JP3040190B2 - タンパクの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌によって産生さ
れたヒトＣ型肝炎ウイルスコア抗原タンパクまたはその
コア抗原領域を含むタンパクの精製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトＣ型肝炎は、ヒトＣ型肝炎ウイルス
によって引き起こされる肝炎であり、輸血後の非Ａ非Ｂ
型肝炎のほとんどは、この肝炎であると言われている。

【０００３】そして、その多くは更に肝ガンへと病状が
進行する。ヒトＣ型肝炎ウイルスは、遺伝子の長さ約１
０Kb（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡウイルスとされ、
フラビウイルスとの類似性から５′末端から約１．５Kb
の部分が構造タンパク遺伝子部分に相当し、残りが非構
造タンパク遺伝子部分に相当すると考えられている。
又、約１．５Kbの構造タンパク遺伝子部分は、コア抗原
遺伝子部分、膜タンパク遺伝子部分、外皮タンパク遺伝
子部分に機能的に分かれているものと考えられている。

【０００４】Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子の非構造タンパ
ク遺伝子領域および構造タンパク遺伝子領域について、
前者は、カイロン社によるヨーロッパ特許（EP0318216)
での報告があり、後者は、カイロン社によるヨーロッパ
特許(EP0388232) での報告および下遠野らの平成２年７
月３日日本ガン学会における口頭発表による報告等があ
る。

【０００５】その後の国内外の研究により、ヒトＣ型肝
炎ウイルス遺伝子の構造タンパク遺伝子領域のうちのコ
ア抗原遺伝子部分でコードされるタンパク（コア抗原）
は、その他の抗原性を有する領域（Ｃ─１００抗原等）
よりも抗原性が強く、特異性も高く、且つヒトＣ型肝炎
ウイルス感染の初期診断が可能であるタンパクであるこ
とが明らかにされた。（Muraiso.K,et al.,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.，１７２,(2),511-16(1990) ）近年輸
血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血液中に存在する抗体を検出
する診断薬に使用できるタンパク試料として、又、ヒト
Ｃ型肝炎ウイルスに関する分子生物学的、免疫学的研究
に使用できるタンパク試料として、高度に純化したタン
パク試料の供給が強く望まれている。そのためには、ヒ
トＣ型肝炎ウイルスコア抗原領域を含むタンパクを大腸
菌および酵母等で大量産生させる製造方法、産生された
該タンパクを産生細胞から抽出する方法、および、得ら
れた抽出物から該タンパクを純化する精製方法とを確立
することが必要である。

【０００６】大腸菌で産生されたヒトＣ型肝炎ウイルス
のコア抗原タンパクまたはその抗原領域を含むタンパク
を大腸菌から抽出する方法および抽出物から該タンパク
を純化する精製方法については現在まで報告がないが、
大腸菌で産生されたタンパクを抽出し、精製した他のタ
ンパクの例は数多くなされている。

【０００７】大腸菌で産生された可溶性タンパクは、一
般に菌を集菌後、変性剤および界面活性剤を含んでいな
い通常の緩衝液でタンパクを抽出し、続いて、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
沈殿（分画）等の精製手段を用いて精製できる。又、大
腸菌で産生された不溶性又は難溶性タンパクの精製法と
しては、菌を集菌後、内容物を変性剤又は界面活性剤を
含んだ緩衝液で抽出した後、該抽出物に対して、ＳＰＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動を行ない、目的のタンパ
ク部分のゲルを切り出しゲルから電気泳動的にタンパク
を抽出する方法、および菌を集菌後、変性剤又は界面活
性剤を含んだ緩衝液で内容物を抽出し、同緩衝液存在下
で、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーを行なっ
た例が報告されている。

