FI96864B - Ei-terapeuttisesti käytettävä HIV:n glykoproteiini GP 160 ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

96864

Ei-terapeuttisesti käytettävä HIV:n glykoproteiini GP 160 ja menetelmä sen valmistamiseksi

Keksintö koskee soluissa tuotettua ei-terapeutti-5 sesti käytettävää HIV:n glykoproteiinia GP 160, sen ei-terapeuttista käyttöä sekä menetelmää sen eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Kaikki fysiologisesti aktiiviset solut tuottavat proteiineja, joita ne tarvitsevat kulloistenkin elintoi-10 mintojensa ylläpitämiseksi. Syntetisoiduilla proteiineilla on erilaisia tehtäviä. Jotkut toimivat entsyymeinä, ts. ne katalysoivat solussa aineenvaihduntareaktioita. Joiden tehtävän on organismin, johon solu kuuluu, elintoimintojen yhteenvirittäminen, ja jotkut muodostavat solun rakenteen.

15 Proteiinit, joita tuotetaan näissä soluissa, voivat kuitenkin vaikuttaa antigeenisesti muihin organismeihin, ts. ne indusoivat näissä organismeissa immuunireaktioita. Myös virukset ovat eliöitä, jotka sisältävät esimerkiksi vaipassaan proteiineja, jotka voivat toimia antigeeneinä.

20 Proteiinisynteesin "ohjeet" ovat solujen geeneissä, joita voidaan pitää perinnöllisen aineksen toiminallisina · yksikköinä. Nykvään hallitaan hyvin menetelmä solun, esi merkiksi bakteerin, genomin muuttamiseksi, jolloin siirretään geeni esimerkiksi eläin- tai ihmissolusta toiseen so- • 25 luun, joka usein on bakteerisolu. Bakteeri tuottaa sitten 1·« · myös proteiinia, jota vastaavan informaation vieras lisät-ty geeni sisältää. Eräs tunnetuimmista esimerkeistä on ih- « · misen haiman tuottama insuliini, jota vastaava geneettinen . informaatio on siirretty Escherichia coli -bakteeriin.

« « · ’”· 30 Sekä luonnostaan että myös solujen geeniteknisen • · · *·* ’ käsittelyn kautta tuotetut proteiinit joko erittyvät kas- " ? vualustaan tai kerääntyvät soluihin, ja ne eristetään sit ten tunnetuin menetelmin solujen rikkomisen jälkeen ja liuotetaan mahdollisesti. Näissä menetelmissä käytetään 35 yleensä tiettyjen fraktiointi- ja puhdistusesivaiheiden 2 96864 jälkeen pinta-aktiivisia aineita, joiden täytyy olla sangen spesifisesti sopivia kulloinkin eristettäville ja puhdistettaville proteiineille. Ongelmana on edelleenkin oikeiden pinta-aktiivisten aineiden löytäminen haluttujen 5 proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Tämän keksinnön päämääränä oli siten saada aikaan aineita ja menetelmiä, joiden avulla voidaan eristää ja puhdistaa fysiologisesti aktiivisten solujen tuottamia proteiineja ja säilyttää samalla proteiinien biologinen 10 aktiivisuus tai parantaa sitä.

Tähän päämäärään päästään tarjoamalla käyttöön proteiineja, jotka ovat pinta-aktiivisten aineiden poissa ollessa ensimmäisessä, suunnilleen pallomaisessa, elektro-nioptisesti nähtävissä olevassa, aggregoituneessa, elekt-15 roforeesissa liikkumattomassa muodossa I ja ensimmäisen, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen lansä ollessa toisessa, lövhemmässä, elektronioptisesti havaittavissa olevassa, aggregoituneessa, elektroforeesissa liikkumattomassa muodossa II ja toisen, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen 20 aineen läsnä ollessa elektroforeesissa liikkuvassa muodossa III, joka ei ole nähtävissä elektronioptisesti, jolloin mainitut muodot I, II ja III ovat muutettavissa reversii-belisti toisikseen mainittujen pinta-aktiivisten aineiden läsnätai poissaolosta riippuvalla tavalla.

; ; ; 25 Proteiinien eristysmenettelyjen yhteydessä on • · · · osoittautunut yllättävästi, että käytettäessä ei-denatu- • · .·.·. roivia pinta-aktiivisia aineita amfifiiliset proteiinit « · eivät ole monomeerisessa muodossaan vaan aggregoituneissa . muodoissa, joilla on aivan yllättävän edullisia ominai- • · < *;j;’ 30 suuksia. Ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen poissa • · · ’·* * ollessa on aggregoituneilla muodoilla tiivis rakenne, jos- ·*· ' ta käytetään tässä nimitystä aggregoitunut muoto I. Tässä muodossa ollessaan hiukkaset soveltuvat parhaiten näiden hiukkasten pinnoilla olevien epäpuhtauksien poistamiseen. ·' 35 Hiukkasen tiivis muoto varmistaa tällöin tietyn suojan 3 96864 aktiivisten keskusten denaturoitumista vastaan, olivatpa nämä sitten entsymaattisesti aktiivisia keskuksia tai epi-tooppeja, jotka herättävät immuunireaktioita. Myös aggre-goituneessa muodossa I olevat tiiviit hiukkaset ovat kui-5 tenkin biologisesti aktiivisia, joskin elektroforeettises-ti liikkumattomia.

Ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa voidaan aggregoituneiden proteiinien tiivis, pallomainen muoto I muuttaa enemmän tai vähemmän löyhentyneeksi 10 muodoksi, jolla on eristys- ja puhdistusmenettelyjen edetessä se etu, että voidaan poistaa epäpuhtaudet, jotka tulevat helpommin saataville muodon I muuttuessa muodoksi II. Lisäksi proteiinien biologiset vaikutukset voimistuvat yllättävästi aggregoituneiden proteiinien muodossa II. On 15 esimerkiksi osoittautunut, että eristettyjen proteiinien immunogeenisyys kasvaa, jos eristetyn proteiinin biologinen ominaisuus on proteiinin immunisoiva antigeenisyys. Biologisesti aktiiviset proteiinit, tai mahdollisesti myös näiden proteiinien osat, jotka ovat biologisesti aktiivi-20 siä, ovat siten aktiivisia erityisesti laajennetussa muodossa ja soveltuvat tässä suunnilleen •'pilvimäisessä" muodossa mainituista syistä erityisen hyvin proteiinien puhdistamiseen aineosista, jotka ovat aggregoituneissa muodoissa sisälle suljettuja.

• :; 25 Aggregoituneessa muodossa II olevat proteiinit ei- • ·· · jV. vät myöskään liiku elektroforeesissa.

• · • ·. Erityisen yllättävää keksinnön mukaisten, hiukkas- I · « maisten, aggregoituneiden proteiinien yhteydessä on se, . että aggregoituneet muodot I ja II ovat muutettavissa re- • · e 30 versiibelisti toisikseen ensimmäisen, ei-denaturoivan pin- • · · '•J * ta-aktiivisen aineen poissa- ja läsnäolosta riippuvalla ·* ; tavalla. Kuvattujen, hiukkasinaisten aggregoituneiden pro teiinien myötä saadaan siten käytettäväksi aina tarkoituksenmukainen kompleksi, jolla on näiden aggregaattien eri-35 laisten muotojen I ja II reversiibelin toisikseen muuttu- • · 4 96864 misen ansiosta valtavia etuja helpottuneen puhdistusmenet-telyn, parantuneen säilyvyyden sekä eristettyjen proteiinien kohonneen biologisen tehon suhteen.

Kun käytetään toista, ei-denaturoivaa pinta-aktii-5 vista anetta, voidaan proteiinit muuttaa aggregoituneesta muodosta II proteiinien monomeeriseen muotoon III, jolloin myös tämä tila on täysin yllättävästi reversiibeli, kun toinen, ei-denaturoiva proteiini poistetaan. Ei-denaturoi-vien pinta-aktiivisten aineiden poissa- tai läsnä olosta 10 riippuvalla tavalla voidaan fysiologisesti aktiivisista soluista eristettävät proteiinit siten muuttaa tarkoituksellisesti ja säädeltävissä olevalla tavalla reversiibe-listi kuhunkin haluttuun ja kulloinkin päämääräänä olevaan käsittelyvaiheen tai käyttötarkoituksen kannalta optimaa-15 liseen muotoon.

Säilytyksen tai eristetyn proteiinin säädellyn, mahdollisesti toivotun vähentyneen biologisen aktiivisuuden kannalta on rakenteeltaan suunnilleen pallomainen agg-regoitunut muoto I edullinen. Pallomainen muoto suojaa 20 lisäksi puhdistusvaiheissa mahdollisesti herkkiä aktiivi sia keskuksia mahdollisesti denaturoivilta käsittelyiltä.

Aggregoituneella muodolla II on käsittelyn kestosta ja ei-denaturoivan entsyyminen konsentraatiosta riippuen suunnilleen pilvimäinen rakenne. Rakenteen avautumisas- ; ; ; 25 teestä riippuvalla tavalla on jatkopuhdistusvaiheissa kä- • ·· * tV. siteltävissä sellaisia proteiinein epäpuhtauksia, jotka ·.·. voivat olla peräisin esimerkiksi proteiinien tuotantoon X m * käytettävistä isäntäsoluista tai vektorijärjestelmistä.

. Proteiinien biologinen aktiivisuus voimistuu.

» · r *·|·* 30 Sekä pallomainen, aggregoitunut muoto I että suun- • · · ’·* ’ nilleen pilvimäinen, aggregoitunut muoto II voidaan tehdä ·*- ? elektronioptisesti nähtävissä olevaksi, jos tuotettavan yksittäisen proteiinin molekyylimassa on vähintään 10 000 daltonia. Jos geenimanipuloinnin avulla tuotetaan kuiten-35 kin esimerkiksi vain tiettyjä antigeenideterminantteja, 5 96864 jotka ovat vain muutaman aminohapon sisältäviä proteiineja, saattavat myös aggregoituneet, useampia proteiineja sisältävät muodot I ja II olla elektronioptisen havaitta-vuusrajan alapuolella.

5 Muodoissa I ja II aggregoituneiden, elektroforee sissa liikkumattomien proteiinien puhtausaste on 80 %, edullisesti 98 %, ts. aggregoituneet muodot I ja II sisältävät haluttuja proteiineja suhteellisen homogeenisena koostumuksena.

