JPH06501033A - 血清アルブミンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血清アルブミンの精製方法 本分野は、血清アルブミン、特にヒトの血清アルブミンの精製に関する。

の主な機能は血管中のコロイド浸透圧の維持である。さらに、該蛋白は幾つかの りガント、例えばビリルビン及び脂肪酸類等のキャリアーとして作用する。　（ Ｆ。

ロススティン、Ｖ、　Ｍ、ローゼノア及び１１．　Ｌ−ヒュージズ（Ｆ、　Ｒｏ ｔｈｓｔｅｉｎ、　Ｖ、　Ｍ、　ＲｏｓｅｎｏｅｒＵ、クラッグーハンセン（口 、　Ｋｒａｇｈ−１（ａｎｓｅｎ）、ファーマコロジカル・レビュー（Ｐｈａｒ ｍａｃｏ　１．　Ｒｅｖ、　）、１９８１年、３３巻、第１７−５３頁：Ｔ、ピ ータース・ジュニア（Ｔ、　Ｐｅｔｅｒｓ　Ｊｒ、　）、アドバンンイズ・オブ ・プロティン・ケミストリイ（Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ。

Ｃｈｅｒｎ、　）、１９８５年、３７巻、３１Ｅ１６１−２４５頁、を参照のこ と。）精製血清アルブミンは、重篤な低アルブミン状態にある血液量減少ショッ クの予防及び治療用に、又、血液透析及び心肺バイパス処置における補助的手段 として、さらに、新生先高ビリルビン血症の治療において交換輸血き共に用いる ことが指示されている。

治療には大量の血清アルブミンが必要であり血清アルブミン（血漿）の材料は限 られているために、ＨＳＡを多量に製造する他の技術が探求されてきた。組み換 えＤ）ＩＡ技術により作られた形質転換された微生物又は細胞株を用いた醗酵に よるＨＳＡの製造において、成功が報告されている。例として、ＥＰ−Ａ−００ ７３６４６参照のこと。

しかしながら、形質転換細胞を用いた醗酵により製造された血清アルブミンの精 製における重大な問題の一つは、精製された均質の血清アルブミンを得るために 除去しなければならない、培地（醗酵ブロス）又はセルライセードからの混入成 分の存在である。

εＰ−Ａ−０３６１９９１にふいて、形質転換酵母で製造されたＩＳＡの、当技 術分野において周知の技術を用いての精製は、９９％より優れた純度の製品を得 ている。医薬用製剤としては、より高い純度が望ましい。

最近、３ステツプの処理を基本とする血清アルブミン類の精製方法がＥＰ−Ａ− ０３１９０６７に開示された。アルカリ沈澱ステップで始まり、次に陰イオン交 換クロマトグラフィーを行い、最後にアフィニティークロ７トグラフイーを行う この製法は、良好な収率及び純度の製品を得る。ＥＰ−Ａ−０３１９０６７には 、ウィッチマン及びアンダーソン（ｌｌｉｃｈｍａｎ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｓ ａｎ）　（１９７４年）により述べられた方法により製造されたＢｒＣＮ活性化 セファロース４Ｂ支持体が言及されている。産業上の使用において、ＢｒＣＮ活 性化セファロースを基礎とするアフィニティーマトリックスは二つの重大な欠点 を有する。

第一に、第一アルキルアミンとの反応の結果できるイソウレア結合（スペーサー ＞　（Ｍ、ウィルチェク、Ｔ、ミｔ）７及びＪ、　］−：／　（Ｍ、１１ｉ１ｃ ｈｅｋ、　Ｔ、Ｍｉｒｏｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｋｏｈｎ）：メソッヅ・インーエンザ イモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、　１９８４年 、１０４巻、第３頁、１１．Ｂ、ジャコレイ（１１，Ｂ、　Ｊａｋｏ　Ｉｅｙ） 　編、アカデミツク・プレス、ロンドン）が、生理的条件下ではプラスの電荷を 持つことである。この荷電スペーサーは、生物特異的吸着を妨げるらしい陰イオ ン交換様特性を示す。第二の欠点は、医薬用製品の製造に必要な殺菌消毒条件（ ０，１−２，０Ｍ　Ｎａ０Ｈ）下でのこのマトリックスの使用を可能にする微ア ルカリ条件下では該イソウレア結合の安定性が制限されることである（Ｃ，Ｍ、 ヤング及びＧ、　Ｔ、　ツｙオ（ＣＪ、　Ｙａｎｇａｎｄ　Ｇ、Ｔ、Ｔｓａｏ） 　：アドバンシイズ・オブ・バイオケミカル・エンジニアリング（Ａｃｔ、　Ｂ ｉｏｃｈｅＩｌｌ、　Ｅｎｇｉｎ、　）、１９８２年、２５巻、第１９頁、Ａ、 フィーヒター（Ａ、　Ｆ　１ｅｃｈｔｅｒ）４ｉｉ、スブリンゲ＃−７エルラー ク、ベルリン−ハイデルベルグ）。