【０００８】具体例としては、組換えレニンタンパクを
大腸菌で産生させ、集菌し、変性剤を含んでいない緩衝
液に懸濁させ、リゾチーム処理、超音波処理、低速遠心
分離による沈殿を行なった後、該沈殿物を６Ｍグアニジ
ン塩酸を含有した緩衝液で可溶化し、同緩衝液存在下で
ゲル濾過して、９５％以上の純度をもつ組換えレニンタ
ンパクを精製した例（Imai,T.,et al,J.Biochem,１０
０,425(1986)）等が挙げられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、大腸菌
で産生されるヒトＣ型肝炎ウイルスのコア抗原タンパク
又はそのコア抗原領域を含むタンパク（以下、Ｃ−タン
パクと略す。）の抽出方法及び精製方法に付いて検討し
た。その結果、Ｃ−タンパクは該タンパクのコア抗原領
域の性質に起因して水に難溶性であり、変性剤非存在下
あるいは界面活性剤非存在下では該タンパクを効率よく
抽出できないことを見い出した。

【００１０】又、上記の方法で得られた抽出物に対して
変性剤非存在下、又は、界面活性剤非存在下でのイオン
交換クロマログラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等の精製手段を用いて精製を進めても大腸菌内のその他
の不純タンパクおよび核酸等と凝集するために有効に精
製できないことがわかった。そして、界面活性剤存在下
でのＣ−タンパクの抽出では、抽出はできるものの、該
抽出物を使用すると、後に続く精製工程を進めることが
容易でないことがわかった。

【００１１】さらに、Ｃ−タンパクの変性剤存在下での
抽出を検討した結果、尿素存在下で大腸菌で産生される
Ｃ−タンパクを抽出すると抽出中にＣ−タンパクが大腸
菌内のプロテアーゼにより分解されることがわかった。

【００１２】又、展開緩衝液中に尿素を含有させて、該
タンパク生産菌の抽出液に対して、イオン交換クロマト
グラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを行なっ
たところ、上記の変性剤非存在下の場合と同様に、Ｃ−
タンパクと大腸菌内のその他の不純タンパクおよび核酸
等と凝集するために、Ｃ−タンパクとクロマトグラフィ
ーを妨害する成分との分離ができず、得られたＣ−タン
パク画分に対して、さらなる精製手段を加えても、有効
に精製できないこともわかった。

【００１３】Ｃ−タンパク精製法として、従来技術で紹
介したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用
した精製法を適用した場合、ある程度精製できるもの
の、産生したＣ−タンパクと分子量の近い大腸菌由来の
不純タンパクも精製タンパク試料に含まれてしまうこ
と、工業的な大量精製法として適当でないこと等の問題
点がわかった。

【００１４】さらに、従来技術で紹介した組換えレニン
タンパクの抽出及び精製法は、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行なう前に、該タンパク抽出物に対して煩雑な前
処理を行わなければならず、工業的な大量精製法という
点で不適である。

【００１５】本発明者らは、大腸菌で産生されたＣ−タ
ンパクをいかなる変性剤を含んだ緩衝液で大腸菌から抽
出すれば効率よく且つ、Ｃ−タンパクが大腸菌内のプロ
テアーゼに分解されずに済むか、そして更に抽出物から
Ｃ−タンパクを精製するために、クロマトグラフィーを
妨害する成分を除去するのにいかなる精製手段で行なえ
ばよいか、又、その精製手段が操作的に簡便で、工業的
な大量精製法に適しているかどうか等について、数多く
の研究を行なった。鋭意研究の結果、大腸菌によって産
生されたＣ−タンパクを２─メルカプトエタノール及び
グアニジン塩酸を含有する緩衝液で抽出した後、グアニ
ジン塩酸を含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマト
グラフィーを行ない、Ｃ−タンパク画分を分取すること
で、かかる目的を達成し得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、大腸菌によっ
て産生されたヒトＣ型肝炎ウイルスコア抗原タンパクま
たはそのコア抗原その領域を含むタンパクを２−メルカ
プトエタノール及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液で
抽出した後、グアニジン塩酸を含有する緩衝液存在下で
ゲル濾過クロマトグラフィーを行って分取することを特
徴とするタンパクの精製方法である。