10 Proteiinien aggregoituminen tapahtuu solujen sisäl lä edullisesti silloin, kun proteiinit ovat geeniteknisesti käsiteltyjen solujen ilmentymistuotteita, erityisesti silloin, kun tuotteita tuotetaan tunnetuin menetelmin ylimäärin näissä soluissa. Ylituotanto voidaan saada aikaan 15 joko sitä kautta, että läsnä on useampia vektoreita, jotka sisältävät haluttua proteiinia koodittavan geenin, tai siten että vastaavan geenin eteen kytketään erityisen voimakkaita promoottoreja. Jos tuotettujen proteiinien kohdalla on kyse proteiineista, jotka ovat soluissa liukene-20 via, ne aggregoituvat kuvatuiksi pallomaisiksi hiukkasiksi.

Geneettisesti käsiteltyjen isäntäsolujen tuottamat proteiinit toimivat edullisesti antigeenisesti. Nämä proteiinit ovat edullisia geeniteknisesti aikaansaatuja pro- • ; ; 25 teiinituotteita, jos tarkoituksena on antigeeneillä ai- .1 2 3.·. kaansaatava vastaava aktiivinen immunisointi. Tällöin on * · « • · ·. kyse erityisesti patogeenisten virusten vaippaproteiineis- 2 I t « ta, jolloin virukset voivat olla joko ihmisille tai eläi- . mille patogeenisiä.

« « 1 *;··' 30 Eristetyt proteiinit ovat edullisesti glykoproteii- • · · *·[ 1 neja, ja keksinnön kohteena on näin ollen ei-terapeutti- 3 ? sesti käytettävä HIV:n glykoproteiini GP 160, jolle on s tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Proteiinia vastaava geeni voidaan saattaa ilmenty-35 mään nisäkässolujärjestelmässä esimerkiksi lehmärokkovi- 6 96864 rusvektorin kautta. Mackett et ai. [J. Virol. 49 (1984) 857 - 846] kuvaavat menetelmää, jolla spesifisiä geenejä insertoidaan lehmärokkovirusvektoreihin. Vieras geeni in-sertoidaan ensin sinänsä tunnetulla tavalla plasmidivekto-5 riin lehmärokkoviruksen transskriptiota säätelevän elementin (7,5 K -promoottorin) jälkeen. Tätä kimeeristä geeniä reunustavat yhdistelmäplasmidissa lehmärokkovirussekvens-sit, jotka koodittavat viruksen tymidiinikinaasigeeniä (TK). Plasmidi viedään sitten soluihin, jotka on ennalta 10 infektoitu villin tyypin lehmärokkoviruksella (kanta WR). Yhdistyminen tapahtuu tällöin TK-alueella, joka on homologinen sekä virus-DNA:lie että plasmidille ja mahdollistaa kimeerisen geenin insertion lehmärokkovirusgenomiin. Tällä tavalla aikaansaadulla yhdistelmäviruksella on fenotyyppi 15 TK , eikä se siten pysty enää tuottamaan tymidiinikinaa-sia, ja se kasvaa selektiivisessä alustassa, joka sisältää 5-bromideoksiuridiinia. Tällä tavalla voidaan valmistaa yhdistelmälehmärokkoviruksia, jotka sisältävät kulloinkin geenejä, jotka saavat aikaan proteiinien tuotannon, mah-20 dollisesti ylimäärin, jotka sitten nisäkässoluissa kerääntyvät yhteen suojatuiksi, lukuisia yksittäisiä proteiineja sisältäviksi aggregoituneiksi muodoiksi. Muiden antigee-: nisten proteiinien yhteydessä tunnetaan samankaltaisia , ilmentymisjärjestelmiä. On esimerkiksi konstruoitu joita- • ; ; 25 kin lehmärokkovirusyhdistelmiä, jotka koodittavat hepa- ··· ♦ tiitti B -viruksen pinta-antigeeneja. Tämän aikaansaami- * « ·,·. seksi tuotettiin heptatiitti B -viruksen pintaantigeeneja lehmärokkoviruksen säätelymekanismien ohjauksessa, jolloin . käytettiin joukkoa lehmärokkovirusspesifisiä promoottoreja

• t I

30 päämääränä vieraan geenin ilmentymistason kohottaminen.

• · · '·[ * Lisäksi on valmistettu lehmärokkovirusyhdistelmiä, jotka sisältävät useamman kuin yhden hepatiitti B -virusgeenin.

Halutun proteiinin geenitekniseen tuottamiseen tarkoitettujen yhdistelmäilmentymisjärjestelmien valmistuksen 35 suhteen viitataan tässä yhteydessä yleisesti teokseen Win- ««1(4 7 96864 nacker, E. L., Gene und Klone, eine Einfiihrung in die Gen-technologie, VCH-Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim 1984.

Mainituissa soluissa tuotettu proteiini, voi olla aggregoituneissa, useita proteiineja sisältävissä muodois-5 sa. Erityisesti aggregoituneessa muodossa II havaitaan voimistunut toiminta, joka voi liittyä siihen, että aktiiviset keskukset ovat avautuneessa aggregoituneessa muodossa II vapaina ja kaikki aktiiviset proteiinit ovat kuitenkin kolmiulotteisesti yhteydessä keskenään, niin että mai-10 nittujen proteiinien aktiivisuuden kautta reagoivien proteiinien ja aktiivisten alueiden kohtaamistodennäköisyys kasvaa.

