JPH02117395A - 菌体内からのヒトインターロイキン３様ポリペプチドの回収法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、形質転換体により産生されたヒトインターロ
イキン３様ポリペプチドを回収する方法に関する。更に
詳しくは、本発明は、ヒトインタ−ロイキン３様ポリペ
プチドを蓄積している形質転換微生物菌体内から、生物
学的に活性な純度の高いヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチドを迅速且つ効率的に回収する方法に関する。

従来の技術 ヒトインターロイキン３は、造血細胞の共通幹細胞や各
種白血球（顆粒球、好酸球など）、マクロファージ、肥
満細胞ならびに血小板の前駆細胞に分化及び増殖を促す
生理活性物質であり、１５２個のアミノ酸残基から成る
ポリペプチドを含む糖蛋白と考えられている（Ｙ、Ｃ，
Ｙ’ａｎｇら：Ｃｅ１ｌ。

４７、ｐ３〜１０（１９８Ｂ））。ヒトインダーロイキ
ン３の遺伝子組換えによる産生については、既に報告（
Ｙ、Ｃ，Ｙａｎｇら：　Ｃｅ１ｌ　　、４７．ｐ３〜１
０（１９８６）、Ｌ、Ｄｏｒ−ｓｓｅｒら：　Ｇｅｎｅ
、　５５．ｐＨ５〜１２４．（１９８７）ならび１こＰ
ＣＴ／ＵＳ８７１０１７０２　（公開日１９８８年１月
２８日））がある。大腸菌で産生されたヒトインターロ
イキン３の回収については、ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１７
０２　（公開日１９８８年１月２８日）にその記載があ
る。

〔発明の概要〕

発明が解決すべき課題 遺伝子組換技術を真核細胞蛋白の大規模な製造に応用す
ることにより、所望の分子を大量に得る可能性が実質的
に増し、場合によっては簡便な回収手順で生物学的に活
性な物質を得る事ができるようになる。

形質転換微生物によって産生される真核細胞蛋白は、こ
の蛋白が本来は糖蛋白として存在するものであっても、
遺伝子工学的に菌体内で産生された場合、グリコジル化
されていない、すなわち糖鎖を持たない、ものである。

形質転換体により産生される所望の蛋白が生物活性を得
るためにグリコジル化を必要としない場合には、多くの
場合、蛋白性汚染物質及びプロテアーゼ等の共存蛋白を
ほとんど含まない不溶性「封入体」の形態で形質転換体
宿主中に大量の蛋白を産生させることができる。宿主細
胞破砕物は、簡単に分離しがたい程（所望の蛋白に）類
似した分子量、電荷、極性及び溶解度特性を有する蛋白
をしばしば含んでいる。

前述したように形質転換微生物によって菌体内に産生さ
れる蛋白はポリペプチドであり、従って形質転換微生物
によって産生されるヒトインターロイキン３はヒトイン
ターロイキン３様ポリペプチドと称することができる。

このポリペプチドが本来は糖蛋白であるヒトインターロ
イキン３と同じ生理活性を持つことは、本出願人による
先の出願において明らかにされたところであるー（特願
昭６２−３２８８８５号明細書参照）。

前述したように、ＰＣＴ／ＵＳ８７１ ０１７０２の実施例４に、大腸菌形質転換体で産生され
たヒトインターロイキン３、すなわちヒトインターロイ
キン３様ポリペプチド、の回収方法が記載されている。

この方法は、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを
産生じた大腸菌菌体の破砕物からこのポリペプチドを不
溶性「封入体」としてショ糖密度勾配超遠心分離操作に
て分離し、尿素及びジチオスレイトール中で可溶化の後
、還元型グルタチオン存在下で酸化型グルタチオンにて
酸化し、変性剤及び還元剤を中性緩衝液中での透析によ
って除去した後、透析によって得られた液を更に陰イオ
ン交換樹脂クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファロース
）、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー（ＳＰセファ
ロース）の２段階の精製工程を経て精製標品を得るもの
である。しかしながら、このようなショ糖密度勾配超遠
心分離操作を工業的規模で実施することは難しいと考え
られる。