従って、高い収率及び非常に高い純度でヒト血清アルブミンを大量精製するため の実用的な製法が強くめられている。

発明の要約 形質転換された宿主細胞により製造されたヒト血清アルブミンをイオン交換クロ ７トグラフイーにより精製した後、２−メルカプト或いは２−ヒドロキシＣ４− Ｃ１４アルカノール酸、又はその塩或いはエステルに結合した担体を含む親油性 表面固電相を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。成熟無 傷アルブミンに非常に似ている醗酵の終了時に存在する血清アルブミン分解産物 は、脂肪酸アフィニティークロマトグラフィーの適用により選択的に除去される 。高い収率及び非常に高い純度が達成される。

図面の簡単な説明 図１：還元条件下での５ＯＳ−ＰＡＧ［！　（ＣＢＢ　Ｒ−２５０染色００分子 量マーカー：レーン１及び５　（２４μｇ）。０−セファロース及びアフィニテ ィークロマトグラフィーにかけた精製組み換えＨＳＡ　：レーン３　（３０μｇ ）。市販のヒト血液由来ＩＳＡ　（シグマ・ヒトアＪレプミンＮｏ、　Ａ−８７ ６３：　Ｃ１ブト：　１０９１’−９３０４）　：レーン４　（３０μｇ）。

図２：精製組み換えＨＳＡのビオシルＴＳＫ−２５００による高速分子篩いクロ マトグラフィー。

図３：市販のヒト血液由来ＩＳＡのビオシルＴＳＫ−２５０■による高速分子篩 いクロマトグラフィー。

図４二〇−セファロース及びアフィニティークロマトグラフィーにかけた精製組 み換えＨＳＡのモノＱ■による高速イオン交換クロマトグラフィー。

図５：０−セファロース及びアフィニティークロマトグラフィーにかけた市販の ヒト血液由来ＨＳＡのモノＱ■による高速イオン交換クロマトグラフィー。

図６二等電集束（ＣＯＢ　Ｒ−２５０染色）。マーカー（レーン１及び４）、０ −セファロース及びアフィニティークロマトグラフィーにかけた精製組み換えＩ ＳＡ　（レーン２（２０μｇ））及び市販のヒト血液由来Ｈ３Ａ　（レーン３（ ２０μｇ））。

特定の態様の説明 組み換えＤＮＡ技術により作られた、例えば微生物又は細胞株等の形質転換され た宿主細胞を用いたｍＭにより調製されたヒト血清アルブミンが、当該発明によ って、医薬用製品としての使用に向けて高い収率及び高い純度で精製される。該 精製法に先立ち、醗酵培地の遠心及び限外濾過を行う。このように得られた上清 又は溶解（Ｉｙｓｉｓ）後の細胞に該方法を適用することができる。それは一般 的に以下のステップを含むニ ー微酸性条件下における血清アルブミンの陰イオン交換樹脂への結合：該アルブ ミンは溶離剤のｐＨを下げることにより樹脂から脱着される；−次に、場合によ り、媒質（ｍｅｄｉａｍ）の限外濾過；−最後に、親水性マトリックス、スペー サー及びリガンドとしての脂肪酸誘導体を含む親油性固定相、並びに溶離剤中に 脱着剤としての親油性陰イオンを用いるアフィニティークロマトグラフィーから 成る本質的なりロマトグラフイーステップ。