【００１７】本発明においてヒトＣ型肝炎ウイルスコア
抗原タンパクとは、ヒトＣ型肝炎ウイルス遺伝子の構造
タンパク遺伝子領域のうちコア抗原遺伝子部分でコード
されるタンパクであり、少なくともヒトＣ型肝炎ウイル
ス遺伝子の開始コドンの最初の塩基（アデニン）から始
まる３６０個の塩基がコードするタンパクを指す。例え
ば開始コドンから始まる４８２塩基のＤＮＡ塩基配列が
コードする１６１個のアミノ酸をヒトＣ型肝炎ウイルス
由来タンパクとして含むタンパクが例示される。

【００１８】本発明のタンパクは、上記コア抗原遺伝子
部分でコードされるタンパクの端部が不可避的に切断さ
れた場合、或いは付加的に例えばベクター由来のペプチ
ドが連結されている場合も含む。

【００１９】本発明において使用されるＣ−タンパクを
産生するための大腸菌は、特に制限されるものではな
い。大腸菌でのＣ−タンパクの産生方法は、ヒトＣ型肝
炎ウイルスコア抗原をコードする遺伝子を大腸菌で遺伝
子発現が可能なベクターに組込んで組換えベクターを
得、該組換えベクターで大腸菌を形質転換された大腸菌
を使用して、Ｃ−タンパクを産生する方法である。ヒト
Ｃ型肝炎ウイルスのコア抗原領域を含むタンパクを大腸
菌で産生させる方法の具体例としては、ヒトＣ型肝炎ウ
イルスコア抗原をコードする遺伝子断片をベクターpET-
３d に挿入して得た組換えベクターpKMR３を用いて、大
腸菌BL２１（DE３）を形質転換させ、該形質転換体をラ
クトースを含まない栄養培養で培養後、ＩＰＴＧ（イソ
プロピルチオガラクトシド）を添加して、引き続き培養
することで産生させる方法（Muraiso.K,et al,Biochem.
Biophys,Res.Commun.,１７２(2),511-16(1990)が挙げら
れる。

【００２０】上記の方法で、Ｃ−タンパクを産生させた
大腸菌を遠心分離することで、大腸菌ペレットを得る。
そして、該大腸菌ペレットを２─メルカプトエタノール
及びグアニジン塩酸を含有する緩衝液に懸濁する。該緩
衝液中に含有される２─メルカプトエタノールの濃度
は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であればいかなる濃度で
も良いが、４０ｍＭ〜６０ｍＭが好適である。

【００２１】又、グアニジン塩酸の濃度は、１Ｍ〜８Ｍ
の範囲であればいかなる濃度でも適用できるが、５Ｍ〜
６Ｍが好適である。

【００２２】又、緩衝液のpHは、５〜９の範囲であれば
いかなるpHでも適用できるが、６〜８が好適である。

【００２３】該緩衝液の種類としては、上記のpHで緩衝
作用を示すものであれば何んら制限されず例えば、リン
酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等が好適に使用される。

【００２４】又、該緩衝液の濃度は、５ｍＭ〜１００ｍ
Ｍの範囲で適用できるが、１０ｍＭ〜５０ｍＭが好適で
ある。

【００２５】次に、細胞懸濁液に対して、ダイノミル破
砕機、超音波破砕装置等を使用し、細胞の破砕を行な
い、該破砕物を遠心分離し、その上清を得ることでＣ−
タンパクと大腸菌の不純タンパク等とが混合した抽出物
を得る。さらに、該抽出物を使用して、グアニジン塩酸
を含有する緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行なう。ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する緩
衝液に含有されるグアニジン塩酸の濃度は、１Ｍ〜８Ｍ
の範囲であればいずれの濃度でも良いが、２Ｍ〜４Ｍが
好適である。