大腸菌形質転換体によるヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチドの産生および菌体からのその回収方法に関して
は、本出願人による特許出願（前記特願昭６２−３２８
８８５号）の明細書にその記載があり、そこに例示され
た回収法は、培養した大腸菌形質転換体を破砕した後の
工程において、適当な洗浄液を用いた通常の遠心分離・
洗浄、ゲルか過、あるは透析などの操作を組み合わせる
ことによって、ショ糖密度勾配超遠心分離のような煩雑
な操作を必要としない方法であるが、菌体からのヒトイ
ンターロイキン３様ポリペプチドの回投法については、
更に生物学的活性の高いヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチドが得られる方法があれば神益することが大きい
ことはいうまでもない。

発明の要旨 本発明は、上記問題点を解決すること、および上記希求
に応えること、を目的とするもので、形質転換体を破砕
した後の工程において、ヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチドを、夾雑物を含む不溶性物質のままの状態で操
作して可溶化すると共に、酸化工程後の溶液について、
所望ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを溶液中に
保持したまま、不要の夾雑物を不溶化することにより、
上記目的を達成しようとするものである。

すなわち、本発明による菌体内からのヒトインターロイ
キン３様ポリペプチドの回収法は、下記の工程１）〜５
）を実施すること、を特徴とするものである。

１）　ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを菌体内
に蓄積しているヒトインターロイキン３様ポリペプチド
産生微生物を用意し、該微生物を破砕した後、ヒトイン
ターロイキン３様ポリペプチドを含有する不溶性物質を
可溶性物質から分離する工程。

２）　ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを含有す
る不溶性物質を、そのまま、または必要に応じて洗浄し
てから、可溶化する工程。

３）可溶化されたヒトインターロイキン３様ポリペプチ
ドを、還元剤の存在下で酸化して分子内のジスルフィド
結合を生成させる工程。

４）酸化工程から得られた溶液相のｐＨを４゜５〜６．
０の範囲に調整して、不溶化するヒトインターロイキン
３様ポリペプチド画分およびその他夾雑物を生成させ、
これによりこの調整溶液相に保持されたままのヒトイン
ターロイキン３様ポリペプチドを、該調整溶液相に不溶
性のヒトインターロイキン３様ポリペプチドおよびその
他夾雑物から分離する工程。

５）分離工程４）より得られる溶液から、必要に応じて
、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを精製して回
収する工程。

発明の効果 本発明によれば、ヒトインターロイキン３様ポリペプチ
ドを菌体内に蓄積しているヒトインターロイキン３様ポ
リペプチド産生微生物を破砕した後の工程において、菌
体内に存在していたヒトインターロイキン３様ポリペプ
チドを、夾雑物が含まれたままの状態で可溶性蛋白など
の可溶性物質から分離する工程、ならびに酸化工程後の
ｐＨ調整によって不溶化された夾雑物および不要のヒト
インターロイキン３様ポリペプチドと溶液相に保持され
たままの目的とするヒトインターロイキン３様ポリペプ
チドとを分離する工程は、単に不溶物と溶解物とを分離
するだけの工程であるため、沈降係数の差を利用するシ
ョ糖密度勾配超遠心分離のような煩雑な操作を必要とせ
ずに、通常の遠心分離などの容易な分離操作で実施でき
る。

従って、本発明による菌体内からのヒトインターロイキ
ン３様ポリペプチドの回収法は工業的規模で迅速かつ効
率的に実施可能なものである。

また、酸化工程後のｐＨ調整によると、夾雑物だけでな
く、同時に生物学的活性の低いまたは該活性を有しない
ヒトインターロイキン３様ポリペプチドをも不溶化して
除去することができるため、より生物学的活性の高いヒ
トインターロイキン３様ポリペプチドのみを回収するこ
とができる。

菌体内からヒトインターロイキン３様ポリペプチドを分
離・回収するにあたり、酸化工程の段階まで夾雑物を含
んだままの状態で各操作を行なっても、酸化工程後のｐ
Ｈ調整によって、夾雑物が不溶化されて分離されると共
に、生物学的活性の低いまたは該活性を有しないヒトイ
ンターロイキン３様ポリペプチドも不溶化されて分離さ
れるという本発明による回収法の特性は、思いがけなか
ったことといえよう。