該血清アルブミンはその後、脱塩及び濃縮により採収してもよい。当該製法によ り製造された血清アルブミンは実質的に均質でモノマーであり、すなわち、純度 は９９．５％よりも高い。

該方法は、微生物又は細胞株を用いた組み換えＤＮＡ技術により調製された血清 アルブミン、特にヒト血清アルブミンの製造に用途が見出される。該微生物は原 核生物又は真核生物でもよく、特に真核生物でもよく、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リヘニ フオルミス（Ｂ、　１ｉｃｈｅｎｉ−ｆｏｒＩｌｉｓ）　、スプレブトミセス（ Ｓｐｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等 のバクテリア類を含む。

真核生物には、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａ　ｒｏｗ＋ｙｃｅｓ）、シゾサツ カロミセス（Ｓｃｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、タルイベロミセス （に１ｕｙｖｅｒｏ＠ｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）等のイースト類 、繊維状真菌類、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）　、アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等がある。

該血清アルブミン発現の結果、該産物は分泌されてもよく、該微生物内に保持さ れてもよい。培地は醗酵槽からバッチごとに、又は連続的に除去してもよい。

分泌される場合、セルフリーの上清を精製工程に用いる。セルフリーの上清は、 該培地を遠心すること且つ／又は、蛋白生成物を濃縮するための限外濾過を用い て濾過することによれば簡便に、該醗酵培地を透明化することにより得られる。

該フィルターは通常５００−１００．００００のカットオフ値を持ち、より一般 には最低的１０．０００　Ｄである。

該産物又はその一部が細胞の細胞質内に保持される場合には、該細胞を採収する 。ライセードは、ライセード製造のために咳細胞を機械的又は化学的粉砕するこ とによる、いずれの便利な技術により製造してもよい。細胞の破片は遠心によっ て除去してもよい。

セルフリーの該上清又は該ライセードのＰＨを約５ないし９、より好ましくは約 ６ないし６，５に調整する。該Ｐｉｔは、水酸化す）ＩＪウム又は他の都合の良 い塩基の、通常的０．１規定度ないし濃縮液までの範囲の液を加えること等の都 合の良いいずれの手段で加減してもよい。

次のステップは陰イオン交換クロマトグラフィーである。約２０ないし２００　 ｍＭのバッファー濃度のセルフリーの該上清を予め条件を整えたカラムに乗せる 。陰イオンゲルの充填量はゲル１リツトル当たり５から５０ｇの蛋白、より好ま しくはゲル１リツトル当たり１５ないし２５ｇの蛋白になる。

次に、該ゲルを平衡化バッファーで洗浄することができる。該洗浄液の量は重要 ではないが、一般的には該ゲル量に対して０．５−１０倍に当たる量である。該 バラ；“アーは一般に０．１−１００　ｍｓ／ｃｍ　、好ましくは約１ないし１ ０　ｍｓ／ｃｍの間の導電率を有する。該アルブミンは、若干低いｐＨの普通に 希釈されたバッファーで溶出することにより該ゲルから脱着される。該バッファ ー濃度は１０ないし１００　ｍＭである。

望ま１−＜は該バッファーは約ｐＨ４，０−６，０の範囲のｐｉであり、より望 ましいのはｐＨ４，２５及び４．７５の間である。

該イオン交換ステップにより、核酸類、エントド牛シン類、及び混入卵アルブミ ン様Ｎ白類の大部分が除去される。市販の担体に結合したＱＡＥ又はＤＥＡＥ等 の陰イオンＳＷａ吸着剤を使用する。

次の必１のステップは、親油性固定相を用いるアフィニティークロマトグラフィ ーである。親油性分子のゲルへの結合は、該親油性分子の活性化及び結合の両方 が可能な二官能価試薬を用いて行われる。そのような試薬の例には、例えば、エ ビクロロヒドリン等のエビハロヒドリン、又はアルカンジオールエーテル、例え ば１．４−ブタンジオールジグリシドオキシエーテルようなビスオキシラン類等 のエポキシ化合物類がある。該ゲルマトリックスとの反応から、２−メルカプト 又は２−ヒドロキシＣ４−Ｃ１４アルカノール酸類等の核性リガンドと反応する ことができる親水性反応性エポキシドを有する誘導体が得られる。より詳しくは 以下を参照のこと：アフィニティークロマトグラフィー：実践的アプローチ：デ ィーン。