Hiukkasmaiseen muotoon kerääntyneet proteiinit voidaan edullisesti sitoa toiseen aineeseen, erityisesti suu-15 rimolekyyliseen proteiiniin, konjugaation kautta, jolloin saadaan aikaan proteiininen stabiilisuuden, aktiivisuuden, in vivo -talteenoton ja biologisen puoliintumisajan paraneminen.

Hiukkasmaiset aggregoituneet proteiinit ovat edul-20 lisesti eukaryoottisoluissa, erityisesti eläin- tai ihmis-soluissa.

Haluttua proteiinia tuotetaan tällöin erityisen edullisesti primaarisissa soluviljelmissä tai solulinjois- ta talteenotetuissa verosoluissa. CHO-soluissa tai primaa- ; ; ; 25 risissa kananalkiofibroblastisoluissa. Mainitut isäntäso- »·· · lut ovat edullisia ilmentymisjärjestelminä, koska niissä • · ·,·, translaatiota seuraavat muuntamiset tapahtuvat käytettä- vien lopputuotteiden kannalta toivottavalla tavalla, kuten . esimerkiksi ilmentymistuoteproteiinien glykosylaatio. Nämä • · r *··>* 30 glykosyloituneet proteiinit kerääntyvät sitten yhteen • · · hiukkasmaiseen muotoon, jotka muodot voivat olla kuvattuja ·* * pallomaisia muotoja I tai pilvimäisiä muotoja II ensimmäi sellä, ei-denaturoivalla pintaaktiivisella aineella tehdyn käsittelyn jälkeen ja muuttua toisella, ei-denaturoidulla 1 35 pinta-aktiivisella aineella tehdyn käsittelyn jälkeen kol manneksi aggreaoituneeksi muodoksi III.

96864 8

Verosolut ovat erityisen edullisia edellä kuvatun HIV-glykoproteiinin 160 valmistukseen. Tämä solujärjestel-mä valittiin, koska sillä on suhteellisen suuri kasvunopeus. Verosolujen infektointi yhdistelmälehmärokkoviruk-5 sella, joka sisältää haluttua, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä eristettävää proteiinia koodittavan geenin, johtaa halutun proteiinin normaaliin synteesiin, sen gly-kosyloitumiseen sekä mahdollisiin jatkokäsittelyvaihei-siin. Käyttämällä kaksoisinfektointijärjestelmää, jossa on 10 kaksi yhdistelmää, voidaan halutun proteiinin määrää nostaa huomattavasti. Tämä järjestelmä sisältää yhdistelmän, joka saa aikaan T7-faagin polymeraasin tuotannon lehmärok-koviruksen P7.5-promoottorin ohjauksessa. Tätä yhdistelmää käytetään infektointiin yhdessä yhdistelmän kanssa, joka 15 sisältää HIV:n T7-promoottorin ja glykoproteiini 160 -geenin. T7-promoottori on sangen voimakas promoottori ja varmistaa korkean ilmentymistason, esimerkiksi noin 10-ker-taisen määrän haluttua proteiinia.

Kuvattuja järjestelmiä on pidettävä edullisina jär-20 jestelmlnä. Yleiskatsaus moniin mahdollisuuksiin käyttää tiettyjä vektoreita haluttujen geenien yhdistämiseen, lisätä näitä vektoreita halutuissa soluissa ja valmistaa vieraiden geenien koodittamia proteiineja esitetään esimerkiksi teoksissa Genetic Engineering 3, toim. Robert ; . ; 25 Williamson, Academic Press 1982 ja Spektrum der Wissen- V. schaft, Industrielle Mikrobiologie 1985.

I * *

Ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine, joiden läsnä- l 4 Γ ’' tai poissaolo vaikuttaa oleellisesti fvsiologisesti aktii visista soluista eristettyjen proteiinien esiintymiseen « t ( *···* 30 keskenään erilaisissa aggregoituneissa muodoissa tai mono- • f i V * meerimuodossa, on edullisesti tietty ioninen, ioniton tai * * kahtaisioninen pinta-aktiivinen aine. Proteiinikemiassa tai proteiinien puhdistusmenettelyissä on tunnettuna ongelmana se, että pinta-aktiivisen aineen valinta halutun 35 proteiinin talteenottamiseksi toisaalta hyvin puhtaassa « 9 96864 muodossa ja toisaalta biologisesti aktiivisessa tilassa on aina jonkinlainen haaste. Nyt on yllättävästi käynyt ilmi, että käyttämällä ei-denaturoivia pinta-aktiivisia aineita, joilla on tietty ioninen, ioniton tai kahtaisioninen luon-5 ne, voidaan täyttää täysin edellä mainitut proteiinien puhdistusmenetelmälle asetetut vaatimukset, jolloin yhteen kerääntyneiden proteiinien, joita esiintyy näissä proteiineja tuottavissa soluissa, odottamattomat konfiguraatio-muutokset lisäksi täyttävät mainitut vaatimusket yllättä-10 vän optimaalisesti. Kuten edellä mainittiin, erityisesti aggregoituneessa muodossa II, avautuneessa eli pilvimäi-sessä konfiguraatiossa, voimistuu yksittäisen proteiinin sisältämä biologinen aktiivisuus selvästi, olipa se sitten luonteeltaan entsymaattinen tai antigeeninen.