〔発明の詳細な説明〕

概要 本発明による菌体内からのヒトインターロイキン３様ポ
リペプチドの回収法は、前記したように工程１）〜５）
を実施することを特徴とする特許であるが、本発明の好
ましい態様は下記の（１）〜（１０）である。

（１）　　工程２）においてカオトロピック剤を使用し
てヒトインターロイキン３様ポリペプチドを含有する不
溶性物質を可溶化することを特徴とする、本発明による
方法。

（２）　　工程３）において還元型グルタチオンの存在
下で酸化型グルタチオンを使用してヒトインターロイキ
ン３様ポリペプチドを酸化することを特徴とする、態様
（１）に記載の方法。

（３）　　工程４）においてｐＨを５．０〜５．５の範
囲に調整することを特徴とする、本発明による方法。

（４）　　工程５）において陽イオン交換クロマトグラ
フィーにより、精製したヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチドを回収することを特徴とする、態様（３）に記
載の方法。

（５）　　カオトロピック剤として塩酸グアニジウムを
使用することを特徴とする、態様（１）に記載の方法。

（８）　　工程４）において酢酸を使用してｐＨを調整
することを特徴とする、態様（５）に記載の方法。

（７）　　塩基性ｐＨで工程２）を実施することを特徴
とする、態様（５）に記載の方法。

（８）８．５〜９．５のｐＨ及び４〜６Ｍの塩酸グアニ
ジウム濃度で工程２）を実施することを特徴とする、態
様（７）に記載の方法。

（９）　　工程４）においてｐＨを約５．０〜５．５の
範囲に調整することを特徴とする、態様（８）に記載の
方法。

（１０）　　ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを
菌体内に蓄積している微生物が大腸菌であることを特徴
とする、本発明による方法。

なお、工程２）における可溶化の手段として可溶化剤を
用いる場合は、工程４）においてｐＨ調整と共に、可溶
化剤の除去操作が必要となる。

ヒトインターロイキン３様ポリペプチド本発明において
、［ヒトインターロイキン３様ポリペプチド」とは、（
１）天然のヒトインターロイキン３におけるポリペプチ
ド部分のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同一のアミ
ノ酸配列及び（２）天然のヒトインターロイキン３と共
通の生物学的活性を有する蛋白、をコードするヒトイン
ターロイキン３遺伝子又はその修飾遺伝子で形質転換さ
れた微生物により産生される蛋白質（すなわちポリペプ
チド）を意味する。ここで、「実質的に同一のアミノ酸
配列」とは、配列が同一であるか、又は天然ヒトインタ
ーロイキン３のポリペプチド部分と合成ヒトインターロ
イキン３様ポリペプチドとの間に、有害な機能的非類似
性を生じさせないような１以上のアミノ酸変化（即ち、
欠失、付加、挿入、置換）を含むことを意味する。

また、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの「生物
学的活性」とは、天然のヒトインターロイキン３の治療
活性を含むものである。

本発明において、対象となる「菌体内からのヒトインタ
ーロイキン３様ポリペプチド」とは、菌体の内部に蓄積
しているヒトインターロイキン３様ポリペプチドの他に
、大腸菌においては菌体のペリプラズムにまで透過して
いるヒトインターロイキン３様ポリペプチドあるいはこ
の外膜表面に付着しているヒトインターロイキン３様ポ
リペプチドをも包含するものとする。

ヒトインターロイキン３様ポリペプチドとしては、例え
ば、前記特願昭６２−３２８８８５号明細書（文献Ａ）
中の第１図に示されているようなアミノ酸配列を有する
ポリペプチド（公知のヒトインターロイキン３　（Ｍａ
ｔｕｒｅ部分）のポリペプチドである）が挙げられる。

このポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖の塩基配列（特
に大腸菌で高発現させるのに適した塩基配列）、および
このような塩基配列を含むＤＮＡ鎖の製造に関する詳細
は、上記文献Ａに記載されている。

ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの例としては、
上述したポリペプチドのアミノ酸配列において、前記ア
ミノ酸変化したポリペプチドも等価物として同様に挙げ
られる。

ヒトインターロイキン３様ポリペプチド産生微生物 本発明において、「ヒトインターロイキン３様ポリペプ
チド産生微生物」とは、ヒトインターロイキン３に関連
する生物学的活性を有するポリペプチドを産生ずるよう
に、遺伝子工学的に形質転換された微生物を意味する。

この形質転換に用いるのに適した微生物の種類としては
、大腸菌、酵母（サツカロミセス属酵母など）などが挙
げられるが、大腸菌が特に好ましい。

ヒトインターロイキン３様ポリペプチド産生微生物の作
成、すなわち形質転換体の作成、は分子生物学、生物工
学ないし遺伝子工学の分野における慣用技術に準じた方
法により、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ鎖を、クローニングベクターから適当な
発現ベクターにつなぎかえ、このベクターを微生物に導
入して形質転換することによって実施される。

形質転換体作成法の一例として、文献Ａに示された前記
ヒトインターロイキン３様ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ鎖を発現ベクターにつなぎかえ、このベクターを用
いて大腸菌形質転換体を作成する方法の詳細がこの文献
Ａに記載されている。

作成された形質転換体を培養することにより、ヒトイン
ターロイキン３様ポリペプチドを産生させることができ
る。

本発明において、対象となるヒトインターロイキン３様
ポリペプチド産生微生物は、培養によって産生じた全ヒ
トインターロイキン３様の少なくとも一部分、好ましく
は全部または大部分、が菌体内に蓄積するように形質転
換されたものである。

菌体内からのヒトインターロイキン３様ポリペプチドの
回収法 本発明による菌体内（すなわち形質転換体内）からのヒ
トインターロイキン３様ポリペプチドの回収法は、前記
工程］）〜５）を実施することを特徴とするもの、であ
ることは前記した通りである。

（１）工程１） 本発明におけるヒトインターロイキン３様ポリペプチド
を菌体内に蓄積しているヒトインターロイキン３様ポリ
ペプチド産生微生物は、前記のようにして形質転換した
微生物を好適な増殖培地で培養することによって用意す
ることができる。目的とする微生物をこの増殖培地から
収集する場合、必要に応じてか過、遠心分離、あるいは
他の従来方法により濃縮することができる。

本発明において、微生物の細胞膜を破砕する方法として
、ホモジネート化、音波処理又は圧力サイクルのような
従来技術など合目的的な任意の方法を使用することがで
きる。好適な方法としては、音波処理又はフレンチプレ
ス、Ｗａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｌｎホモジナイザー等を用
いる方法が挙げられる。細胞の破砕後、ヒトインターロ
イキン３様ポリペプチドを含有する不溶性物質を遠心分
離などによって溶解物の液相（可溶性蛋白などの可溶性
物質を含む）から分離し、水に再懸濁させる。

（２）工程２） 工程１）で得られた不溶性物質は、必要に応じて水に再
懸濁させ、遠心分離などによって該不溶性物質を洗浄し
て、水溶性の残存大腸菌蛋白などを除去してもよい。然
る後、好ましくは塩基性ｐＨ条件の可溶化剤の存在下で
、不溶性物質中のヒトインターロイキン３様ポリペプチ
ドを可溶化する。可溶化剤は一般に、カオトロピック剤
（すなわち、水素結合を解離し、蛋白質の三次構造に影
響を与える蛋白変性剤）の水溶液である。代表的なカオ
トロピック剤には尿素及び塩酸グアニジウムがあり、特
に塩酸グアニジムラが好適である。

カオトロピック剤の濃度は、使用する特定の接剤及び存
在する細胞物質量に依存する。好ましくは、４〜８Ｍ、
より好ましくは４〜６Ｍの濃度を有する塩酸グアニジウ
ムを使用し、最も好ましくは６Ｍ程度の塩酸グアニジウ
ム溶液を使用する。このｐＨは好適な緩衝液を加えるこ
とにより調製され得るが、好ましくは約８．０〜９．５
、より好ましくは８．０〜９．０である。