【００２６】該緩衝液のpHは、５〜９の範囲であればい
ずれのpHでも適用できるが、細胞懸濁時に使用した緩衝
液のpHと合わせることが望ましい。

【００２７】該緩衝液の種類としては、上記のpHで緩衝
作用を示すものであれば、何ら制限されず、細胞懸濁時
に使用した緩衝液の種類と合わせることが望ましい。

【００２８】該緩衝液の濃度は、５ｍＭ〜１００ｍＭの
範囲で適用できるが、１０ｍＭ〜５０ｍＭが好適であ
る。

【００２９】ゲル濾過クロマトグラフィーに使用できる
担体としては、担体のタンパク分画範囲内にＣ−タンパ
クの分子量が入っているものであれば、特に限定されな
い。例えば Sephacryl S-200 HR , Sephacryl S-300
ＨＲ( pharmacia 社製）が好適である。ゲル濾過クロマ
トグラフィーの操作および分取方法は特に限定されず、
一般の公知の方法で行なえる。分取されたフラクション
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検
定し、そのデータを元にして、Ｃ−タンパク画分を集め
る。

【００３０】大腸菌内に存在するクロマログフィーを妨
害する成分が除かれた上記画分に対して、更にイオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の
公知の方法で精製を進めることができる。具体的に例示
すれば、該画分を、尿素を含有する緩衝液に交換した
後、該交換液に硫酸アンモニウムを最終濃度０．５Ｍ〜
２Ｍになるように添加し、溶解後、さらに該硫酸アンモ
ニウム溶解液を、疎水性担体を充填したカラムにかけ、
カラムを出発用緩衝液で洗浄後硫酸アンモニウムの逆濃
度勾配で吸着画分を溶出させ、分取されたフラクション
をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検定
し、その結果をもとにして、Ｃ−タンパク画分を集める
疎水性クロトグラフィーが挙げられる。

【００３１】

【発明の効果】本精製方法は、大腸菌で産生されたヒト
Ｃ型肝炎ウィルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原
領域を含むタンパクを大腸菌から高収率で、且つ、大腸
菌内のプロテアーゼによる分解を受けずに抽出でき、更
に抽出物から緩衝液を交換することなく直接即ち、操作
的に簡便で、且つ迅速に該タンパクを精製するためのク
ロマトグラフィーを妨害する成分を除去することができ
る有用な精製法である。本精製法で得られた画分は、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー等の公知の方法でさらに精製を進めることが可能であ
る。

【００３２】

【実施例】以下、実施例をあげて説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。 実施例１ ヒトＣ型肝炎ウィルスコア抗原領域を含む組換えタンパ
ク（分子量２３ｋｄ；以下、ｃｏｒｅｘタンパクと略
す）を産生する大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３からのｃｏｒｅｘ
タンパクの精製 プラスミドｐＫＭＲ３で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ
３）大腸菌ＨＣＶＫＭＲ３（微工研菌寄第１１５６９
号；ＦＥＲＭ Ｐ−１１５６９）を２０リットルのＭ９
ＺＢ倍地（ＮＨ₄ Ｃｌ ０．３％，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．
３％，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ０．６％，ＮａＣｌ ０．５
％，ＭｇＳＯ₄ １ｍＭ，バクトトリプトン１％，グル
コース０．１％，アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）で培養
し、ＯＤ₆₀₀ が０．４となった時点で、ＩＰＴＧ（イソ
プロピルチオガラクトシド）を最終濃度が０．４ｍＭに
なるように添加し、引続き、３７℃で２時間培養するこ
とで、ｃｏｒｅｘタンパクを生産させた。

【００３３】その後、細胞を８０００ｒｐｍ，４℃で連
続遠心し、ペレットを凍結することにより保存用に回収
した。

【００３４】湿潤重量は、２０ｇであった。次に湿潤重
量５ｇの凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレットを解凍し、ペレッ
ト１ｇにつき、抽出用緩衝液４ｍｌの比率で懸濁した。

【００３５】抽出用緩衝液の組成は、３Ｍグアニジン塩
酸、４０ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ７．０の１０
ｍＭリン酸緩衝液とした。

【００３６】該懸濁物を超音波処理によりｃｏｒｅｘタ
ンパクを抽出し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，３０ｍ
ｉｎ，４℃）し、上清（１９ｍｌ）を得た。

