JPH11191A - 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン - Google Patents
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンInfo
- Publication number
- JPH11191A JPH11191A JP10124714A JP12471498A JPH11191A JP H11191 A JPH11191 A JP H11191A JP 10124714 A JP10124714 A JP 10124714A JP 12471498 A JP12471498 A JP 12471498A JP H11191 A JPH11191 A JP H11191A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hsa
- serum albumin
- human serum
- treatment
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由
来する夾雑物を実質的に含まないことを特徴とする、遺
伝子操作により得られるヒト血清アルブミン。 【効果】 本発明によれば、原料中のある種の着色成
分、あるいは微生物が分泌する物質が夾雑し、これらが
ヒト血清アルブミンと結合することによって起こる着色
が充分に抑えられ、夾雑成分が充分に除去された、実質
的に夾雑成分を含まない高純度のヒト血清アルブミンを
提供することができる。
来する夾雑物を実質的に含まないことを特徴とする、遺
伝子操作により得られるヒト血清アルブミン。 【効果】 本発明によれば、原料中のある種の着色成
分、あるいは微生物が分泌する物質が夾雑し、これらが
ヒト血清アルブミンと結合することによって起こる着色
が充分に抑えられ、夾雑成分が充分に除去された、実質
的に夾雑成分を含まない高純度のヒト血清アルブミンを
提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により得られ
るヒト血清アルブミンに関する。
るヒト血清アルブミンに関する。
【０００２】
【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。
【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。
【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。
【０００５】ところが、遺伝子操作においては、宿主で
ある微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際
に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌す
る物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合するこ
とによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われ
る。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡ
の精製方法では充分に除去することはできず、該夾雑物
質を含まぬ遺伝子操作由来のＨＳＡは得られていないの
が現状である。
ある微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際
に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌す
る物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合するこ
とによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われ
る。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡ
の精製方法では充分に除去することはできず、該夾雑物
質を含まぬ遺伝子操作由来のＨＳＡは得られていないの
が現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作により得られるＨＳＡに関し、宿主
由来の夾雑成分を実質的に含まず、かつ着色が充分に抑
えられたＨＳＡを提供することにある。
課題は、遺伝子操作により得られるＨＳＡに関し、宿主
由来の夾雑成分を実質的に含まず、かつ着色が充分に抑
えられたＨＳＡを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程にお
いて、特に好ましくはその最後に当該ＨＳＡをキレート
樹脂で処理することにより着色物質がキレート樹脂に吸
着され、ＨＳＡの着色を減少できるとともに、夾雑成分
が充分に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを
見出し、本発明を完成した。
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程にお
いて、特に好ましくはその最後に当該ＨＳＡをキレート
樹脂で処理することにより着色物質がキレート樹脂に吸
着され、ＨＳＡの着色を減少できるとともに、夾雑成分
が充分に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを
見出し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は以下のとおりである。 （１）ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由来する夾
雑物を実質的に含まないことを特徴とする遺伝子操作に
より得られるヒト血清アルブミン。 （２）ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由来する夾
雑物の量が、実質的に抗原性を有さない量であることを
特徴とする遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミ
ン。
雑物を実質的に含まないことを特徴とする遺伝子操作に
より得られるヒト血清アルブミン。 （２）ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由来する夾
雑物の量が、実質的に抗原性を有さない量であることを
特徴とする遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミ
ン。
【０００９】上記特徴を有するＨＳＡは、遺伝子操作に
より得られるＨＳＡについて、その精製工程において、
特に好ましくはその最後に、キレート樹脂、好ましくは
ポリオール基、ポリアミン基またはチオ尿素基から選ば
れたキレート能を有する交換基をリガンドとして有する
キレート樹脂で処理することにより得ることができる。
より得られるＨＳＡについて、その精製工程において、
特に好ましくはその最後に、キレート樹脂、好ましくは
ポリオール基、ポリアミン基またはチオ尿素基から選ば
れたキレート能を有する交換基をリガンドとして有する
キレート樹脂で処理することにより得ることができる。
【００１０】本発明は、遺伝子操作によって得られるＨ
ＳＡに関わるものであり、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経
てＨＳＡを発現する宿主（例えば、大腸菌、酵母、枯草
菌、麹等の菌体、動物細胞等）を培養し、分泌発現（菌
体外発現）により産生される。
ＳＡに関わるものであり、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経
てＨＳＡを発現する宿主（例えば、大腸菌、酵母、枯草
菌、麹等の菌体、動物細胞等）を培養し、分泌発現（菌
体外発現）により産生される。
【００１１】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により調製された
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞等が挙げられる。特に、本発明においては、宿主とし
て、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロ
マイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichiapastoris)〕が使用されることが好ましい。ま
た、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さ
らにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a,his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞等が挙げられる。特に、本発明においては、宿主とし
て、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロ
マイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichiapastoris)〕が使用されることが好ましい。ま
た、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さ
らにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a,his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。
【００１２】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６
２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特
開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−
７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現
（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６
２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特
開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−
７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現
（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。