15 Eräs edullinen ioniton pinta-aktiivinen aine on ok- tyyliglukosidi tai tämän pinta-aktiviisen aineen johdannainen edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %.

Samoin on edullista käyttää pinta-aktiivisena ai-20 neena sappihapon suolaa samoin kuin sen johdannaista, edullisesti pinta-aktiivista deoksikolaattia (DOC), joka on erityisen sopiva useiden HIV-glykoproteiinien 160 muodostaman pallomaisen konfiguraation eristämisen ja puhdistamisen yhteydessä, jos tämä proteiini sekä puhdistetaan : . . 25 käyttämällä mainittua pinta-aktiivista ainetta pitoisuute- »•4 « na 0,25 - 5 %, edullisesti 1 %, että käytetään deoksiko- f · « II laattia GP 160:n käytön yhteydessä, esimerkiksi yhdistet- * * tynä alumiinihydroksidiin.

Ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine, jota käyte- • » e *·*· 30 tään edullisesti aggregoituneiden proteiinien muuttamiseen • * « ^ V * muodossa II monomeeriseen muotoon III, on Zwittergent * -sarjaan kuuluva kahtaisioninen pinta-aktiivinen aine sa moin pitoisuutena 0,25 - 5 %, edullisesti 1 %. Zwitter- ® . ... . .... gent -sarjan pinta-aktilviset aineet ovat kahtaisionisia «·> 3 5 pinta-aktiivisia aineita, jotka ovat tulleet tunnetuiksi 10 96864 sulfobetaiineina ja joilla on seuraava yleinen rakennekaava: + CH 0

I ^ I

„ CnH2n+l-N-(CH2>2-S-°' 5 i , ch2 o

Aggregoituneessa muodossa I olevat proteiinit sopivat, kuten edellä mainittiin, erityisen hyvin proteiinien 10 säilyttämiseen stabiileina. Niitä voidaan kuitenkin käyttää myös haluttuihin biokemiallisiin muuttamisiin tai reaktioihin, koska myös aggregoituneeseen muotoon I kerääntyneet proteiinit ovat biologisesti aktiivisia.

Aggregoituneessa muodossa II olevia proteiineja 15 käytetään edullisesti proteiinien biologisen vaikutuksen voimistamiseen.

Proteiinien kukin aggregoitunut muoto soveltuu diagnostiseen käyttöön sekä kuvatuissa pallomaisissa, pil-vimäisissä tai monomeerisissa muodoissa että edellä kuva-20 tuissa muiden suurimolekyylisten proteiinien kanssa kytketyissä muodoissa.

Eräs aggregoituneiden proteiinien lisäkäyttö on substituutiokäsittely, monoklonaalisten vasta-aineiden talteenotto sekä aineiden talteenotto tällaisten aineiden ; . . 25 osoittamiseksi kvalitatiivisesti ja määrittämiseksi kvan- • · · • ·· · titatiivisesti elimistönesteistä.

« · « ·,·, Joukosta proteiineja koostuvien hiukkasten lisäksi, t · ί jotka ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä tai poissaolon mukaan voivat olla muodoltaan erilaisissa kon- • · » 30 figuraatioissa, jotka voivat muuttua reversiibelisti toi- V : sikseen, tämä keksintö koskee myös menetelmää haluttujen » ’ * proteiinien, joita tuotetaan soluissa, edullisesti geeni teknisesti käsitellyissä soluissa, eristämiseksi ja puhdistamiseksi, jolloin ensimmäisessä puhdistusvaiheessa *"! 35 ensimmäisessä aggregoituneessa muodossa olevista proteii- * « i t t · t · 11 96864 neista poistetaan pinnalla olevat epäpuhtaudet, muutetaan sitten proteiinit käyttämällä ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta toiseen aggregoituneeseen muotoon II ja poistetaan toisessa puhdistusvaiheessa tässä aggregoitu-5 neessa muodossa II saavutettavissa olevat epäpuhtaudet, ja proteiinit ovat muutettavissa monomeeriseen muotoon III lisäämällä toista ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta ja reversiibelisti takaisin aggregoituneeseen muotoon I tai II poistamalla ei-denaturoivat pintaaktiiviset aineet. 10 Keksinnön mukaiselle mentelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 13 esitetään.

Tämän menetelmän valtavia etuja on käsitelty jo edellä olennaisilta osiltaan, ja ne perustuvat siihen, että proteiinien erilaiset aggregoituneet muodot ovat re-15 versiibelisti muutettavissa toisikseen.