【００３７】上清の全タンパク量は、１８６０ｍｇであ
った。

【００３８】次に、該上清画分１９ｍｌに対して、展開
緩衝液を２Ｍグアニジン塩酸、ｐＨ７．０の２０ｍＭリ
ン酸緩衝液とし、担体として、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−
３００ＨＲ（ｐｈａｒｍａｃｉａ（株）社製）を使用し
てゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。

【００３９】使用カラムは内径４ｃｍ，長さ１５０ｃｍ
で担体容量は、１．８リットルであった。流速は３６ｍ
ｌ／ｈｒで行なった。カラムからの溶出液を７ｍｌ画分
毎に集め、その後、集めた各フラクションをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動によって検定し、その結果を
もとにしてｃｏｒｅｘタンパク画分を集めた。

【００４０】該ｃｏｒｅｘタンパク画分は、８０ｍｌ中
にたんぱく質６０ｍｇを含有していた。次に、上記ｃｏ
ｒｅｘタンパク画分に対して疎水性クロマトグラフィー
を行うために、緩衝液変換を行なった。

【００４１】ｃｏｒｅｘタンパク画分を６Ｍ尿素を含ん
だ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルに対
して、２回透析することで、緩衝液変換を行なった。
尚、１回の透析時間は５ｈｒで、４℃で行なった。

【００４２】続いて、該透析液に硫酸アンモニウム濃度
０．８Ｍになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。

【００４３】最後に該溶解液に対して、第二段階のクロ
マトグラフィーとして、疎水性クロマトグラフィーを行
なった。

【００４４】まず、出発用緩衝液を０．８Ｍ硫酸アンモ
ニウム、６Ｍ尿素を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）とし、担体としてＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ（東ソ−（株）社製）を使用するカラムを作製し
た。

【００４５】上記の溶解液８５ｍｌを、作成したカラム
にかけた。尚、作製したカラムは、内径１．４ｃｍ，長
さ１８ｃｍで担体容量２５ｍｌのものであった。又、流
速は１４ｍｌ／ｈｒで行なった。

【００４６】カラムにかけた後、出発用緩衝液１００ｍ
ｌでカラムを洗浄し、末吸着画分を溶出した。洗浄後、
吸着画分を０．８Ｍ→ＯＭ硫酸アンモニウム直線勾配で
溶出させた。（勾配の全容量は、３００ｍｌで行なっ
た。）カラムからの溶出液を２ｍｌ画分毎に集め、その
後、集めた各フラクションをＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって検定し、その結果をもとに、ｃ
ｏｒｅｘタンパク画分を集めた。その画分は、５６ｍｌ
中にタンパク４ｍｇを含有していた。

【００４７】以上の精製法により、ＨＣＶＫＭＲ３ ５
ｇにつきｃｏｒｅｘタンパク４ｍｇを得た。ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による評価では、純度９
５％以上であった。

【００４８】図１にｃｏｒｅｘタンパクの各精製工程で
の純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べた結果を示す。

【００４９】Ｌａｎｅ１：ｃｏｒｅｘタンパクを産生し
ているＨＣＶＫＭＲ３のペレットをグアニジン塩酸を含
有した緩衝液で懸濁、続いて超音波処理した処理液を遠
心分離し、得た上清。

【００５０】Ｌａｎｅ２：上記処理液を遠心分離し、得
た沈殿物 Ｌａｎｅ３：Ｌａｎｅ１の上清に対して、ゲル濾過クロ
マトグラフィーを行なって得られたｃｏｒｅｘタンパク
画分 Ｌａｎｅ４：Ｌａｎｅ３のｃｏｒｅｘタンパク画分に対
し緩衝液交換、硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性
クロマトグラフィーを行なって得られたｃｏｒｅｘタン
パク画分（精製タンパク試料） 比較例１ 実施例１で得られた凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレット５ｇを
解凍し、ペレット１ｇにつき抽出用緩衝液４ｍｌの比率
で懸濁した。抽出用緩衝液の組成は、ｐＨ７．０の１０
ｍＭリン酸緩衝液とした。