（３）工程３） ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの可溶化後、不
溶性物質を分離及び廃棄する。この可溶化されたヒトイ
ンターロイキン３様ポリペプチドを還元剤の存在下で酸
化する。この酸化工程にはグルタチオン酸化還元緩衝液
（還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオン）の使
用がより好ましく、この酸化工程によって、正しく折り
畳まれた、すなわち天然のヒトインターロイキン３の正
しいコンフォメーシジンを維持した状態でのジスルフィ
ド結合を有する、あるいは正しい架橋位置におけるジス
ルフィド結合を有する、生物学的活性の高い酸化型ヒト
インターロイキン３様ポリペプチドが高収率で得られる
。この酸化工程において、不正に折り畳まれた、すなわ
ちペプチド同士がジスルフィド結合によって分子間結合
した、あるいは正しくない架橋位置におけるジスルフィ
ド結合を有する、あるいは天然のヒトインターロイキン
３と異なるコンフォメーション状態でのジスルフィド結
合を有する、生物学的活性の低い（もしくは無い）ヒト
インターロイキン３様ポリペプチドの形成を実質的に減
少させることができる。

酸化還元緩衝液中の還元型グルタチオン二酸化型グルタ
チオンの比は当業者により容易に確定されよう。好まし
くは過剰の還元型グルタチオンを使用し、より好ましく
は２：１〜１０：１の還元型グルタチオン二酸化型グル
タチオン重量比を用いる。

この工程３）における還元剤−酸化剤の組合せとしては
、上記の還元型グルタチオン−酸化型グルタチオンの他
に、システィン−シスチンあるいはシステアミン−酸化
型システアミンなどが可能である。

（４）工程４） 工程３）から得られた溶液より、残留している不溶性物
質を除去する。好ましくは、該溶液を緩衝液と交換し、
残留塩酸グアニジウム及びグルタチオンを除去する。そ
の後酢酸のような適当な酸を使用してｐＨを約４．５〜
６．０、好ましくは５．０〜５．５、のｐＨ範囲に調整
することにより、ｐＨ調整溶液相に保持されたままのヒ
トインターロイキン３様ポリペプチドを該溶液相に不溶
性のヒトインターロイキン３様ポリペプチド及びその他
夾雑物から選択的に分離することができる。

ｐＨ調整によるこのｐＨ範囲（すなわち４．５〜６．０
）では不正に折り畳まれた（すなわち生物学的活性の低
いまたは無い）ヒトインターロイキン３様ポリペプチド
及びその他夾雑物は沈降し、正しく折り畳まれた（すな
わち生物学的活性の高い）ヒトインターロイキン３様ポ
リペプチドは溶液中に溶解して残る。得られた混合物を
遠心分離し、不溶性物質を除去し、可溶性の正しく折り
畳まれたヒトインターロイキン３様ポリペプチドを残留
物から分離する。

（５）工程５） 分離工程４）から得られた溶液を適当な精製手段、好ま
しくは、クロマトグラフィー操作、に付すことにより、
精製ヒトインターロイキン３様ポリペプチド（すなわち
正しく折り畳まれた生物学的活性の高いヒトインターロ
イキン３様ポリペプチド）を残留汚染物から単離する。

好適には、遠心分離後の溶液をイオン交換クロマトグラ
フィーに付して精製ヒトインターロイキン３様ポリペプ
チドを回収する。さらにゲル濾過によるクロマトグラフ
ィー等公知の精製手法を組み合わせてもよい。本発明の
好適実施態様によると、遠心分離後の溶液をＣＭ−セフ
ァロースイオン交換カラムに通した後、セファクリル５
２００ゲルン濾過クロマトグラフイーを使用して分離操
作を行なうことにより、生物学的活性の高い精製ヒトイ
ンターロイキン３様ポリペプチドを高収率で回収できる
。こうして回収したヒトインターロイキン３様ポリペプ
チドを医学上許容可能な希“釈剤、等張化剤、ｐＨ調整
剤等、好ましくはリン酸緩衝生理食塩溶液（ｐＨ６，５
）と調合すると、患者に投与可能な最終製品が得られる
。