Suurin piirtein pallomainen muoto I mahdollistaa proteiinien tiiviin järjestymisen ansiosta esimerkiksi kasvualustan aineosien helpomman poistamisen pallomaisen proteiinikerääntymän pinnalta. Kun sen jälkeen on toteu-20 tettu toinen puhdistusvaihe, jossa positetaan epäpuhtaudet, jotka ovat aggregoituneessa muodossa II avautumisen ansiosta erityisen helposti saavutettavissa, voidaan valmistaa reversiibelisti takaisin aggregoitunut muoto I poistamalla ei-denaturoiva reagenssi, jossa muodossa esi- • . . 25 merkiksi proteiinien aktiiviset keskukset ovat erityisen ··· · jV. hyvin suojattuina pallomaisen proteiinimuodostelman sisäl- »,·. lä, niin että proteiineja voidaan erityisen hyvin säilyt ti* tää aggregoituneessa muodossa I. Aggregoituneella muodolla , II on, kuten jo mainittiin, niiden etujen lisäksi, jotka S * 1 jj·* 30 liittyvät tuotteen helpompaan puhdistamiseen isäntäsolun, V : jossa proteiini on tuotettu, rakenneosista tai vektoreis- * * ta, jotka sisältävät eritettyä proteiinia koodittavan gee nin, se lisäetu, että proteiinien biologista aktiivisuutta voidaan voimistaa oleellisesti useiden aktiivisten keskus-·' 35 ten ollessa kolmiulotteisesti lähellä toisiaan proteiinien aggregoituneen tilan ansiosta.

12 96864

Kulloisenkin koejärjestelyn mukaan poistetaan solut tai solukalvot sentrifugoimalla ja uutetaan ne puskuri-liuoksella, joka sisältää ei-denaturoivaa pintaaktiivista ainetta sekä proteaasi-inhibiittorijärjestelmää tai, jos 5 haluttu suurimolekyylinen aine siirtyy soluista superna-tanttiin, lisätään tähän supernatanttiin ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta ja proteaasiinhibiittorijärjestelmää, jolloin ei-denaturoiva pintaaktiivinen aine on esimerkiksi deoksikolaatti (DOC) ja sitä käytetään pitoi-10 suutena noin 0,25 - 5 %, edullisesti kuitenkin 1 %.

Kun eristettävä ja puhdistettava aine on glykopro-teiini, konsentroidaan siten saadut liuokset lektiineillä, jotka on immobiloisoitu kiinteään matriksiin, ja erotetaan hiilihydraattia sisältämättömät epäpuhtaudet. Käytettävä1-15 lä, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella on tässä vaiheessa sen ominaisuuden lisäksi, että se muuttaa aineen muotoon II, myös kyky estää epäspesifinen adsorptio. Eluointi tehdään glykosideilla.

Toinen edullinen puhdistusvaihe voidaan toteuttaa 20 sitomalla esipuhdistettu, suurimolekyylinen aine spesiri- sestiimmuuniadsorbtiopylväälle. Kun on tehty riittävä pesu puskurilla, tehdään eluointi kaotrooppisella aineella, esimerkiksi urealla tai KSCN:lla (2 - 8, edullisesti 3 , mol/1). Tekemällä sen jälkeen dialyysi puskuria vastaan ·.. 25 päästään takaisin hiukkasmaiseen muotoon I. Tarvittaessa ··· · • ·. suurimolekyylinen aine muutetaan tietyllä kahtaisionisella • · · pinta-aktiivisella aineella monomeeriseen muotoon III ja t · · * * puhdistetaan ionivaihtokromatografisesti. Dialysoimalla pinta-aktiivista ainetta sisältämätöntä puskuria vastaan • « ( *···' 30 saadaan monomeerisesta muodosta III jälleen aggregoitunei- V * ta muotoja II ja I.

♦ * * Kuvattujen solujen tuottamien proteiinien erilaiset aggregoituneet muodot voidaan tehdä elektronimikroskopiassa nähtävissä oleviksi.

35 Keksintöä valaistaan seuraavassa yksityiskohtaises- '·"· ti kuvin ja esimerkein.

13 96864

Kuvio 1 on elektronimikroskooppikuva glykoproteii-nista 160 tris-puskurissa, suurennus 278 640-kertainen. Proteiinit ovat tiiviissä, pallomaisessa aggregoituneessa muodossa I.

5 Kuvio 2 on elektronimikroskooppikuva HIV-glykopro- teiinista 160 puskurissa, joka sisältää 1 % DOC:tä. Proteiinit ovat avoimessa, pilvimäisessä aggregoituneessa muodossa II.

Esimerkki 1 10 HIV-qlvkoproteiinin 160 eristys ia puhdistus HIV-glykoproteiinin 160 eristys ja puhdistus tehdään seuraavan ohjelman mukaisesti: 1. Geeniteknisesti manipuloidut verosolut, jotka tuottavat XIV-glykoproteiinia 160, sentrifugoidaan tihey- 15 den ollessa haluttu.

2. Sentrifugoimalla saatu pelletti suspendoidaan uudelleen TBS-puskuriin (pH 7,4), joka sisältää 1 mmol/1 CuS04:a ja 0,5 mmol/1 ZnCl2:a.

3. Uudelleen suspendoitu pelletti uutetaan 50 mM

20 Tris-HCl-puskurilla (pH 8,3), joka sisältää 1 % DOC:tä, 1 mmol/1 CuS04:a ja 0,5 mM ZnCl2:a. Suspensio kirkastetaan sentrigugoimalla 30 minuuttia lämpötilassa 25 °C.

4. Supernatant!Ile tehdään linssilektiinikromato-grafia, jossa halutut proteiinit adsorboidaan pylväälle ja 25 pestään DOC-puskurilla. Proteiinit eluoidaan 5 % metyyli- • · · . " glykosidia sisältävällä pesupuskurilla.