Ｐ、　Ｄ、　Ｇ、、ジョンソン、１１．Ｓ、及びミドル、　Ｐ、Ａ、　（Ｄｅａ ｎ、　Ｐ、Ｄ、Ｇ、、Ｊｏｈｎｓｏｎ、　１１．Ｓ、　ａｎ■ Ｍｉｄｄｌｅ、　Ｆ、Ａ、）編、ＩＲＬプレス、オックスフォード、イングラン ド、ｌ５ＢＮ−０−９０４１４７−７１−１゜ これらのアフィニティークロマトグラフィー用吸着剤は非常に安定であり、スペ ーサー中に電荷を持たない。

該イオン交換ステップの後、該媒質（ａ＋ｅｄｉｕｍ）のｐＨを生理的条件、通 常的６．５から８．０、より一般には約７から７．５の範囲に上げなければなら ない。バッファー濃度は一般に５０から２５０　ｍＭの範囲である。該媒質をカ ラムに乗せた後、該ゲルを平衡化バッファーで洗浄する。該洗浄液の量は重要で はないが、一般的には該ゲル量に対して０．２５−５倍容である。該バッファー は一般に１．０−２０ａ＋Ｓ／ｃｍ　、好ましくは約ＩＯないし１５　ｌｌ１ｓ ／ｃｍの間の導電率を有するである。該アフィニティーゲルの充填量はゲル１リ ツトル当たり５から７０ｇの蛋白、より好ましくはゲル１リツトル当たり１５な いし３０ｇの蛋白になる。アルブミンは、例えばカプリル酸ナトリウム等の脂肪 酸を２５−２５０　ｍＭ含むバッファーを使用することにより溶出される。

成熟ヒト血清アルブミンの他に、特定の分解産物が該醗酵培地の上清中に存在す る。これらの分解産物は４０−５０　ｋＤの分子量を持ち、三つのドメインを含 む成熟蛋白のうちのドメイン■及びＩＩから成る。当該４０−５０　ｋｎ断片中 に存在しないドメイン１１１が、アルブミンの原（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）脂肪酸 結合部位を含む（Ｔ、ピータース（Ｔ、Ｐｅｔｅｒｓ）　、上記）。驚くべきこ とに、当該４０−５０　ｋｎ断片は、親油性アフィニティマトリックスに対して 成熟ヒト血清アルブミンよりも高い親和性を示し、このことが完全な該蛋白から の該４０−５０　ｋｎ断片の分離を可能にする。

種々の多様な支持体及び吸着剤を該固形担体又は支持体として使用してよい。

そのような固形担体には、ガラス及びシリカゲル等の無機担体類及び、例えば、 アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミド類、 二官能価アクリル酸のビニルコポリマー類及び種々の水酸化モノマー類等の合成 又は天然の有機担体類などが含まれる。市販の担体類は、セファデックス［株］ 、セファロース［相］、トリサクリル［株］、ウルトロゲル■、グイノスファー ス■、マクロソーブ［株］、ＸＡＤ樹脂、及びその他の名称で売られている。

種々のステップにおけるの条件は、通常的−１０℃から＋３０℃の範囲の都合の 良い温度、より一般にはおよそ室温の、変成しない条件が用いられるであろう。

該クロマトグラフィーステップは、都合が良いように、バッチごと又は連続的に 行ってもよい。遠心、濾過、デカント等の都合の良いいずれの分離方法を用いて もよい。このようにして、９９．９％より高い純度、とりわけ９９．９５％より 高い純度という驚くほど高い純度の単離血清アルブミン製剤を得ることができる 。

引用した全文書は、参考文献としてこれに組み込まれる。

以下の非限定的実施例は本発明をさらに説明するであろう。

−エポキシ活性化セファロース６ＦＦ用のＥ釦；−１０個の炭素原子のスペーサ ー長をもたらす第一のＣＩＯ鎖ニーカルボン酸リガすド中の炭素原子数を決める 第二のＣＩＯ鎖。