【００５１】該懸濁物を超音波処理によりｃｏｒｅｘタ
ンパクを抽出し、遠心分離し、上清（１５ｍｌ）を得
た。上清の全タンパク量は、１１００ｍｇであった。

【００５２】得られた上清（１５ｍｌ）を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルに対して、２回透析
することで、緩衝液交換した。

【００５３】尚、１回の透析時間は５ｈｒで、４℃で行
なった。

【００５４】次に、該交換液に対して、展開用緩衝液を
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とし、担体として
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）を使用したゲル濾過クロマトグラフィーを行
なった。

【００５５】使用カラムは、内径４ｃｍ、長さ１５０ｃ
ｍで担体容量は、１．８リットルであった。流速は３６
ｍｌ／ｈｒで行なった。

【００５６】カラムからの溶出液を７ｍｌ画分毎に集
め、その後、集めたフラクションをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって検定し、そのデータを元
にして、ｃｏｒｅｘタンパク画分を集めた。該ｃｏｒｅ
ｘタンパク画分は白濁しており、１５０ｍｌ中にタンパ
ク質９００ｍｇを含有していた。

【００５７】次に、上記ｃｏｒｅｘタンパク画分に対し
て、疎水性クロマトグラフィーを行うために、まず最終
濃度６Ｍになるように粉末尿素を添加、溶解した。

【００５８】次に、該溶解液を６Ｍ尿素を含んだ１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルに対して、２
回透析することで、緩衝液交換を行なった。尚、１回の
透析時間は５ｈｒで４℃で行なった。

【００５９】続いて、該透析液に硫酸アンモニウム濃度
０．８Ｍになるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、
溶解した。

【００６０】最後に該溶解液に対して、疎水性クロマト
グラフィーを行なった。まず、出発用緩衝液を０．８Ｍ
硫酸アンモニウム、６Ｍ尿素を含んだ１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）とし、担体としてＢｕｔｙｌ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ（東ソ−（株）社製）を使用するカラム
を作製した。上記の溶解液１７０ｍｌを作製したカラム
にかけた。

【００６１】尚、作製したカラムは、内径１．４ｃｍ，
長さ１８ｃｍで担体容量２５ｍｌのものであった。又、
流速は１４ｍｌ／ｈｒで行なった。

【００６２】カラムにかけた後、出発用緩衝液１００ｍ
ｌでカラムを洗浄し未吸着画分を溶出した。

【００６３】洗浄後、吸着画分を０．８→０Ｍ硫酸アン
モニウム直線勾配で溶出させた。（勾配の全容量は、３
００ｍｌで行なった。）カラムからの溶出液を３ｍｌ画
分毎に集め、その後集めたフラクションをＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって検定し、そのデー
タを元にｃｏｒｅｘタンパク画分を集めた。

【００６４】その画分は、１００ｍｌ中にタンパク２２
ｍｇを含有していた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による評価では、純度約６％以下であった。

【００６５】図２に、比較例１で行なったｃｏｒｅｘタ
ンパクの各精製工程での純度をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。

【００６６】Ｌａｎｅ１：ｃｏｒｅｘタンパクを産生し
ているＨＣＶＫＭＲ３のペレットを２−メルカプトエタ
ール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液で懸濁、続
いて超音波処理した処理液を遠心分離し、得た上清Ｌａ
ｎｅ２：上記処理液を遠心分離し、得た沈殿物Ｌａｎｅ
３：Ｌａｎｅ１の上清に対して、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを行なって得られたｃｏｒｅｘタンパク画分Ｌａ
ｎｅ４：Ｌａｎｅ３のｃｏｒｅｘタンパク画分に対し緩
衝液交換硫酸アンモニウム添加、溶解後、疎水性クロマ
トグラフィーを行なって得られたｃｏｒｅｘタンパク画
分である。