• · · *;*.* 5. Lektiinipylväästä tullut eluaatti laimennetaan • · · *;*·* Tween-puskurilla. Sen jälkeen tehdään absorbointi immuuni- • · · af f initeettikromatograf iapylväälle, joka pestään TBS- 30 Tween-puskurilla ja sen jälkeen TBSrllä. Tehdään käsittely DNA:ta ja RNA:ta pilkkovilla entsyymeillä. Eluoidaan 3 M KSCN-liuoksella ja dialysoidaan pintaaktiivisia aineita sisältämätöntä puskuria vastaan.

6. Dialysoituun eluaattiin lisätään pitoisuudeksi 1 *; 35 % Zwittergentiä ja pitoisuudeksi 5 % betaiinia ja tehdään » · 14 96864 adsorbointi anioninvaihtimena toimivalle mono-Q-matriksil-le, eluoidaan KSCN-gradientilla ja dialysoidaan puskuria vastaan.

7. Tehdään toinen linssilektiinikromatografia ab-5 sorboimalla ja pesemällä pinta-aktiivisia aineita sisältämättömällä puskurilla. Eluointi tehdään 5-%:isella metyy-liglykosidiliuoksella, minkä jälkeen tehdään dialyysi TBS-:ää vastaan. Tällä menettelyvaiheella saadaan aikaan proteiinin konsentrointi.

10 Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukaisella menettelyllä puhdistetulle HIV:n glykoproteiinille (GP) 160 tehtiin tehokkuustesti, joka osoittaa sekä tiiviissä, pallomaisessa muodossa I että avautuneessa, pilvimäisessä muodossa II olevan gly-15 koproteiini 160:n immunogeenisen tehon.

Kutakin immunisointia kohden tehtiin 5 laimennosta, jotka sisälsivät 10 μg, 2,5 μg, 0,625 μg, 0,158 μg ja 0,04 μg GP 160/ml. Kullakin laimennoskella immunisoitiin ihonalaisesti 10 BALBc-hiirtä; kutakin immunogeenilajia vasten 20 tarvittiin siten 50 eläintä. Tässä kokeessa testattiin neljää erilaista adsorptiomenetelmää.

1. GP 160 + 0,2 % AI(OH)3 2. [GP 160 + 0,25 % DOC] + 0,2 % Al(OH)3 3. [GP 160 + 0,25 % DOC] + [0,2 % Al(OH)3 + 0,25 % 25 DOC] 4. [GP 160 + 0,25 % DOC] + [0,2 % Al(OH)3 + pesty)] « · · *;1.1 Kaikki eläimet immunisoitiin ihonalaisesti 1 ml:11a • · · II liuosta. Kunkin yksittäisen eläimen seerumista tutkittiin

anti-HIV ELISA: n (SORIN) avulla GP 160 -vasta-aineiden 30 läsnäolo ja laskettiin kullekin immunogeenilajille GP

# 160:n EDS0-arvo reagoivissa eläimissä tunnetulla Spearman-' : 1 Kaerber -menetelmällä.

< 4(11 · is 96864

Tulokset 1. I - V 10 pg GP 160/ml + 0,2 % Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus eläimiä korkeintaan I väkevä 1 100 5 II 1:4 1 10 III 1:16 0 / IV 1:64 1 10 V 1:256 1 10 ED^q: 10 pg/ml GP 160 10 2. VI - X 10 pg (GP 160/ml + DOC + 0,2 % Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus eläimiä korkeintaan VI väkevä 7 1000 15 VII 1:4 5 200 VIII 1:16 1 10 IX 1:64 0 / X 1:256 0 / ED5Q: 3,3 pg/ml GP 160 20 3. XI - XV 10 pg GP 160/ml + DOC + DOC-Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus .·. : eläimiä korkeintaan XI väkevä 7 800 ! 25 XII 1:4 5 1000 • · « :;V XIII 1:16 6 100 :·**·: XIV 1:64 2 100 • · *V.: XV 1:256 1 100 EDj-q: 1,09 pg/ml GP 160 • · · • · · • « · 1 · · 16 96864 4. XVI - XX 10 jig GP 160/ml + DOC + Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus eläimiä korkeintaan XVI väkevä 0 / 5 XVII 1:4 1 10 XVIII 1:16 0 / XIX 1:64 0 / XX 1:256 0 / EDc-q: 10 jig/ml GP 160 10 HIV-glykoproteiinin 160 tehokkuustestin tulokset osoittavat glykoproteiini 160:n immunogeenisyyden vaihtelun aggregoituneen muodon mukaan. ED50-arvo, joka osoittaa sen määrän käytettyä ainetta, johon 50 % immunisoiduista 15 eläimistä reagoi, pienenee huomattavasti, jos pinta-aktiivista ainetta DOC on läsnä. Pinta-aktiivisen DOC:n ollessa läsnä on glykoproteiini 160 aggregoituneessa muodossa II, jossa antigeeniset epitoopit ovat toisaalta vapaina ja toisaalta kuitenkin kolmiulotteisesti yhdessä, niin että 20 tuloksena on voimistunut immuunivaste.