実験例 以下の実験は、本発明の態様をさらに詳しく説明するた
めのものである。

実験例１：菌体からのヒトインターロイキン３様ポリペ
プチドの回収 既に提案されているヒ（インターロイキン３の製造法（
前記文献Ａ実施例５）に従い、ヒトインターロイキン３
様ポリペプチドを蓄積している形質転換大腸菌細胞のペ
ースト約５ｇ（湿重量）を得た。すなわち、まずヒトイ
ンターロイキン３様ポリペプチドをコードする遺伝子に
よって形質転換された形質転換大腸菌ｐｓＴ１１／ＲＲ
Ｉ　（詳細な内容は文献Ａに記載されている。）をアン
ピシリン含有し培地にて３７℃で一晩振とう培養した。

この培養液２０ｍ１を１０００■１のＭ９培地（０，８
％グルコース、０．４％カザミノ酸、１０℃ｇ／Ｉａｌ
チアミン、５０．ｃｚｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に
加え、３７℃にて３時間振とうした。

インドールアクリル酸を最終濃度２０μｇ／ａｔになる
ように添加した。このまま更に５時間振とう培養した。

得られた大腸菌の一部をサンプル緩衝液中で煮沸（５分
）し、煮沸液についてＳＤＳ　−ポリアクリルアミド電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、ヒトインターロ
イキン３様ポリペプチドの含有量を調べた。この条件に
おいては、大腸菌細胞蛋白質の３０％以上であった。こ
の培養液を遠心分離することにより、ヒトインターロイ
キン３様ポリペプチドを蓄積している上記形質転換大腸
菌細胞のペースト約５ｇを得た。

このペーストを、約４℃の温度で、２０１の２０ｗＭ　
　　Ｔｒ　　ｉ　　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）　　
、　１ｎ＋Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）に均一に懸
濁させた。懸濁液をフレンチプレスに３回かけて、菌体
を破砕した。この懸濁液を５０００Ｇで１０分間遠心分
離後、上澄液をデカンテーションし残渣を得た。この残
渣を、２０　ｍ　ｌの冷水に再懸濁させて、４℃、５０
００Ｇで１０分間遠心分離後、上澄液をデカンテーショ
ンし残渣を得た。この残渣を再度２０１の冷水に再懸濁
させて、同様の条件で遠心分離後残渣を得た。残渣を９
．２１の冷水に再懸濁させた後、０．８１のＩＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐＨ９，２）　、３０ｉ１の８Ｍ　塩酸グ
アニジウムを加え、室温にて１時間おだやかに撹拌した
。次に、１２０１の２ＣＬｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｈ
Ｃｌ　（ｐＨ９，２）をゆっくり撹拌しながら加えた後
、更に３０分撹拌した。これに９８．　３ｎ＋ｇの還元
型グルタチオン及び１９．６ｍｇの酸化型グルタチオン
を加えた後、約４℃にて約２０時間静置した。この液に
つき約４℃にて２０ａ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ
８，０）に対して５回透析を行った。透析の際に析出し
てきた沈澱物は、前述の条件での遠心分離により除去し
た。次いで、上澄液に対し１１５０容量の１Ｍ酢酸ナト
リウムを加え、ＩＮ酢酸にてｐＨを５．４に調整した。

ｐｎ調整の際に析出してきた沈澱物は、前述の条件での
遠心分離により除去した。この上澄液を、予め０．２Ｎ
　　ＮａＯＨを通して脱パイロジエン化した後に２０１
Ｍ　　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，４）にて平衡化
しておいたＣＭセファロースＦＦカラム（ファルマシア
社）に充填し、２０ＩＩＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ　　
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，４）を数カラム容量通
した後、５０ｍＭＮａＣ１を含む２０ＩＩＩＭ　　酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，４）で溶離した。溶離液を
限外ｉ濾過（分子ｆｆ１５０００カツト、ミリポア社）
により約１０倍に濃縮した。この濃縮液を、予め０，２
ＮＮａＯＨを通して脱パイロジエン化した後にリン酸緩
衝生理食塩水（但しｐＨ６，５）にて平衡化しておいた
セファクリル８２００カラム（ファルマシア社）にかけ
、ピーク画分を分取し約１５０ｆｆｉｇの最終精製品を
得た。