【００１３】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１４】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を
添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１
７１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方
法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱
処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１
８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性
炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡ
と着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平
４−５４１９８号公報）等が例示される。
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を
添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１
７１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方
法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱
処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１
８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性
炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡ
と着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平
４−５４１９８号公報）等が例示される。
【００１５】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１６】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。
【００１７】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。
【００１８】（２）ＨＳＡの精製 本発明のＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方
法が採用される。当該精製工程としては、例えば以下の
〜を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜
３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
溶出する工程、または前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程と
の間、との間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩
濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回
収する工程をさらに含むものであってもよい。
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方
法が採用される。当該精製工程としては、例えば以下の
〜を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。 また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜
３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
溶出する工程、または前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程と
の間、との間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩
濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回
収する工程をさらに含むものであってもよい。
【００１９】（３）ＨＳＡの脱色 本発明のＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、
特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド
部を有するキレート樹脂とＨＳＡを接触することにより
行われる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担
体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベ
ンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合
体等が挙げられる。一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグ
ルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、エ
チレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキレ
ンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げ
られる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹
脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジ
ビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガン
ド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAION
CR20 （リガンド部；−ＮＨ(CH 2 CH2 NH) n Ｈ、三菱
化成製）、LEWATIT TP（リガンド部；−ＮＨＣＳＮ
Ｈ2 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００等が好
適に使用される。
特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド
部を有するキレート樹脂とＨＳＡを接触することにより
行われる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担
体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベ
ンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合
体等が挙げられる。一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグ
ルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、エ
チレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキレ
ンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げ
られる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹
脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジ
ビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガン
ド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAION
CR20 （リガンド部；−ＮＨ(CH 2 CH2 NH) n Ｈ、三菱
化成製）、LEWATIT TP（リガンド部；−ＮＨＣＳＮ
Ｈ2 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００等が好
適に使用される。
【００２０】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（３〜９、好ましくは４〜
７) 時間：少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（３〜９、好ましくは４〜
７) 時間：少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
【００２１】上記の工程（〜および塩析処理、さら
にキレート樹脂処理を含む）を経て得られうるＨＳＡの
着色度は、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ500nm ／Ａ
280nm が０．００１〜０．００５程度である。キレート
樹脂処理によりＨＳＡの着色度は１／２〜１／１０に低
減される。特に吸収波長５００ｎｍ付近、すなわち赤色
系の着色度が１／３〜１／１０に低減される。
にキレート樹脂処理を含む）を経て得られうるＨＳＡの
着色度は、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ500nm ／Ａ
280nm が０．００１〜０．００５程度である。キレート
樹脂処理によりＨＳＡの着色度は１／２〜１／１０に低
減される。特に吸収波長５００ｎｍ付近、すなわち赤色
系の着色度が１／３〜１／１０に低減される。
【００２２】（４）製剤化 本発明のＨＳＡは公知の手法（限外濾過、安定化剤の添
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。
【００２３】（５）本発明の遺伝子操作由来のＨＳＡの
性状 本発明のＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６〜
５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量体のみか
らなり、二量体、重合体または分解物を実質的に含まな
い。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有
量は０．０１％以下程度である。また本発明のＨＳＡ
は、産生宿主に由来する夾雑成分（例えば、ＨＳＡ以外
の蛋白質、多糖成分等）を実質的に含まず、該夾雑物と
の含量比から算出されるＨＳＡの純度は９９．９９９９
９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上で
