乾燥等の処理前である。 【００３５】かくの如き限外濾過、除菌濾過されたｒＨ
ＳＡ製剤は、投与単位あたりに容器に無菌充填される。
ここで、投与単位あたりに容器に充填するとは、ｒＨＳ
Ａ製剤の投与量、例えば、ｒＨＳＡを25％含有し、ｐＨ
は 6.4〜7.4 程度、浸透圧比は１程度の液状製剤を、20
〜50ml（ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ）ごとに容器に充填
することを意味する。あるいはｒＨＳＡを５％含有し、
100 〜250ml ( ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ) ごとに容器
に充填することを意味する。ｒＨＳＡ製剤を充填する容
器としては、10〜250ml 容のガラス製容器、ポリエチレ
ン製容器、脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器（特開
平４−２１０６４６号公報）等が挙げられる。 【００３６】 【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡについて、原料中のある種の着色成分、ある
いは微生物が分泌する物質が夾雑し、これらがＨＳＡと
結合することによって起こる着色が充分に抑えられたＨ
ＳＡを提供することができる。 【００３７】 【実施例】本発明をさらに詳細に説明するために、実施
例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のはない。 【００３８】参考例１ ＨＳＡ産生宿主の培養 (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1 プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。 【００３９】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。 【００４０】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。 【００４１】 【表１】 【００４２】（前培養）ＹＰＤ培地５ｌを含む１０ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。 【００４３】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０ｌに前培養液を植菌し、１，２００ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。 【００４４】 【表２】【００４５】 【表３】 【００４６】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特開平４−２９９９８４号公報）。
参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳ
Ａを産生させた。 【００４７】参考例３ (1) 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間
の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナト
リウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速
に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度
分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜
分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過
膜を用いてＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換し
た。 【００４８】(2) 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにＨ
ＳＡを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９
でＨＳＡの溶出を行った。 【００４９】(3) 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたＨＳＡ溶液
を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝
液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを
充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはフェ
ニルセルロファインに吸着することなく、カラムを通過
した。カラムを通過したＨＳＡは、分画分子量３万の限
外濾過膜を用いて液量を約５０ｌに濃縮するとともに、
ＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
６．８に交換した。 【００５０】(4) 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったＨ
ＳＡ溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化
したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加し
た。この条件ではＨＳＡはＤＥＡＥ−セファロースに吸
着することなく、カラムを通過した。 【００５１】実施例１ 参考例１または参考例２で得られた培養液約８００ｌを
圧搾することにより、培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分
画分子量約３万の限外濾過膜で用いて約８０ｌに濃縮し
た〔膜分画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃で３時間加熱
処理した。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、５
ｍＭアセチルトリプトファン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンおよび１０ｍＭシステインの共存下にｐＨ７．５で
行った。システイン処理の前後で着色度（２８０ｎｍと
３５０ｎｍの吸光度の比、以下Ａ350 ／Ａ 280）が２３
％低減した。 【００５２】実施例２ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、亜リン酸・亜硫酸ナ
トリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム、亜硫酸・ピ
ロリン酸ナトリウム）を１％濃度となるように添加し、
ＨＳＡ０．５％濃度、ｐＨ９の条件下で３７℃２４時間
放置した。結果を表４に示す。 【００５３】 【表４】 【００５４】いずれの還元剤処理においても、着色度が
２０〜３０％程度低減した。 【００５５】実施例３ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（アスコ
ルビン酸）を１％濃度となるように添加し、ＨＳＡ０．
５％濃度、ｐＨ４．５の条件下で１５℃２４時間放置し
た。結果を表５に示す。 【００５６】 【表５】 【００５７】アスコルビン酸処理において、着色度が２
０％程度低減した。 【００５８】実施例４ （ｐＨの影響） 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム）を１％濃度となるよう添加し、ＨＳＡ０．
５％濃度、ｐＨ７〜１０の条件下で３７℃１２時間放置
した。結果を表６に示す。 【００５９】 【表６】 いずれのｐＨ（ｐＨ７〜１０）においても着色度の低減
が認められるが、特にｐＨ８，９における還元剤処理の
効果が優れていた（着色度が２３〜２４％程度低減）。 【００６０】実施例５ 参考例３の最終画分を用いて実施した。還元剤（亜硫酸
ナトリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム）を添加
し、ｐＨ９の条件下、１５℃で放置した。還元剤処理後
に０．３％塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に対して透析を行い、還元剤を除去し
た。結果を表７に示す。 【００６１】 【表７】【００６２】いずれにおいても、着色度が３０〜４５％
程度低減した。 【００６３】実施例６ （各精製段階における還元剤処
理効果） 各精製段階における還元剤処理効果を確認した。参考例
３に記載した陽イオン交換体処理、疎水性クロマト処
理、陰イオン交換体処理の各精製段階のＨＳＡを０．３
％溶液に調製後に還元剤（亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウ
ム）を２％濃度となるように添加し、ｐＨ９の条件下、
１５℃５日放置した。還元剤処理後に０．３％塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対
して透析を行い、還元剤を除去した。結果を表８に示
す。 【００６４】 【表８】 【００６５】各精製段階において良好な脱色効果を認め
た。また、長波長領域での脱色効果はより顕著であっ
た。 【００６６】実施例７（精製処理と還元剤との同時処
理） 還元剤の共存下に精製処理を行った場合の脱色効果を検
討した。参考例３の最終工程で実施した。還元剤（亜硫
酸ナトリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム）の共存
下に陰イオン交換体処理（Ｑ−セファロース、ファルマ
シア社製）を行った。還元剤を含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ９）で接触させ、室温で一晩放置（すな
わち、還元剤の共存下である）する。５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９）で洗浄して還元剤を洗浄除去後
に、１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９）でＨＳＡを溶出した。精製したＨＳＡの
着色度を結果として表９に示す。 【００６７】 【表９】 【００６８】本実施例においては、還元剤共存下に陰イ
オン交換体処理を行った場合、還元剤濃度０．１〜０．
５％で良好な脱色効果を認めた。 【００６９】実施例８ 参考例３の（１）で６０℃３時間の加熱処理を行った
後、１５℃において１０ｍＭシステイン含有緩衝液（ｐ
Ｈ４）で透析して、そのまま１６時間放置した。その結
果、着色度（Ａ350 ／Ａ280 ）は加熱処理後に０．１で
あったが、還元剤処理後は０．０６６に減少した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:84） Ａ６１Ｋ 37/04 ＡＢＹ
(72)発明者 野田 宗宏
大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号
株式会社ミドリ十字中央研究所内
(72)発明者 大村 孝男
大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号
株式会社ミドリ十字中央研究所内
(56)参考文献 特開 平４−54198（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−260986（ＪＰ，Ａ)
特表 平７−503137（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−500110（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 21/00
C07K 1/14
C12N 15/00 - 15/90
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 遺伝子操作により発現されるヒト血清ア
ルブミンを還元剤で処理することを特徴とする、脱色さ
れたヒト血清アルブミンの製造方法。
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| DE69434126T DE69434126T3 (de) | 1993-12-17 | 1994-12-16 | Verfahren zum Entfärben von menschlichemn Serum-Albumin |
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- 1993-12-17 JP JP31871093A patent/JP3533687B2/ja not_active Expired - Lifetime
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