実験例２：ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの活
性測定 ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの活性は、メチ
ルセルロースを用いた半固形培地中のヒト骨髄細胞由来
のコロニーの成長を促進する能力により確認した。まず
ヒトの骨髄細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）
で希釈し、Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア
社）溶液上に重層した。これを室温で３０分間４００Ｇ
で遠心分離し、中間層を集めて２０倍量のＰＢＳで洗浄
した。次に、懸濁液を室温で１０分間２５０Ｇで遠心分
離し、洗浄した。次に、細胞を１０％ウシ胎児血清を含
むα培地（ギブコ社）に懸濁させ、プラスチックシャー
レ中で２時間３７℃、５％二酸化炭素の状態で培養した
。培 養後、非付着細胞を集め、２　ｘ　１０８ｅｅｌ　Ｉｓ
／ｅｌの細胞懸濁液を調製した。

検定において、３５１１ｍプラスチックシャーレ中に、
１×１０５個の上記骨髄細胞、１．２％メチルセルロー
ス（和光）、３０％ヒト血清（Ｆｌｏｖ社）１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）　　Ｃ３Ｉｇｍａ社）、６０μ
Ｍメルカプトエタノール（和光）、２Ｕエリスロポイエ
チン（ＥＰＯ）、及び、実験例１で精製したヒトインタ
ーロイキン３様ポリペプチド溶液を含むα培地を１１加
え、５％二酸化炭素存在下で湿潤空気中３７℃にて保温
した。１４日間の培養後、コロニーの形成を確認した。

形成されたコロニーは、赤芽球系、混合系、顆粒球系、
マクロファージ系などであり、実験例１で精製したヒト
インターロイキン３様ポリペプチドは多官能性であるこ
とが示された。

比活性は最大コロニー数の５０％のコロニー形成を刺激
する濃度を５０ユニツト／１として計算した（Ｍｅｔｅ
ａＲら：　ＢＬＯＯＤ、６７、ｐ３７〜．（１９８Ｂ）
）。その結果、実験例１で精製したヒトインターロイキ
ン３様ポリペプチドは８Ｘ１０７ユニツト／＋ａｇの比
活性を有することが判った（第１図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの用
量とヒト骨髄細胞由来のコロニーの成長促進作用との関
係を表わすヒトインターロイキン３様ポリペプチドの用
量・作用曲線を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の工程１）〜５）を実施することを特徴とする、菌
   体内からのヒトインターロイキン３様ポリペプチドの回
   収法。 １）ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを菌体内に
   蓄積しているヒトインターロイキン３様ポリペプチド産
   生微生物を用意し、該微生物を破砕した後、ヒトインタ
   ーロイキン３様ポリペプチドを含有する不溶性物質を可
   溶性物質から分離する工程。 ２）ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを含有する
   不溶性物質を、そのまま、または必要に応じて洗浄して
   から、可溶化する工程。 ３）可溶化されたヒトインターロイキン３様ポリペプチ
   ドを、還元剤の存在下で酸化して分子内のジスルフィド
   結合を生成させる工程。 ４）酸化工程から得られた溶液相のｐＨを ４．５〜６．０の範囲に調整して、不溶化するヒトイン
   ターロイキン３様ポリペプチド画分およびその他夾雑物
   を生成させ、これによりこの調整溶液相に保持されたま
   まのヒトインターロイキン３様ポリペプチドを、該調整
   溶液相に不溶性のヒトインターロイキン３様ポリペプチ
   ドおよびその他夾雑物から分離する工程。 ５）分離工程４）より得られる溶液から、必要に応じて
   、ヒトインターロイキン３様ポリペプチドを精製して回
   収する工程。