該アフィニティーマ）　ＩＪソックス類合成には周知の方法を使用した（例えば 、ディーンら（口ｅａｎ、　ｅｔ　ａｔ、）　；上記、を参照のこと）。

Ｃ３及びＣＩＯスペーサーの製造には、エビクロロヒドリン及び１．４−ブタン ジオールグリシドオキシエーテルをそれぞれ使用した。

Ｅ−ＣＩＯ−ＣＩＯマトリックスの合成：１１Ｊツトルのセファロース６ＰＦを 蒸留水で入念に洗浄した。過剰の水はガラス濾過器により除去した。該ゲルを０ ．６１の１．４−ブタンジオールグリシドオキシエーテルに懸濁し、およそ３０ 分間攪拌した。次に０．６１の０．５　Ｎ　ＮａＯＨ溶液を加え、２４時間攪拌 を続けた。該エポキシ活性化ゲルを蒸留水で入念に洗浄し、０℃で保存した。０ ．７ｋｇの湿った生成物が得られた（Ｅ−ＣＩＯ）。

該エポキシ活性化セファロース６ＦＦ　（０，５ｋｇの湿った生成物、　Ｅ−Ｃ ＩＯ）を、０．５Ｍの炭酸ナトリウム溶液中に８ｇの２−メルカプトデカン酸を 溶かした溶液に９１％し、２４ｈ攪拌した。該ゲルをガラス濾過器で濾過し、０ ６２鍵炭酸ナトリウム、続％Ｎで水で洗浄した。湿った該ゲルを０℃で保存した 。このマトリックスをＥ−ＣＩＯ−ＣＩＯと名付けた。

遊離のカルボン酸の数を単純滴定により測定し、湿ったゲルマｌ−Ｕツクス１ｇ 当たり１９，３μ当量であることがわかった。

髭 透明化された醗酵培地からの組み換えＩＳＡのヒュ互二ｊ型Ｅ叱孤ヱｌ丘た二部 ニゾΣ■ゴ込ｙ曙里醪： ＩＳＡに対する遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたクルイベロミセスーラ クティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓ）株ＣＢ５２３６０　（ 菌培養中央局、）く−ルン、オランダ）を、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１ ．４％（ｗ／ｖ）グルコース、１．０％（ｗ／ｖ）カゼイン加水分解物、ビタミ ン類及び金属塩類を含む培地中で、３０℃、９０時間生育させた。醗酵中にグル コースが供給された。

濾過及び限外濾過： 該醗酵培地を遠心した（４０００　ｒｐｍ、５分）。上清を［！ＫＳフイルター で濾過し、３０．００００のカットオフ値を持つフィルターを用いた限外濾過に より１１回濃縮した。

限外濾過後の蛋白濃度は２８　ｍｇ／ｍｌであり、その内、６５％はモノマーで 完全な組み換えＨＳＡであった。０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐｉ（５，５、を加 えてｐＨを６．４に調整した。

Ｑ−セファロースクロマトグラフィー：該Ｈ３Ａ溶液を、５０ＩＩＭ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ５，５、で平衡化しである０−セファロースＰＦカラムに結合させた （充填：セファロース１１当たり蛋白２５ｇ）。該ゲルを平衡化バッフＴ−で洗 浄した後、Ｒ）ＩＡを５０ＬＩＩＭ酢酸すｌ−’Ｊウム、ｐＨ４，６、で溶出し た。ＩＭＵン酸バッファー、ｐＨ６，６、（比率；溶出液＝）くツファ−（ｖ／ ｖ）＝１０：１）及び４　Ｍ　Ｎａ０）１を加えて、該溶出液のｐ）ｌをｐＨ７ ，４に上げた。蛋白濃度は１０　ｍｇ／ｍｌであり、その内、７８％はモノマー で完全な組み換えＩＳＡであった。