【００６７】以上の結果よりｃｏｒｅｘタンパクを産生
しているＨＣＶＫＭＲ３のペレットを２−メルカプトエ
タール及びグアニジン塩酸を含有しない緩衝液を使用し
て抽出した場合、抽出効率が低く、抽出操作後、遠心分
離した沈殿物にかなりｃｏｒｅｘタンパクが残ってい
る、（デンシドメトリーによる分析で、約４０％程のｃ
ｏｒｅｘタンパクが残っていることが判った）又、得ら
れた上清に対して、グアニジン塩酸を含有しない展開用
緩衝液存在下で、ゲル濾過クロマトグラフィーを行なっ
た場合、ｃｏｒｅｘタンパクが核酸および他の不純タン
パクと凝集するため、効果的に精製されず、上記ゲル濾
過クロマトグラフィーのｃｏｒｅｘタンパク画分に対し
て、実施例１と同様な疎水性クロマトグラフィーを行な
っても、得られたｃｏｒｅｘタンパク画分の該タンパク
の純度は悪いものになっていることがわかった。

【００６８】実施例１と比較例１の比較から、本発明に
よりｃｏｒｅｘタンパクが該タンパクを産生しているＨ
ＣＶＫＭＲ３から高収率で抽出され、該抽出物に対し
て、本法の方法で精製することで、該タンパクと大腸菌
内の核酸および他の不純タンパクとの凝集が阻止され
る。

【００６９】又、本法によって得られたｃｏｒｅｘタン
パク画分は、公知の一般的な方法でさらに精製できるこ
とが判明した。

【００７０】比較例２ 実施例１で得られた凍結ＨＣＶＫＭＲ３ペレットを解凍
し、ペレット１ｇにつき、表１に示す組成の各々の緩衝
液４ｍｌの割合でそれぞれ懸濁し、該懸濁物を超音波処
理後遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）
し、上清４ｍｌと沈殿物を得た。

【００７１】

【表１】

【００７２】得られた沈殿物および上清をそれぞれ別々
にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルを
クーマシー染色した後、脱色した。脱色したゲルをデン
シドメトリーで分析することで、電気泳動したゲル上の
ｃｏｒｅｘタンパクのバンドの濃さを上清と沈殿とで比
較し、上清に抽出された割合を抽出効率として求め、そ
れぞれ表２に示した。

【００７３】又、上清を電気泳動したゲル上のｃｏｒｅ
ｘタンパクのバンドの濃さを表１の１〜５の緩衝液間で
比較した。表１の緩衝液５を使用して得られた上清のｃ
ｏｒｅｘタンパクのバンドの濃さを１００％とし、表１
の緩衝液１〜４を用いて、抽出して得られた上清のｃｏ
ｒｅｘタンパクのバンドの濃さをｃｏｒｅｘタンパク相
対量として表わした。（表２）

【００７４】

【表２】

【００７５】表１の１．２で示されている変性剤を含有
しない緩衝液を使用した場合、表２に示す通り、抽出効
率が低い。

【００７６】又、表１の緩衝液３，緩衝液４を使用した
場合、抽出効率は１００％であるが、緩衝液５で抽出し
た時のｃｏｒｅｘタンパク量を１００％とした場合、ｃ
ｏｒｅｘタンパク相対量はそれぞれ３０％，６０％と少
ない。

【００７７】これは、抽出操作時に大腸菌内のプロテア
ーゼによりｃｏｒｅｘタンパクが分解されていることが
原因と考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたｃｏｒｅｘタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。

【図２】比較例１のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたｃｏｒｅｘタンパクの各精製工程での純
度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（1990）Ｖｏｌ. 172，Ｎｏ．２，ｐ．511−516 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 1/16 C12N 15/51 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌によって産生されたヒトＣ型肝炎
   ウイルスコア抗原タンパクまたはそのコア抗原領域を含
   むタンパクを２−メルカプトエタノール及びグアニジン
   塩酸を含有する緩衝液で抽出した後、グアニジン塩酸を
   含有する緩衝液存在下でゲル濾過クロマトグラフィーを
   行って分取することを特徴とするタンパクの精製方法。