ある。具体的には、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、蛋白質
成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ
以下が例示される。また、同じく多糖成分が１０ｎｇ／
ｍｌ以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。
尚、本発明でいうＨＳＡの純度とは、産生宿主に由来す
る夾雑成分との含量比から算出されるＨＳＡの純度を意
味する。着色度はＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ350 ／Ａ
280 が０．０１〜０．０５、Ａ 450 ／Ａ280 が０．００
１〜０．０２、Ａ500 ／Ａ280 が０．００１〜０．００
５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪
酸量がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．
１分子以下が例示される。
性状 本発明のＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６〜
５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量体のみか
らなり、二量体、重合体または分解物を実質的に含まな
い。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有
量は０．０１％以下程度である。また本発明のＨＳＡ
は、産生宿主に由来する夾雑成分（例えば、ＨＳＡ以外
の蛋白質、多糖成分等）を実質的に含まず、該夾雑物と
の含量比から算出されるＨＳＡの純度は９９．９９９９
９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上で
ある。具体的には、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、蛋白質
成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ
以下が例示される。また、同じく多糖成分が１０ｎｇ／
ｍｌ以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。
尚、本発明でいうＨＳＡの純度とは、産生宿主に由来す
る夾雑成分との含量比から算出されるＨＳＡの純度を意
味する。着色度はＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ350 ／Ａ
280 が０．０１〜０．０５、Ａ 450 ／Ａ280 が０．００
１〜０．０２、Ａ500 ／Ａ280 が０．００１〜０．００
５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪
酸量がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．
１分子以下が例示される。
【００２４】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
【００２５】参考例１ ＨＳＡ産生宿主の培養 (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ１
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ１
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００２６】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有
無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２
％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個
のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほ
とんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００２７】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。
【００２８】
【表１】
【００２９】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。
【００３０】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。
【００３４】参考例３ ＨＳＡの精製 [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することに
より培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０
万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万
の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分
画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３時間の加熱処理
後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整し、再
度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した
〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外
濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩
化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に
交換した。
より培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０
万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万
の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分
画（Ｉ）〕。この濃縮液を６０℃、３時間の加熱処理
後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整し、再
度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した
〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外
濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩
化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に
交換した。
【００３５】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
【００３６】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件でフェニルセ
ルロファインを吸着することなく、カラムを通過した画
分を回収した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件でフェニルセ
ルロファインを吸着することなく、カラムを通過した画
分を回収した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００３７】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったアル
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
ブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加
した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロー
スに吸着することなく、カラムを通過した。
【００３８】[v] ＨＳＡの塩析処理 ５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。
【００３９】[vi] 脱色処理 ２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ
０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキ
レート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イ
オン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌し
た。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして
回収した。
０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキ
レート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イ
オン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌し
た。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして
回収した。
【００４０】実施例１ 本発明の精製ＨＳＡの性状 (1) 精製工程のＨＰＬＣ分析 疎水性クロマト処理までの精製工程を終了したＨＳＡを
ＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記
の条件で行った。 カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社
製） 展開液：0.1M KH 2 PO4 /0.3M NaCl 緩衝液 検出：波長２８０ｎｍでの吸光度 精製ＨＳＡはＨＳＡモノマーのシングルピークとなっ
た。
ＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記
の条件で行った。 カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社
製） 展開液：0.1M KH 2 PO4 /0.3M NaCl 緩衝液 検出：波長２８０ｎｍでの吸光度 精製ＨＳＡはＨＳＡモノマーのシングルピークとなっ
た。
【００４１】(2) 酵母由来成分分析 アルブミン非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて精製ＨＳＡ中に存在する酵母由来成分の検出を試み