• · • « · • · • · • · · • · · • ·· · • · • · · • · • · • · • · « • · · • · • · · • · · ··· 1 • · · ·

Claims (18)

96864

1. Ei-terapeuttisesti käytettävä HIV:n glykopro-teiini GP 160, tunnettu siitä, että se on avautu- 5 neessa, elektronioptisesti nähtävissä olevassa, aggregoi-tuneessa, elektroforeettisesti liikkumattomassa muodossa (muoto II) ja että se on saatavissa käsittelemällä soluissa tuotettua, suunnilleen pallomaisesti aggregoitunutta, tiivistä, elekronioptisesti nähtävissä olevaa, elektrofo-10 reettisesti liikkumattomatonta GP 160 (muoto I) ei-denatu-roivalla pinta-aktiivisella aineella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen GP 160, tunnettu siitä, että sen puhtausaste on vähintään 80 %, edullisesti vähintään 98 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen GP 160, tunnettu siitä, että se on geeniteknisesti muokattujen solujen, erityisesti proteiineja ylimäärin tuottavien solujen ilmentymistuote.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen GP 160, t u n -20 n e t t u siitä, että sillä on antigeeninen vaikutus.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen GP 160, tunnettu siitä, että solut ovat euka-ryoottisia, edullisesti eläin- tai ihmissoluja.

.·. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen GP 160, t u n - .·. 25 n e t t u siitä, että solut otetaan talteen primaarisolu- • · · . viljelmistä tai solulinjoista ja ovat erityisesti Vero- • · · *.’V soluja, CHO-soluja tai primaarisia kananalkiotibroblasti- • · · ’·1;1 soluja. • · *·"·1

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- 30 nen GP 160, tunnettu siitä, että pinta-aktiiviset aineet ovat tiettyjä ionisia, ionittomia tai kahtaisioni-’ ' ' siä pinta-aktiivisia aineita.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen GP 160, tunnettu siitä, että ensimmäisenä, ionittomana pinta-ak-35 tiivisena aineena muodon I muuttamiseksi muodoksi II käy- 96864 tetään oktyyliglukosidia tai sen johdannaista, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %, ja toisena, kah- taisionisena pinta-aktiivisena aineena käytetään Zwitter- ® .... gent -sarjan ainetta, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, 5 erityisesti 1 % muodon II muuttamiseksi monomeeriseksi muodoksi (muoto III).

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen GP 160, tunnettu siitä, että pinta-aktiivinen aine on sappihapon suola tai sen johdannainen, edullisesti deoksikolaatti 10 (DOC), edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %.

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukaisen HIV:n glykoproteiinin GP 160:n ei-terapeuttinen käyttö aggregoituneessa muodossaan II biologisen vaikutuksen voi- 15 mistamiseen.

11. HIV:n glykoproteiinin GP 160:n muodon II diagnostinen käyttö.

12. HIV:n glykoproteiinin GP 160:n muodon II käyttö HIV:n vastaisten vasta-aineiden talteenottamiseen mainit- 20 tujen vasta-aineiden osoittamiseksi kvalitatiivisesti tai määrittämiseksi kvantitatiivisesti elimistönesteistä.

13. Menetelmä soluissa tuotettavan ei-terapeutti- ·:·. sesti käytettävän HIV:n glykoproteiinin GP 160:n eristämi- ,·. : seksi ja puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että • · I 25 ensimmäisessä puhdistusvaiheessa ensimmäisessä aggregoitu- • · . “ neessa muodossa I olevasta GP 160:stä poistetaan pinnalla • · · olevat epäpuhtaudet sinänsä tunnetulla tavalla, muutetaan • · · *·'·* GP 160 sitten käyttämällä ei-denaturoituvaa pinta-aktii- * · i.:.: vista ainetta, joka on oktyyliglukosidia tai sen johdan- 30 naista, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 % tai sappihapon suola tai sen johdannainen, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 % toiseen aggregoituneeseen muotoon II ja poistetaan toisessa puhdistusvaiheessa tässä aggregoituneessa muodossa II saavutettavissa olevat epäpuhtaudet sinänsä tunne-35 tulla tavalla, ja mahdollisesti GP 160 muutetaan monomee- 96864 riseen muotoon III lisäämällä toista, ei-denaturoivaa pin-ta-aktuvista ainetta, joka on Zwittergent -sarjan ainetta, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, joka muoto voidaan reversiibelisti taas muuttaa aggregoituneeseen muo-5 toon I tai II poistamalla mainitut ei-denaturoivat pinta-aktiiviset aineet vastaavasti.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GP 160 on geeniteknisesti muokattujen solujen, erityisesti proteiineja ylimäärin 10 tuottavien solujen, ilmentymistuote.

15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat eukaryootti-sia, edullisesti eläin- tai ihmissoluja.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että solut otetaan talteen primaa-risoluviljelmistä tai solulinjoista ja ovat erityisesti Vero-soluja, CHO-soluja tai primaarisia kananalkiotibro-blastisoluja.

17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että ensimmäisenä, ionittomana pinta-aktiivisena aineena käytetään oktyyliglukosidia tai sen johdannaista, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %, ja toisena, kahtaisionisena pinta-aktii-visena aineena käytetään Zwittergent -sarjan ainetta, 25 edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %. • ♦ :·1

18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, • · : tunnettu siitä, että pinta-aktiivinen aine on sap- • · *.V pihapon suola tai sen johdannainen, edullisesti deoksiko- laatti (DOC), edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityi- 30 sesti 1 %. • · · • · · ··· 1 · 96864