アフィニティークロマトグラフィｍ： １１ｓＡを含む０−セファロース溶出液を、例１に述べたようにジグリシジルエ ーテルによってエポキシ活性化セファロース６ＦＦに結合された２−メルカプト デカン酸（Ｅ−ＣＩＯ−ＣＩＯ−セファロース）に接触させた。該アフィニティ ー吸着剤を１００ｍＭ　ＩＪン酸す）ＩＪウムバッファー、ｐＨ７，４、で平衡 化した。該組み換えＩＳＡを吸着剤（こ結合させた後（充填ニゲル１リツトル当 たり蛋白２２　ｇ）　、該カラムを平衡化ノクンフア−で洗浄した。該ＩＳＡを ７５−カプリル酸ナトリウムを含む１００　ｍＭ　ＩＪン酸す）　＋７　’７ム 、ｐｉ（７，４、で溶出した。該）ＩＳＡを脱塩し、３０．００００のカー／） オフ値を持つフィルターを用いた限外濾過により濃縮した。咳精製ＩＳＡは蛋白 濃度が５Ｏｎ＋ｇ／Ｉｌｌ　＋であり、その内、９９．９％より多くが単量体成 熟ＩＳＡであった。

この例ではＩＳＡの回収率は５０％であった。５Ｏ３−ＰＡＧＥ　Ｃ図１　＞　 、）ＩＰＬｃ−ＳＥＣ（図２、　３）　、ＩＩＰＬｃ−ＩＥｃ　（図４．５）及 びＩＥＦ　（図６）では、僅かに痕跡量の分解産物が検出されたのみで、混入物 は検出されなかった。ＩＩＰＬｃ−ＳＥＣによる純度は、９９．３％と見なされ た。２４．７７の塩関連ピークで補正すると＞９９．９１％の純度が得られる。

実際に、イムノブロッティング法を用いると該精製Ｈ３Ａの純度は少なくとも９ ９、９５％と評価された。この技術ではポリクローナル抗体類が蛋白類に対して 増加したが、それらはこの例に述べた方法によりブランクのに、ラクテイス　（ Ｋ。

１ａｃｔ　ｉｓ）醗酵培地から精製された。エンドトキシンの濃度は５％（ｗ／ ｖ）組み換えＨＳＡ　ｉｌｌ縮液１ａ＋ｌ当たりｌエンドトキシンユニットより も低かった。エンドトキシンユニットは、いわゆるＥＣ−５として、ＦＤＡ交付 の参考基準（ＲＳＥ）に関連付けられている。エンドトキシンは０−七ファロー ス力ラムステップの間に主１こ除去された；表１参照のこと。

組成物　総エンドトキシンユニット に９ラクテイス（Ｋ、　Ｉａｃｔｉｓ）上清　１１５．００００−セファロース 流出液　１１３．００００−セファロース溶出液　５９ アフイニテイーマトリツクス流出液　４１アフイニテイーマトリツクス溶出液　 ４１最終産物（５，５％（ｗ／ｖ）　ＩＳＡ　）　１７Ｑ−セファロース及びＥ −ＣＩＯ−Ｃ８−アフィニティークロマトグラフィーによる精製醗酵、濾過及び 限外濾過：例２に述べであるように行った。

Ｑ−セファロースクロマトグラフィー：　ＥＰ−Ａ−０３１９０６７に述べであ るように行った。

採取した上清を３０．００００のカットオフ値を持つフィルターを用いた限外濾 過により濃縮した。該残留液のｐＨｆｉ−ｐＨ７，４に調整した。モノマー性Ｈ ＳＡの濃度は１４　ｍｇ／ｍｌであった。

Ｅ−［：１Ｏ−Ｃ８−マトリックスによるアフィニティークロマトグラフィー： 濃縮した０−セファロース溶出液をジグリシジルエーテルによってエポキシ活性 化セファロース６ＦＦに結合されたＣ３（２−メルカプトオクタン酸）に加えた 。該アフィニティー吸着剤を１００　ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７ ，４、で平衡化し、吸着後洗浄した。該単量体ＩＳＡ及び分解生成物類は１００ 　ｍＭカプリル酸すｌ−リウムにより溶出することができた。無傷のＨＳＡ及び 分解生成物類は１００　ｍＭ　ＩＪン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７，４、中 の０（００ｍＭカプリル酸ナナトリウム勾配用いることにより分離することがで きた。ＩＳＡ及び分解生成物類のε−ＣＩＯ−Ｃ８−マトリックスへの結合は、 例２に述べたＥ−ＣＩＯ−ＣＩＯ−７トリックスへの結合はど強くなかった。