た。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。各サ
ンプルについての酵母由来成分の検出結果を示す。サン
プルはアルブミン濃度として250 mg／mlに調整したもの
を用いて測定した。
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて精製ＨＳＡ中に存在する酵母由来成分の検出を試み
た。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。各サ
ンプルについての酵母由来成分の検出結果を示す。サン
プルはアルブミン濃度として250 mg／mlに調整したもの
を用いて測定した。
【００４２】
【表４】
【００４３】(3) 分子量 分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発
明の精製ＨＳＡ中のＨＳＡの分子量は約６７０００であ
り、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
明の精製ＨＳＡ中のＨＳＡの分子量は約６７０００であ
り、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
【００４４】(4) 等電点 等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Allen ら
の方法 [J. Chromatog., 146, 1 (1978)] に準じて測定
した。本発明の精製ＨＳＡ中のＨＳＡの等電点は約４．
９であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
の方法 [J. Chromatog., 146, 1 (1978)] に準じて測定
した。本発明の精製ＨＳＡ中のＨＳＡの等電点は約４．
９であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
【００４５】(5) 着色度 着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００
ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ350 ／Ａ 280、Ａ 450／Ａ
280、Ａ 500／Ａ 280を算出した。本発明の精製ＨＳＡ
の着色度はＡ350 ／Ａ 280は約０．０２、Ａ 450／Ａ
280は約０．０１、Ａ 500／Ａ 280は約０．００２であ
り、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ350 ／Ａ 280、Ａ 450／Ａ
280、Ａ 500／Ａ 280を算出した。本発明の精製ＨＳＡ
の着色度はＡ350 ／Ａ 280は約０．０２、Ａ 450／Ａ
280は約０．０１、Ａ 500／Ａ 280は約０．００２であ
り、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
【００４６】(6) 結合脂肪酸量 測定には、ＮＦＥＡ−テストワコー（和光純薬社製）を
用いた。その結果、キレート樹脂処理前は１．６モル
（ＨＳＡ１モル当たり）であったが、処理後は０．０３
７モル（ＨＳＡ１モル当たり）と大幅に減少した。
用いた。その結果、キレート樹脂処理前は１．６モル
（ＨＳＡ１モル当たり）であったが、処理後は０．０３
７モル（ＨＳＡ１モル当たり）と大幅に減少した。
【００４７】実施例２ 参考例２で得た培養液を参考例３と同様に処理した。精
製されたＨＳＡの性状は実施例１で開示した分子量・等
電点および着色度、多糖体含量、ゲル濾過パターンおよ
び酵母由来成分量と同程度であった。
製されたＨＳＡの性状は実施例１で開示した分子量・等
電点および着色度、多糖体含量、ゲル濾過パターンおよ
び酵母由来成分量と同程度であった。
【００４８】
【発明の効果】本発明は産生宿主に由来する夾雑成分を
実質的に含まないことを特徴とする遺伝子操作由来のＨ
ＳＡであり、かかる本発明によれば、産生宿主が分泌す
る物質が夾雑していないがゆえに、これらがＨＳＡと結
合することによって起こる着色および他の夾雑物の混在
が充分に抑えられた高純度のＨＳＡを提供することがで
きる。
実質的に含まないことを特徴とする遺伝子操作由来のＨ
ＳＡであり、かかる本発明によれば、産生宿主が分泌す
る物質が夾雑していないがゆえに、これらがＨＳＡと結
合することによって起こる着色および他の夾雑物の混在
が充分に抑えられた高純度のＨＳＡを提供することがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 上出 佳永子 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 野田 宗宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由
来する夾雑物を実質的に含まないことを特徴とする遺伝
子操作により得られるヒト血清アルブミン。 - 【請求項２】 ヒト血清アルブミン以外の産生宿主に由
来する夾雑物の量が実質的に抗原性を有さない量である
ことを特徴とする遺伝子操作により得られるヒト血清ア
ルブミン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10124714A JPH11191A (ja) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10124714A JPH11191A (ja) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4253142A Division JP2869417B2 (ja) | 1992-05-20 | 1992-09-22 | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11191A true JPH11191A (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=14892299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10124714A Pending JPH11191A (ja) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11191A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1119352C (zh) * | 1998-05-15 | 2003-08-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 |
-
1998
- 1998-05-07 JP JP10124714A patent/JPH11191A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1119352C (zh) * | 1998-05-15 | 2003-08-27 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3230091B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 | |
| EP0570916B1 (en) | Process for the purification of human recombinant serum albumin | |
| KR100392021B1 (ko) | 재조합 사람혈청알부민의 정제방법 | |
| EP0322094A1 (en) | N-terminal fragments of human serum albumin | |
| US5986062A (en) | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same | |
| JP3360315B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 | |
| JPH07102148B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法、およびそれにより得られるヒト血清アルブミン含有組成物 | |
| JPH07308199A (ja) | ヒト血清アルブミンの製造方法 | |
| EP0612761A1 (en) | Human serum albumin and process for producing the same | |
| JPH05260986A (ja) | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 | |
| JP2869417B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン | |
| JP2885212B2 (ja) | 遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンより得られる高純度ヒト血清アルブミン含有組成物 | |
| US5710253A (en) | Method for decoloring human serum albumin | |
| JPH11191A (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン | |
| JP3508149B2 (ja) | ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 | |
| JPH0672891A (ja) | ヒト血清アルブミン含有製剤 | |
| JP2004002449A (ja) | ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 | |
| JPH05328991A (ja) | ヒト血清アルブミンの脱色方法 | |
| JP2004002450A (ja) | ヒト血清アルブミン | |
| JPH06245788A (ja) | ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 | |
| JP3298405B2 (ja) | 脱脂されたヒト血清アルブミン | |
| JPH0733398B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの脱脂方法 | |
| JP3684584B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの脱色方法 | |
| JPH07170993A (ja) | ヒト血清アルブミンの脱色方法 | |
| JP3772355B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの製造方法 |