例３Ｂ 透明化された醗酵培地からの組み換えＨ３への０−セファロース及びＥ−Ｃ３− Ｃ１２−アフィニティークロマトグラフィーによる精製醗酵、濾過、限外濾過及 び０−セファロースクロマトグラフィー二実施例３Ａに述べであるように行った 。

［！−Ｃ３−Ｃ１２−マトリックスによるアフィニティークロマトグラフィｍ： ＩＳＡの精製は、２−メルカプトドデカオクタン酸がＣ３−エーテルによってエ ポキシ活性化上ファロース６ＰＦに結合されていることを除けば、例３Ａに述べ たと同様に行った。結合した単量体成熟１１ｓＡ、ＵＳＡの分解生成物類及び他 の混入物類は、１００　ａＭ　リン酸ナトリウムバッファー、ｐ）１７．４、中 の１００１１ＩＭカプリル酸ナトリウムでは溶出できなかった。しかしながら、 溶出は１％ＳＤＳにより可能であった。

無傷のＩＳＡ及び他の蛋白類の分離は不可能であった。

ＦＩＧ、　１／６ １４．１　−　、　− ＦＩＧ、　２／６ Ａ　２８０　ｎｍ 時間粉） ＦＩＧ、　３／６ Ａ　２８０　ｎｍ 時間（９） ＦＩＧ、　４／６ Ａ　２８０　ｎｍ ０　５　１０　ｉ５　２０　２５　３０ＦＩＧ、　５／６ Ａ　２８０　ｎｍ ｍｍ陶　ρｃＴ／ＭＬ　９２１００１２５

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．組み換えＤＮＡ技術的より作られた形質転換された微生物又は細胞株を用い た酸酵により調製された血清アルブミンの精製血清アルブミンを製造する方法に おいて： 当該血清アルブミンを含む透明化された酸酵培養液又はセルライセートを出発原 料として用い； 必要ならば、該生成物培地のｐＨをほぼ生理的ｐＨに変える工程；該培地を陰イ オン交換媒質とインキュベートし、該血清アルブミンを酸性ｐＨのＦのバッファ ー溶液で洗浄することにより溶出する工程； 必要ならば、該生成物培地のｐＨをほぼ生理的ｐＨに変える工程；当該濃縮培地 を２−メルカプト或いは２−ヒドロキシＣ４−Ｃ１４アルカノール酸、又はその 塩或いはエステルに結合された担体を含む親油性固定相によるクロマトグラフィ ーにかけ、脱着剤として水溶性脂質陰イオンを該水相に加えることにより該アル ブミンを溶出する工程；及び 精製された血清アルブミンを、当該微生物又は細胞株からの混入物を実質的に欠 いて単離する工程； を含む方法。
2. ２．請求項１記載の方法において、当該担体がエポキシド化合物により活性化さ れている方法。
3. ３．請求項２記載の方法において、アガロース担体が以下の構造式を有するエポ キシド化合物により活性化されている方法：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘが▲数式、化学式、表等があります▼又はハロゲン原子を示し；且つ ｎ及びｍがそれぞれ独立に０−１０であり、但しＸがハロゲン原子を示す場合に はｎが１であることを条件とする。）。
4. ４．請求項３記載の方法において、該エポキシエーテルがジグリシジルエーテル （すなわち、ｎ＝１、▲数式、化学式、表等があります▼）、又はエピクロロヒ ドリン（すなわち、Ｘ＝塩素原子）である方法。
5. ５．請求項１〜４のいずれかに記載の方法において、当該精製血清アルブミンを 透析するステップをさらに含む方法。
6. ６．請求項１〜５のいずれかに記載の方法において、当該血清アルブミンがヒト 血清アルブミンである方法。
7. ７．Ｃ４−Ｃ１４の２−メルカプト又は２−ヒドロキシアルカノール酸に結合さ れたクロマトグラフィー担体。
8. ８．請求項７記載のエポキシ活性化担体。
9. ９．９９．９％よりも高い純度、とりわけ９９．９５％よりも高い純度の単離血 清アルブミン組成物。
10. １０．薬剤として使用するための、請求項９記載の単離血清アルブミン組成物。